KR102605464B1

KR102605464B1 - 일차 조혈 세포에서의 단백질 전달

Info

Publication number: KR102605464B1
Application number: KR1020177024409A
Authority: KR
Inventors: 알렉산더 마르슨; 제니퍼 다우드나; 제프리 블루스톤; 카트린 슈만; 스티븐 린
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2023-11-22
Also published as: AU2016211161B2; EP3250693A1; KR20170106486A; JP6886404B2; IL253498B; JP7114117B2; AU2016211161C1; CN107429254B; JP2018503387A; AU2022204635A1; NZ733807A; AU2016211161A1; CN107429254A; HK1248755A1; US20190388469A1; ES2880473T5; SG11201706059SA; IL253498A0; EP3250693B2; EP3929296A1

Abstract

일차 조혈 세포 및 일차 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포로의 Cas9 및 Cas9 리보핵산단백질의 매우 효율적인 전달을 위한 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

일차 조혈 세포에서의 단백질 전달

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2015년 1월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 62/110,187호 및 2015년 8월 25일에 출원된 62/209,711호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원 각각의 전체내용은 모든 목적상 참조로서 본원에 포함된다.

일차 세포의 정확하고 효율적인 조작을 위한 방법, 조성물, 반응 혼합물, 키트 및 장치는 세포-기반 요법의 개발 뿐만 아니라 신체 내의 다양한 세포, 조직, 기관 및 시스템의 기능에 대한 기본적인 연구에 대한 큰 가능성을 갖는다. 예를 들어, 일차 항원-특이적 T 세포의 생성 및 사용에서의 최근의 진전은 암 및 감염성 질병에 대한 면역요법에 대한 큰 가능성을 갖는다. 또 다른 예로서, 일차 세포 내의 조절성 유전자를 정확하게 표적화하는 능력은 상기 조절의 표현형 결과를 연구하는데 이용될 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은 a) Cas9 뉴클레아제 도메인(예를 들어, Cas9 아포 단백질) 및 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계; b) 세포 내에 Cas9 뉴클레아제 도메인을 도입시키는 단계로서, Cas9 뉴클레아제 도메인이 세포 내의 가이드 RNA와 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 세포의 유전체를 편집하는 방법을 제공하며, 상기 세포는 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포이다. 일부 구체예에서, 세포 내의 가이드 RNA는 세포 내의 가이드 RNA 유전자에 의해 인코딩되며, 가이드 RNA 유전자는 DNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 Cas9 뉴클레아제 도메인을 인코딩하는 핵산을 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, Cas9 전달 효율은 적어도 약 20% 또는 30%이다. 일부 구체예에서, 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포는 세포의 유전체가 상기 또는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 편집되기 전, 편집되는 동안 또는 편집된 후에 이종성 단백질을 발현하도록 변형된다. 일부 구체예에서, 이종성 단백질은 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스) 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 이종성 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR) 단백질 또는 재배열된 T-세포 수용체(TCR)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 이종성 TCR이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 a) Cas9 리보핵산단백질 복합체 및 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계로서, Cas9 리보핵산단백질 복합체가 Cas9 뉴클레아제 도메인 및 가이드 RNA를 포함하고, 가이드 RNA가 세포의 유전체의 표적 영역에 특이적으로 하이브리드화되는, 단계; 및 b) Cas9 리보핵산단백질 복합체를 세포 내에 도입시키는 단계를 포함하는 세포의 유전체를 편집하는 방법을 제공하며, 상기 세포는 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 적어도 약 20%의 유전체 편집 효율을 제공한다. 일부 구체예에서, 세포는 Cas9을 인코딩하는 핵산 및/또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 핵산을 함유하지 않는다.

일부 구체예에서, a)의 제공 단계 전에 세포는 무한증식되거나 형질전환되지 않는다. 일부 경우에서, b)의 도입 단계 후에 세포는 무한증식되거나 형질전환되지 않는다. 일부 구체예에서, 세포는 a)의 제공 단계 전에 계대배양되지 않았다. 일부 경우에서, a)의 제공 단계 전에 세포는 숙주 유기체 또는 조직으로부터 직접 분리되었고, 배양되었다. 일부 경우에서, a)의 제공 단계 전에 세포는 숙주 유기체 또는 조직으로부터 직접 분리되었고, 배양되지 않았다.

일부 구체예에서, 도입 단계는 전기천공을 포함한다. 일부 구체예에서, 도입 단계는 나노와이어 또는 나노튜브를 Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질로 코팅하는 단계; 세포와 Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질로 코팅된 나노와이어 또는 나노튜브를 접촉시키는 단계; Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질로 코팅된 나노와이어 또는 나노튜브로 세포의 세포막을 관통시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 도입 단계는 세포의 직경보다 작은 세포 변형 수축을 통해 반응 혼합물을 강제로 주입시키는 단계로서, 강제 주입이 세포의 세포막에 일시적 포어를 도입시키는 단계; 및 Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질을 일시적 포어를 통해 세포로 진입시키는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질은 세포 상의 세포외 수용체에 대한 리간드를 포함하고, 도입 단계는 Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질의 수용체 매개 내재화를 포함한다. 일부 구체예에서, Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질은 세포 침투 펩티드를 포함하고, 도입 단계는 세포 침투 펩티드를 세포에 접촉시키는 단계를 포함한다.

일부 경우에서, 전기천공은 반응 혼합물을 캐쏘드(cathode)와 애노드(anode) 사이의 챔버에 위치시키는 단계, 및 캐쏘드와 애노드 사이에 약 20 kV/m 내지 약 100 kV/m의 전압 전위를 적용하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 전압 전위는 약 5 ms 내지 약 100 ms의 길이를 갖는 펄스로 적용된다. 일부 경우에서, 상기 방법은 전압 전위 펄스의 적용을 2 내지 10회 반복하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 챔버는 세로 길이 및 수평 단면적을 갖는 중공 부재이며; 챔버는 세로 길이에 의해 분리된 제1 및 제2 원위 말단을 포함하고; 챔버는 제1 원위 말단에 제1 전극, 및 챔버의 제2 원위 말단과 유체 연통하는 전해질 용액을 함유하는 저장소를 갖고, 상기 저장소는 제2 전극을 갖는다. 일부 경우에서, 챔버는 50 내지 10,000의 범위 내의 세로 길이 대 수평 단면적의 비를 갖는다.

일부 구체예에서, 반응 혼합물 내의 Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질은 약 0.25 μM 내지 약 5 μM의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 반응 혼합물 내의 Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질은 약 0.9 μM 내지 약 1.8 μM의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 반응 혼합물은 μL 당 약 1 x 10⁵ 내지 약 4 x 10⁵개의 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포 또는 약 0.9 x 10⁴ 내지 약 3.6 x 10⁴개의 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에서, 반응 혼합물은 μL 당 약 2 x 10⁵ 내지 약 2.5 x 10⁵개의 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포 또는 1.8 x 10⁴ 내지 약 2.2 x 10⁴개의 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포를 함유한다. 일부 구체예에서, 세포는 일차 조혈 세포이다.

일부 경우에서, 일차 조혈 세포는 면역 세포이다. 일부 경우에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 경우에서, T 세포는 조절성 T 세포, 효과기 T 세포, 또는 나이브 T 세포이다. 일부 경우에서, 조절성 T 세포, 효과기 T 세포, 또는 나이브 T 세포는 CD4⁺ T 세포이다. 일부 경우에서, T 세포는 CD4⁺CD25^hiCD127^lo 조절성 T 세포이다. 일부 경우에서, T 세포는 FOXP3⁺ T 세포이다. 일부 경우에서, T 세포는 CD4⁺CD25^loCD127^hi 효과기 T 세포이다. 일부 경우에서, T 세포는 CD4⁺CD25^loCD127^hiCD45RA^hiCD45RO^- 나이브 T 세포이다. 일부 경우에서, T 세포는 CD8⁺ T 세포이다. 일부 경우에서, T 세포는 CD4⁺CD8⁺ T 세포이다. 일부 경우에서, a)의 제공 단계 전에 T 세포는 사전 활성화된다. 일부 경우에서, a)의 제공 단계 전에 T 세포는 자극되지 않는다. 일부 경우에서, T 세포는 재조합 항원 수용체를 포함한다.

일부 구체예에서, 반응 혼합물은 이중 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형을 추가로 포함하며, 상기 방법은 세포 내로 이중 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형을 도입시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형은 약 9 μM 내지 약 180 μM의 농도로 존재한다. 일부 경우에서, 이중 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형은 약 45 μM의 농도로 존재한다. 일부 경우에서, 상기 방법은 적어도 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 또는 80%의 일차 조혈 세포(예를 들어, 자극되거나 자극되지 않은 T 세포) 또는 일차 조혈 줄기 세포 유전체 편집(예를 들어, 닉(nick) 복구, 비-상동성 말단 결합 복구, 또는 Cas9 단일 또는 이중 가닥 절단 부위의 상동성 지시형 복구에 의함)의 효율을 제공한다.

일부 경우에서, 상기 방법은 약 20% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 65%, 약 30% 내지 약 60%, 또는 약 35% 내지 약 55%의 일차 조혈 세포(예를 들어, 자극되거나 자극되지 않은 T 세포) 또는 일차 조혈 줄기 세포 유전체 편집(예를 들어, 닉 복구, 비-상동성 말단 결합 복구, 또는 Cas9 단일 또는 이중 가닥 절단 부위의 상동성 지시형 복구에 의함)의 효율을 제공한다.

일부 경우에서, 상기 방법은 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% 또는 75%의 일차 조혈 세포(예를 들어, 자극되거나 자극되지 않은 T 세포) 또는 일차 조혈 줄기 세포 주형 지시형 유전체 편집의 효율을 제공한다.

일부 경우에서, 상기 방법은 약 5% 내지 약 30%, 약 7% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 또는 약 10% 내지 약 15의 일차 조혈 세포(예를 들어, 자극되거나 자극되지 않은 T 세포) 또는 일차 조혈 줄기 세포 주형 지시형 유전체 편집의 효율을 제공한다. 일부 경우에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형은 재조합 항원 수용체, 이의 일부, 또는 이의 성분을 인코딩한다.

일부 구체예에서, 세포는 T 세포이며, 상기 방법은 b)의 도입 단계 후에 반응 혼합물을 CD3 효능제 및 CD28 효능제를 함유하는 배양 배지로 옮기고 세포를 배양하는 단계 c)를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, CD3 효능제 또는 CD28 효능제는 고체 표면 상에 고정되거나, CD3 효능제 또는 CD28 효능제는 고체 표면 상에 고정된다(예를 들어, 비드 또는 별개의 비드 상, 또는 배양 플레이트 또는 웰의 표면 상에 고정됨). 일부 경우에서, CD3 효능제는 항-CD3 항체이다. 일부 경우에서, CD28 효능제는 항-CD28 항체이다. 일부 경우에서, 상기 방법은 c)의 배양 단계 후에 반응 혼합물을 CD3 효능제 또는 CD28 효능제를 함유하지 않는 배양 배지로 옮기고 세포를 배양하는 단계 c)를 추가로 포함한다.

일부 경우에서, 항-CD3 항체(예를 들어, 고정되거나 가용성임)는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 μg/mL의 농도로 존재한다. 일부 경우에서, 항-CD3 항체(예를 들어, 고정되거나 가용성임)는 약 0.5 내지 약 25 μg/mL, 약 1 내지 약 20 μg/mL, 약 2 내지 약 15 μg/mL, 약 5 내지 약 15 μg/mL, 또는 약 5 내지 약 10 μg/mL의 농도로 존재한다. 일부 경우에서, 항-CD28 항체(예를 들어, 고정되거나 가용성임)는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 μg/mL의 농도로 존재한다. 일부 경우에서, 항-CD28 항체(예를 들어, 고정되거나 가용성임)는 약 0.5 내지 약 15 μg/mL, 약 1 내지 약 15 μg/mL, 약 2 내지 약 10 μg/mL, 약 1 내지 약 7.5 μg/mL, 또는 약 2 내지 약 5 μg/mL의 농도로 존재한다.

일부 구체예에서, Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질은 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. 일부 구체예에서, Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질은 Cas9 닉카제(nickase)를 포함한다. 일부 구체예에서, Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질은 제한 엔도뉴클레아제 또는 닉카제에 융합된 Cas9 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 Cas9 아포 단백질은 전사 조절인자 또는 염색질 변형제에 융합된 Cas9 뉴클레아제 도메인을 포함한다.

일부 구체예에서, 반응 혼합물은 적어도 2개의 구조적으로 상이한 Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 적어도 2개의 구조적으로 상이한 Cas9 아포 단백질을 포함한다. 일부 경우에서, 적어도 2개의 구조적으로 상이한 Cas9 리보핵산단백질 복합체는 구조적으로 상이한 sgRNA를 함유한다. 일부 경우에서, 적어도 2개의 구조적으로 상이한 Cas9 리보핵산단백질 복합체 또는 적어도 2개의 상이한 Cas9 아포 단백질은 구조적으로 상이한 Cas9 도메인을 함유한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 복수의 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포를 제공하며, 복수의 세포는 Cas9을 인코딩하는 핵산 및/또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 핵산을 함유하지 않고, 복수의 세포 중 적어도 20%는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 함유한다. 일부 구체예에서, 복수의 세포 중 적어도 30%는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 함유한다. 일부 구체예에서, 복수의 세포 중 적어도 20%는 Cas9 리보핵산단백질 복합체 및 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형을 함유한다. 일부 구체예에서, 복수의 세포는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 존재에 대해 농축되지 않는다. 일부 구체예에서, 복수의 세포 중 적어도 20% 또는 30%는 표적 유전체 영역에서 이중 가닥 절단, 또는 NHEJ 또는 HDR 복구된 이중 가닥 절단을 함유한다. 일부 구체예에서, 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포는 세포의 유전체가 상기 또는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 편집되기 전, 편집되는 동안 또는 편집된 후에 이종성 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR))을 발현하도록 변형된다. 이종성 단백질은 세포로 도입된 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)에 의해 인코딩될 수 있다.

정의

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 달리 명백히 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.

용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 나타낸다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명백히 명시된 서열 뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오쏠로그(ortholog), SNP 및 상보성 서열을 암묵적으로 포함한다. 특히, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬을 생성시키거나 인코딩하는 것과 관련된 DNA의 세그먼트를 나타낼 수 있다. 이는 코딩 영역 전후의 영역(선도 및 트레일러) 뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 용어 "유전자"는 비-번역 RNA, 예를 들어, rRNA, tRNA, 가이드 RNA(예를 들어, 작은 가이드 RNA), 또는 마이크로 RNA를 생성하거나 인코딩하는 것과 관련된 DNA의 세그먼트를 나타낼 수 있다.

"프로모터"는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 조절 서열의 어레이로 정의된다. 본원에서 사용되는 프로모터는 전사 시작 부위 근처의 필요한 핵산 서열, 예를 들어, 중합효소 II 타입 프로모터의 경우 TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 또한 전사 시작 부위로부터 수천개의 염기쌍만큼 위치될 수 있는 원위 인핸서 또는 억제인자 요소를 선택적으로 포함한다.

"발현 카세트"는 숙주 세포에서 특정 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 요소를 갖는 재조합적 또는 합성으로 생성된 핵산 작제물이다. 발현 카세트는 플라스미드, 바이러스 유전체 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 통상적으로, 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전사되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

"리포터 유전자"는 이들의 생화학적 특징, 예를 들어, 효소 활성 또는 화학형광 특징으로 인해 용이하게 검출 가능한 단백질을 인코딩한다. 상기 리포터의 한 특정 예는 녹색 형광 단백질이다. 이러한 단백질로부터 발생된 형광은 다양한 상업적으로 이용 가능한 형광 검출 시스템으로 검출될 수 있다. 다른 리포터는 염색에 의해 검출될 수 있다. 리포터는 또한 적절한 기질과 접촉되는 경우 검출 가능한 신호를 발생시키는 효소일 수 있다. 리포터는 검출 가능한 생성물의 형성을 촉매 작용하는 효소일 수 있다. 적합한 효소는 프로테아제, 뉴클레아제, 리파제, 포스파타제 및 가수분해효소를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 리포터는 기질이 진핵생물 형질막에 실질적으로 불투과성이어서, 신호 형성을 엄격히 조절하는 것을 가능하게 하는 효소를 인코딩할 수 있다. 효소를 인코딩하는 적합한 리포터 유전자의 특정 예는 CAT(클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제; Alton and Vapnek (1979) Nature 282: 864-869); 루시페라제(lux); β-갈락토시다제; LacZ; β-글루쿠로니다제; 및 알칼리성 포스파타제(Toh, et al. (1980) Eur. J. Biochem. 182: 231-238; 및 Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101)를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 상기 참고문헌 각각의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다. 다른 적합한 리포터는 에피토프를 특이적으로 인지하는 표지된 항체로 검출될 수 있는 특정 에피토프를 인코딩하는 것을 포함한다.

용어 "아미노산"은 천연 발생 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 나타낸다. 천연 발생 아미노산은 유전 코드에 의해 인코딩되는 것, 뿐만 아니라 이후에 변형되는 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소에 결합된 α 탄소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 갖는 화합물을 나타낸다. 상기 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이하나, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 구조를 갖는 화학적 화합물을 나타낸다.

부위 특이적 방식으로 폴리펩티드 사슬로의 비천연 아미노산 유도체 또는 유사체의 혼입을 허용하는 당 분야에 공지된 다양한 방법이 있으며, 예를 들어, WO 02/086075호를 참조한다.

아미노산은 일반적으로 공지된 3문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장되는 1문자 기호에 의해 본원에서 언급될 수 있다. 뉴클레오티드는 마찬가지로 이들의 일반적으로 허용되는 단일-문자 코드에 의해 언급될 수 있다.

"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 3개 용어 모두는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에서 사용되는 용어는 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합에 의해 연결된 전장 단백질을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함한다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 인코딩하지 않는 경우 본질적으로 동일한 서열을 나타낸다. 유전 코드의 축퇴성으로 인해, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 제공된 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정화되는 모든 위치에서, 코돈은 인코딩된 폴리펩티드를 변경시키지 않고 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 코돈으로 변경될 수 있다. 상기 핵산 변이는 "침묵 변이"이며, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 폴리펩티드를 인코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성시킬 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에서 암시적이다.

아미노산 서열에 관해서, 당업자는 인코딩된 서열 내의 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산을 변경시키거나, 첨가하거나, 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적 치환, 결실 또는 첨가가 이러한 변경이 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 한 아미노산의 치환을 발생시키는 경우에 "보존적으로 변형된 변이체"임을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 치환 표는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 상기 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자에 추가되거나, 이들을 배제하지 않는다. 일부 경우에서, Cas9 또는 sgRNA의 보존적으로 변형된 변이체가 본원에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다.

하기 8개의 그룹은 각각 서로에 대해 보존성 치환인 아미노산을 함유한다:

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)

(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Co., N. Y. (1984)] 참조).

아미노산은 이들의 일반적으로 공지된 3문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장되는 1문자 기호에 의해 본원에서 언급될 수 있다. 뉴클레오티드는 마찬가지로 이들의 일반적으로 허용되는 단일-문자 코드에 의해 언급될 수 있다.

"전위 서열" 또는 "형질도입 서열"은 하나의 세포 구획으로부터 또 다른 세포 구획으로, 또는 세포 또는 형질막을 통해 세포외 공간으로부터 세포로 단백질의 이동을 지시하는 펩티드 또는 단백질(또는 이들의 활성 단편 또는 도메인) 서열을 나타낸다. 세포 또는 형질막을 통해 세포외 공간으로부터 세포로 단백질의 이동을 지시하는 전위 서열은 "세포 침투 펩티드"이다. 세포의 핵으로 국소화시키는 전위 서열은 "핵 국소화" 서열, 신호, 도메인, 펩티드 등으로 언급된다. 전위 서열의 예는 TAT 형질도입 도메인(예를 들어, 문헌[S. Schwarze et al., Science 285 (Sep. 3, 1999)] 참조); 페네트라틴(penetratin) 또는 페네트라틴 펩티드(D. Derossi et al., Trends in Cell Biol. 8, 84-87); 단순 헤르페스 바이러스 타입 1 VP22(A. Phelan et al., Nature Biotech. 16, 440-443 (1998)), 및 다중양이온(예를 들어, 다중-아르기닌) 펩티드(Cell Mol. Life Sci. 62 (2005) 1839-1849)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 전위 서열은 당 분야에 공지되어 있다. 전위 펩티드는 다른 것들 중에서 표적 세포로 용이하게 통과할 수 있거나, 혈액뇌장벽을 통해 표적 세포로 용이하게 통과할 수 있는 컨쥬게이트 화합물을 생성시키기 위해 본 발명의 화합물에 융합(예를 들어, 아미노 또는 카르복시 말단에서 융합)되거나, 컨쥬게이션되거나, 커플링될 수 있다.

"CRISPR/Cas" 시스템은 외래 핵산에 대한 방어를 위한 널리 보급된 종류의 박테리아 시스템을 나타낸다. CRISPR/Cas 시스템은 매우 다양한 유박테리아 및 고세균에서 발견된다. CRISPR/Cas 시스템은 타입 I, II, 및 III 서브타입을 포함한다. 야생형 타입 II CRISPR/Cas 시스템은 외래 핵산을 인지하고 분해하기 위해 가이드 및 활성화 RNA와 복합체화된 RNA-매개 뉴클레아제, Cas9을 이용한다. 가이드 RNA 및 활성화 RNA 둘 모두의 활성을 갖는 가이드 RNA가 또한 당 분야에 공지되어 있다. 일부 경우에서, 상기 이중 활성 가이드 RNA는 작은 가이드 RNA(sgRNA)로 언급된다.

Cas9 동족체는 악티노박테리아(Actinobacteria), 아퀴피카에(Aquificae), 박테로이데테스-클로로비(Bacteroidetes-Chlorobi), 클라미디아에-베루코미크로비아(Chlamydiae-Verrucomicrobia), 클로플렉시(Chlroflexi), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 피르미쿠테스(Firmicutes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로카에테스(Spirochaetes), 및 테르모토가에(Thermotogae)의 분류학적 그룹의 박테리아를 포함하나 이에 제한되지는 않는 매우 다양한 유박테리아에서 발견된다. 예시적 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 단백질이다. 추가의 Cas9 단백질 및 이의 동족체는, 예를 들어, 문헌[Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5): 726-737 ; Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6): 467-477; Hou, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9; Sampson et al., Nature. 2013 May 9;497(7448):254-7; 및 Jinek, et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21]에 기재되어 있다. Cas9 뉴클레아제 도메인은 숙주 세포에서의 효율적인 활성 또는 향상된 안정성을 위해 최적화될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "Cas9"은 RNA-매개 뉴클레아제(예를 들어, 박테리아 또는 고세균 기원, 또는 이들로부터 유래된 것)를 나타낸다. 예시적 RNA-매개 뉴클레아제는 외래 Cas9 단백질 및 이의 동족체를 포함하며, CPF1을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다(예를 들어, 문헌[Zetsche et al., Cell, Volume 163, Issue 3, p759-771, 22 October 2015] 참조). 유사하게, 본원에서 사용되는 용어 "Cas9 리보핵산단백질" 복합체 등은 Cas9 단백질과 crRNA(예를 들어, 가이드 RNA 또는 작은 가이드 RNA), Cas9 단백질과 전사활성 crRNA(tracrRNA), Cas9 단백질과 작은 가이드 RNA 사이의 복합체, 또는 이들의 조합물(예를 들어, Cas9 단백질, tracrRNA, 및 crRNA 가이드 RNA를 함유하는 복합체)을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같은 세포의 유전체의 편집의 상황에서의 어구 "편집"은 표적 유전체 영역에서 유전체의 서열 내에 구조적 변화를 도입시키는 것을 나타낸다. 예를 들어, 편집은 표적 유전체 영역의 유전체 서열에 삽입 결실(삽입결실) 돌연변이를 유도하는 형태를 취할 수 있다. 상기 편집은 표적 유전체 영역 내에서 이중 가닥 절단을 유도하거나, 표적 유전체 영역에 측접하는 반대 가닥 상에서 한 쌍의 단일 가닥 닉(nick)을 유도함으로써 수행될 수 있다. 표적 유전체 영역에서 또는 표적 유전체 영역 내에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유도하기 위한 방법은 표적 유전체 영역에 특이적인 Cas9 뉴클레아제 도메인, 또는 이의 유도체, 및 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA의 쌍의 이용을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키거나 Cas9 뉴클레아제 도메인을 도입시키는 상황에서의 어구 "도입"은 세포 외부로부터 세포 내부로의 Cas9 단백질 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 전위를 나타낸다. 일부 경우에서, 도입은 세포 외부로부터 세포의 핵의 내부로의 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질의 전위를 나타낸다. 전기천공, 나노와이어 또는 나노튜브와의 접촉, 수용체 매개 내재화, 세포 침투 펩티드를 통한 전위, 리포솜 매개 전위 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 상기 전위의 다양한 방법이 고려된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 일차 세포 또는 일차 줄기 세포의 상황에서의 어구 "일차"는 형질전환되거나 무한증식화되지 않은 세포를 나타낸다. 상기 일차 세포는 제한된 횟수로 배양되거나, 계대배양되거나, 계대(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20회 배양)될 수 있다. 일부 경우에서, 일차 세포는 시험관내 배양 조건에 적합화된다. 일부 경우에서, 일차 세포는 유기체, 시스템, 기관 또는 조직으로부터 분리되고, 선택적으로 분류되고, 배양 또는 계대배양 없이 직접 사용된다. 일부 경우에서, 일차 세포는 자극되거나, 활성화되거나, 분화된다. 예를 들어, 일차 T 세포는 CD3, CD28 효능제, IL-2, IFN-γ, 또는 이들의 조합물과의 접촉(예를 들어, 이들의 존재하에서 배양)에 의해 활성화될 수 있다.

본원에서 사용되는 어구 "조혈 줄기 세포"는 혈액 세포를 생성시킬 수 있는 줄기 세포의 유형을 나타낸다. 조혈 줄기 세포는 골수 또는 림프 계통의 세포, 또는 이들의 조합을 발생시킬 수 있다. 조혈 줄기 세포는 말초 혈액 또는 이의 분획으로부터 분리될 수 있으나 이들은 주로 골수에서 발견된다. 조혈 줄기 세포를 확인하거나, 분류하거나, 정제하기 위해 다양한 세포 표면 마커가 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 조혈 줄기 세포는 c-kit⁺ 및 lin^-로 확인된다. 일부 경우에서, 인간 조혈 줄기 세포는 CD34⁺, CD59⁺, Thy1/CD90⁺, CD38^lo ^/-, C-kit/CD117⁺, lin^-로 확인된다. 일부 경우에서, 인간 조혈 줄기 세포는 CD34^-, CD59⁺, Thy1/CD90⁺, CD38^lo ^/-, C-kit/CD117⁺, lin^-로 확인된다. 일부 경우에서, 인간 조혈 줄기 세포는 CD133⁺, CD59⁺, Thy1/CD90⁺, CD38^lo ^/-, C-kit/CD117⁺, lin^-로 확인된다. 일부 경우에서, 마우스 조혈 줄기 세포는 CD34^lo ^/-, SCA-1⁺, Thy1^+/lo, CD38⁺, C-kit⁺, lin^-로 확인된다. 일부 경우에서, 조혈 줄기 세포는 CD150⁺CD48^-CD244^-이다.

본원에서 사용되는 어구 "조혈 세포"는 조혈 줄기 세포로부터 유래된 세포를 나타낸다. 조혈 세포는 유기체, 시스템, 기관 또는 조직(예를 들어, 혈액 또는 이의 분획)으로부터의 분리에 의해 획득되거나 제공될 수 있다. 대안적으로, 조혈 줄기 세포가 분리될 수 있고, 조혈 줄기 세포를 분화시킴으로써 조혈 세포가 획득되거나 제공될 수 있다. 조혈 세포는 추가의 세포 유형으로 분화할 잠재성이 제한적인 세포를 포함한다. 상기 조혈 세포는 다능성 전구 세포, 계통-제한 전구 세포, 공통 골수 전구 세포, 과립구-대식세포 전구 세포, 또는 거대핵세포-적혈구 전구 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 조혈 세포는 림프 및 골수 계통의 세포, 예를 들어, 림프구, 적혈구, 과립구, 단핵구 및 혈소판을 포함한다. 일부 구체예에서, 조혈 세포는 면역 세포, 예를 들어, T 세포, B 세포, 대식 세포, 또는 수지상 세포이다.

본원에서 사용되는 어구 "T 세포"는 T 세포 수용체 분자를 발현하는 림프 세포를 나타낸다. T 세포는 나이브 T 세포, 자극된 T 세포, 일차 T 세포(예를 들어, 배양되지 않음), 배양된 T 세포, 무한증식화된 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절성 T 세포, 자연 살해 T 세포, 이들의 조합, 또는 이들의 하위 집단을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. T 세포는 CD4⁺, CD8⁺, 또는 CD4⁺ 및 CD8⁺일 수 있다. T 세포는 헬퍼 세포, 예를 들어, 타입 T_h1, T_h2, T_h3, T_h9, T_h17 또는 T_FH의 헬퍼 세포일 수 있다. T 세포는 세포독성 T 세포일 수 있다. 조절성 T 세포는 FOXP3⁺ 또는 FOXP3^-일 수 있다. T 세포는 알파/베타 T 세포 또는 감마/델타 T 세포일 수 있다. 일부 경우에서, T 세포는 CD4⁺CD25^hiCD127^lo 조절성 T 세포이다. 일부 경우에서, T 세포는 Tr1, Th3, CD8+CD28-, Treg17, 및 Qa-1 제한 T 세포, 또는 이들의 조합 또는 하위 집단으로 구성된 군으로부터 선택된 조절성 T 세포이다. 일부 경우에서, T 세포는 FOXP3⁺ T 세포이다. 일부 경우에서, T 세포는 CD4⁺CD25^loCD127^hi 효과기 T 세포이다. 일부 경우에서, T 세포는 CD4⁺CD25^loCD127^hiCD45RA^hiCD45RO^- 나이브 T 세포이다.

T 세포는 유전적으로 조작된 재조합 T 세포일 수 있다. 일부 경우에서, 재조합 T 세포는 재조합(예를 들어, 돌연변이 또는 이종성) T 세포 수용체를 갖는다. 예를 들어, T 세포 수용체는 항원 특이성을 변경시키기 위해 T 세포 수용체의 상보성 결정 영역에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 또 다른 예로서, T 세포 수용체는 신호전달을 증가시키거나 감소시키기 위해 돌연변이(예를 들어, 엔도도메인 내에서 돌연변이)될 수 있다. 또 다른 예로서, T 세포 수용체는 이종성 T 세포 수용체로 대체될 수 있다. 또 다른 예로서, T 세포 수용체는 상이한 수용체 도메인을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편으로 대체될 수 있다. 일부 경우에서, T 세포 수용체는 표적화 도메인(예를 들어, 항체 단편), 막횡단 도메인, 및 세포내 또는 엔도도메인 도메인을 함유하는 키메라 수용체이다. 엔도도메인은 확실한 T 세포 활성화 및 항-항원 활성을 제공하기 위해 하나 이상의 신호전달 도메인 및/또는 어댑터 도메인을 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "비-상동성 말단 결합" 또는 NHEJ는 상동성 주형 핵산을 필요로 하지 않고 DNA 가닥의 절단 또는 니킹된 말단이 직접 라이게이션되는 세포 과정을 나타낸다. NHEJ는 복구 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 발생시킬 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 상동성 지시형 복구(HDR)는 DNA 가닥의 절단 또는 니킹된 말단이 상동성 주형 핵산으로부터의 중합에 의해 복구되는 세포 과정을 나타낸다. 따라서, 본래의 서열이 주형의 서열로 대체된다. 상동성 주형 핵산은 유전체의 다른 위치의 상동성 서열(자매 염색분체, 상동성 염색체, 또는 동일하거나 상이한 염색체 상의 반복 영역)에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로, 표적 부위에서 서열의 특이적 HDR-유도 변화를 획득하기 위해 외인성 주형 핵산이 도입될 수 있다. 이러한 방식으로, 특정 돌연변이가 절단 부위에 도입될 수 있다.

본원에서 사용되는 어구 "단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형" 또는 "ssODT"는 HDR을 위한 주형으로서 세포에 의해 이용될 수 있는 DNA 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 일반적으로, ssODT는 표적 부위에 대한 적어도 하나의 상동성 영역을 갖는다. 일부 경우에서, ssODT는 표적 절단 부위에 삽입되는 돌연변이 또는 이종성 서열을 함유하는 영역에 측접한 2개의 상동성 영역을 갖는다.

도 1. 일차 인간 CD4⁺ T 세포에서의 인간 CXCR4 유전자좌의 확실한 편집. (A) 유전체 편집 후 유전적 및 표현형 특성규명을 위한 일차 인간 CD4⁺ T 세포로의 Cas9:단일-가이드 RNA 리보핵산단백질(Cas9 RNP) 전달의 실험적 개략도. (B) 인간 CXCR4 유전자좌의 코딩 서열을 편집하기 위해 설계된 단일-가이드 RNA(sgRNA) 표적(청색) 및 PAM(녹색) 서열의 개략적 표현(SEQ ID NOS:31-32). (C) FACS 플롯은 대조군 처리된 세포(sgRNA가 없는 Cas9, CTRL)에 비해 더 높은 농도의 CXCR4 Cas9 RNP와 함께 낮은 CXCR4 발현(CXCR4^lo)을 갖는 세포의 증가하는 백분율을 제시한다. (D) T7 엔도뉴클레아제 I(T7E1) 검정은 CXCR4 유전자좌에서의 유전체 편집을 나타내며, CXCR4^hi 세포보다 FACS-분류된 CXCR4^lo 세포에서 더 많은 편집이 관찰된다. 예상 PCR 생성물 크기(938개의 뉴클레오티드; nt) 및 대략적인 예상 T7E1 단편 크기가 표시된다. 전체 편집 빈도는 T7 엔도뉴클레아제 I 검정을 이용하여 측정되었고, '재료 및 방법'에 기재된 공식을 이용하여 분석되었으며, 수치 결과는 아가로스 젤 이미지 아래에 편집 %(전체)로 표시된다. (E) 분류된 Cas9 RNP 처리 CXCR4^hi(각각 SEQ ID NOS:34-43) 및 CXCR4^lo(각각 SEQ ID NOS:45-54)에서 CXCR4 유전자좌의 시퀀싱에 의해 검출된 돌연변이 패턴이 CXCR4^lo 대조군 처리 세포(CTRL)(각각 SEQ ID NOS:56-65)로부터의 서열과 비교된다. 참조(REF) 서열은 각각의 집단으로부터의 클론 서열의 상단에 제시되며, sgRNA 표적(청색) 및 PAM(녹색) 서열이 표시된다. 적색 점선은 결실된 염기를 나타내고(SEQ ID NO:33 - Cas9 RNP 처리된 CXCR4^hi; SEQ ID NO:44 - Cas9 RNP 처리된 CXCR4^lo; SEQ ID NO:55 - CXCR4^lo 대조군), 적색 서열은 돌연변이되거나 삽입된 뉴클레오티드를 나타낸다. 여러 클론으로부터의 돌연변이되지 않은 서열은 트렁케이션되었다.
도 2. 효율적인 상동성-지시형 복구는 일차 인간 T 세포에서 표적화된 DNA 대체를 가능하게 한다. (A) 12 nt를 대체하고, Cas9 RNP가 절단하는 CXCR4 유전자좌(SEQ ID NO:66)에서 새로운 HindIII 제한 효소 절단 부위(주황색)를 도입하도록 설계된 90개의 뉴클레오티드(nt) 상동성 아암(arm)을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 HDR 주형의 개략적 표현. sgRNA 표적(청색) 및 PAM(녹색) 서열이 표시된다(SEQ ID NOS:31-32). (B) 단일 가닥 HDR 주형의 존재 및 부재하에서 CXCR4 Cas9 RNP-처리된 세포에서 흐름세포측정법에 의해 평가된 CXCR4 세포 표면 염색의 히스토그램(대조군 Cas9 단백질 처리 세포 및 염색되지 않은 세포와 비교). (C) FACS 플롯(패널 B의 히스토그램에 해당)은 Cas9 RNP 처리 및 100 pmol의 ssODT에 의한 CXCR4의 최대 절제를 제시한다. (D) 전체 편집(Cas9 절단 부위에서 삽입결실을 발생시키는 모든 NHEJ 및 HDR 사건의 합계로 정의됨) 백분율을 계산하기 위해 T7E1 검정이 이용된 반면, HDR 빈도는 새로이 통합된 HindIII 부위를 특이적으로 절단하는 HindIII 절단에 의해 결정되었고, DNA 생성물 대 DNA 기질의 비로 계산되었다. 예상 PCR 생성물 크기(938개의 뉴클레오티드; nt) 및 대략적인 예상 T7E1 및 HindIII 절단 단편이 표시된다. 전체 편집 및 HDR 빈도는 대조군 세포 및 다양한 농도의 ssODT(0, 50, 100 및 200 pmol)와 함께 CXCR4 Cas9 RNP로 처리된 세포에서 계산되었고, 수치 결과는 아가로스 젤 이미지 아래에 표시된다.
도 3. FOXP3의 유전체 편집은 인간 Treg 사이토카인 수용체 수준을 불안정화시킨다. (A) 인간 FOXP3 유전자좌 내의 코딩 서열을 편집하기 위해 설계된 2개의 sgRNA 표적(청색) 및 PAM 서열(녹색)의 개략적 표현(각각 SEQ ID NOS:67-70). (B) T7E1 검정은 FOXP3 유전자좌 내의 2개의 표적에서의 유전체 편집을 확인하며, 예상 PCR 생성물 크기(900 뉴클레오티드; nt) 및 대략적인 예상 T7E1 단편 크기가 표시된다. (C) 대조군(sgRNA가 없는 Cas9 단백질 및 아이소형 염색 대조군)에 비한 FOXP3 Cas9 RNP 처리 세포에서 흐름세포측정법에 의해 평가된 세포내 FOXP3 수준의 히스토그램. (D) 대조군(sgRNA가 없는 Cas9 단백질 및 염색되지 않은 대조군)에 비한 FOXP3 Cas9 RNP 처리 세포에서 흐름세포측정법에 의해 평가된 CD127(IL7Rα) 세포 표면 염색의 히스토그램.
도 4. FOXP3를 표적으로 하는 Cas9 RNP는 인간 유도 Treg 분화를 손상시킨다. (A) 나이브 CD4⁺ T 세포는 생체외 자극 2일 후에 Cas9 RNP로 전기천공되었다. Cas9 RNP 처리 후, 세포는 IL-2 및 TGF-β와 함께 iTreg 발생 조건에서 배양되었다. FOXP3 Cas9 RNP는 FOXP3⁺ iTreg 생성을 감소시켰고, 전염증성 사이토카인인 IFNγ를 분비하는 세포의 백분율을 증가시켰다(흐름세포측정법에 의해 평가됨). (B) FOXP3 Cas9 RNP 또는 대조군 RNP를 갖는 FOXP3⁺ 및 IFNγ 분비 세포의 양은 3회의 실험으로부터 계산되었다(오차 막대는 표준 편차를 나타내고; 대조군 세포에 비한 유의한 차이가 표시된다: * p<0.05, ** p<0.01). 삽입물은 FOXP3⁺IFNg⁺의 백분율을 확대하여 제시한다. (C) FOXP3 Cas9 RNP는 FOXP3⁺CTLA-4⁺ iTreg 생성을 감소시켰다(FACS에 의해 평가됨). FOXP3^- 집단에서의 CTLA-4⁺ 발현은 덜 영향을 받았고, 이는 CTLA-4 발현에 모두 기여하는 FOXP3-의존성 및 FOXP3-독립적 메커니즘과 일치한다.
도 5는 일차 인간 효과기 T 세포(CD4⁺CD25^loCD127^hi)에서의 PD-1 인코딩 유전체 영역의 성공적인 편집을 예시한다.
도 6은 세포 및 Cas9 RNP를 함유하는 반응 혼합물이 세포의 직경보다 작은 세포 변형 수축을 통해 강제로 주입되는 세포 압착 장치를 이용한 자극되지 않은 효과기 CD4⁺ T 세포로의 Cas9 RNP 전달의 결과를 예시한다. 강제 주입은 세포의 세포막에 일시적 포어를 도입시키고, 이는 Cas9 RNP가 일시적 포어를 통해 세포로 진입하도록 한다. 세포는 퍼시픽 블루(Pacific Blue)(PB)-표지된 덱스트란(3 kD) 및 FITC-표지된 덱스트란(500 kD)의 흡수를 기초로 하여 분류되었다. T7 엔도뉴클레아제 1 검정은 둘 모두의 덱스트란을 흡수한 세포에서 편집의 풍부화를 확인하였다.
도 7은 일차 인간 CD4⁺ T 세포에서의 CXCR4 의 효율적인 편집을 예시한다. (A) 유전체 편집 후 유전적 및 표현형 특성규명을 위한 일차 인간 CD4⁺ T 세포로의 Cas9:단일-가이드 RNA 리보핵산단백질(Cas9 RNP) 전달의 실험적 개략도. (B) 인간 CXCR4 유전자좌의 코딩 서열을 편집하기 위해 설계된 단일-가이드 RNA(sgRNA) 표적 및 PAM 서열의 개략적 표현(SEQ ID NOS:76 및 32). (C) FACS 플롯은 대조군 처리된 세포(sgRNA가 없는 Cas9, CTRL; 최종 농도: 1.8 μM)에 비해 더 높은 농도의 CXCR4 Cas9 RNP(Cas9 RNP ^lo: 0.9 μM; Cas9 RNP ^hi: 1.8 μM)와 함께 낮은 CXCR4 발현(CXCR4^lo)을 갖는 세포의 증가하는 백분율을 제시한다. (D) T7 엔도뉴클레아제 I(T7E1) 검정은 CXCR4 유전자좌에서의 유전체 편집을 나타내며, CXCR4^hi 세포보다 FACS-분류된 CXCR4^lo 세포에서 더 많은 편집이 관찰된다. 예상 PCR 생성물 크기(938개의 뉴클레오티드; nt) 및 T7E1 절단된 단편의 대략적인 예상 크기가 표시된다. 전체 편집 빈도는 아가로스 젤 이미지 아래에 전체 편집 %로 표시된다. (E) 분류된 Cas9 RNP(1.8 μM) 처리 CXCR4^hi(각각 SEQ ID NOS:78-87) 및 CXCR4^lo 세포(각각 SEQ ID NOS:89-94)에서 CXCR4 유전자좌의 클로닝 및 생거 시퀀싱에 의해 검출된 돌연변이 패턴이 CXCR4^lo 대조군 처리 세포(CTRL)(각각 SEQ ID NOS:96-104)로부터의 서열과 비교된다. 참조(REF) 서열은 각각의 집단으로부터의 클론 서열의 상단에 제시되며, sgRNA 표적(청색) 및 PAM(녹색) 서열이 표시된다(SEQ ID NO:77 - Cas9 RNP 처리된 CXCR4^hi; SEQ ID NO:88 - Cas9 RNP 처리된 CXCR4^lo; SEQ ID NO:95 - CXCR4^lo 대조군). 적색 점선은 결실된 염기를 나타내고, 적색 서열은 돌연변이된 뉴클레오티드를 나타낸다. 화살촉은 예상 Cas9 절단 부위를 나타낸다. 3개의 추가 CXCR4^lo 클론으로부터 획득된 불량한 품질의 서열은 서열 정렬로부터 제거되었다.
도 8: 효율적인 상동성-지시형 복구는 일차 인간 T 세포에서 표적화된 DNA 대체를 가능하게 한다. (A) PAM 서열을 포함하는 12 nt를 대체하고, Cas9 RNP가 절단하는 CXCR4 유전자좌(SEQ ID NOS:31-32)에서 새로운 HindIII 제한 효소 절단 부위(SEQ ID NO:66)를 도입하도록 설계된 90 nt 상동성 아암을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 HDR 주형의 개략적 표현. sgRNA 표적 및 PAM 서열이 표시된다. (B) 다양한 농도의 단일 가닥 HDR 주형의 존재하에서 CXCR4 Cas9 RNP-처리된 세포에서 흐름세포측정법에 의해 평가된 CXCR4 세포 표면 염색의 히스토그램(대조군 Cas9 단백질 처리 세포 및 염색되지 않은 세포와 비교). (C) FACS 플롯(패널 B의 히스토그램에 해당)은 Cas9 RNP 처리 및 100 pmol의 HDR 주형에 의한 CXCR4의 최대 절제를 제시한다. (D) 전체 편집(Cas9 절단 부위에서 삽입결실을 발생시키는 모든 NHEJ 및 HDR 사건의 합계로 정의됨) 백분율%를 평가하기 위해 T7E1 검정이 이용된 반면, HDR 빈도는 새로이 통합된 HindIII 부위를 특이적으로 절단하는 HindIII 절단에 의해 결정되었고, DNA 생성물 대 DNA 기질의 비로 계산되었다. 예상 PCR 생성물 크기(938 nt) 및 대략적인 예상 T7E1 및 HindIII 절단 단편이 표시된다.
도 9: PD-1 및 CXCR4 표면 발현 수준에 대한 '표적내' 및 대조군 HDR 주형의 효과. (A) CXCR4 발현에 대한 효과가 동일한 뉴클레오티드 조성을 갖는 2개의 상이한 HDR 주형에 대해 시험되었다. CXCR4 Cas9 RNP로 모두 처리된 세포에서, CXCR4 HDR 주형(5-8열)이 HindIII 제한 부위를 포함하고(1-4열), HDR 주형 처리가 없는(9-12열) 무작위 순서의 본래의 CXCR4 HDR과 동일한 뉴클레오티드로 구성된 대조군 HDR 주형과 비교되었다. 추가 대조군은 Cas9 CTRL(HDR 주형이 없는 Cas9; 최종 2개의 열) 및 100 pmol CXCR4 HDR 주형과 스크램블된 가이드 Cas9 RNP(13 및 14열)(인간 유전체 내 예측 절단이 없음)이다. 히스토그램은 2개의 상이한 혈액 공여자에서 시험된 2개의 상이하게 시험관내 전사된 CXCR4 sgRNA(2개의 상이한 정제 방법, 실시예 4의 재료 및 방법 섹션 참조)를 이용한 4개의 실험의 결과를 제시한다. 도 12에서와 같이, 각각의 혈액 공여자에 대해, 페놀/클로로포름 추출된 sgRNA로 수행된 실험이 상단에 제시되고, PAGE 정제된 sgRNA를 이용한 시험이 하단에 제시되며; 스크램블된 가이드는 둘 모두의 실험에 대해 페놀/클로로포름 추출로 제조되었다. (B) 각각의 Cas9 RNP 및 표적내 또는 표적외 HDR 주형을 이용한 편집 후의 PD-1(좌측 패널) 및 CXCR4(우측 패널) 표면 발현 수준. 표적화된 세포는 표시된 바와 같이 Cas9 CTRL(진한 회색) 또는 스크램블된 가이드 Cas9 RNP로 처리된 세포와 비교되었다.
도 10: 딥-시퀀싱에 의한 Cas9 RNP-매개 편집 및 HDR의 정량 분석. (A) 도 8의 실험으로부터의 CXCR4 Cas9 RNP-매개 삽입결실 및 HDR은 CXCR4 유전자좌의 표적화된 딥 시퀀싱에 의해 분석되었다. 예측 절단 부위를 중심으로 하여 전체 100 nt가 sgRNA 표적, PAM, 및 HDR 유전체 표적화 후의 예측 서열과 함께 제시된다(CTRL (SEQ ID NO:105); RNP (SEQ ID NO:106); RNP + HDR (SEQ ID NO:107). 각각의 위치에서, 참조 유전체 또는 HDR 주형-유래 서열과 정확하게 정렬된 판독 분획이 제시된다. 드물지만(~1-2%), Cas9 RNP의 미량의 실험적 오염을 잠재적으로 나타내는 예측 CXCR4 절단 부위를 포함하여 Cas9 단독 대조군 처리로 편집이 검출되었다. (B) 막대 그래프는 CXCR4 부위 및 2개의 예측된 표적외 부위에서 50 pmol 또는 100 pmol CXCR4 HDR 주형을 이용한 Cas9 CTRL, CXCR4 Cas9 RNP 및 CXCR4 Cas9 RNP 세포에서의 결실, 삽입, 또는 성공적인 HDR 표적화로 편집된 판독 분획을 요약한다. 결실 및 삽입을 갖는 분획을 계산하기 위해 통합된 HDR 주형-유래 서열을 갖는 판독을 제거하였다. 분산 플롯은 유전체 위치확인(예상 Cas9 절단면 주위의 +/- 100 nt; 염색체 2:136873140-136873340) 및 (C) 결실 및 (D) 삽입의 길이를 제시한다. 상단 패널은 CXCR4 RNP 처리된 세포에 대한 결실/삽입을 제시하고; 중간은 CXCR4 RNP 및 CXCR4 HDR 주형으로 처리된 세포에 통합된 HDR 주형 서열이 없는 판독에서의 결실/삽입을 제시하며; 하단 패널은 통합된 HDR 주형-유래 서열을 갖는 판독에서의 결실/삽입을 제시한다. 화살촉은 예상 Cas9 절단 부위의 대략적인 위치를 나타낸다.
도 11: 예상 CXCR4 절단 부위 근처에서의 삽입 및 결실 길이의 분포. 히스토그램은 예측 절단 부위의 +/- 20 nt 내의 다양한 크기의 결실(회색 막대) 및 삽입(흑색 막대)을 함유하는 판독의 퍼센트를 제시한다. 상단은 CXCR4 RNP 처리된 세포에 대한 삽입 및 결실을 제시한다. 중간은 CXCR4 RNP 및 CXCR4 HDR 주형으로 처리된 세포에 통합된 HDR 주형-유래 서열이 없는 판독에서의 삽입 및 결실을 제시한다(하단). CXCR4 RNP 및 CXCR4 HDR 주형으로 처리된 세포에서 HDR 주형-유래 서열이 통합되지 않은 판독에서의 삽입 및 결실.
도 12: 도 4. Cas9 RNP는 PD-1 또는 CXCR4의 넉인(knock-in) 편집을 위해 프로그램화될 수 있다. (A) 12 nt를 PAM 서열을 대체하기 위해 신규한 HindIII 제한 효소 절단 부위를 도입시키는 11 nt로 대체하도록 설계된 90 nt 상동성 아암을 갖는 단일 가닥 PD-1 HDR 주형의 개략적 표현(SEQ ID NO:110). sgRNA 표적 및 PAM 서열이 표시된다(SEQ ID NOS:108-109). (B) 흐름세포측정법에 의해 평가된 PD-1 세포 표면 발현 수준의 히스토그램. 모든 세포는 100 pmol의 PD-1 HDR 주형으로 처리되었다. PD-1 Cas9 RNP-처리된 세포는 청색으로 제시되고, CXCR4 Cas9 RNP-처리된 세포는 밝은 회색으로 제시되며, 스크램블된 가이드(인간 유전체 내에 예측 절단이 없음) Cas9 RNP-처리된 세포는 어두운 회색으로 제시된다. (C) 흐름세포측정법에 의해 평가된 CXCR4 세포 표면 발현 수준의 히스토그램. 모든 세포는 100 pmol의 CXCR4 HDR 주형으로 처리되었다. CXCR4 Cas9 RNP-처리된 세포는 처음 4개의 열에 제시되고, PD-1 Cas9 RNP-처리된 세포는 다음 4개의 열에 제시되며, 스크램블된 가이드 Cas9 RNP-처리된 세포는 마지막 2개의 열에 제시된다. 패널 B 및 C는 2개의 상이한 혈액 공여자에서 시험된 2개의 상이하게 시험관내 전사되고 정제된 CXCR4 및 PD-1 sgRNA(실시예 4의 보충 정보의 재료 및 방법 섹션 참조)를 이용한 4개 실험의 결과를 제시한다. 각각의 혈액 공여자에 대해, 페놀/클로로포름 추출된 sgRNA로 수행된 실험이 상단에 제시되고, PAGE 정제된 sgRNA를 이용한 실험이 하단에 제시되며; 스크램블된 가이드는 둘 모두의 실험에 대해 페놀/클로로포름 추출로 제조되었다. 점선은 각각 PD-1 고 발현 또는 CXCR4 고 발현 세포 상에서의 게이팅(gating)을 나타낸다. PD-1 고 발현 세포의 백분율은 CXCR4 Cas9 RNP 처리(p < 0.001) 또는 스크램블된 가이드 Cas9 RNP 처리(p < 0.001)에 비해 PD-1 Cas9 RNP 처리에서 유의하게 낮았다. CXCR4 고 발현 세포의 백분율은 PD-1 Cas9 RNP 처리(p < 0.001) 또는 스크램블된 가이드 Cas9 RNP 처리(p < 0.001)에 비해 CXCR4 Cas9 RNP 처리에서 유의하게 낮았다(피어슨 카이-제곱(Pearson's chi-squared)). (D) 유전체 편집은 T7E1 검정에 의해 분석된 반면, HDR은 새로이 통합된 HindIII 부위를 특이적으로 절단하는 HindIII 절단에 의해 검출되었으며; 둘 모두의 검정에 대한 절단 생성물은 화살촉으로 표시된다. 다양한 HDR 주형의 농도는 아가로스 젤 위에 표시된다. CTRL HDR 주형은 HindIII 제한 부위를 포함하는 본래의 CXCR4 HDR 주형의 스크램블된 형태를 나타낸다. 불명확한 유의성의 비특이적인 제2 젤 밴드가 모든 조건하에서 PD-1 앰플리콘의 T7E1에서 인지되었다. 전체 편집 및 HDR 빈도가 계산되었고, 아가로스 젤 이미지 아래에 제시된다.

I. 서문

핵산, 단백질, 및 단백질과 핵산의 복합체의 일차 세포, 예를 들어, 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포로의 전달은 낮은 효율에 의해 제한될 수 있다. 일차 세포 또는 일차 줄기 세포로의 Cas9 단백질 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 놀라운 고효율 전달을 달성하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 기재된다. Cas9 또는 이의 리보핵산단백질 복합체의 상기 고효율 전달은 유전체 편집, 염색질 변형, 유전자 조절, 세포 분화, 및 세포 활성의 조절의 개선된 방법을 가능하게 할 수 있다. 일부 구체예에서, Cas9 또는 이의 리보핵산단백질 복합체의 고효율 전달은 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포에서 수행된다.

Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질의 일차 조혈 세포로의 고효율 전달은, 예를 들어, 면역 세포, 예를 들어, T 세포의 유전체 편집, 염색질 변형, 유전자 조절, 세포 분화, 및 활성의 조절을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 유전체 편집 시약, 염색질 변형 시약, 또는 하나 이상의 유전자의 발현을 조절하기 위한 제제가 T 세포로 전달될 수 있다. 또 다른 예로서, T 세포 활성, 분화, 또는 탈분화를 조절하는 시약이 T 세포로 전달될 수 있다. 상기 방법은 암, 감염성 질병, 또는 자가면역 질병을 치료하거나 예방하기 위해 이용될 수 있다.

일부 경우에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 재조합 T 세포, 예를 들어, 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR T 세포)의 생성, 변형, 사용 또는 조절을 위해 이용될 수 있다. 상기 CAR T 세포는 암, 감염성 질병, 또는 자가면역 질병을 치료하거나 예방하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 하나 이상의 유전자 생성물은 이종성 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR))을 발현하도록 변형된 세포에서 넉인(knocked-in)되거나 넉아웃(knocked out)된다. 넉아웃시키기 위한 예시적 유전자 생성물은, 예를 들어, PD-1을 포함할 수 있다. CAR은 이용 가능한 임의의 방법, 예를 들어, 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스) 발현에 의해 도입될 수 있다. CAR 벡터는 세포의 유전체가 유전자 생성물을 넉인시키거나 넉아웃시키도록 편집되기 전, 편집되는 동안, 또는 편집된 후에 세포로 도입될 수 있다.

I. 방법

일차 세포로의 Cas9 단백질의 전달을 위한 방법은 Cas9 뉴클레아제 도메인을 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계 및 세포 내로 Cas9 뉴클레아제 도메인을 도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 방법은 Cas9 리보핵산단백질 복합체 및 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계 및 b) 세포 내로 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, Cas9 리보핵산단백질 복합체는 Cas9 뉴클레아제 도메인 및 가이드 RNA(예를 들어, 작은 가이드 RNA)를 포함한다. 가이드 RNA는 세포의 유전체의 표적 부위에 특이적으로 하이브리드화되도록 구성될 수 있다.

일부 경우에서, 복수의 구조적으로 상이한 리보핵산단백질 복합체가 세포로 도입된다. 예를 들어, Cas9 단백질은 복수의 구조적으로 상이한 표적 유전체 영역을 표적화하기 위해 복수(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상, 예를 들어, 2-10개, 5-100개, 20-100개)의 구조적으로 상이한 가이드 RNA와 복합체화될 수 있다. 또 다른 예로서, 복수의 구조적으로 상이한 Cas9 단백질(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)이 가이드 RNA, 또는 복수의 상이한 효과기 기능을 세포에 도입시키기 위해 복수의 구조적으로 상이한 가이드 RNA와 복합체화될 수 있다. 일부 경우에서, Cas9 리보핵산단백질 복합체는 별개로 형성되어, 선택된 Cas9 효과기 기능(예를 들어, 유전체 편집, 전사 조절 등)이 선택된 가이드 RNA와 커플링될 수 있고, 이에 따라 선택된 표적 유전체 영역에 대해 표적화될 수 있다. 일단 형성되면, 복수의 구조적으로 상이한 Cas9 리보핵산단백질은 세포를 함유하는 반응 혼합물 내에 제공될 수 있으며, 본원에 기재된 바와 같이 세포 내로 도입될 수 있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 99.5%, 99%, 또는 그 초과의 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 전달 효율을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 약 20% 내지 약 99%, 약 30% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 85% 또는 90% 또는 그 초과, 약 40% 내지 약 85% 또는 90% 또는 그 초과, 약 50% 내지 약 85% 또는 90% 또는 그 초과, 약 50% 내지 약 85% 또는 90% 또는 그 초과, 약 60% 내지 약 85% 또는 90% 또는 그 초과, 또는 약 70% 내지 약 85% 또는 90% 또는 그 초과의 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 전달 효율을 제공한다. 일부 경우에서, 효율은 세포 내로 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질을 도입시킨 후에 살아 있는 세포와 관련하여 결정된다. 일부 경우에서, 효율은 세포 내로 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질을 도입시키는 세포의 전체수(살아 있거나 살아있지 않음)와 관련하여 결정된다.

전달 효율을 결정하기 위한 방법은 Cas9, 가이드 RNA, 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체에 융합되거나 이들에 달리 부착된 검출 가능한 표지의 검출 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, Cas9 또는 가이드 RNA는 형광 표지에 융합될 수 있으며, 상기 형광 표지의 세포로의 내재화는 당 분야에 공지된 수단에 의해 검출될 수 있다. 또 다른 예로서, 가이드 RNA는 세포를 용해시키고, 가이드 RNA를 증폭시키고, 증폭된 가이드 RNA를 검출함으로써 검출될 수 있다. 일부 경우에서, 증폭은 가이드 cDNA를 생성시키기 위한 역전사 단계를 포함하며, 가이드 cDNA는 증폭되고 검출된다.

또 다른 예로서, 전달 효율은 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 다운스트림 효과를 검출함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 전달은 세포 집단에서 유전체 편집된 세포 또는 유전체 편집된 대립유전자의 수를 정량(도입 단계 후에 획득된 전체 세포/대립유전자 또는 전체 살아 있는 세포와 비교함)함으로써 평가될 수 있다. 유전체 편집을 정량하기 위한 다양한 방법이 이용될 수 있다. 이들 방법은 미스매치-특이적 뉴클레아제, 예를 들어, T7 엔도뉴클레아제 I의 이용; 하나 이상의 표적 유전자좌의 시퀀싱(예를 들어, 클로닝된 표적 유전자좌 증폭 단편의 생거 시퀀싱에 의함); 분해에 의한 삽입결실의 추적(TIDE); 및 고 처리량 딥 시퀀싱(deep sequencing)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

T7 엔도뉴클레아제 I 검정에서, 편집된 세포의 분획을 함유하는 복수의 세포가 수거되고, 유전체 DNA가 추출되고, 표적 유전체 영역이 증폭되고, 앰플리콘이 하이브리드화된다. 편집된 유전체 DNA 앰플리콘은 야생형 DNA 앰플리콘과 미스매치된 하이브리드 구조를 형성할 것이다. DNA는 하나 이상의 미스매치된 염기쌍을 함유하는 이중 가닥 DNA를 분해하는 미스매치 특이적 뉴클레아제로 분해된다. 분해의 정도는 편집 효율을 결정하기 위해 검정될 수 있다. 편집 효율의 정량화를 위한 대안적 접근법은 정량적 PCR 또는 디지털 PCR을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 편집된 세포의 수는 표적 유전체 영역으로의 결합에서의 다운스트림 비효율, 또는 표적 유전체 영역의 분해, 또는 편집 사건의 검출에서의 비효율로 인해 전달이 달성된 세포의 수보다 낮을 수 있다. 유사하게, 전달된 Cas9 단백질이 상기 활성을 제공하는 효과기 도메인과의 융합체인 경우 전사 조절 또는 염색질 변형을 나타내는 세포의 수는 전달이 달성된 세포의 수보다 낮을 수 있다. 따라서, 검출된 다운스트림 효과의 효율은 전달 효율의 하한으로 간주될 수 있다.

일부 경우에서, 본원에 기재된 방법은 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질이 세포 내로 도입된 세포의 높은 세포 생존력을 제공한다. 일부 경우에서, 높은 생존력은 짧은 존재기간을 갖는 제한된 수의 포어의 세포외 막에서의 형성에 의해 달성된다. 일부 경우에서, Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질이 세포 내로 도입된 세포의 생존력은 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 99.5%, 99%, 또는 그 초과이다. 일부 경우에서, Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질이 세포 내로 도입된 세포의 생존력은 약 20% 내지 약 99%, 약 30% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 85% 또는 90% 또는 그 초과, 약 40% 내지 약 85% 또는 90% 또는 그 초과, 약 50% 내지 약 85% 또는 90% 또는 그 초과, 약 50% 내지 약 85% 또는 90% 또는 그 초과, 약 60% 내지 약 85% 또는 90% 또는 그 초과, 또는 약 70% 내지 약 85% 또는 90% 또는 그 초과이다.

일부 경우에서, Cas9 단백질이 전달되는 세포는 Cas9을 인코딩하는 핵산을 달리 함유하지 않는다. 일부 경우에서, Cas9 단백질이 전달되는 세포는 전달된 Cas9 단백질과 구조적으로 동일한 Cas9 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하지 않는다. 이러한 경우, 전달 효율의 결정은 임의의 Cas9 단백질을 갖는 세포의 수가 아니라 구조적으로 다른 전달된 Cas9 단백질이 도입된 세포의 수에 관한 것일 수 있다. 일부 경우에서, Cas9이 전달되는 세포는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 함유하지 않는다. 예를 들어, Cas9 리보핵산단백질 복합체 형태의 Cas9은 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA를 함유하지 않고/않거나, Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA를 함유하지 않고/않거나, 리보핵산단백질 복합체 내의 전달되는 Cas9 단백질과 구조적으로 동일한 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA를 함유하지 않는 세포로 도입될 수 있다.

A. Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질의 세포로의 도입

세포(예를 들어, 조혈 세포 또는 조혈 줄기 세포, 예를 들어, 인간으로부터의 상기 세포)로 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키기 위한 방법은 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 함유하는 반응 혼합물을 형성시키는 단계 및 세포의 세포외 막에서 일시적 구멍을 도입시키는 단계를 포함한다. 상기 일시적 구멍은 전기천공, 세포 압착(cell squeezing), 또는 나노와이어 또는 나노튜브와의 접촉을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 방법에 의해 도입될 수 있다. 일반적으로, 일시적 구멍은 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 존재하에서 도입되며, Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 세포 내로 확산시킨다.

Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키기 위해 세포를 전기천공하는 방법, 조성물 및 장치는 본원의 실시예에 기재된 것을 포함할 수 있다. Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키기 위해 세포를 전기천공하는 추가 또는 대안적 방법, 조성물 및 장치는 WO/2006/001614호 또는 문헌[Kim, J.A. et al. Biosens. Bioelectron. 23, 1353-1360 (2008)]에 기재된 것을 포함할 수 있다. Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키기 위해 세포를 전기천공하는 추가 또는 대안적 방법, 조성물 및 장치는 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0094095호; 2005/0064596호; 또는 2006/0087522호에 기재된 것을 포함할 수 있다. Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키기 위해 세포를 전기천공하는 추가 또는 대안적 방법, 조성물 및 장치는 문헌[Li, L.H. et al. Cancer Res. Treat. 1, 341-350 (2002)]; 미국 특허 번호 6,773,669호; 7,186,559호; 7,771,984호; 7,991,559호; 6485961호; 7029916호; 및 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0017213호; 및 2012/0088842호에 기재된 것을 포함할 수 있다. Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키기 위해 세포를 전기천공하는 추가 또는 대안적 방법, 조성물 및 장치는 문헌[Geng, T. et al.. J. Control Release 144, 91-100 (2010); 및 Wang, J., et al. Lab. Chip 10, 2057-2061 (2010)]에 기재된 것을 포함할 수 있다.

일부 경우에서, 본원에 인용된 특허 또는 간행물에 기재된 방법 또는 조성물은 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 전달을 위해 변형된다. 상기 변형은 전압, 펄스 길이 또는 펄스의 수를 증가시키거나 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 변형은 완충액, 배지, 전해질 용액 또는 이들의 성분의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 전기천공은 당 분야에 공지된 장치, 예를 들어, Bio-Rad Gene Pulser Electroporation 장치, Invitrogen Neon 트랜스펙션 시스템, MaxCyte 트랜스펙션 시스템, Lonza Nucleofection 장치, NEPA Gene NEPA21 트랜스펙션 장치, 펌프 및 정전압 전원을 함유하는 유량 통과(flow though) 전기천공 시스템, 또는 당 분야에 공지된 다른 전기천공 장치 또는 시스템을 이용하여 수행될 수 있다.

예시적 구체예에서, 전기천공은 캐쏘드와 애노드 사이에 긴 거리를 갖는 장치로 수행될 수 있다. 일부 경우에서, 캐쏘드와 애노드 사이의 거리는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45 mm이다. 일부 경우에서, 장치는 세포를 함유하는 반응 혼합물과 접촉하는 비교적 작은 표면적을 갖는 전극으로 구성된다. 일부 경우에서, 전극 중 적어도 하나의 표면적, 또는 반응 혼합물과 접촉하는 전극 중 적어도 하나의 표면적은 0.1 mm², 0.2 mm², 0.3 mm², 0.33 mm², 0.4 mm², 0.5 mm², 0.6 mm², 0.7 mm², 0.8 mm², 0.9 mm² 또는 1 mm², 또는 약 0.1 mm², 약 0.2 mm², 약 0.3 mm², 약 0.33 mm², 약 0.4 mm², 약 0.5 mm², 약 0.6 mm², 약 0.7 mm², 약 0.8 mm₂, 약 0.9 mm² 또는 약 1 mm²이다. 일부 경우에서, 캐쏘드와 애노드 사이의 거리와 전극 표면적의 비는 1/50 내지 1/1000이다. 일부 경우에서, 전기천공 챔버의 긴 축의 길이 대 전기천공 챔버의 단면적의 비는 50 내지 10,000이다. 일부 경우에서, 전기천공 장치는 세로 길이에 의해 분리된 제1 및 제2 원위 말단을 갖는 전기천공 챔버를 가지며, 제1 전극은 제1 원위 말단에 존재하고, 제2 전극을 함유하는 저장소는 제2 원위 말단과 유체 연통한다.

또 다른 예시적 구체예에서, 전기천공은 Lonza 4D Nucleofector™ 장치로 수행된다. 예를 들어, 전기천공은 Amaxa P3 일차 세포 96-웰 Nucleofector™ 키트 또는 P3 일차 세포 4D-Nucleofector X 키트 S로 수행될 수 있다. 일부 경우에서, 전기천공은 적합한 전기천공 완충액(예를 들어, 완충액 보충액을 갖는 Amaxa 완충액 P3)에 세포를 재현탁시키고, 세포를 전기천공 챔버에 배치하고, 세포를 전기천공함으로써 수행된다. 일부 경우에서, 활성화된 T 세포는 하기 프로그램 중 어느 하나를 이용하여 Nucleofector™ 장치로 전기천공될 수 있다: EH-115, CA-137, DS-150, CM-138, DS-120, CM-137, EH-100, CM-150, EO-100, DN-100, EN-138, DS-138, EN-150, DS-137, EW-113 또는 DS-130. 일부 경우에서, 활성화된 T 세포는 EH-115 프로그램을 이용하여 Nucleofector™ 장치로 전기천공될 수 있다. 일부 경우에서, 나이브 T 세포는 하기 프로그램 중 어느 하나를 이용하여 Nucleofector™ 장치로 전기천공될 수 있다: EH-100, DN-100, EO-100 EN-138, EW-113 또는 EN-150. 일부 경우에서, 나이브 T 세포는 EH-100 또는 DN-100 프로그램을 이용하여 Nucleofector™ 장치로 전기천공될 수 있다.

전기천공은 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 및 세포를 함유하는 반응 혼합물을 캐쏘드와 애노드 사이의 챔버로 배치하고, 캐소드와 애노드 사이에 전압 전위를 적용시킴으로써 수행될 수 있다. 전압 전위는 약 20 kV/m 내지 약 100 kV/m일 수 있다. 일부 경우에서, 전압 전위는 약 30 kV/m 내지 약 90 kV/m, 약 30 kV/m 내지 약 80 kV/m, 약 30 kV/m 내지 약 70 kV/m, 약 30 kV/m 내지 약 60 kV/m, 약 40 kV/m 내지 약 60 kV/m, 약 45 내지 약 55 또는 60 kV/m, 또는 약 50 내지 약 55 kV/m이다. 일부 경우에서, 전압 전위는 적어도 약 20 kV/m, 30 kV/m, 40 kV/m, 50 kV/m, 53 kV/m, 60 kV/m, 70 kV/m, 80 kV/m, 90 kV/m 또는 100 kV/m이다. 일부 경우에서, 전압 전위는 0.5, 0.75, 1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 또는 2.5 kV, 또는 약 0.5, 약 0.75, 약 1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4 또는 약 2.5 kV이다. 일부 경우에서, 전압 전위는 약 0.5 내지 약 2 kV, 약 0.75 내지 약 2 kV, 약 1 내지 약 2 kV, 약 1.1 내지 약 1.9 kV, 약 1.2 내지 약 1.8 kV, 약 1.3 내지 약 1.7 kV, 약 1.4 내지 약 1.7 kV, 또는 약 1.5 내지 약 1.7 kV이다.

전압 전위는 펄스 또는 연속적으로 적용될 수 있다. 연속 전압 적용을 위해, 반응 혼합물은 펌프 또는 다른 액체 취급 장치를 이용하여 전극 챔버를 통해 유동될 수 있다. 일부 경우에서, 반응 혼합물은 전극 챔버를 통해 한번 유동된다. 대안적으로, 반응 혼합물은 전극 챔버를 통해 재순환될 수 있다. 펄스 전압 적용을 위해, 펄스 길이, 펄스의 수 및 펄스 사이의 기간은 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 고효율 전달을 달성하도록 최적화될 수 있다.

전압 전위는 펄스로서 한번 또는 여러번 적용될 수 있다. 일부 경우에서, 전압 전위는 1 내지 10회, 1 내지 9회, 1 내지 8회, 1 내지 7회, 1 내지 6회, 1 내지 5회, 또는 1 내지 4회 펄스화된다. 일부 경우에서, 전압 전위는 2 내지 9회, 2 내지 8회, 2 내지 7회, 2 내지 6회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 펄스화된다. 일부 경우에서, 전압 전위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 펄스화된다.

전압 전위 펄스 길이는 1 내지 100 ms, 2 내지 90 ms, 3 내지 80 ms, 4 내지 70 ms, 5 내지 60 ms, 5 내지 50 ms, 5 내지 40 ms, 6 내지 30 ms, 7 내지 20 ms, 또는 8 내지 15 ms일 수 있다. 일부 경우에서, 펄스 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 ms, 또는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95 또는 약 100 ms이다.

일부 경우에서, 전압 펄스는 정의된 기간의 휴지 기간이 산재되어 있다. 일부 경우에서, 휴지 기간은 본원에 기재된 상기 펄스 길이 중 임의의 펄스 길이와 동일한 길이이다. 일부 경우에서, 휴지 기간은 펄스 길이보다 유의하게 더 길다. 예를 들어, 반응 혼합물은 전압 펄스에 적용될 수 있고, 1, 2, 5, 10, 15, 20 또는 30분 또는 그 보다 긴 기간 동안 회복될 수 있고, 전압 전위가 다시 적용될 수 있다. 일부 경우에서, 다중 전압 펄스에 대한 크기, 기간 또는 휴지 기간은 가변적이다. 예를 들어, 제1 펄스는 제2 펄스보다 높은 전압 전위 또는 더 긴 기간일 수 있거나, 그 반대일 수도 있다.

Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키기 위한 나노와이어 또는 나노튜브의 사용을 위한 방법, 조성물 및 장치는 문헌[Proc Natl Acad Sci U S A. Feb 2, 2010; 107(5): 1870-1875]; 미국 특허 출원 공개 번호 2012/0094382호; 및 2013/0260467호; 및 WO/2014/031173호에 기재된 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, Cas9 단백질 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체는 하나 이상의 나노와이어 또는 나노튜브 상에 코팅되고, 반응 혼합물 내에서 세포와 접촉된다. 나노와이어 또는 나노튜브는 세포막을 관통하여, Cas9 단백질 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 전달할 수 있다.

Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키기 위해 세포를 압착하거나 변형시키기 위한 방법, 조성물 및 장치는 본원에 기재된 것을 포함할 수 있다. 추가 또는 대안적 방법, 조성물 및 장치는 문헌[Nano Lett. 2012 Dec 12;12(12):6322-7; Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Feb 5;110(6):2082-7; J Vis Exp. 2013 Nov 7;(81):e50980; 및 Integr Biol (Camb). 2014 Apr;6(4):470-5]에 기재된 것을 포함할 수 있다. 추가 또는 대안적 방법, 조성물 및 장치는 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0287509호에 기재된 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, Cas9 단백질 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체는 세포를 함유하는 반응 혼합물에 제공되고, 반응 혼합물은 세포 변형 구멍 또는 압축을 통해 강제 주입된다. 일부 경우에서, 압축은 세포의 직경보다 작다. 일부 경우에서, 압축은 세포 변형 구성요소, 예를 들어, 강한 정전기 전하 영역, 소수성 영역, 또는 나노와이어 또는 나노튜브를 함유하는 영역을 함유한다. 강제 주입은 세포의 세포막에 일시적 포어를 도입시켜, Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체가 일시적 포어를 통해 세포로 진입할 수 있게 한다. 일부 경우에서, Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질을 도입시키기 위해 세포를 압축시키거나 변형시키는 것은 세포가 분열하지 않는 상태인 경우에도 효과적일 수 있다.

세포 내로 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키기 위한 방법은 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 함유하는 반응 혼합물을 형성시키는 단계 및 세포와 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 접촉시켜 수용체-매개 내재화를 유도하는 단계를 포함한다. 수용체 매개 내재화를 위한 조성물 및 방법은, 예를 들어, 문헌[Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 및 Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 수용체-매개 내재화는 세포 표면 수용체와 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체에 융합된(예를 들어, Cas9 리보핵산단백질 복합체 내의 가이드 RNA에 공유적으로 부착되거나 융합됨) 리간드 사이의 상호작용에 의해 매개된다. 리간드는 세포의 표면 상의 수용체에 결합하거나 이에 의해 인지되는 임의의 단백질, 소분자, 중합체, 또는 이들의 단편일 수 있다. 예시적 리간드는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)이다.

예를 들어, Cas9 단백질은 Cas9 뉴클레아제 도메인과 항-CD3 scFv 사이의 융합체일 수 있다. scFv는 T 세포 상에서 발현되는 T 세포 공동-수용체 CD3에 결합할 수 있고, Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 수용체-매개 내재화를 유도할 수 있다. 다른 적합한 수용체 표적은 표적 세포 상의 임의의 세포 표면 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에서, 적합한 수용체 표적은 표적 세포의 표면에서 발현되는 이종성 수용체(예를 들어, 표적 세포로의 재조합 핵산의 도입에 의해 생성되는 수용체)이다. T 세포로의 전달의 경우에서, 수용체는 T 세포의 표면 상의 임의의 세포 표면 단백질, 예를 들어, CD28, CTLA-4, PD-1, 인테그린, 렉틴 수용체, 사이토카인 수용체, 또는 케모카인 수용체일 수 있다. 기타 면역 세포, 예를 들어, 대식세포, 수지상 세포, 단핵구 등으로의 전달의 경우에서, 수용체는 표적 대식세포, 수지상 세포, 단핵구 등의 표면 상의 세포 표면 단백질일 수 있다.

일부 경우에서, 융합체는 절단 가능한 융합체이다. 일부 경우에서, 융합체는 세포 표면에서 절단되거나, 수용체 매개 내재화시 절단되는 절단 가능한 융합체이다. 예를 들어, 융합체는 리간드와 Cas9 단백질 사이에 링커를 함유할 수 있으며, 상기 링커는 세포내 또는 막 결합된 프로테아제에 대한 하나 이상의 절단 부위를 함유하는 펩티드이다. 또 다른 예로서, 융합체는 에스테르 결합을 함유할 수 있으며, 상기 결합은 하나 이상의 막 결합된 에스테라제 또는 세포내 에스테라제의 존재하에서 불안정하다.

일부 경우에서, Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체는 시험관 내에서 수용체-매개 내재화를 위한 리간드에 컨쥬게이션된다. 단백질 또는 핵산에 소분자, 펩티드 및 중합체 리간드를 컨쥬게이션시키기 위한 다양한 시험관내 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Cas9 뉴클레아제는 C-말단에서 소르타제(sortase) 인지 부위(예를 들어, LPXTG)에 융합될 수 있으며, 리간드는 자유 N-말단을 갖는 올리고-글리신 모티프를 함유할 수 있다. Cas9-리간드 혼합물 또는 Cas9 리보핵산단백질 및 리간드 혼합물로의 소르타제의 첨가시, Cas9 단백질 및 리간드는 천연 펩티드 결합을 통해 공유적으로 연결된다.

일부 구체예에서, Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체는 세포 침투 펩티드로 세포 내에 도입된다. 일부 경우에서, 세포 침투 펩티드는 수용체-매개 내재화를 유도한다. 다른 경우에서, 세포 침투 펩티드는 세포막을 침투한다. 일부 경우에서, 세포 침투 펩티드는 세포 진입을 위한 일시적인 역전된 마이셀(micelle) 구조를 형성한다. 하나 이상의 세포 침투 펩티드, 또는 하나 이상의 카피의 세포 침투 펩티드, 또는 이들의 조합은 Cas9, Cas9 리보핵산단백질 복합체, 또는 가이드 RNA에 융합될 수 있다.

예시적인 세포 침투 펩티드는 HIV TAT, TAT2-M1, MPG, PEP-1, 페네트라틴(penetratin), 트랜스포르탄(transportan), 폴리-아르기닌, CADY, 또는 이들의 유도체, 유사체, 및 돌연변이체를 포함할 수 있다. 예시적인 세포 침투 펩티드는 미국 특허 번호 8575305호; 8772449호; 8389481호; 8691528호; 8372951호; 또는 8614194호에 기재된 것을 추가로 포함할 수 있다. Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질을 전달하기 위해 문헌[Nature Methods, 4 (2). pp. 153-159 (2007)]에 기재된 것과 같은 세포 침투 펩티드의 소분자 모방체가 또한 본원에 기재된 방법에서 이용될 수 있다.

세포(예를 들어, T 세포)는 본원에 기재된 Cas9 또는 Cas9 RNP 도입 방법 중 하나(예를 들어, 전기천공) 전에 자극될 수 있거나(예를 들어, 가용성 또는 고체 표면 고정된 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 또는 이들의 조합물과의 접촉에 의함), 자극되지 않을 수 있다. 일부 경우에서, 세포(예를 들어, T 세포)는 본원에 기재된 Cas9 또는 Cas9 RNP 도입 방법 중 하나(예를 들어, 전기천공) 후에 자극될 수 있거나(예를 들어, 가용성 또는 고체 표면 고정된 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 또는 이들의 조합물과의 접촉에 의함), 자극 없이 인큐베이션될 수 있다. 일부 경우에서, 적절한 사이토카인(예를 들어, IL-2)은 Cas9 또는 Cas9 RNP 도입 시약(예를 들어, 전기천공 완충액)과의 혼합 전에 세포와 접촉될 수 있거나, Cas9 또는 Cas9 RNP 도입 후에 세포와 접촉될 수 있거나, 이들의 조합일 수 있다.

B. Cas9

아포 단백질이거나 RNA와의 복합체이건 간에 전달된 Cas9 단백질은 활성 엔도뉴클레아제 형태로 존재할 수 있어, 가이드 RNA와의 복합체의 일부로서 표적 핵산에 결합되는 경우, 이중 가닥 절단이 표적 핵산 내에 도입된다. 이중 가닥 절단은 NHEJ에 의해 복구되어 무작위 돌연변이가 도입될 수 있거나, HDR에 의해 복구되어 특정 돌연변이가 도입될 수 있다. 다양한 Cas9 뉴클레아제가 본원에 기재된 방법에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA에 의해 표적화되는 영역의 바로 3'에 NGG 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 필요로 하는 Cas9 뉴클레아제가 이용될 수 있다. 이러한 Cas9 뉴클레아제는 NGG 서열을 함유하는 유전체의 임의의 영역으로 표적화될 수 있다. 또 다른 예로서, 직교 PAM 모티프 요구조건을 갖는 Cas9 단백질이 인접한 NGG PAM 서열을 갖지 않는 서열을 표적화하는데 이용될 수 있다. 직교 PAM 서열 특이성을 갖는 예시적 Cas9 단백질은 CFP1, 문헌[Nature Methods 10, 1116-1121 (2013)]에 기재된 것, 및 문헌[Zetsche et al., Cell, Volume 163, Issue 3, p759-771, 22 October 2015]에 기재된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

일부 경우에서, Cas9 단백질은 닉카제여서, 가이드 RNA와의 복합체의 일부로서 표적 핵산에 결합하는 경우, 단일 가닥 절단 또는 닉(nick)이 표적 핵산 내로 도입된다. 구조적으로 상이한 가이드 RNA에 각각 결합된 한 쌍의 Cas9 닉카제는 표적 유전체 영역의 2개의 근위 부위로 표적화될 수 있으며, 이에 따라 표적 유전체 영역으로 한 쌍의 근위 단일 가닥 절단을 도입할 수 있다. 닉카제 쌍은 표적외 효과가 염기-절제 복구 메커니즘에 의해 일반적으로 병변 없이 복구되는 단일 닉을 발생시킬 수 있으므로 향상된 특이성을 제공할 수 있다. 예시적 Cas9 닉카제는 D10A 또는 H840A 돌연변이를 갖는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다.

일부 경우에서, Cas9 단백질은 뉴클레아제 비활성 형태로 존재한다. 예를 들어, Cas9 단백질은 또 다른 부속 단백질 또는 효과기 도메인에 융합되는 뉴클레아제 비활성 형태로 존재할 수 있다. 따라서, 가이드 RNA와의 복합체 형태의 Cas9 뉴클레아제는 부속 단백질, 효과기 도메인 또는 이들의 활성을 표적 유전체 영역으로 표적화시키는 기능을 할 수 있다. 일부 경우에서, 뉴클레아제 비활성 Cas9 단백질은 엔도뉴클레아제 또는 닉카제에 융합된다. 예를 들어, 뉴클레아제 비활성 Cas9은 절대 이종이합체 엔도뉴클레아제 또는 닉카제(예를 들어, Fok I 엔도뉴클레아제의 절대 이종이합체)에 융합될 수 있다. 절대 이종이합체 뉴클레아제의 해당 구성원에 융합된 한 쌍의 상기 뉴클레아제 비활성 엔도뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 활성을 표적 유전체 영역에 향상된 특이성으로 국소화시키기 위해 이용될 수 있다. 예시적 Cas9 이종이합체 엔도뉴클레아제 융합체는 문헌[Nat Biotechnol. Jun 2014; 32(6): 577-582]에 기재된 것을 포함한다.

일부 경우에서, 유전자 발현을 조절하거나, 염색질 구조를 변형시키기 위해 Cas9 단백질, 예를 들어, 뉴클레아제 비활성 Cas9 단백질이 이용될 수 있다. 일부 경우에서, 뉴클레아제 비활성 Cas9 단백질은 유전자 또는 유전자의 프로모터로 표적화되는 가이드 RNA와 복합체를 형성할 수 있다. 이에 의해, 뉴클레아제 비활성 Cas9 단백질은 전사 인자 또는 다른 전사 기구의 결합을 방해하고, 이에 의해 표적 유전자의 전사를 하향 조절할 수 있다. 동일한 유전자 또는 프로모터 영역 또는 이들의 조합을 표적으로 하는 다수의 구조적으로 상이한 가이드 RNA의 이용은 표적 유전자의 전사를 추가로 감소시키기 위해 이용될 수 있다.

또 다른 예로서, Cas9 단백질, 예를 들어, 뉴클레아제 비활성 Cas9 단백질은 표적 유전자의 전사를 조절하기 위해 전사 활성인자 또는 억제인자에 융합될 수 있다. 예시적 활성인자는 하나 이상의 카피의 VP8, VP16, VP64, 또는 p65 활성화 도메인(p65AD)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적 억제인자는 KRAB 도메인, 크로모섀도우(chromoshadow) 도메인, SID 도메인, 또는 EAR-억제 도메인(SRDX)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 전사 활성인자 또는 억제인자는 숙주 세포에서의 효율적인 활성 또는 향상된 안정성을 위해 최적화될 수 있다.

일부 경우에서, Cas9 뉴클레아제, 예를 들어, 뉴클레아제 비활성 Cas9 뉴클레아제는 DNA 메틸화, 히스톤 메틸화 또는 탈메틸화, 히스톤 탈아세틸화, RNA polII 인산화를 조절하거나, 감소된 DNAse I 과민성 또는 감소된 미세구균 뉴클레아제 접근성에 의해 측정되는 바와 같이 뉴클레오솜 압축의 증가를 촉진하는 하나 이상의 효과기 도메인에 융합될 수 있다. 전사를 촉진할 수 있는 활성화 효과기 도메인 또는 효소의 조합은 DNA 탈메틸효소, 히스톤 탈메틸효소 또는 메틸라제, 히스톤 아세틸라제, RNA polII 인산화효소, 또는 증가된 DNAse I 과민성 또는 증가된 미세구균 뉴클레아제 접근성에 의해 측정되는 바와 같이 뉴클레오솜 압축을 감소시키거나, 원위 인핸서 요소와 근위 프로모터 요소 사이의 천연 또는 비-천연 염색체 루핑(looping)을 촉진하는 효소 또는 효과기 도메인을 포함할 수 있다. 전사를 억제할 수 있는 억제인자 효과기 도메인 또는 효소의 조합은 DNA 메틸라제, 히스톤 탈메틸효소 또는 메틸라제, 히스톤 탈아세틸화효소, RNA polII 탈인산화효소, 또는 감소된 DNAse I 과민성 또는 감소된 미세구균 뉴클레아제 접근성에 의해 측정되는 바와 같이 뉴클레오솜 압축을 증가시키거나, 원위 인핸서 요소와 근위 프로모터 요소 사이의 염색체 루핑을 억제하는 효소 또는 효과기 도메인을 포함할 수 있다.

Cas9 뉴클레아제는 하나 이상의 핵 전위 서열에 융합될 수 있다. N-말단, C-말단 또는 내부 핵 전위 서열, 또는 Cas9 뉴클레아제에 융합되는 도메인 또는 부속 단백질에 융합된 하나 이상의 핵 전위 서열의 사용은 세포의 핵으로의 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 전달을 향상시킬 수 있다. 세포의 핵으로의 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 전달을 유도하는 것은 세포 내로 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질을 도입시킴으로써 제공되는 유전체 편집 또는 전사 조절의 수준을 증가시킬 수 있다.

세포 내로 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키기 위한 반응 혼합물은 약 0.25 μM 내지 약 5 μM, 약 0.5 μM 내지 약 2.5 μM, 또는 약 0.9 μM 내지 약 1.8 μM의 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질의 농도를 가질 수 있다. Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 농도는 0.25 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1 μM, 1.1 μM, 1.2 μM, 1.3 μM, 1.4 μM, 1.5 μM, 1.6 μM, 1.7 μM, 1.8 μM, 1.9 μM, 2 μM, 2.1 μM, 2.2 μM, 2.3 μM, 2.4 μM, 2.5 μM 또는 그 초과의 농도, 또는 약 0.25 μM, 약 0.3 μM, 약 0.4 μM, 약 0.5 μM, 약 0.6 μM, 약 0.7 μM, 약 0.8 μM, 약 0.9 μM, 약 1 μM, 약 1.1 μM, 약 1.2 μM, 약 1.3 μM, 약 1.4 μM, 약 1.5 μM, 약 1.6 μM, 약 1.7 μM, 약 1.8 μM, 약 1.9 μM, 약 2 μM, 약 2.1 μM, 약 2.2 μM, 약 2.3 μM, 약 2.4 μM, 약 2.5 μM 또는 그 초과의 농도로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체의 농도는 5 μM, 4 μM 또는 3 μM 미만, 또는 약 5 μM, 약 4 μM 또는 약 3 μM 미만이다.

세포 내로 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키기 위한 반응 혼합물은 약 1 x 10⁵ 내지 약 4 x 10⁵개의 표적 세포, 약 1.5 x 10⁵ 내지 약 3.5 x 10⁵개의 표적 세포, 약 1.75 x 10⁵ 내지 약 3 x 10⁵개의 표적 세포, 또는 약 2 x 10⁵ 내지 약 2.5 x 10⁵개의 표적 세포를 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 반응 혼합물 내의 세포의 농도는 μL 당 약 0.5 x 10⁴ 내지 약 5 x 10⁴개의 표적 세포, μL 당 약 0.75 x 10⁴ 내지 약 4 x 10⁴개의 표적 세포, μL 당 약 1 x 10⁴ 내지 약 3 x 10⁴개의 표적 세포, μL 당 약 1.5 x 10⁴ 내지 약 2.5 x 10⁴ 또는 3 x 10⁴개의 표적 세포, 또는 μL 당 약 1.8 x 10⁴ 내지 약 2.3 x 10⁴개의 표적 세포이다.

C. 주형 핵산

일부 구체예에서, 세포 내로 Cas9 또는 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 도입시키기 위한 반응 혼합물은 표적 유전체 영역에서 Cas9 매개, 또는 Cas9 융합체 매개 절단 또는 니킹(nicking)의 상동성 지시형 복구(HDR)를 유도하기 위한 핵산을 함유할 수 있다. 주형 핵산은 일반적으로 이중 또는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드이다. 일부 경우에서, 주형 핵산은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형(ssODT)이다.

주형 핵산은 15개의 염기(b) 또는 염기쌍(bp) 내지 약 5 킬로베이스(kb) 또는 킬로베이스 쌍(kbp) 길이(예를 들어, 약 50, 75 또는 100 b 또는 bp 내지 약 110, 120, 125, 150, 200, 225 또는 250 b 또는 bp 길이)를 함유할 수 있다. 일반적으로, 더 긴 주형 핵산은 원형 또는 선형화된 플라스미드의 형태로 또는 벡터의 성분(예를 들어, 바이러스 벡터의 성분), 또는 이의 증폭 또는 중합 생성물로서 제공된다. 더 짧은 주형 핵산은 단일 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드로 제공될 수 있다. 예시적 단일 또는 이중 가닥 주형 올리고뉴클레오티드는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 115, 120, 125, 150, 175, 200, 225 또는 250 b 또는 bp 길이, 또는 적어도 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100, 약 110, 약 115, 약 120, 약 125, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225 또는 약 250 b 또는 bp 길이이다. 상기 주형 올리고뉴클레오티드는 표적 절단 부위에 인접하거나 측접한 영역과 동일하거나 실질적으로 동일한 1개 또는 2개(예를 들어, 측접 상동성 아암(arm)) 상동성 아암을 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 상동성 아암(들)은 25 내지 약 90개의 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 상동성 아암(들)은 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115 또는 120개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

주형 핵산은 약 1 μM 내지 약 200 μM, 약 2 μM 내지 약 190 μM, 약 2 μM 내지 약 180 μM, 약 5 μM 내지 약 180 μM, 약 9 μM 내지 약 180 μM, 약 10 μM 내지 약 150 μM, 약 20 μM 내지 약 140 μM, 약 30 μM 내지 약 130 μM, 약 40 μM 내지 약 120 μM, 또는 약 45 또는 50 μM 내지 약 90 또는 100 μM의 농도로 세포로의 도입을 위한 반응 혼합물에 제공될 수 있다. 일부 경우에서, 주형 핵산은 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 16 μM, 17 μM, 18 μM, 19 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM, 45 μM, 50 μM, 55 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 100 μM, 110 μM, 115 μM, 120 μM, 130 μM, 140 μM, 150 μM, 160 μM, 170 μM, 180 μM, 190 μM, 200 μM 또는 그 초과, 또는 약 1 μM, 약 2 μM, 약 3 μM, 약 4 μM, 약 5 μM, 약 6 μM, 약 7 μM, 약 8 μM, 약 9 μM, 약 10 μM, 약 11 μM, 약 12 μM, 약 13 μM, 약 14 μM, 약 15 μM, 약 16 μM, 약 17 μM, 약 18 μM, 약 19 μM, 약 20 μM, 약 25 μM, 약 30 μM, 약 35 μM, 약 40 μM, 약 45 μM, 약 50 μM, 약 55 μM, 약 60 μM, 약 70 μM, 약 80 μM, 약 90 μM, 약 100 μM, 약 110 μM, 약 115 μM, 약 120 μM, 약 130 μM, 약 140 μM, 약 150 μM, 약 160 μM, 약 170 μM, 약 180 μM, 약 190 μM, 약 200 μM 또는 그 초과의 농도로 세포로의 도입을 위한 반응 혼합물에 제공될 수 있다.

일부 경우에서, 주형 핵산(예를 들어, ssODT)의 존재하에서의 주형 지시형 및 NHEJ 유전체 편집의 효율은 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 적어도 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 그 초과일 수 있다. 일부 경우에서, HDR에 의한 주형 핵산(예를 들어, ssODT)의 서열의 혼입 효율은 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과, 또는 적어도 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 그 초과일 수 있다.

주형 핵산은 매우 다양한 상이한 서열을 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 주형 핵산은 절단 및 HDR 전에 표적 유전체 영역과 비교하여 정지 코돈 또는 해독틀을 인코딩한다. 상기 주형 핵산은 유전자 또는 이의 일부를 넉아웃시키거나 비활성화시키는데 유용할 수 있다. 일부 경우에서, 주형 핵산은 표적 유전체 영역과 비교하여 하나 이상의 미스센스 돌연변이 또는 인-프레임(in-frame) 삽입 또는 결실을 인코딩한다. 상기 주형 핵산은 표적 유전자 또는 이의 일부의 발현 수준 또는 활성(예를 들어, 리간드 특이성)을 변경시키는데 유용할 수 있다.

예를 들어, 주형 핵산은 T 세포 수용체 사슬 또는 항체 유전자의 하나 이상의 상보성 결정 영역 또는 이의 일부를 대체하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 상기 주형 핵산은 표적 세포의 항원 특이성을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 종양 항원 또는 감염성 질병 항원을 인지하고, 이에 의해 이들에 대한 면역 반응을 유도하도록 변경될 수 있다.

또 다른 예로서, 주형 핵산은 표적 내인성 유전자 또는 단백질의 발현 수준 또는 활성을 구제하기 위한 야생형 서열을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, FoxP3 유전자 또는 이의 프로모터 영역에 돌연변이를 함유하는 T 세포는 X-연관 IPEX 또는 전신 홍반 루푸스를 치료하기 위해 구제될 수 있다. 대안적으로, 주형 핵산은 표적 유전자의 낮은 발현 또는 활성을 발생시키는 서열을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 증가된 면역치료 반응은 암 또는 감염성 질병 표적에 대한 면역요법을 위해 제조된 T 세포에서 FoxP3의 발현 또는 활성을 결실시키거나 감소시킴으로써 달성될 수 있다.

또 다른 예로서, 주형 핵산은 표적 유전자의 기능을 변경시키는 돌연변이를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 주형 핵산은 바이러스 인지 또는 유입에 필요한 세포 표면 단백질의 돌연변이를 인코딩할 수 있다. 돌연변이는 표적 세포를 인지하거나 감염시키는 바이러스의 능력을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, CCR5 또는 CXCR4의 돌연변이는 CD4⁺ T 세포에서 HIV 감염에 대한 증가된 내성을 제공할 수 있다.

일부 경우에서, 주형 핵산은 충분한 상동성 영역에 인접하거나 측접하여 있으나 내인성 서열과 완전히 직교하는 서열을 인코딩한다. 예를 들어, 주형 핵산은 표적 유전자의 내인성 프로모터와 관련되지 않은 유도성 프로모터 또는 억제인자 요소를 인코딩할 수 있다. 유도성 프로모터 또는 억제인자 요소는 표적 유전자 발현 또는 활성의 시간적 및/또는 공간적 조절을 제공하기 위해 표적 유전자의 프로모터 영역에 삽입될 수 있다. 또 다른 예로서, 주형 핵산은 자살 유전자, 리포터 유전자 또는 가변저항 유전자(rheostat gene), 또는 이들의 일부를 인코딩할 수 있다. 자살 유전자는 성공적인 치료 후에 숙주로부터 항원 특이적 면역요법 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 가변저항 유전자는 면역요법 동안 면역 반응의 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 리포터 유전자는 숙주로의 도입 후 시험관내 또는 생체내에서 세포의 수, 위치 및 활성을 모니터하는데 사용될 수 있다.

예시적 가변저항 유전자는 면역 체크포인트 유전자이다. 하나 이상의 면역 체크포인트 유전자의 발현 또는 활성의 증가 또는 감소는 면역요법 동안 면역 반응의 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역 체크포인트 유전자는 발현이 증가되어 면역 반응이 감소될 수 있다. 대안적으로, 면역 체크포인트 유전자는 비활성화되어 면역 반응이 증가될 수 있다. 예시적 면역 체크포인트 유전자는 CTLA-4 및 PD-1을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 가변저항 유전자는 표적 세포의 증식 또는 효과기 기능을 조절하는 임의의 유전자를 포함할 수 있다. 상기 가변저항 유전자는 전사 인자, 케모카인 수용체, 사이토카인 수용체, 또는 공동-억제 경로와 관련된 유전자, 예를 들어, TIGIT 또는 TIM을 포함한다. 일부 경우에서, 가변저항 유전자는 세포 신호전달 기구와 상호작용하는 합성 또는 재조합 가변저항 유전자이다. 예를 들어, 합성 가변저항 유전자는 세포 신호전달을 억제하거나 활성화시키는 약물-의존성 또는 광-의존성 분자일 수 있다. 상기 합성 유전자는, 예를 들어, 문헌[Cell 155(6):1422-34 (2013); 및 Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Apr 22;111(16):5896-901]에 기재되어 있다.

예시적인 자살 유전자는 티미딘 키나제, 단순 헤르페스 바이러스 타입 1 티미딘 키나제(HSV-tk), 사이토크롬 P450 동종효소 4B1(cyp4B1), 시토신 데아미나제, 인간 폴릴폴리글루타메이트 신타제(fpgs), 또는 유도성 casp9을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 자살 유전자는 HSV-1 티미딘 키나제(HSV-tk로 약칭됨)를 인코딩하는 유전자, 스플라이스-보정된 HSV-tk(cHSV-tk로 약칭됨, 문헌[Fehse B et al., Gene Ther (2002) 9(23): 1633-1638] 참조), 고도의 간시클로버(Gancyclovir)-민감성 HSV-tk 돌연변이체(위치 75의 잔기 및/또는 위치 39의 잔기가 돌연변이된 돌연변이체(문헌[Black ME et al. Cancer Res (2001) 61(7):3022-3026; 및 Qasim W et al., Gene Ther (2002) 9(12) :824-827] 참조))를 코딩하는 유전자로 구성된 군으로부터 선택된다. 티미딘 키나제 기반 유전자가 아닌 자살 유전자가 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 CD20(임상-등급 모노클로날 항체, 예를 들어, Rituximab®의 표적; 문헌[Serafini M et al., Hum Gene Ther. 2004;15:63-76.] 참조), 유도성 카스파제(예로서, 소분자 약제를 이용하여 조건적 이합체화를 가능하게 하는 인간 FK506 결합 단백질(FKBP)에 융합된 변형된 인간 카스파제 9; 문헌[Di Stasi A et al., N Engl J Med. 2011 Nov 3 ;365(18): 1673-83; Tey SK et al., Biol Blood Marrow Transplant. 2007 Aug;) '3(8) :9) '3-24. Epub 2007 May 29] 참조) 및 FCU1(비독성 프로드러그 5-플루오로시토신 또는 5-FC를 이의 고도로 세포독성인 유도체 5-플루오로우라실 또는 5-FU 및 5'-플루오로우리딘-5'모노포스페이트 또는 5'-FUMP로 전환시킴; 문헌[Breton E et al., C R Biol. 2010 Mar;333(3):220-5. Epub 2010 Jan 25.])을 코딩하는 유전자가 자살 유전자로 사용될 수 있다.

일부 구체예에서, 주형 핵산은 재조합 항원 수용체, 이의 일부 또는 이의 성분을 인코딩한다. 재조합 항원 수용체, 이의 일부 및 이의 성분은 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0215427호; 2004/0043401호; 2007/0166327호; 2012/0148552호; 2014/0242701호; 2014/0274909호; 20140314795호; 2015/0031624호; 및 국제 출원 공개 번호 WO/2000/023573호; 및 WO/2014/134165호에 기재된 것을 포함한다. 상기 재조합 항원 수용체는 특정 종양 관련 또는 감염성 질병 관련 항원을 표적으로 하는 면역요법에 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 기재된 방법은 내인성 항원 수용체, 예를 들어, T 세포 수용체, B 세포 수용체 또는 이들의 일부 또는 이들의 성분을 넉아웃시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 또한 재조합 항원 수용체, 이의 일부 또는 이의 성분을 넉인시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 내인성 수용체는 넉아웃되고, 재조합 수용체(예를 들어, 재조합 T 세포 수용체 또는 재조합 키메라 항원 수용체)로 대체된다. 일부 경우에서, 재조합 수용체는 내인성 수용체의 유전체 위치에 삽입된다. 일부 경우에서, 재조합 수용체는 내인성 수용체와 비교하여 상이한 유전체 위치에 삽입된다.

D. 표적 유전체 영역

본원에 기재된 방법 및 조성물은 본질적으로 숙주 세포의 임의의 유전체 서열을 표적화하기 위해 이용될 수 있다. 표적화는 표적 유전체 서열의 적어도 일부의 돌연변이 또는 대체를 발생시킬 수 있다. 대안적으로, 표적화는, 예를 들어, 염색질 변형 효과기 단백질을 보충함으로써 표적 유전체 영역 내 및/또는 부근의 염색질의 변형을 발생시킬 수 있다. 상기 염색질 변형은 표적 유전체 영역 또는 그 부근의 유전자의 전사를 증가시키거나 감소시키는데 사용될 수 있다. 또 다른 대안으로서, 표적화는 표적 유전체 영역에 억제인자(예를 들어, KRAB) 또는 활성인자(예를 들어, VP64) 도메인을 보충함으로써 표적 유전체 영역 또는 그 부근의 유전자를 억제하거나 활성화시킬 수 있다.

예시적 표적 유전체 영역은 PD-1 유전자 또는 CTLA-4 유전자 내 또는 그 부근의 영역을 포함한다. PD-1 및 CTLA-4는 면역 체크포인트 유전자이며, 상기 유전자 중 하나 이상의 조절 또는 제거는 표적 세포의 면역원성 활성을 조절하는데 사용될 수 있다. 예시적 표적 유전체 영역은 바이러스 인지 또는 유입에 이용되는 수용체를 인코딩하는 유전자 내 또는 그 부근의 영역을 포함한다. 예를 들어, CCR5 또는 CXCR4 유전자는 이들 수용체를 돌연변이시키거나 하향조절하여 이에 따라 표적화된 세포에서 HIV 감염에 대한 내성을 제공하도록 표적화될 수 있다.

예시적 표적 유전체 영역은 세포 트래피킹(cell trafficking) 및 표적 귀소 또는 표적 인지와 관련된 단백질을 인코딩하는 유전자 내 또는 그 부근의 영역을 포함한다. 상기 유전자는 T 세포 및 B 세포 수용체, T 세포 케모카인 수용체, 예를 들어, CXCR4, CCR9, CCR7, 패턴 인지 수용체, 피부 림프구 항원, CD34, L-셀렉틴, CD28 및 GLYCAM-1을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

예시적 표적 유전체 영역은 질병과 연관되거나, 관련되거나, 질병을 야기시키는 돌연변이를 함유하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, FOXP3를 인코딩하는 유전자 또는 그 부근의 표적 유전체 영역은 FOXP3 기능을 증가시키거나 구제하고, 이에 의해 자가면역 질병, 예를 들어, IPEX로 고통받는 환자를 치료하도록 표적화될 수 있다. 또 다른 예로서, IL2RA를 인코딩하는 유전자 또는 그 부근의 표적 유전체 영역은 IL2RA 기능을 증가시키거나 구제하고, 이에 의해 자가면역 질병으로 고통받는 환자를 치료하도록 표적화될 수 있다. 또 다른 예로서, IL2RG를 인코딩하는 유전자 또는 그 부근의 표적 유전체 영역은 IL2RG 기능을 증가시키거나 구제하고, 이에 의해 면역결핍, 예를 들어, 중증 복합 면역결핍으로 고통받는 환자를 치료하도록 표적화될 수 있다. 또 다른 예로서, GATA2를 인코딩하는 유전자 또는 그 부근의 표적 유전체 영역은 GATA2 기능을 증가시키거나 구제하고, 이에 의해 MonoMAC으로 고통받는 환자를 치료하도록 표적화될 수 있다.

E. 가이드 RNA

가이드 RNA 및 가이드 RNA의 라이브러리가 본원에 기재된다. 가이드 RNA는 5'에서 3' 방향으로 결합 영역, 5' 헤어핀 영역, 3' 헤어핀 영역, 및 전사 종결 서열을 함유할 수 있다. 가이드 RNA는 Cas9 단백질과 안정적이고 활성인 복합체를 형성하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에서, 가이드 RNA는 숙주 세포에서 가이드 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 향상시키도록 최적화된다.

5' 헤어핀 영역은 약 15 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 약 50개의 뉴클레오티드 길이)일 수 있다. 일부 경우에서, 5' 헤어핀 영역은 약 30-45개의 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45개의 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 경우에서, 5' 헤어핀 영역은 31개 또는 적어도 약 31개의 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 적어도 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45개의 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 경우에서, 5' 헤어핀 영역은 하나 이상의 루프 또는 돌출부(bulge)를 함유하며, 각각의 루프 또는 돌출부는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드이다. 일부 경우에서, 5' 헤어핀 영역은 약 10 내지 30개의 상보적 염기쌍(예를 들어, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 상보적 염기쌍)의 줄기를 함유한다.

일부 구체예에서, 5' 헤어핀 영역은 단백질-결합, 또는 소분자-결합 구조를 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 5' 헤어핀 기능(예를 들어, Cas9 단백질과의 상호작용 또는 어셈블링)은 약물, 성장 인자, 소분자 리간드, 또는 5' 줄기-루프의 단백질-결합 구조에 결합하는 단백질에 의해 조건적으로 활성화될 수 있다. 일부 구체예에서, 5' 헤어핀 영역은 비-천연 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 비-천연 뉴클레오티드는 단백질-RNA 상호작용을 향상시키거나, 열 안정성 또는 가이드 RNA의 분해에 대한 내성을 증가시키기 위해 혼입될 수 있다.

가이드 RNA는 5' 및 3' 헤어핀 영역 사이에 개재 서열을 함유할 수 있다. 5' 및 3' 헤어핀 영역 사이의 개재 서열은 약 0 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드의 길이, 또는 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 또는 약 50개 뉴클레오티드의 길이)일 수 있다. 일부 경우에서, 개재 서열은 선형, 비구조적, 실질적으로 선형, 또는 실질적으로 비구조적이 되도록 설계된다. 일부 구체예에서, 개재 서열은 비-천연 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 비-천연 뉴클레오티드는 단백질-RNA 상호작용을 향상시키거나, 가이드 RNA:Cas9 리보핵산단백질 복합체의 활성을 증가시키기 위해 혼입될 수 있다. 또 다른 예로서, 천연 뉴클레오티드는 열 안정성 또는 가이드 RNA의 분해에 대한 내성을 향상시키기 위해 혼입될 수 있다.

3' 헤어핀 영역은 약 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 뉴클레오티드 루프 및 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오티드 또는 더 긴 줄기를 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 3' 헤어핀 영역은 가이드 RNA의 이차 및/또는 삼차 구조를 조건적으로 안정화시킬 수 있는 단백질-결합, 소분자-결합, 호르몬-결합, 또는 대사물-결합 구조를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 3' 헤어핀 영역은 비-천연 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 비-천연 뉴클레오티드는 단백질-RNA 상호작용을 향상시키거나, 가이드 RNA:Cas9 리보핵산단백질 복합체의 활성을 증가시키기 위해 혼입될 수 있다. 또 다른 예로서, 천연 뉴클레오티드는 열 안정성 또는 가이드 RNA의 분해에 대한 내성을 향상시키기 위해 혼입될 수 있다.

일부 구체예에서, 가이드 RNA는 이의 3' 말단에 종결 구조를 포함한다. 일부 경우에서, 가이드 RNA는, 예를 들어, 종결 영역 앞 및 첫번째 3' 헤어핀 영역 뒤에 가이드 RNA: Cas9 리보핵산단백질 어셈블리 또는 활성의 조건적 안정화 또는 조건적 조절과 같은 안정화 또는 추가 기능성을 위해 단백질, 소분자, 호르몬 등과 상호작용할 수 있는 추가의 3' 헤어핀 영역을 포함한다.

일반적으로, 결합 영역은 표적 유전체 영역 또는 일련의 표적 유전체 영역에 상보적이거나 실질적으로 상보적이고, 따라서 이들에 결합하거나 하이브리드화되도록 설계된다. 일부 경우에서, 결합 영역은 다수의 표적 유전체 영역에 결합하기 위해 워블(wobble) 또는 축퇴성 염기를 혼입할 수 있다. 일부 경우에서, 결합 영역은 다수의 표적 유전체 영역에 결합하기 위해 일련의 표적 유전체 영역 사이에서 보존된 서열을 보충할 수 있다. 일부 경우에서, 결합 영역은 안정성을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 예를 들어, 비-천연 뉴클레오티드가 분해에 대한 RNA 내성을 증가시키기 위해 혼입될 수 있다. 일부 경우에서, 결합 영역은 결합 영역에서 이차 구조 형성을 피하거나 감소시키도록 변경되거나 설계될 수 있다. 일부 경우에서, 결합 영역은 G-C 함량을 최적화시키도록 설계될 수 있다. 일부 경우에서, G-C 함량은 바람직하게는 약 40% 내지 약 60%(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%)이다. 일부 경우에서, 결합 영역은 가이드 RNA의 효율적인 전사를 촉진하는 서열로 시작하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 결합 영역은 G 뉴클레오티드로 5' 말단에서 시작할 수 있다. 일부 경우에서, 결합 영역은 변형된 뉴클레오티드, 비제한적인 예로, 메틸화되거나 인산화된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.

가이드 RNA는 당 분야에 공지된 방법에 의해 변형될 수 있다. 일부 경우에서, 변형은 하기 서열 요소 중 하나 이상의 첨가를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다: 5' 캡(예를 들어, 7-메틸구아닐레이트 캡); 3' 아데닐중합체형성 꼬리; 리보스위치(riboswitch) 서열; 안정성 조절 서열; 헤어핀; 세포내 국소화 서열; 검출 서열 또는 표지; 또는 하나 이상의 단백질에 대한 결합 부위. 변형은 또한 하기 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-천연 뉴클레오티드의 도입을 포함할 수 있다: 형광 뉴클레오티드 및 메틸화된 뉴클레오티드.

일부 구체예에서, 가이드 RNA는 유의한 표적외 효과를 갖지 않도록 선택된다. 일부 경우에서, 표적외 유전 요소 서열에 대한 가이드 RNA 결합 영역의 유사성이 결정될 수 있다. 사전 지정된 역치를 초과하는 하나 이상의 표적외 유전체 영역에 대한 높은 유사성을 갖는 표적 유전체 영역에 특이적인 가이드 RNA가 걸러질 수 있다. 일부 경우에서, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 포함하는 후보 결합 영역은 수작업 또는 자동화 방식으로 스코어링 측정을 이용하여 스코어링될 수 있다. 허용 가능한 수의 표적외 미스매치를 갖는 가이드 RNA 결합 영역이 이후 선택될 수 있다.

일부 구체예에서, sgRNA는 유전자 또는 그 부근의 특정 유전자로 표적화된다. 예를 들어, sgRNA는 유전자의 전사 시작 부위의 5' (업스트림)의 0-750 bp 영역 또는 그 부근의 영역으로 표적화될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 영역의 0-750 bp 표적화는 가이드 RNA:Cas9 리보핵산단백질 복합체에 의한 증가된 전사 활성화를 제공할 수 있거나, 제공한다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 유전자의 전사 시작 부위의 5'의 0-750 bp 영역으로 표적화된 전사 활성인자에 융합된 Cas9 도메인 또는 에피토프 융합 도메인 및 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA의 라이브러리와 접촉될 수 있다.

또 다른 예로서, 가이드 RNA는 유전자의 전사 시작 부위의 3' (다운스트림)의 0-1000 bp 영역 또는 그 부근의 영역으로 표적화될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 영역의 0-1000 bp 표적화는 가이드 RNA:Cas9 리보핵산단백질 복합체에 의한 증가된 전사 억제를 제공할 수 있거나, 제공한다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 유전자의 전사 시작 부위의 3'의 0-1000 bp 영역으로 표적화된 전사 억제인자에 융합된 dCas9 또는 에피토프 융합 도메인 및 가이드 RNA, 또는 가이드 RNA의 라이브러리와 접촉될 수 있다.

일부 구체예에서, 가이드 RNA는 자동화 또는 수작업의 주석이 달린 데이터베이스를 기초로 하여 전사 시작 부위(TSS) 또는 그 부근의 영역으로 표적화된다. 예를 들어, Ensembl/GENCODE 또는 APPRIS 파이프라인(Rodriguez et al., Nucleic Acids Res. 2013 Jan;41(Database issue):D110-7)에 의해 주석이 달린 전사물이 TSS 및 TSS의 업스트림의 0-750 bp(예를 들어, 하나 이상의 전사 활성인자 도메인을 표적화하기 위함) 또는 다운스트림의 0-1000 bp(예를 들어, 하나 이상의 전사 억제인자 도메인을 표적화하기 위함)의 표적 유전 요소를 확인하기 위해 이용될 수 있다.

일부 구체예에서, sgRNA는 비교적 뉴클레오솜이 없는 것으로 예측되는 유전체 영역으로 표적화된다. 뉴클레오솜의 위치 및 점유는 미세구균 뉴클레아제(MNase)에 의한 효소적 분해의 이용을 통해 검정될 수 있다. MNase는 네이키드 DNA 및 뉴클레오솜 사이의 링커 내의 DNA를 우선적으로 분해하여, 이에 따라 뉴클레오솜-회합된 DNA를 풍부화시키는 엔도-엑소 뉴클레아제이다. 유전체 전체에서 뉴클레오솜 구성을 결정하기 위해, MNase 분해로부터 남아 있는 DNA가 고-처리량 시퀀싱 기술(MNase-seq)을 이용하여 시퀀싱된다. 따라서, 높은 MNase-seq 신호를 갖는 영역은 뉴클레오솜에 의해 상대적으로 점유되는 것으로 예측되며, 낮은 MNase-seq 신호를 갖는 영역은 뉴클레오솜에 의해 상대적으로 점유되지 않는 것으로 예측된다. 따라서, 일부 구체예에서, sgRNA는 낮은 MNase-Seq 신호를 갖는 유전체 영역으로 표적화된다.

일부 경우에서, 가이드 RNA는 매우 전사적으로 활성인 것으로 예측되는 영역으로 표적화된다. 예를 들어, 가이드 RNA는 RNA 중합효소 II(PolII)에 대해 비교적 높은 점유를 갖는 것으로 예측되는 영역으로 표적화될 수 있다. 상기 영역은 항-PolII 항체를 이용하여 PolII에 결합된 DNA의 친화성 영역을 친화성 정제하고, 시퀀싱에 의해 정제된 영역을 확인하는 것을 포함하는 PolII 염색질 면역침전 시퀀싱(ChIP-seq)에 의해 확인될 수 있다. 따라서, 높은 PolII Chip-seq 신호를 갖는 영역은 매우 전사적으로 활성인 것으로 예측된다. 따라서, 일부 경우에서, 가이드 RNA는 ENCODE-공개된 PolII ChIP-seq 데이터베이스(Landt, et al., Genome Research, 2012 Sep;22(9):1813-31)에 개시된 바와 같은 높은 PolII ChIP-seq 신호를 갖는 영역으로 표적화된다.

또 다른 예로서, sgRNA는 런-온(run-on) 시퀀싱 또는 전체 런-온 시퀀싱(GRO-seq)에 의해 확인되는 바와 같은 매우 전사적으로 활성인 것으로 예측되는 영역으로 표적화될 수 있다. GRO-seq는 세포 또는 핵을 표지된 뉴클레오티드 및 전사 시작 부위로의 새로운 RNA 중합효소의 결합을 억제하는 작용제(예를 들어, 사르코실(sarkosyl))와 인큐베이션하는 것을 포함한다. 따라서, 연동된 RNA 중합효소를 갖는 유전자만이 표지된 전사물을 생성한다. 전체 전사가 진행되도록 하는 충분한 기간 후, 표지된 RNA가 추출되고, 해당하는 전사된 유전자가 시퀀싱에 의해 확인된다. 따라서, 높은 GRO-seq 신호를 갖는 영역은 매우 전사적으로 활성인 것으로 예측된다. 따라서, 일부 경우에서, 가이드 RNA는 공개된 GRO-seq 데이터(예를 들어, 문헌[Core et al., Science. 2008 Dec 19;322(5909):1845-8; 및 Hah et al., Genome Res. 2013 Aug;23(8):1210-23])에 개시된 바와 같이 높은 GRO-seq 신호를 갖는 영역으로 표적화된다.

일부 구체예에서, 가이드 RNA는 DNA 서열 모티프, ChIP-seq, ATAC-seq, 및/또는 RNA-seq 데이터를 기초로 하여 추정 조절성 서열(예를 들어, 추정 포유동물 또는 인간 조절성 서열), 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인슐레이터(insulator), 사일런서(silencer), 스플라이스 조절제 등으로 표적화될 수 있다.

숙주 세포에서 가이드 RNA를 생성시키기 위한 발현 카세트 및 벡터가 또한 본원에 기재된다. 발현 카세트는 가이드 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터(예를 들어, 이종성 프로모터)를 함유할 수 있다. 프로모터는 유도성 또는 항시성 프로모터일 수 있다. 프로모터는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 일부 경우에서, 프로모터는 U6, H1, 또는 비장 병소-형성 바이러스(SFFV) 긴 말단 반복 프로모터이다. 일부 경우에서, 프로모터는 인간 연장 인자 1 프로모터(EF1A)에 비해 약한 포유동물 프로모터이다. 일부 경우에서, 약한 포유동물 프로모터는 유비퀴틴 C 프로모터 또는 포스포글리세레이트 키나제 1 프로모터(PGK)이다. 일부 경우에서, 약한 포유동물 프로모터는 유도인자의 부재하에서의 TetOn 프로모터이다. 일부 경우에서, TetOn 프로모터가 이용되는 경우, 숙주 세포는 또한 테트라사이클린 교차활성인자(transactivator)와 접촉된다. 일부 구체예에서, 선택되는 가이드 RNA 프로모터의 강도는 전달되는 Cas9의 양에 비례하는 가이드 RNA의 양(예를 들어, 약 0.5배, 1배, 2배, 5배, 7.5배, 또는 10배 내)을 발현시키도록 선택된다. 발현 카세트는 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등에 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 발현 카세트는 숙주 세포 내에 존재한다. 가이드 RNA 발현 카세트는 숙주 세포에서 에피솜 형태로 존재하거나, 숙주 세포 내에 통합될 수 있다.

시험관내 전사에 의해 가이드 RNA를 생성시키기 위한 발현 카세트 및 벡터가 또한 본원에 기재된다.

실시예

하기 실시예는 예시를 위해 제공되지만, 청구된 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1:

T 세포 유전체 공학은 암 면역요법 및 HIV 및 자가면역 질병에 대한 세포-기반 요법에 대해 큰 가능성을 갖지만, 일차 인간 T 세포의 유전적 조작은 비효율적이었다. 본 발명자는 Cas9의 고효율 전달을 달성하는 방법을 개발하였다. 이러한 Cas9의 고효율 전달은 고효율 유전체 편집, 유전자 침묵, 및 염색질 또는 염색체 변형에 사용될 수 있다. 전달되는 Cas9은 가이드 RNA와 함께 사전 조립된 복합체로 전달될 수 있다. 이들 활성 Cas9 리보핵산단백질(RNP)은 일차 인간 T 세포에서 처음으로 성공적인 Cas9-매개 상동성 지시형 복구(HDR)를 가능하게 하였다. 따라서, 성숙 면역 세포에서의 특정 뉴클레오티드 서열은 고효율로 대체될 수 있으며, 이는 다양한 연구 및 치료 적용을 가능하게 하는 당 분야의 오래된 목표이다. 이들 연구는 일차 인간 T 세포에서 HDR에 의한 효율적인 DNA 서열 대체를 포함하는 다양한 실험 및 치료 유전체 공학 적용을 위한 Cas9(예를 들어, Cas9 RNP) 기술을 확립한다.

서문

CRISPR/Cas9 시스템은 포유동물 점-라인 서열 및 세포주를 편집하는데 점점 더 많이 사용되고 있다(1, 2). 이러한 강력한 시스템을 일차 인간 조직에서 직접 사용하기 위해 상당한 노력이 진행 중이지만, 특히 일차 조혈 세포, 예를 들어, 인간 CD4⁺ T 세포에서 효율이 제한적이다. cas9 및 작은 가이드 RNA(sgRNA)의 플라스미드 전달은 다른 세포 유형에서 효과적이었으나, CD4⁺ T 세포에서 표적 단백질 발현의 1-5%만 제거되었다(3). 인간 T 세포에서 핵심 표적을 제거하고, 병원성 유전체 서열을 교정하는 개선된 능력이 치료적 적용성을 가지며, 예를 들어, T 세포가 생체 외에서 편집된 후, 환자로 재도입되도록 한다.

전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 및 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)에 의한 유전자 결실, 및 바이러스 형질도입에 의한 외인성 유전자 도입을 포함하는 이용 가능한 기술로 T 세포 유전체를 조작하기 위한 다수의 과학 및 임상 시험이 진행 중이다(4). HIV 감염에 대한 내성을 얻기 위해 T 세포에서 HIV 공동-수용체 CXCR4 및 CCR5를 넉아웃시키려는 유전학적 조작이 시도되었다(5-7). 혈액학적 악성종양을 인지하고 사멸시키기 위한 T 세포 공학처리에서 뚜렷한 성공이 또한 있었으나, 고형 장기 종양 면역요법에 대해서는 추가적인 유전학적 변형이 필요한 것으로 보인다(8-10). 표적화된 T 세포 유전체 유전자좌가 삭제되지 않고 특정 대체 서열로 교정될 수 있는 경우 추가의 치료 기회가 가능할 것이다(11). T 세포에서 상동성 재조합을 촉진하는 확실한 기술은 조절성 T 세포(Treg) 발달을 방해하고, 면역조절이상 다발내분비병증 창자병증 X-연관 증후군(IPEX)을 갖는 환자에서 심각한 다기관 자가면역 질병을 야기시키는 돌연변이를 포함하는 특수화된 T 세포 기능에 영향을 미치는 돌연변이의 치료적 교정을 가능하게 할 수 있다(12, 13).

포유동물 세포주에서의 최근의 보고는 Cas9 리보핵산단백질(RNP; 시험관내 전사된 단일-가이드 RNA와 복합체화된 재조합 Cas9 단백질)이 효율적이고 특이적인 유전체 편집을 달성할 수 있음을 입증한다(14-16). 여기서, 본 발명자는 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포로의 Cas9(예를 들어, Cas9 RNP의 형태)의 전달이 높은 효율로 수행될 수 있음을 제시한다. sgRNA와의 Cas9 리보핵산단백질 복합체 형태의 Cas9의 고효율 전달은 CD4⁺ T 세포의 매우 효율적인 유전체 편집을 발생시킨다. 본 발명자는 무작위 삽입 및 결실 돌연변이로 CXCR4 발현을 제거(CXCR4의 높은 세포 표면 발현을 갖는 세포의 수를 70%까지 감소시킴; 대조군 처리된 세포에서의 60%에 비해 18%)할 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명자는 또한 외인성 단일 가닥 DNA 주형을 이용한 상동성 지시형 복구(HDR)에 의해 일차 T 세포 내에 정확하게 표적화된 유전체 서열을 도입시킬 수 있었다(높은 세포 표면 발현을 갖는 세포의 수를 98%까지 감소시킴; 대조군 처리된 세포에서의 60%에 비해 1%). 일차 T 세포에서 Cas9-매개 편집으로 이전에 보고된 적이 없는 이러한 유전학적 '넉인' 기술은 약 15%의 효율을 갖고 관찰된 유전체 편집의 대략 절반을 차지하며, 이는 질병 관련 돌연변이의 치료적 대체에 유용할 수 있음을 입증한다. 추가로, 본 발명자는 Treg의 주요 전사 인자를 인코딩하는 FOXP3를 돌연변이시키는 Cas9 RNP 기술을 이용한 유전자 조작의 기능적 결과를 입증한다. Cas9 RNP는 FOXP3 돌연변이가 조절성 T 세포 분화를 손상시키는 다기관 자가면역 질병인 IPEX의 인간 시험관내 모델을 가능하게 하였다. 이들 연구는 일차 인간 T 세포에서 유전체의 실험적 및 치료적 편집을 위한 Cas9 RNP 기술을 확립한다.

결과

본 발명자는 일차 T 세포의 유전학적 조작에서의 장기간의 난제를 극복하고, 확실한 유전체 공학처리 툴킷(toolkit)을 확립하는 것을 목표로 하였다. 포유동물 세포주에서의 최근의 보고는 Cas9 RNP가 효율적이고 특정한 유전체 편집을 달성할 수 있음을 암시한다(14-17). Cas9의 DNA 전달에 의한 T 세포의 효율적인 유전체 편집의 유의한 과제를 감안하여, 본 발명자는 일차 인간 T 세포에서 표적화된 유전체 편집을 위한 RNP 전달의 효율을 시험하였다(도 1a).

Cas9 RNP에 의한 HIV 공동-수용체 CXCR4의 제거

T 세포 공학처리에서의 주요 목적은 HIV 감염에 대한 공동-수용체 및 종양 면역 반응을 손상시키는 공동-억제 면역 체크포인트를 포함하는 특정 세포 표면 수용체의 표적화된 제거이다. 본원에서, 본 발명자는 HIV 진입에 대한 공동-수용체로 작용하는 CD4⁺ T 세포 상에서 발현되는 케모카인 수용체를 인코딩하는 CXCR4의 코딩 서열을 표적화하도록 Cas9 RNP를 프로그램화시켰다(18, 19). 본 발명자는 C 말단에서 융합된 2개의 핵 국소화 신호 서열(NLS)을 갖는 재조합 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9을 정제하였다. 이러한 Cas9 단백질을 인간 CXCR4 유전체 서열을 독특하게 인지하도록 설계된 시험관내 전사된 단일-가이드 RNA(sgRNA)와 함께 인큐베이션하였다(도 1b). 이들 사전 조립된 RNP 복합체를 건강한 공여자로부터 분리된 인간 CD4⁺ T 세포로 전기천공시켰다(방법).

CXCR4 Cas9 RNP의 전기천공은 유전체 DNA의 효율적인 부위 특이적 편집을 유발시켰다. CXCR4 유전자 내의 Cas9 RNP-유도 이중 가닥 절단은 가변적인 삽입 및 결실(삽입결실)을 발생시키고, 종종 프레임시프트 돌연변이를 발생시키는 세포에서의 우세한 DNA 복구 경로인 비-상동성 말단 결합(NHEJ)에 의해 복구되었을 가능성이 있다(20). 흐름세포측정법은 CXCR4 유전자의 돌연변이와 일치하는 낮은 수준의 CXCR4를 발현하는 T 세포의 백분율에서의 RNP 용량-의존적 증가를 나타내었다(도 1c). T7 엔도뉴클레아제 1(T7E1) 검정은 유전체 편집을 측정하기에 편리한 방법이다. 여기서, T7E1은 CXCR4 RNP로 처리된 세포에서 유전체 DNA 편집을 확인하였으나, sgRNA와 복합체를 형성하지 않은 spCas9 단백질(CTRL)로 처리된 대조군 세포에서는 확인되지 않았다(도 1d). Cas9 RNP-처리된 세포를 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 CXCR4 발현을 기초로 하여 분리하였고, 본 발명자는 CXCR4^hi 세포(4-12%)에 비해 CXCR4^lo 세포(15-17%)에서 편집의 풍부함을 발견하였다. 편집 사건을 직접 확인하기 위해 수행된 표적 CXCR4 유전체 유전자좌의 생거 시퀀싱은 T7E1 검정이 편집 효율을 과소평가한 것을 암시하였다. CXCR4^lo 세포에서의 CXCR4 유전자의 시퀀싱은 8/9 클론이 돌연변이/결실을 갖는 반면, 이러한 돌연변이/결실이 CXCR4^hi 및 CTRL 처리된 CXCR4^lo 세포에서 각각 4/10 클론 및 0/9 클론에서만 관찰된 것을 나타내었다. CXCR4^hi 집단에서 관찰된 편집 중 어느 것도 코딩 서열(1개의 미스센스 돌연변이 및 3개의 인-프레임 결실)을 종결시키지 않았으며, 이는 단백질 발현의 유지와 일치한다. 대조적으로, CXCR4^lo 집단은 유전자좌 내에 더욱 광범위한 돌연변이 부담을 갖는 세포에 대해 풍부해졌다(도 1e). 이들 결과는 Cas9 RNP를 이용한 성공적인 유전체 표적화 및 인간 CD4⁺ T 세포에서의 단백질 발현에 대한 기능적 효과를 입증하였다. FACS는 편집된 세포를 정제할 수 있어, 일차 T 세포에서 Cas9 RNP 적용을 위한 추가의 유용한 도구를 제공한다.

상동성 지시형 복구( HDR )를 이용한 효율적인 유전학적 '넉-인'

외인성 주형-매개 HDR은 특정 변이체 서열의 실험적 및 치료적 편집을 가능하게 하는 정확한 유전자 변형을 위한 강력한 기술이다. Cas9 RNP의 높은 편집 효율을 고려하여, 본 발명자는 다음으로 본 발명자가 일차 T 세포에서 외인성 주형-매개 HDR을 달성할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 본 발명자는 Cas9 RNP 절단 부위에서 CXCR4 유전자좌와 조합시키기 위해 90개의 뉴클레오티드(nt) 상동성 아암을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형(ssODT)을 사용하였다(15). ssODT는 인간 참조 유전체로부터 12 nt를 대체하고, 새로운 HindIII 제한 효소 절단 부위를 도입시키도록 설계되었다(도 2a). Cas9 RNP를 4개의 상이한 농도의 ssODT(0, 50, 100 및 200 pmol)의 존재하에서 일차 CD4⁺ T 세포로 전기천공시켰다. ssODT가 없는 Cas9 RNP는 다시 CXCR4^Hi 세포의 백분율을 감소시켰다. 특히, ssODT의 첨가는 CXCR4 제거의 효능을 유의하게 개선시켰다. 본원에 제시된 실험에서, 본 발명자는 100 pmol ssODT 및 Cas9 RNP로 높은 세포 표면 CXCR4 발현을 갖는 세포의 수에서 98% 이하의 감소를 달성할 수 있었다(대조군 처리된 세포에서의 60%에 비해 1%)(도 2b 및 c).

Cas9 RNP 및 ssODT로 처리된 세포에서 현저하게 효율적인 HDR이 관찰되었다(도 2d). 본 발명자는 T7E1 검정에 의해 측정된 바와 같이 ssODT가 없이 24%의 전체 편집(Cas9 절단 부위에서 삽입결실을 발생시키는 모든 NHEJ 및 HDR 사건의 합으로 정의됨)을 관찰하였다. 50 pmol ssODT의 존재하에서 33% 이하의 전체 편집이 관찰되었다. 이 농도에서, 표적 유전자좌의 HindIII 분해에 의해 14% HDR이 관찰되었으며, 이는 편집의 40% 초과가 HDR로부터 발생(관찰된 편집의 나머지 약 60%는 NHEJ로부터 발생한 것일 수 있음)된 것을 나타낸다. HDR의 백분율은 100 pmol ssODT(12%)로 약간 낮았지만, 전체 편집에 대한 HDR의 더 높은 비가 계산되었다(100 pm으로 0.48 대 50 pmol으로 0.42). 이러한 조건에서의 CXCR4 염색의 거의 완전한 상실은 HDR에 의해 도입된 돌연변이(84DLLFV88 → 84ESLDP88; SEQ ID NOS:1 및 2))가 CXCR4의 세포 표면 발현 또는 항체에 의한 이의 인지에 강하게 영향을 미친 것을 입증한다(도 2b 및 c). 이러한 실험에서, 편집 효율은 200 pmol ssODT로 감소되었다.

전체 편집 및 HDR 둘 모두는 CXCR4^lo 집단을 분류함으로써 풍부해질 수 있으나, 효과는 도 1에서보다 덜 현저하였고, 이는 분류되지 않은 집단에서의 CXCR4^lo 세포의 더 큰 분획과 일치한다. 이들 실험에서 더욱 엄격한 게이트가 CXCR4의 가장 높은 발현을 갖는 세포를 분리하기 위해 적용되었고, 이러한 CXCR4^hi 집단에서 편집이 관찰되지 않은 것을 주목한다. 이들 연구는 일차 인간 T 세포에서 표적화된 DNA 서열을 정확하게 대체하는 ssODT와 커플링된 Cas9 RNP의 능력을 집합적으로 입증하였다.

Treg 분화 동안의 FOXP3 돌연변이의 기능적 영향

본 발명자는 다음으로 Cas9 RNP-매개 유전체 편집이 병원체 및 악성종양에 대한 보호와 관련된 전염증성 효과기 T 세포 부분집합과 자가면역의 발달을 예방하는데 필수적인 억제성 FOXP3⁺ Treg 사이의 균형을 변경시킬 수 있는지의 여부를 시험하였다. FOXP3는 마우스에서 기능적 Treg에 필수적이다(21-24). 인간에서의 FOXP3 유전자의 돌연변이는 다기관 자가면역 증후군인 IPEX를 야기시키는 손상된 Treg 발달 및 기능을 발생시켰다(12, 13). Cas9 RNP-매개 유전체 편집은 인간 FOXP3 유전자에 돌연변이를 실험적으로 도입시키고, Treg의 발달에 대한 이들의 효과를 시험할 독특한 기회를 제공한다.

FOXP3 돌연변이의 기능적 결과를 시험하기 위해, 본 발명자는 Cas9 RNP로 2개의 엑손 부위를 표적화하였다(도 3a). X 염색체 상의 FOXP3 유전자좌에서의 편집의 해석을 돕기 위해, 이들 실험을 남성 공여자로부터의 세포로 수행하였다. 본 발명자는 이전에 기재된 바와 같이 인간 남성 공여자로부터 분리된 일차 CD4⁺CD25⁺CD127^lo Treg에서의 Cas9 RNP의 효능을 시험하였다(25). 성공적인 유전체 편집이 FOXP3 Cas9 RNP로 처리된 Treg에서 T7E1 검정에 의해 검출되었으나, Cas9 단백질 단독으로 트랜스펙션된 대조군 세포에서는 검출되지 않았다(도 3b). FOXP3 Cas9 RNP는 세포내 염색에 의해 평가된 FOXP3 음성 세포의 백분율을 증가시켰다(도 3c). 흐름세포측정법 결과는 세포의 40% 이하가 Cas9 RNP 처리의 결과로서 FOXP3 발현을 상실(대조군 처리된 세포에서의 85% FOXP3⁺ 대 FOXP3 Cas9 RNP1에서의 63%, FOXP3 Cas9 RNP2에서의 46% 및 조합된 FOXP3 Cas9 RNP 1 및 2에서의 54%)한 것을 나타내었다. FOXP3 제거된 세포의 분획은 처음에 더 높을 수 있는데, 이는 FOXP3 Cas9 RNP 처리가 Treg에서 증식 결함을 야기시키는 것으로 보이기 때문이다(데이터는 제시되지 않음).

Cas9 RNP 편집은 일차 인간 Treg에서 FOXP3 제거의 표면형 결과를 나타내었다. 흐름세포측정법은 증가된 수준의 CD127(IL7Rα)로 FOXP3 Cas9 RNP 처리된 세포에서 변경된 사이토카인 수용체 발현을 확인하였다(도 3d). CD127은 FOXP3에 의해 직접적으로 전사적으로 억제되며(25), 이는 Cas9 RNP 처리가 Treg의 주요 조절인자의 손실로부터 예상 조절이상을 야기시키는 것을 암시한다. 상기 발견은 Cas9 RNP-매개 FOXP3 제거의 결과로서의 Treg 기능에 필요한 유전자 발현 프로그램의 불안정화와 일치하였다.

본 발명자는 다음으로 IPEX 환자에서 FOXP3 돌연변이와 관련된 결함이 있는 Treg 분화를 시험관 내에서 반복적으로 시도하였다. Cas9 RNP를 생체외 자극된 나이브 T 세포로 전달하였고, 이를 이후 IL-2 및 TGF-β에서 배양하여 iTreg의 발생을 촉진시켰다(26-28). Cas9 단백질 단독으로 처리된 대조군 세포에서, 30%의 FOXP3⁺ iTreg가 발생하였다. FOXP3 Cas9 RNP 1, FOXP3 Cas9 RNP 2, 및 FOXP3 Cas9 RNP 1 및 2 둘 모두를 이용한 처리는 모두 FOXP3⁺ iTreg의 백분율을 감소시켰다(각각, 8%, 9% 및 11%)(도 4a). FOXP3⁺ iTreg의 감소된 백분율, 및 전염증성 사이토카인 인터페론-γ(IFNγ)을 생성시키는 세포의 분획에서의 작지만 재현가능한 증가가 3개의 독립적 실험 전체에 걸쳐 관찰되었다(도 4b).

iTreg 분화 동안 FOXP3 돌연변이의 기능적 영향을 추가로 조사하기 위해, 본 발명자는 Cas9 RNP-처리 세포를 Treg 억제와 관련된 주요 세포 표면 수용체인 CTLA-4의 FACS 분석에 적용시켰다(29). FOXP3 Cas9 RNP를 이용한 처리는 CTLA-4를 발현하는 세포의 백분율을 감소시켰다(도 4c). 대조군 세포에서, CTLA-4가 iTreg 뿐만 아니라 자극된 FOXP3^- 효과기 T 세포에서 유도되었다. 본 발명자는 FOXP3 표적화가 CTLA-4⁺FOXP3⁺ iTreg의 백분율을 강하게 감소시켰으나, FOXP3^- 세포에서 CTLA-4 발현에 대해 약간의 효과를 갖는 것을 발견하였고, 이는 CTLA-4 발현에 모두 기여하는 FOXP3-의존적 및 FOXP3-독립적 메커니즘과 일치한다(23, 30). 수명이 짧은 Cas9 RNP를 이용한 전기천공은 FOXP3 제거된 T 세포의 발달 잠재성을 변경시켰다. 이러한 기술은 인간 Treg 분화에 필요한 추가 유전자 또는 조절 요소를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 중요하게는, Cas9 RNP 접근법에 의한 T 세포에서의 매우 효율적인 유전체 편집은 FOXP3 돌연변이가 iTreg 분화를 손상시키는 것을 확인하는 IPEX의 인간 시험관내 질병 모델을 가능하게 하였다.

논의

일차 조혈 세포 및/또는 일차 조혈 줄기 세포로의 Cas9의 효율적인 전달은 세포, 조직 및 시스템 기능의 기초 연구 뿐만 아니라 세포-기반 치료제의 개발 및 사용을 위한 강력한 플랫폼을 제공한다. 예를 들어, Cas9-매개 유전체 공학처리는 염증성 및 억제성 인간 T 세포 부분집합에 중요한 DNA 요소를 실험적 및 치료적으로 표적화하는데 사용될 수 있다. 본 발명자는 시험관내 조립되고 기능성인 Cas9 RNP의 전달에 의한 인간의 통상적이고 조절성인 CD4⁺ T 세포에서의 성공적인 유전체 공학처리를 본원에서 보고한다. Cas9 RNP의 전기천공은 CXCR4 세포 표면 수용체의 표적화된 '넉아웃'을 가능하게 하였다. RNP는 또한 최초의 성공적인 Cas9-매개 유전학적 '넉인' 일차 인간 T 세포를 촉진시켰다. 성숙한 면역 세포에서의 매우 효율적인 표적화된 DNA 대체는 해당 분야에서 오래된 목적을 달성하며, 이는 다양한 연구 및 치료 적용을 가능하게 한다. 최종적으로, 본 발명자는 또한 IPEX를 갖는 환자에서 Treg 분화의 기능 장애를 모델링하기 위해 자극된 인간 나이브 T 세포 및 Treg에서 주요 전사 조절인자인 FOXP3를 표적으로 하기 위해 Cas9 RNP를 사용하였다. 연구는 집합적으로 인간 일차 T 세포의 유전학적 조작을 위한 광범위하게 적용가능한 툴킷을 확립한다.

다른 CRISPR/Cas9 전달 방법에 비해 일시적 RNP 전달을 갖는 유전체 공학처리에는 주목할 만한 장점이 있다. 최근의 연구는 cas9 유전자 및 가이드 RNA 코딩 서열을 갖는 플라스미드의 트랜스펙션에 의한 벌크 인간 CD4⁺ T 세포에서 세포 표면 마커의 제거를 보고하였다(3). 성공적이지만, 효율은 다른 세포 유형에 비해 CD4⁺ T 세포에서 특히 낮았는데, 이는 Cas9 또는 sgRNA의 최적이하 수준, 최적이하의 핵 전위 또는 최적이하의 세포내 RNP 복합체 형성(또는 이들 요인의 일부 조합)으로 인한 것일 수 있다. RNP-기반 전달은 이들 난제를 피한다. Cas9 RNP의 전달은 이들이 보고에 의하면 전달 24시간 이내에 분해됨에 따라 신속한 편집 작용 및 신속한 단백질 전환을 세포에 제공한다(14). 이러한 Cas9 편집의 제한된 시간적 범위는 세포가 더 기간 동안 Cas9에 노출되는 다른 전달 방식에 비해 Cas9 RNP를 치료 적용에 대해 더 안전하게 만들 수 있다. 본 발명의 발견은 이제 Cas9 RNP가 인간 T 세포를 신속하고 효율적으로 편집할 수 있음을 제시한다.

본 발명자는 한 실험에서 CXCR4를 표적으로 하는 Cas9 RNP 및 HDR 주형으로 CXCR4^hi 세포에서의 98% 감소로 현저하게 효율적인 HDR을 본원에서 달성할 수 있었다. 일차 T 세포에서 편집 및 HDR 효율에 영향을 미치는 나머지 변수를 최적화하여 보다 높은 유전체 편집 효율을 달성할 수 있다. 예를 들어, 세포 유형 및 세포 주기 동역학에서의 변화는 Cas9 RNP 효율을 유의하게 변경시킬 수 있다(15). 일차 인간 T 세포에서, 편집 효율은 또한 T 세포 공여자 특이적 요인(예를 들어, 유전학, 최근의 감염), 시험관내 T 세포 활성화 상태, 및 표적화된 유전체 유전자좌의 특징(예를 들어, DNA 서열, 염색질 상태)에 의해 영향을 받을 수 있다.

인간 T 세포 부분집합에서 특정 DNA 서열을 편집하는 능력은 전사 인자, 시스-조절성 요소, 및 T 세포 염증 및 억제 기능과 관련된 표적 유전자의 실험적 연구를 가능하게 한다. 본원에서, 본 발명자는 원리의 증거로서 다운스트림 발현 프로그램 및 세포 분화에 대한 기능적 영향을 평가하기 위해 주요 전사 조절인자인 FOXP3를 넉아웃시키는 능력을 입증한다. 이들 실험은 멘델 다기관 자가면역 증후군인 IPEX와 관련된 Treg 분화를 시험관내에서 모델링한다. 광범위한 노력으로 다양하고 전문화된 T 세포 하위집단의 발달 및 기능을 조절하는 주요 유전자 조절 회로가 맵핑되었다(31). 본 발명자는 최근에 인간 자가면역 질병의 위험에 기여하는 가장 인과적인 유전적 변이가 T 세포의 주요 조절 요소에 있는 것을 보고하였다(32). 일차 T 세포의 유전체 편집은 조절 요소의 기능을 평가하고, 질병-관련 코딩 및 비-코딩 변화의 효과를 특성규명하기 위한 강력한 교란 시험을 제공한다.

치료적 편집은 집단에서 성공적으로 편집된 세포를 확인하기 위해 개선된 기술을 필요로 한다. 편집된 세포의 선택은 형질전환된 세포주와 달리 배양물에서 무기한 유지될 수 없는 일차 세포에서 특히 난제이다. 본원에서, 본 발명자는 세포 표면 수용체 발현에서 예상된 표현형 변화를 기초로 하여 편집된 세포의 FACS 풍부화를 입증한다. Cas9 RNP-매개 HDR의 성공은 또한 특정 적용을 위해 균일하게 편집된 세포를 정제하는 유전학적 마커의 도입을 허용한다.

치료용 T 세포 공학처리는 일차 세포에서 매우 효율적이고 정확하게 표적화된 유전체 편집을 필요로 한다. 본원에 보고된 매우 효율적인 Cas9 전달 기술은, 예를 들어, 일차 세포에서 매우 효율적이고 정확하게 표적화된 유전체 편집을 제공할 수 있다. 상기 매우 효율적인 전달은 유전학적 변이를 교정하고, 감염, 자가면역 및 암의 치료를 위해 인간 T 세포 기능을 공학처리하는데 사용될 수 있다.

재료 및 방법

인간 T 세포 분리 및 배양

UCSF 인간 연구 위원회(CHR)에 의해 승인된 프로토콜에 따라, 전혈을 인간 공여자로부터 소듐 헤파린 처리된 진공채혈관(Becton Dickinson)으로 수집하고, 12시간 내에 처리하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll 구배 원심분리에 의해 분리시켰다. 혈액을 Ca² ⁺ 및 Mg² ⁺ 비함유 행크 균형 염 용액(HBSS)과 1:1 비로 혼합하고, 50 ml Falcon 튜브(30 ml의 혈액 HBSS 혼합물/튜브)로 옮기고, 12 ml Ficoll-Paque PLUS(Amersham/GE healthcare) 밑에 두었다. 밀도 구배 원심분리(1000g, 20분, 브레이크(brake) 없음) 후, PBMC 층을 조심스럽게 제거하고, 세포를 Ca² ⁺ 및 Mg² ⁺ 비함유 HBSS로 2회 세척하였다. CD4⁺ T 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 Easysep Human CD4⁺ T 세포 풍부화 키트(Stemcell technologies)로 사전 풍부화시켰다. 사전 풍부화된 CD4⁺ T 세포를 다음과 같은 항체로 염색하였다: αCD4-PerCp (SK3; Becton Dickinson), αCD25-APC (BC96; TONBO Biosciences), αCD127-PE (R34-34; TONBO Biosciences), αCD45RA-violetFluor450 (HI100; TONBO Biosciences) 및 αCD45RO-FITC (UCHL1; TONBO Biosciences). CD4⁺CD25^hiCD127^lo Treg, CD4⁺CD25^loCD127^hi T 효과기(Teff), 및 CD4⁺CD25^loCD127^hiCD45RA^hiCD45RO^- 나이브 T 세포(Tnaive)를 FACS Aria Illu(Becton Dickinson)를 이용하여 분리하였다. Treg, Teff 및 Tnaive 순도는 97% 초과였다.

Cas9 RNP 트랜스펙션을 위해, Treg, Teff, 또는 Tnaive를 48시간 동안 αCD3 (UCHT1; BD Pharmingen) 및 αCD28(CD28.2; BD Pharmingen) 코팅된 플레이트에서 사전 활성화시켰다. 플레이트를 37℃에서 적어도 2시간 동안 10 μg/ml의 PBS 중 αCD3 및 αCD28로 코팅하였다. iTreg 분화를 위해, FACS-분류된 Tnaive를 100 IU/ml의 IL-2 (알데스류킨(Aldesleukin), UCSF Pharmacy) 및 10 ng/ml의 TGF-β1 (Tonbo Biosciences)의 존재하에서 플레이트 코팅된 αCD3 및 αCD28로 활성화시켰다. 항-IFNγ 및 항-IL-4 차단 항체의 존재하에서 수행된 하나의 iTreg 분화 실험을 도 4의 분석에서 제외시켰다.

Teff를 RPMI 완전 배지(5x10⁵ 세포/ml의 세포 밀도의 5 mmol/l 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES)(UCSF CCF), 2 mmol/l Glutamax(Gibco), 50 μg/ml 페니실린/스트렙토마이신(Corning), 50 μmol/l 2-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich), 5 mmol/l 비필수 아미노산(Corning), 5 mmol/l 소듐 피루베이트(UCSF CCF), 및 10% 소 태아 혈청(Atlanta Biologicals)이 보충된 RPMI-1640 (UCSF CCF))에서 활성화시켰다. 전기천공 후, 배지에 40 IU/ml의 IL-2를 보충하였다.

Treg을 RPMI 완전 배지에서 활성화시켰다. 전기천공 후, 300 IU/ml의 IL-2를 배지에 첨가하여 세포를 추가로 확장시켰다. Treg, Teff 또는 Tnaive는 전기천공 후 1일, 3일 및 5일에 이들의 각각의 배지로 추가로 보충되었다. Teff 및 Teff를 5x10⁵/ml의 세포 밀도로 유지시켰다. Treg를 2.5x10⁵ 세포/ml의 세포 밀도에서 배양하였다.

Cas9의 발현 및 정제

본 연구에서 사용된 재조합 S. 피오게네스 Cas9은 C-말단에서 HA 태그 및 핵막을 가로지르는 운반을 촉진하는 2개의 핵 국소화 신호 펩티드를 갖는다. 단백질을 플라스미드 pMJ915로부터 E. 콜리 Rosetta 2 세포(EMD Millipore)에서 N-말단 헥사히스티딘 태그 및 말토스 결합 단백질을 갖도록 발현시켰다. His 태그 및 말토스 결합 단백질을 TEV 프로테아제에 의해 절단시키고, Cas9을 문헌[Jinek et al., 2012]에 기재된 프로토콜에 의해 정제하였다. Cas9을 -80℃에서 pH 7.5의 20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% 글리세롤, 1 mM 트리스(2-클로로에틸) 포스페이트(TCEP) 중에 보관하였다.

sgRNA의 시험관내 T7 전사

T7 프로모터, 20 nt 표적 서열 및 키메라 sgRNA 스캐폴드를 인코딩하는 DNA 주형을 중첩 PCR에 의해 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립하였다. 간단히, CXCR4 sgRNA 주형에 대해, PCR 반응물은 제조업체의 프로토콜에 따라 SLKS3 (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA GCG TGA TGA CAA AGA GGG TTT TAG AGC TAT GCT GGA AAC AGC ATA GCA AGT TAA AAT AAG G -3'; SEQ ID NO:3) 및 SLKS1 (5'- GCA CCG ACT CGG TGC CAC TTT TTC AAG TTG ATA ACG GAC TAG CCT TAT TTT AAC TTG CTA TGC TGT TTC CAG C -3'; SEQ ID NO:4)의 20 nM 프리믹스(premix), T25 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3'; SEQ ID NO:5) 및 SLKS1 (5'- GCA CCG ACT CGG TGC CAC TTT TTC AAG -3'; SEQ ID NO:6)의 1 μM 프리믹스, 200 μM dNTP 및 Phusion 중합효소(NEB)를 함유한다. 써모사이클러(thermocycler) 설정은 10초 동안 95℃, 10초 동안 57℃ 및 10초 동안 72℃의 30주기로 구성되었다. PCR 생성물을 페놀:클로로포름:이소아밀알콜로 1회 추출한 후, 클로로포름으로 1회 추출하고, -20℃에서 밤새 이소프로판올 침전시켰다. DNA 펠렛을 70% 에탄올로 3회 세척하고, 진공에 의해 건조시키고, DEPC-처리된 물에 용해시켰다. FOXP3 sgRNA 주형을 동일 절차에 의해 T25, SLKS1, SLKS2 및 SLKS4 (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG AGG AGC CTC GCC CAG CTG GAG TTT TAG AGC TAT GCT GGA AAC AGC ATA GCA AGT TAA AAT AAG G -3'; SEQ ID NO:7)로부터 조립하였다.

100 μl의 T7 시험관내 전사 반응물은 30 mM Tris-HCl (pH 8), 20 mM MgCl₂, 0.01% Triton X-100, 2 mM 스퍼미딘(spermidine), 10 mM 신선한 디티오트레이톨, 5 mM의 각각의 리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 100 μg/ml T7 Pol 및 0.1 μM DNA 주형으로 구성되었다. 반응물을 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 5 유닛의 RNase-비함유 DNaseI(Promega)을 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 DNA 주형을 분해하였다. 반응을 5분 동안 60℃에서 2xSTOP 용액(95% 탈이온화 포름아미드, 0.05% 브로모페놀 블루(bromophenol blue) 및 20 mM EDTA)로 켄칭시켰다. RNA를 6M 우레아를 함유하는 10% 폴리아크릴아미드 젤에서의 전기영동에 의해 정제하였다. RNA 밴드를 젤로부터 절제하고, 15 ml 튜브에서 분쇄시키고, 4℃에서 밤새 5 부피의 300 mM 소듐 아세테이트(pH 5)로 용리시켰다. -20℃에서 1 당량의 이소프로판올을 첨가하여 RNA를 침전시켰다. RNA 펠렛을 원심분리에 의해 수거하고, 70% 에탄올로 3회 세척하고, 진공에 의해 건조시켰다. sgRNA를 재폴딩시키기 위해, RNA 펠렛을 먼저 20 mM HEPES(pH 7.5), 150 mM KCl, 10% 글리세롤 및 1 mM TCEP에 용해시켰다. sgRNA를 5분 동안 70℃로 가열하고, 실온으로 냉각시켰다. MgCl₂를 1 mM의 최종 농도로 첨가하였다. sgRNA를 다시 5분 동안 50℃로 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 얼음 상에서 유지시켰다. sgRNA 농도를 Nanodrop을 이용하여 OD_260nm에 의해 결정하고, 20 mM HEPES(pH 7.5), 150 mM KCl, 10% 글리세롤, 1 mM TCEP 및 1 mM MgCl₂를 이용하여 100 μM로 조정하였다. sgRNA를 -80℃에서 보관하였다.

Cas9 RNP 조립 및 전기천공

10분 동안 37℃에서 20 μM HEPES(pH 7.5), 150 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10% 글리세롤 및 1 mM TCEP 중에서 1:1의 비로 20 μM Cas9와 20 μM sgRNA를 10 μM의 최종 농도로 인큐베이션시킴으로써 Cas9 RNP를 실험 직전에 제조하였다.

T 세포를 Neon 트랜스펙션 키트 및 장치(Invitrogen)로 전기천공하였다. 2 - 2.5 x 10⁵개의 T 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 9 μl의 완충액 T(Neon kit, Invitrogen)에 재현탁시켰다. Cas9 RNP(1 - 2 μl의 10 μM Cas9 단독(CTRL) 또는 Cas9:sgRNA RNP; 최종 농도 0.9 - 1.8 μM) 뿐만 아니라 HDR 주형(0 - 200 pmol)을 세포 현탁액에 첨가하고, 혼합하고, Neon 전기천공 장치(Invitrogen; 1600V, 10 msec, 3 펄스)를 이용하여 세포로 트랜스펙션시켰다. HDR 주형은 표적 서열에 상보적(- 가닥)인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이며, 90-nt 상동성 아암에 측접된 HindIII 제한 서열을 함유한다(서열: 5'-GGG CAA TGG ATT GGT CAT CCT GGT CAT GGG TTA CCA GAA GAA ACT GAG AAG CAT GAC GGA CAA GTA CAG GCT GCA CCT GTC AGT GGC CGA AAG CTT GGA TCC CAT CAC GCT TCC CTT CTG GGC AGT TGA TGC CGT GGC AAA CTG GTA CTT TGG GAA CTT CCT ATG CAA GGC AGT CCA TGT CAT CTA CAC AGT-3'; SEQ ID NO:8).

전기천공된 Treg, Teff 또는 Tnaive를 αCD3/CD28 코팅된 48-웰 플레이트 중의 500 μl의 이들 각각의 배양 배지로 옮겼다. 전기천공 24시간 후, 세포를 재현탁시키고, 코팅되지 않은 웰 플레이트로 옮겼다. 전기천공 4 - 6일 후, T 세포를 FACS 및 T7 엔도뉴클레아제 I 검정에 의해 분석하였다.

표적 영역의 PCR 증폭

100 μl의 Quick Extraction 용액(Epicenter)에 재현탁된 5x10⁴ - 2x10⁵개의 세포를 첨가하여 세포를 용해시키고, 유전체 DNA를 추출하였다. 세포 용해질을 20분 동안 65℃ 및 이후 20분 동안 95℃에서 인큐베이션하고, -20℃에서 보관하였다. 유전체 DNA의 농도를 NanoDrop(Thermo Scientific)에 의해 결정하였다.

CXCR4 표적, FOXP3 표적 1 또는 FOXP3 표적 2 표적 부위를 함유하는 유전체 영역을 하기 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭시켰다. CXCR4에 대해: 정방향 5'- AGA GGA GTT AGC CAA GAT GTG ACT TTG AAA CC -3' (SEQ ID NO:9) 및 역방향 5'- GGA CAG GAT GAC AAT ACC AGG CAG GAT AAG GCC -3' (SEQ ID NO:10)(938 bp). FOXP3 표적 1에 대해: 정방향 5'-TTC AAA TAC TCT GCA CTG CAA GCC C-3' (SEQ ID NO:11) 및 역방향 5'- CAT GTA CCT GTG TTC TTG GTG TGT GT-3' (SEQ ID NO:12)(900 bp), FOXP3 표적 2에 대해: 정방향 5'- GCT GAC ATT TTG ACT AGC TTT GTA AAG CTC TGT GG-3' (SEQ ID NO:13) 및 역방향 5'- TCT CCC CGA CCT CCC AAT CCC-3' (SEQ ID NO:14)(900 bp). CXCR4 프라이머를 상동성 아암 외부에서 어닐링함으로써 HDR 주형을 증폭시키는 것을 피하도록 설계하였다. PCR 반응물은 제조업체의 프로토콜에 따라 고 GC 완충액 중 200 ng의 유전체 DNA 및 Kapa Hot 스타트 고-충실도 중합효소(Kapa Biosystems)를 함유하였다. 써모사이클러 설정은 5분 동안 95℃의 1회 주기, 20초 동안 98℃, 15초 동안 62℃(CXCR4 및 FOXP3 표적 2) 또는 60℃(FOXP3 표적 1) 및 1분 동안 72℃의 35회 주기, 및 1분 동안 72℃의 1회 주기로 구성되었다. PCR 생성물을 SYBR Safe(Life Technologies)를 함유하는 2% 아가로스 젤에서 정제하였다. PCR 생성물을 QIAquick 젤 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 아가로스 젤로부터 용리시켰다. PCR DNA의 농도를 NanoDrop 장치(Thermo scientific)로 정량하였다. T7 엔도뉴클레아제 I 및 HindIII 분석을 위해 200 ng의 PCR DNA를 사용하였다.

T7 엔도뉴클레아제 I 검정에 의한 편집 효율의 분석

편집 효율을 T7 엔도뉴클레아제 I 검정에 의해 결정하였다. T7 엔도뉴클레아제 I은 야생형 및 돌연변이체 DNA 가닥의 하이브리드화로부터 발생하는 미스매치된 헤테로듀플렉스 DNA를 인지하고 절단한다. 하이브리드화 반응은 KAPA 고 GC 완충액 및 50 mM KCl 중 200 ng의 PCR DNA를 함유하였고, 다음과 같은 설정으로 써모사이클러에서 수행하였다: 95℃, 10분, -2℃/초에서 95-85℃, 1분 동안 85℃, -2℃/초에서 85-75℃, 1분 동안 75℃, -2℃/초에서 75-65℃, 1분 동안 65℃, -2℃/초에서 65-55℃, 1분 동안 55℃, -2℃/초에서 55-45℃, 1분 동안 45℃, -2℃/초에서 45-35℃, 1분 동안 35℃, -2℃/초에서 35-25℃, 1분 동안 25℃, 및 4℃에서 유지. 완충액 2 및 5 유닛의 T7 엔도뉴클레아제 I(NEB)을 첨가하여 재어닐링된 DNA를 분해하였다. 37℃에서 1시간의 인큐베이션 후, 반응을 10분 동안 70℃에서 6x 블루 젤(blue gel) 로딩 염료(Thermo Scientific)로 켄칭시켰다. 생성물을 SYBR gold(Life technologies)를 함유하는 2% 아가로스 젤에 용해시켰다. DNA 밴드 강도를 Image Lab을 이용하여 정량하였다. 편집 백분율을 식 (1 - (1 - (b + c / a + b +c))¹ ^/2 ) x 100을 이용하여 계산하였고, 여기서 "a"는 DNA 기질의 밴드 강도이고, "b" 및 "c"는 절단 생성물이다.

HindIII 제한 분해에 의한 HDR의 분석

CXCR4 HDR 주형은 유전자 유전자좌로 HindIII 제한 부위를 도입시킨다. 프라이머 5'- AGA GGA GTT AGC CAA GAT GTG ACT TTG AAA CC -3' (SEQ ID NO:9) 및 5'- GGA CAG GAT GAC AAT ACC AGG CAG GAT AAG GCC -3' (SEQ ID NO:10)을 이용하여 PCR 증폭된 938 bp 영역. 반응물은 CutSmart 완충액(NEB) 중 200 ng의 PCR DNA 및 10 유닛의 HindIII High Fidelity로 구성되었다. 37℃에서 2시간의 인큐베이션 후, 반응을 10분 동안 70℃에서 1 부피의 젤 로딩 염료로 켄칭시켰다. 생성물을 SYBR gold(Life technologies)를 함유하는 2% 아가로스 젤에 용해시켰다. 밴드 강도를 Image Lab을 이용하여 정량하였다. HDR의 백분율을 식 (b + c / a + b +c) x 100을 이용하여 계산하였고, 여기서 "a"는 DNA 기질의 밴드 강도이고, "b" 및 "c"는 절단 생성물이다.

편집된 T 세포의 FACS 분석

CXCR4 세포 표면 염색을 얼음 상에서 15분 동안 αCXCR4-APC(12G5; BD Pharmingen)로 수행하였다. 세포를 항체-매개 내재화 및 항체의 분해를 피하기 위해 세포 분류때까지 염색 절차 전체에 걸쳐 4℃에서 유지시켰다. 세포를 FACS Aria Illu (Becton Dickinson)를 이용하여 분류하였다.

Cas9 RNP-편집된 Treg 및 iTreg의 분석을 위해, 다음과 같은 항체를 사용하였다: αCD-PacificBlue (RPA-T4; BD Pharmingen), αFOXP3-AlexaFluor488 (206D; Biolegend), αCD25-APC (BC96; TONBO Biosciences), αCD127-PECy7 (HIL-7R-M21; BD Pharmingen), αIL-17a-PerCp-Cy5.5 (N49-653; BD Pharmingen), αIL-10-PE (JES3-9D7; BD Pharmingen), αIFNγ-AlexaFluor700 (B27; Biolegend), αCTLA-4-PE (L3D10; Biolegend).

세포를 100 ng/ml PMA (Sigma-Aldrich) 및 1 μg/ml 이오노마이신(Iononmycin)(Sigma-Aldrich)으로 2시간 동안 자극하였다. 1 μM 모넨신(Monensin)(Biolegend)을 3시간의 추가 세포 자극 동안 첨가하였다. 세포를 실온에서 20분 동안 표면 마커에 대해 염색한 후, FOXP3/전사 인자 Fix/Perm(TONBO Biosciences)과 함께 30분 인큐베이션하였다. FOXP3 신호를 증가시키기 위해, Treg을 Flow Cytometry Perm 완충액(TONBO Biosciences) 중 100 U/ml DNAseI(Sigma-Aldrich)와 함께 인큐베이션하였다. iTreg은 이후의 세포 분류 및 T7EI 분석 때문에 DNaseI으로 처리하지 않았다. 세포내 사이토카인 및 전사 인자 염색을 실온에서 30분 동안 수행하였다. Treg을 LSRFortessaDual(Becton Dickinson)로 획득하고, iTreg을 획득하고, FACS Aria Illu(Becton Dickinson)를 이용하여 분류하였다.

통계

3개의 iTreg 분화 실험에서 FOXP3 Cas9 RNP 처리 후 FOXP3⁺ 및 IFNγ 분비 세포의 양을 t-검정을 이용하여 대조군 처리 후의 양과 비교하였다. 표준 편차를 계산하였고, 이는 오차 막대로 표시된다. 분석 결과가 도 4b에 제시되어 있다.

본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시 목적을 위한 것으로, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 암시될 것이고, 이들은 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것이 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적상 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.

참고문헌

실시예 2:

PD-1 엑손 1(sgRNA1에 의해 표적화되는 PD-1 표적 1(SEQ ID NO:75) 및 sgRNA2에 의해 표적화되는 PD-1 표적 2(SEQ ID NO:74)) 및 엑손 2(sgRNA3에 의해 표적화되는 PD-1 표적 3(SEQ ID NO:72) 및 sgRNA4에 의해 표적화되는 PD-1 표적 4(SEQ ID NO:73))에 특이적인 sgRNA를 설계하였다(도 5a). sgRNA 표적 부위에서 유도된 이중 가닥 절단의 주형 지시형 복구를 제공하는 HDR 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO:71)를 또한 생성시켰다(도 5a). sgRNA 1-4를 함유하는 Cas9 RNP를 생성시키고, 일차 인간 효과기 T 세포(CD4⁺CD25^loCD127^hi)로 전달하고, 세포를 회수하였다. FACS에 의한 회수 후의 세포의 분석은 다수의 Cas9 RNP 및 이의 조합을 이용하여 PD-1의 고효율 제거를 나타낸다. PD-1 코딩 서열을 표적으로 하는 Cas9 RNP와 2개의 상이한 HDR 주형의 다양한 조합의 기능적 효과를 PD-1 세포 표면 발현의 FACS 분석에 의해 평가하였다. Cas9 RNP와 2개의 HDR 주형 각각과의 다수의 조합(코딩 서열의 일부를 결실시키고, 조기 정지 코돈 및 새로운 HindIII 제한 효소 분해 부위를 도입하도록 설계됨)으로 제거가 관찰되었다.

본 발명자는 또한 (CAR) CD4+ 및 CD8+ T 세포를 발현하는 키메라 항원 수용체를 편집하였다. T 세포를 상기 기재된 바와 같은 PD-1 Cas9 RNP(PD-1 sgRNA 2)로 편집하였다. PD-1 Cas9 RNP를 이용한 뉴클레오펙션(nucleofection) 후, CAR-GFP 렌티바이러스로 형질도입시켰다. CAR-GFP 발현 및 PD-1 표면 발현 수준을 FACS에 의해 평가하였다. 본 발명자는 PD-1-/저 CAR+ T 세포를 발생시킬 수 있었다.

실시예 3:

Cas9 RNP, FITC 표지된 덱스트란, Pacific Blue(PB) 표지된 덱스트란, 및 자극되지 않은 CD4⁺ T 세포를 함유하는 반응 혼합물을 제공하고, SQZ 세포 압착 장치(SQZ Biotech)를 통해 압착시켰다. 세포를 이중 표지된 세포(FITC 및 PB) 및 표지되지 않은 세포의 집단으로 FACS에 의해 분류하였다. 세포의 2개의 집단을 T7 엔도뉴클레아제 1(T7E1) 검정을 이용하여 Cas9-매개 유전체 편집에 대해 검정하였다. 세포를 Pacific Blue(PB)-표지된 덱스트란(3000 MW) 및 FITC-표지된 덱스트란(500,000 MW)의 흡수를 기초로 하여 분류하였고, T7 엔도뉴클레아제 1 검정으로 둘 모두의 덱스트란을 흡수한 세포에서 편집의 풍부함을 확인하였다. (도 6)

실시예 4:

서문

본 실시예는 실시예 1에서 수행된 실험 뿐만 아니라 추가의 관련된 실험 방법 및 결과의 추가 세부사항을 제공한다. 본 실시예는 Cas9-유도된 이중 가닥 DNA 절단(DSB)의 비-상동성 말단 결합(NHEJ) 복구로부터 발생할 수 있는 무작위 삽입 및 결실 돌연변이로 표적 유전자를 제거하는 본원에 기재된 방법 및 조성물의 능력을 입증한다. CXCR4에서 유전체 편집이 있는 세포는 낮은 CXCR4 발현에 기초한 분류에 의해 풍부화될 수 있다. 본 실시예는 Cas9 RNP 및 외인성 단일 가닥 DNA 주형을 이용한 상동성-지시형 복구(HDR)에 의해 CXCR4 및 PD-1에서 일차 T 세포 내에 정확하게 표적화된 뉴클레오티드 대체를 도입시키기 위해 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하는 능력을 추가로 입증한다. 이러한 기술은 '넉인' 일차 인간 T 세포의 Cas9-매개 생성을 가능하게 하였다. 표적 부위의 딥 시퀀싱은 Cas9 RNP가 전체 편집 사건의 약 1/3 이하를 차지하는 약 20% 이하의 효율(50 pmol의 HDR 주형으로 약 22%가 달성되고, 100 pmol의 HDR 주형으로 약 18%가 달성됨)로 '넉인' 유전체 변형을 촉진시킨 것을 입증하였다. 이러한 결과는 Cas9 RNP-매개 뉴클레오티드 대체가 질병-관련 돌연변이의 치료적 교정에 유용한 것을 증명할 수 있음을 제시한다. 이는 일차 인간 T 세포에서 유전체의 실험적 및 치료적 넉아웃 및 넉인 편집에 대한 Cas9 RNP 기술의 유용성을 확립한다.

결과

본원에 기재된 방법 및 조성물은 일차 T 세포의 유전학적 조작에서의 장기간의 난제를 극복하고, 효율적인 유전체 공학처리 툴킷을 확립한다. 포유동물 세포주에서의 최근의 보고는 Cas9 RNP가 효율적이고 특정한 유전체 편집을 달성할 수 있음을 암시한다(15-18). 본원에 기재된 실험은 일차 인간 T 세포에서의 표적화된 유전체 편집을 위한 Cas9 RNP 전달의 효능을 입증한다(도 7a).

Cas9 RNP를 이용한 HIV 공동-수용체 CXCR4의 제거. T 세포 공학처리에서의 주요 목적은 HIV 감염에 대한 공동-수용체 및 종양 면역 반응을 손상시키는 공동-억제 면역 체크포인트를 포함하는 특정 세포 표면 수용체의 표적화된 제거이다. 본 실시예는 CD4⁺ T 세포에서 발현되고, HIV 진입을 위한 공동-수용체로 작용하는 조혈 및 세포 귀소에서 다수의 역할을 갖는 케모카인 수용체를 인코딩하는 CXCR4의 엑손 서열을 표적화하도록 프로그램된 Cas9 RNP의 사용을 입증한다(19-21). C 말단에서 융합된 2개의 핵 국소화 신호 서열(NLS)을 갖는 정제된 재조합 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9을 사용하였다. 이러한 Cas9 단백질을 인간 CXCR4 유전체 서열을 독특하게 인지하도록 설계된 시험관내 전사된 단일-가이드 RNA(sgRNA)와 함께 인큐베이션하였다(도 1b). 이들 사전 조립된 Cas9 RNP 복합체를 건강한 공여자로부터 분리된 인간 CD4⁺ T 세포로 전기천공시켰다.

CXCR4 Cas9 RNP의 전기천공은 유전체 DNA의 효율적인 부위 특이적 편집을 유발시켰다. CXCR4 유전자 내에서의 Cas9 RNP-유도 DSB는 가변적인 삽입 및 결실(삽입결실)을 발생시키고, 종종 프레임시프트 돌연변이 및 유전자 기능의 손실을 발생시키는 세포에서의 우세한 DNA 복구 경로인 NHEJ에 의해 복구되었을 수 있다(22). 흐름세포측정법은 CXCR4 유전자의 돌연변이와 일치하는 낮은 수준의 CXCR4를 발현하는 T 세포의 백분율에서의 Cas9 RNP 용량-의존적 증가를 나타내었다(도 7c). T7 엔도뉴클레아제 I(T7E1) 검정은 유전체 내의 특정 부위에서의 편집을 평가하기에 편리한 방법이다. 여기서, T7E1 검정은 CXCR4 Cas9 RNP로 처리된 세포 내의 CXCR4 유전자좌에서 유전체 DNA 편집을 확인하였으나, Cas9 단백질 단독(sgRNA 없음; CTRL)으로 처리된 대조군 세포에서는 확인되지 않았다. Cas9 RNP-처리된 세포를 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 CXCR4 발현을 기초로 하여 분리하였다. T7E1 검정을 이용하여, CXCR4^hi 세포(가변적인 용량의 Cas9 RNP를 이용하여 4-12%)에 비한 CXCR4^lo 세포에서의 편집의 풍부화(15-17%)가 발견되었다(도 7d). 편집 사건을 직접 확인하기 위해 수행된 표적 CXCR4 유전체 부위의 생거 시퀀싱은 T7E1 검정이 편집 효율을 과소 평가했을 수 있음을 암시하였다. T7E1 검정은 야생형 및 돌연변이체 서열의 변성 및 하이브리드화를 이용하여 이후에 T7 엔도뉴클레아제에 의해 분해되는 미스매치 DNA 듀플렉스를 생성시킨다. 그러나, 미스매치 듀플렉스의 하이브리드화는 특히 삽입결실 돌연변이가 야생형 서열과 크게 다른 경우에 비효율적일 수 있으며, 이는 자가-하이브리드화를 에너지적으로 더욱 바람직한 생성물로 만든다. 엔도뉴클레아제 검정을 이용한 편집 효율의 관찰된 과소평가에 대한 다른 잠재적 이유는 불완전한 듀플렉스 용융, 단일 염기쌍 삽입결실의 비효율적인 절단, 및 큰 유전체 편집의 결과로서 아가로스 젤 상에서의 예상된 300 및 600 염기쌍 생성물의 편차를 포함한다(23). CXCR4^lo 세포에서의 CXCR4 유전자의 시퀀싱은 5/6 클론이 돌연변이/결실을 갖는 반면, 이러한 돌연변이/결실이 CXCR4^hi 및 CTRL 처리된 CXCR4^lo 세포에서 각각 4/10 클론 및 0/9 클론에서만 관찰된 것을 나타내었다. 중요하게는, CXCR4^hi 집단에서 관찰된 편집 중 어느 것도 코딩 서열(1개의 미스센스 돌연변이 및 3개의 인-프레임 결실)을 종결시키지 않았으며, 이는 단백질 발현의 유지와 일치한다. 대조적으로, CXCR4^lo 집단은 유전자좌 내에 더욱 광범위한 돌연변이 부담을 갖는 세포에 대해 풍부해졌다(도 7e). 이들 결과는 Cas9 RNP를 이용한 성공적인 유전체 표적화 및 인간 CD4⁺ T 세포에서의 단백질 발현에 대한 기능적 효과를 입증하였다. FACS는 편집된 세포의 집단을 농축화시킬 수 있어, 일차 T 세포에서 Cas9 RNP 적용을 위한 추가의 유용한 도구를 제공한다.

상동성 지시형 복구( HDR )를 이용한 효율적인 유전학적 '넉-인'. 외인성 주형-매개 HDR은 특정 변이체 서열의 실험적 및 치료적 편집을 가능하게 할 수 있는 정확한 유전자 변형을 위한 강력한 기술이다. Cas9 RNP의 높은 편집 효율을 고려하여, 본 발명자는 다음으로 일차 T 세포에서 외인성 주형-매개 HDR이 달성될 수 있는지의 여부를 시험하였다. Cas9 RNP 절단 부위에서 CXCR4 유전자좌와 조합시키기 위해 90개의 뉴클레오티드 상동성 아암을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형(HDR 주형)을 사용하였다(16). CXCR4 HDR 주형을 CRISPR-매개 DNA 절단에 필요한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 포함하여 인간 참조 유전체로부터 12개의 뉴클레오티드를 대체하고, HindIII 제한 효소 절단 부위를 도입하도록 설계하였다(도 8a). Cas9 RNP를 4개의 상이한 농도의 CXCR4 HDR 주형(0, 50, 100 및 200 pmol; 보충 정보의 재료 및 방법 참조)의 존재하에서 일차 CD4⁺ T 세포로 전기천공시켰다. HDR 주형이 없는 Cas9 RNP는 다시 CXCR4^hi 세포의 백분율을 감소시켰다. 특히, 본 실험에서, CXCR4 HDR 주형의 첨가는 CXCR4 제거의 효능을 개선시켰으나, 세포 표면 발현에 대한 이러한 효과는 모든 실험에서 관찰되지는 않았다(도 9a). 본원에 제시된 실험에서, 세포의 약 60%는 100 pmol HDR 주형 및 Cas9 RNP로 높은 수준의 세포 표면 CXCR4 발현을 상실한다(대조군 처리된 세포에서의 60%에 비해 1%)(도 8b 및 c).

Cas9 RNP 및 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 HDR 주형으로 처리된 세포에서 매우 효율적인 HDR이 관찰되었다(도 8d). T7E1 검정에 의해 평가된 바와 같이 50 pmol CXCR4 HDR 주형의 존재하에서 33% 이하의 전체 편집(Cas9 절단 부위에서 삽입결실을 발생시키는 모든 NHEJ 및 HDR 사건의 합계로 정의됨)이 관찰되었다. 이러한 농도에서, 14% HDR은 표적 유전자좌의 HindIII 분해에 의해 평가되었으며, 이는 편집의 높은 분획이 HDR로부터 발생되었음을 나타낸다(추가 정량을 위해 하기 결과 참조). HDR 주형의 첨가를 이용한 CXCR4 염색의 거의 완전한 손실은 HDR에 의해 도입된 돌연변이(84DLLFV88 → 84ESLDP88)가 CXCR4의 세포 표면 발현 또는 항체에 의한 이의 인지에 강하게 영향을 미친 것을 암시한다(도 8b 및 c). 아마도 세포 독성의 결과로서 200 pmol HDR 주형으로 편집 효율이 감소되었다.

전체 편집 및 HDR 둘 모두는 CXCR4^lo 집단을 분류함으로써 풍부해질 수 있었으나, 효과는 도 7에서보다 덜 현저하였고, 이는 분류되지 않은 집단에서의 CXCR4^lo 세포의 더 큰 분획과 일치한다. 이들 실험에서 더욱 엄격한 게이트가 CXCR4의 가장 높은 발현을 갖는 세포를 분리하기 위해 적용되었고, 이러한 CXCR4^hi 집단에서 편집이 관찰되지 않은 것을 주목한다. 이들 연구는 일차 인간 T 세포에서 표적화된 DNA 서열을 정확하게 대체하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 HDR 주형과 커플링된 Cas9 RNP의 능력을 집합적으로 입증하였다.

표적 유전체 DNA의 딥 시퀀싱. 표적화된 CXCR4 유전자좌의 딥 시퀀싱은 유전체 편집 사건의 더욱 상세하고 정량적인 분석을 가능하게 하였다. 도 10에서 강조된 결과는 대조군 처리된 세포와 비교하여 CXCR4 HDR 주형을 갖거나 갖지 않는 CXCR4 Cas9 RNP-처리된 세포에서 삽입, 결실 및 HDR-매개 뉴클레오티드 대체의 빈도를 제시한다. CXCR4 Cas9 RNP 처리된 세포에서, 본 발명자는 예상 절단 부위를 중심으로 200개의 뉴클레오티드 범위 내에 적어도 하나의 삽입결실을 함유하는 CXCR4 표적 부위와 중첩되는 55%의 판독을 발견하였다(도 10a, b). 상기 논의된 바와 같이, T7E1 검정은 편집된 유전자좌를 확인하는데 유용하나, 실제 편집 효율을 과소평가할 수 있다(도 8d에서의 T7E1 검정의 정량은 딥-시퀀싱에 의해 계산된 55% 편집 효율에 비해 33% 편집을 암시하였다). 본 발명자는 또한 CXCR4 Cas9 RNP에 대한 2개의 상위 예측된 '표적외' 부위를 시퀀싱하였다(도 10b). 희귀한 삽입결실이 둘 모두의 표적외 부위에서 관찰되었으나(약 1-2%), Cas9 단백질만 처리된 대조군 세포 내의 부위에 대해 관찰된 것과 동등한 비율(약 1-2%)로 관찰되었다.

딥 시퀀싱 결과는 관찰된 삽입결실 돌연변이 및 표적 영역에서의 이들의 공간적 분포의 정량적 분석을 가능하게 하였다. S. 피오게네스 Cas9이 PAM 서열로부터 약 3개의 뉴클레오티드 업스트림을 절단한다는 보고와 일치하게, 본 발명자는 PAM의 4개의 뉴클레오티드 업스트림에서 삽입결실의 가장 높은 빈도를 발견하였다(도 10a). 삽입결실은 시퀀싱된 영역 전체에 걸쳐 분포하였으며(도 10c 및 d), 사건의 대부분은 절단 부위 근처에 있었다(40개의 뉴클레오티드 내에서 94% 초과). CXCR4 Cas9 RNP 처리된 세포에서, 절단 부위로부터 +/- 100개 뉴클레오티드 내에서, 본 발명자는 삽입결실을 갖는 판독의 95%가 결실을 함유한 한편 10%가 삽입 사건을 함유한 것을 관찰하였다. 흥미롭게도, 삽입 사건을 갖는 판독 중, 약 50%가 또한 적어도 하나의 결실을 함유하였다. 본 발명자는 광범위한 삽입 및 결실 크기를 관찰하였으며, 많은 판독이 약 80개 이하의 뉴클레오티드 길이의 결실(평균 18개의 뉴클레오티드, SD 15 뉴클레오티드) 및 약 55개 이하의 뉴클레오티드 길이의 일부 삽입(평균 4.4개의 뉴클레오티드, SD 4.8 뉴클레오티드)을 나타내었다(도 10c, d 및 11). 상기 범위의 삽입결실 크기 및 위치는 도 7에서 CXCR4^lo 선택된 세포의 생거 시퀀싱에서 관찰된 광범위한 돌연변이 부담과 일치하였다.

딥 시퀀싱은 Cas9 RNP 및 CXCR4 HDR 주형 둘 모두로 처리된 세포에서만 CXCR4 유전자좌에서 12개의 뉴클레오티드의 성공적인 표적화되 대체를 확인하였다. 본 발명자는 50 pmol HDR 주형을 이용한 HDR 주형 서열의 25% 혼입 및 100 pmol HDR 주형을 이용한 HDR 주형 서열의 21% 혼입을 관찰하였다(도 10a). 혼입된 HDR 주형 서열을 갖는 판독 중, 검출된 HDR 주형 판독의 약 14%는 혼입된 HindIII 부위를 둘러싼 추가의 비특이적인 삽입결실 또는 예측된 절단 부위에 중심을 둔 200개의 뉴클레오티드 범위 내의 다른 불완전한 형태의 편집을 가졌다. 그러나, 혼입된 HindIII 부위를 갖는 판독에서 삽입결실의 빈도는 HindIII 부위가 검출되지 않은 판독에 비해 감소되었다(도 10c, d 및 11). 흥미롭게도, 2개의 뉴클레오티드(11%) 및 22개의 뉴클레오티드(5.4%)의 결실이 풍부한 CXCR4 HDR 주형을 갖거나 갖지 않는 CXCR4 Cas9 RNP 사이에서 결실 사건의 일치하는 패턴이 있었다(도 11). PAM 서열의 대체는 '넉인' 서열의 재절단을 제한하는 것을 도왔을 수 있다. 전체적으로, 판독의 18-22%(다양한 농도의 HDR 주형을 가짐)는 시퀀싱된 유전체 표적 부위 전체에 걸친 정확하게 대체된 뉴클레오티드를 가졌으며, 이는 이러한 접근법이 실험적 및 치료적 뉴클레오티드 '넉인' 일차 인간 T 세포의 생성에 유용한 것을 증명할 수 있음을 암시한다.

주요 세포 표면 수용체의 특정한 '넉인' 표적화 . Cas9 RNP가 다른 유전체 부위에서 HDR을 매개하는 것을 확인하기 위해, 본 발명자는 PD-1(PDCD1) 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA 및 HDR 주형을 설계하였다. PD-1은 암의 효과적인 T 세포-매개 청소를 억제할 수 있는 만성적으로 활성화되거나 소진된 T 세포의 표면에서 발견되는 '면역 체크포인트' 세포 표면 수용체이다. PD-1의 모노클로날 항체 봉쇄는 진행된 악성종양의 치료에 대해 승인되어 있으며, PD-1의 유전학적 결실은 세포 기반 암 면역요법을 위해 T 세포를 공학처리하는데 유용함을 증명할 수 있다(12). 프레임시프트 돌연변이를 발생시키고, PD-1의 첫번째 엑손에서 HindIII 제한 부위를 '넉인'시켜 PAM 서열을 대체하도록 설계된 PD-1 Cas9 RNP 및 PD-1 HDR 주형으로 일차 인간 T 세포를 전기천공시켰다(도 12a).

Cas9 RNP-매개 표적화의 특이성을 시험하기 위해, 본 발명자는 PD-1 Cas9 RNP 대 CXCR4 Cas9 RNP(PD-1 유전자좌를 표적화해서는 안됨) 또는 스크램블된 가이드 Cas9 RNP(인간 유전체 내에 예측 절단이 없음)를 이용한 처리 후에 PD-1 세포 표면 발현을 비교하였다. 본 발명자는 2명의 상이한 혈액 공여자 및 2개의 상이한 시험관내 전사 프로토콜(보충 정보의 재료 및 방법 참조)로 생성된 sgRNA로 나란히 반복 실험을 수행하였다. PD-1 HDR 주형으로 전기천공된 PD-1 Cas9 RNP는 CXCR4 Cas9 RNP 및 PD-1 HDR 주형과 함께 전달된 스크램블된 가이드 Cas9 RNP 둘 모두에 비해 높은 PD-1 세포 표면 발현을 갖는 세포의 백분율을 유의하게 감소시켰다(도 12b). 유사하게, CXCR4 Cas9 RNP 및 CXCR4 HDR 주형은 PD-1 및 CXCR4 HDR 주형과 함께 스크램블된 가이드 Cas9 RNP 처리 둘 모두에 비해 CXCR4^hi 세포 집단에서 감소를 야기시켰다(도 12c). CXCR4의 손실은 CXCR4 Cas9 RNP와 함께 전달된 단일 가닥 DNA의 비특이적 효과가 아니었으며, 본 발명자는 CXCR4 Cas9 RNP 및 CXCR4 HDR 주형을 이용한 처리보다 CXCR4 Cas9 RNP 및 스크램블된 HDR 주형을 이용한 처리 후에 더 높은 백분율의 CXCR4 발현 세포를 관찰하였다(도 9a). 이들 발견은 프로그램화 가능한 Cas9 RNP 및 HDR 주형 처리로 일차 T 세포에서 세표 표면 수용체 발현의 표적-특이적 조절을 확인하였다.

이후, 본 발명자는 뉴클레오티드 대체에 대한 HDR 주형의 특이성을 시험하였다(도 12d; 해당 세포 표면 발현 데이터의 예는 도 9b에 제시되어 있다). 예상된 바와 같이, 본 발명자는 PD-1 HDR 주형, CXCR4 HDR 주형과 함께, 또는 임의의 HDR 주형이 없이 전달되었는지의 여부와 상관 없이 PD-1 Cas9 RNP에 의한 효율적인 PD-1 편집을 관찰하였다. 대조적으로, HindIII 부위는 PD-1 Cas9 RNP 및 PD-1 HDR 주형 둘 모두의 존재하에서만 PD- 1으로 혼입되었으나, CXCR4 HDR 주형으로는 그렇지 않았으며, 이는 서열 상동성의 결핍으로 인해 PD-1 유전자좌에서 조합되어야 한다. 유사하게, HindIII 부위는 CXCR4 Cas9 RNP 및 CXCR4 HDR 주형을 이용한 처리 후에만 CXCR4로 혼입되었고; PD-1 HDR 주형, 대조군의 스크램블된 HDR 주형(HindIII 부위를 가짐)을 갖거나 HDR 주형을 갖지 않는 CXCR4 유전자좌에서 HDR은 관찰되지 않았다(도 12d). 종합적으로, 이들 연구는 프로그램화된 Cas9 RNP 및 해당 HDR 주형의 특정 쌍형성이 일차 인간 T 세포에서 표적화된 뉴클레오티드 대체를 제공할 수 있음을 확립하였다.

재료 및 방법

인간 T 세포 분리 및 배양. 인간 일차 T 세포를 신선한 전혈 또는 백혈구 연층으로부터 분리하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll 구배 원심분리에 의해 분리시켰다. CD4⁺ T 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 Easysep Human CD4⁺ T 세포 풍부화 키트(Stemcell technologies)로 사전 풍부화시켰다. 사전 풍부화된 CD4⁺ T 세포를 다음과 같은 항체로 염색하였다: αCD4-PerCp (SK3; Becton Dickinson), αCD25-APC (BC96; TONBO Biosciences), αCD127-PE (R34-34; TONBO Biosciences), αCD45RA-violetFluor450 (HI100; TONBO Biosciences) 및 αCD45RO-FITC (UCHL1; TONBO Biosciences). CD4⁺CD25^loCD127^hi T 효과기(Teff)를 FACS Aria Illu(Becton Dickinson)를 이용하여 분리하였다.

Cas9 RNP 조립 및 전기천공. 10분 동안 37℃에서 20 μM HEPES(pH 7.5), 150 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10% 글리세롤 및 1 mM TCEP 중에서 1:1의 비로 20 μM Cas9와 20 μM sgRNA를 10 μM의 최종 농도로 인큐베이션시킴으로써 Cas9 RNP를 실험 직전에 제조하였다. T 세포를 Neon 트랜스펙션 키트 및 장치(Invitrogen)로 전기천공하였다.

유전체 편집의 분석. 편집 효율을 T7 엔도뉴클레아제 I 검정에 의해 평가하였다. HDR 주형을 표적화된 유전자 유전자좌로 HindIII 제한 부위를 도입시키도록 설계하였고; 성공적인 HDR을 HindIII 제한 효소 분해로 확인하였다. CXCR4 표적내 및 2개의 예상 표적외 유전자에 대해 Cas9 표적 부위의 영역이 측접한 유전체 DNA 라이브러리를 2 단계 PCR 방법으로 조립하고, Illumina HiSeq 2500으로 시퀀싱하였다.

보충 정보의 재료 및 방법

인간 T 세포 분리 및 배양. 인간 일차 T 세포를 신선한 전혈 또는 백혈구 연층으로부터 분리하였다(Stanford Blood Center). UCSF 인간 연구 위원회(CHR)의 승인을 얻어 전혈을 인간 공여자로부터 소듐 헤파린 처리된 진공채혈관(Becton Dickinson)으로 수거하고, 12시간 이내에 처리하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll 구배 원심분리에 의해 분리시켰다. 신선한 혈액을 Ca² ⁺ 및 Mg² ⁺ 비함유 행크 평형 염 용액(HBSS)과 1:1 비로 혼합하였고, 백혈구 연층을 HBSS로 1:10의 비로 희석시켰다. 30 ml의 각각의 HBSS/혈액 용액을 50 ml Falcon 튜브로 옮기고, 12 ml Ficoll-Paque PLUS(Amersham/GE healthcare) 밑에 두었다. 밀도 구배 원심분리(1000g, 20분, 브레이크 없음) 후, PBMC 층을 조심스럽게 제거하고, 세포를 Ca² ⁺ 및 Mg² ⁺ 비함유 HBSS로 2회 세척하였다. CD4⁺ T 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 Easysep Human CD4⁺ T 세포 풍부화 키트(Stemcell technologies)로 사전 풍부화시켰다. 사전 풍부화된 CD4⁺ T 세포를 다음과 같은 항체로 염색하였다: αCD4-PerCp (SK3; Becton Dickinson), αCD25-APC (BC96; TONBO Biosciences), αCD127-PE (R34-34; TONBO Biosciences), αCD45RA-violetFluor450 (HI100; TONBO Biosciences) 및 αCD45RO-FITC (UCHL1; TONBO Biosciences). CD4⁺CD25^loCD127^hi T 효과기(Teff)를 FACS Aria Illu(Becton Dickinson)를 이용하여 분리하였다. Teff 순도는 97% 초과였다.

Cas9 RNP 트랜스펙션을 위해, 전혈로부터 분리된 효과기 CD4⁺ T 세포를 48시간 동안 αCD3 (UCHT1; BD Pharmingen) 및 αCD28(CD28.2; BD Pharmingen) 코팅된 플레이트에서 사전 활성화시켰다. 플레이트를 37℃에서 적어도 2시간 동안 10 μg/ml의 PBS 중 αCD3 및 αCD28로 코팅하였다. 백혈구 연층 유래 T 세포를 RPMI 완전 배지에 직접 첨가된 5 μg/ml αCD28과 함께 10 μg/ml αCD3(PBS 중, 37℃에서 적어도 2시간)로 코팅된 플레이트에서 활성화시켰다.

T 세포를 RPMI 완전 배지(5 mmol/l 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES)(UCSF CCF), 2 mmol/l Glutamax(Gibco), 50 μg/ml 페니실린/스트렙토마이신(Corning), 50 μmol/l 2-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich), 5 mmol/l 비필수 아미노산(Corning), 5 mmol/l 소듐 피루베이트(UCSF CCF), 및 10% 소 태아 혈청(Atlanta Biologicals)이 보충된 RPMI-1640 (UCSF CCF))에서 활성화시켰다. 전기천공 후, 배지에 40 IU/ml의 IL-2를 보충하였다.

Cas9의 발현 및 정제. 본 연구에서 사용된 재조합 S. 피오게네스 Cas9은 C-말단에서 HA 태그 및 핵막을 가로지르는 운반을 촉진하는 2개의 핵 국소화 신호 펩티드를 갖는다. 단백질은 플라스미드 pMJ915로부터 E. 콜리 Rosetta 2 세포(EMD Millipore)에서 N-말단 헥사히스티딘 태그 및 말토스 결합 단백질을 갖도록 발현되었다. His 태그 및 말토스 결합 단백질을 TEV 프로테아제에 의해 절단시키고, Cas9을 문헌[Jinek M, et al. (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337(6096):816-821]에 기재된 프로토콜에 의해 정제하였다. Cas9을 -80℃에서 pH 7.5의 20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% (v/v) 글리세롤, 1 mM 트리스(2-클로로에틸) 포스페이트(TCEP) 중에 보관하였다.

PAGE 정제를 이용한 sgRNA의 시험관내 T7 전사. T7 프로모터, 20개의 뉴클레오티드(nt) 표적 서열 및 키메라 sgRNA 스캐폴드를 인코딩하는 DNA 주형을 중첩 PCR에 의해 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립하였다. 간단히, CXCR4 sgRNA 주형에 대해, PCR 반응물은 제조업체의 프로토콜에 따라 SLKS3 (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA GCG TGA TGA CAA AGA GGG TTT TAG AGC TAT GCT GGA AAC AGC ATA GCA AGT TAA AAT AAG G -3'; SEQ ID NO:3) 및 SLKS1 (5'- GCA CCG ACT CGG TGC CAC TTT TTC AAG TTG ATA ACG GAC TAG CCT TAT TTT AAC TTG CTA TGC TGT TTC CAG C -3'; SEQ ID NO:4)의 20 nM 프리믹스, T25 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3'; SEQ ID NO:5) 및 SLKS1 (5'- GCA CCG ACT CGG TGC CAC TTT TTC AAG -3'; SEQ ID NO:6)의 1 μM 프리믹스, 200 μM dNTP 및 Phusion 중합효소(NEB)를 함유한다. 써모사이클러 설정은 10초 동안 95℃, 10초 동안 57℃ 및 10초 동안 72℃의 30주기로 구성되었다. PCR 생성물을 페놀:클로로포름:이소아밀알콜로 1회 추출한 후, 클로로포름으로 1회 추출하고, -20℃에서 밤새 이소프로판올 침전시켰다. DNA 펠렛을 70% (v/v) 에탄올로 3회 세척하고, 진공에 의해 건조시키고, 디에틸피로카르보네이트(DEPC)-처리된 물에 용해시켰다. PD-1 sgRNA 주형을 동일 절차에 의해 T25, SLKS1, SLKS2 및 SLKS11 (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG CGA CTG GCC AGG GCG CCT GTG TTT TAG AGC TAT GCT GGA AAC AGC ATA GCA AGT TAA AAT AAG G -3'; SEQ ID NO:15)로부터 조립하였다.

100 μl의 T7 시험관내 전사 반응물은 30 mM Tris-HCl (pH 8), 20 mM MgCl₂, 0.01% (v/v) Triton X-100, 2 mM 스퍼미딘, 10 mM 신선한 디티오트레이톨, 5 mM의 각각의 리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 100 μg/ml T7 Pol 및 0.1 μM DNA 주형으로 구성되었다. 반응물을 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 5 유닛의 RNase-비함유 DNaseI(Promega)을 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 DNA 주형을 분해하였다. 반응을 5분 동안 60℃에서 2xSTOP 용액(95% (v/v) 탈이온화 포름아미드, 0.05% (w/v) 브로모페놀 블루 및 20 mM EDTA)으로 켄칭시켰다. RNA를 6M 우레아를 함유하는 10% (v/v) 폴리아크릴아미드 젤에서의 전기영동에 의해 정제하였다. RNA 밴드를 젤로부터 절제하고, 50 ml 튜브에서 분쇄시키고, 가벼운 진동과 함께 4℃에서 밤새 25 ml의 300 mM 소듐 아세테이트(pH 5)로 밤새 용리시켰다. 이후, 용액을 10분 동안 4000g에서 원심분리시키고, RNA 상층액을 0.45 μm 필터를 통해 통과시켰다. -20℃에서 밤새 1 당량의 이소프로판올을 여과된 상층액에 첨가하여 RNA를 침전시켰다. RNA 펠렛을 원심분리에 의해 수거하고, 70% (v/v) 에탄올로 3회 세척하고, 진공에 의해 건조시켰다. sgRNA를 재폴딩시키기 위해, RNA 펠렛을 먼저 20 mM HEPES(pH 7.5), 150 mM KCl, 10% (v/v) 글리세롤 및 1 mM TCEP에 용해시켰다. sgRNA를 5분 동안 70℃로 가열하고, 실온으로 냉각시켰다. MgCl₂를 1 mM의 최종 농도로 첨가하였다. sgRNA를 다시 5분 동안 50℃로 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 얼음 상에서 유지시켰다. sgRNA 농도를 Nanodrop을 이용하여 OD_260nm에 의해 결정하고, 20 mM HEPES(pH 7.5), 150 mM KCl, 10% (v/v) 글리세롤, 1 mM TCEP 및 1 mM MgCl₂를 이용하여 100 μM로 조정하였다. sgRNA를 -80℃에서 보관하였다.

페놀/클로로포름 추출을 이용한 sgRNA의 시험관내 T7 전사. 시험관내 T7 전사를 위한 DNA 주형을 상보적 단일 가닥 울트라머(ultramer)를 어닐링시킴으로써 생성시켰다(울트라머 서열: CXCR4_1: 5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA GCG TGA TGA CAA AGA GGG TTT TAG AGC TAT GCT GGA AAC AGC ATA GCA AGT TAA AAT AA GGC TAG TCC GTT ATC AAC TTG AAA AAG TGG CAC CGA GTC GGT G-3' (SEQ ID NO:16); CXCR4_2: 5'- CAC CGA CTC GGT GCC ACT TTT TCA AGT TGA TAA CGG ACT AGC CTT ATT TTA ACT TGC TAT GCT GTT TCC AGC ATA GCT CTA AAA CCC TCT TTG TCA TCA CGC TTC CTA TAG TGA GTC GTA TTA-3' (SEQ ID NO:17); PD-1_1: 5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG CGA CTG GCC AGG GCG CCT GTG TTT TAG AGC TAT GCT GGA AAC AGC ATA GCA AGT TAA AAT AAG GCT AGT CCG TTA TCA ACT TGA AAA AGT GGC ACC GAG TCG GTG C-3' (SEQ ID NO:18); PD-1_2: 5'- GCA CCG ACT CGG TGC CAC TTT TTC AAG TTG ATA ACG GAC TAG CCT TAT TTT AAC TTG CTA TGC TGT TTC CAG CAT AGC TCT AAA ACA CAG GCG CCC TGG CCA GTC GCT ATA GTG AGT CGT ATT A-3' (SEQ ID NO:19)). 울트라머를 뉴클레아제 비함유 듀플렉스 완충액(IDT) 중에서 1:1 비로 혼합하고, 2분 동안 95℃ 이하에서 가열한 후, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.

100 μl의 T7 시험관내 전사 반응물은 1x 전사 최적화 완충액(Promega), 10 mM의 신선한 디티오트레이톨, 2 mM의 각각의 리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 400U의 T7 Pol(Promega), 0.5U의 피로포스파타제(Life technologies) 및 2 μg의 DNA 주형을 함유하였다. 반응물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 5U의 RNase 비함유 DNaseI(Promega)을 첨가하여 30분 동안 37℃에서 DNA 주형을 분해하였다. 반응을 5 μL의 0.5M EDTA로 중지시켰다.

PAGE 정제 동안 웰들 사이의 핵산 변화의 가능성에 대한 우려를 감안하여, 본 발명자는 도 12 및 9a에 표시된 대로 페놀/클로로포름 정제된 sgRNA를 PAGE 정제된 sgRNA와 나란히 시험하였다. 페놀/클로로포름 추출을 190 μl의 RNA 비함유 H₂O의 첨가 후에 수행하였다. sgRNA를 80 μl의 3M 소듐 아세테이트 및 420 μl의 이소프로포날(isoproponal)로 침전시키고, 4시간 동안 -20℃에서 인큐베이션하였다. RNA 펠렛을 70%(v/v) EtOH로 2회 및 100%(v/v) EtOH로 1회 세척하였다. 진공 건조된 펠렛을 재구성시키고, sgRNA를 "PAGE 정제를 이용한 sgRNA의 시험관내 T7 전사"에 기재된 바와 같이 재폴딩시켰다.

Cas9 RNP 조립 및 전기천공. 10분 동안 37℃에서 20 μM HEPES(pH 7.5), 150 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10% (v/v) 글리세롤 및 1 mM TCEP 중에서 1:1의 비로 20 μM Cas9과 20 μM sgRNA를 10 μM의 최종 농도로 인큐베이션시킴으로써 Cas9 RNP를 실험 직전에 제조하였다.

T 세포를 Neon 트랜스펙션 키트 및 장치(Invitrogen)로 전기천공하였다. 2.5 x 10⁵개의 T 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 8 μl의 완충액 T(Neon kit, Invitrogen)에 재현탁시켰다. Cas9 RNP(2 μl의 sgRNA가 없는 10 μM Cas9 CTRL 또는 1 - 2 μl Cas9:sgRNA RNP; 최종 농도 0.9 - 1.8 μM) 뿐만 아니라 HDR 주형(표시된 바와 같이 0 - 200 pmol)을 11 μL의 최종 부피(Cas9 보관 완충액으로 조정됨)로 세포 현탁액에 첨가하고, 혼합하였다. 10 μl의 현탁액을 Neon 전기천공 장치(Invitrogen; 1600V, 10 msec, 3 펄스)로 전기천공시켰다. CXCR4 및 PD-1에 대한 HDR 주형은 표적 서열에 상보적인(안티센스 가닥) 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이며, 90-nt 상동성 아암과 함께 HindIII 제한 서열을 함유한다. 성공적인 HDR 시, 각각의 PAM 부위가 결실되며, 이는 Cas9 RNP에 의한 편집된 부위의 재절단을 방지해야 한다. PD-1 HDR 주형은 추가로 12 nt를 11 nt로 대체함으로써 아미노산 위치 25만큼 초기에 프레임시프트 및 넌센스 돌연변이를 야기시킨다(CXCR4 HDR 주형: 5'-GGG CAA TGG ATT GGT CAT CCT GGT CAT GGG TTA CCA GAA GAA ACT GAG AAG CAT GAC GGA CAA GTA CAG GCT GCA CCT GTC AGT GGC CGA AAG CTT GGA TCC CAT CAC GCT TCC CTT CTG GGC AGT TGA TGC CGT GGC AAA CTG GTA CTT TGG GAA CTT CCT ATG CAA GGC AGT CCA TGT CAT CTA CAC AGT-3' (SEQ ID NO:8); PD-1 HDR 주형: 5'-AAC CTG ACC TGG GAC AGT TTC CCT TCC GCT CAC CTC CGC CTG AGC AGT GGA GAA GGC GGC ACT CTG GTG GGG CTG CTC CAG GCA TGC AGA TAA TGA AAG CTT CTG GCC AGT CGT CTG GGC GGT GCT ACA ACT GGG CTG GCG GCC AGG ATG GTT CTT AGG TAG GTG GGG TCG GCG GTC AGG TGT CCC AGA GC-3' (SEQ ID NO:20)). CXCR4 HDR 대조군 공여체는 HindIII 제한 부위를 함유하는 본래의 CXCR4 HDR 주형에 대한 서열 스크램블된 형태이다(CXCR4 대조군 HDR 주형: 5'- TTC AAA ACT AGC GTC AGG GGC TCG ATT TAC TCG GGA CTT GCT ACA ACA TCG CAG TCA CGC GCA CGA TCC TTC CAG GAT TGG AGG TGG ACT TAG ATA AAG CTT CCG TGT GCA CCG TAT AGA TTC GTT GAT GCA GGC TAT TCC CGT GAT CCC ACG CGG AGG TGA TGG AGC GTC AAG CAT AGC TAG CAC AGA TGA -3' (SEQ ID NO:21))

전기천공된 T 세포를 αCD3/CD28 코팅된 48-웰 플레이트 중의 500 μl의 이들 각각의 배양 배지로 옮겼다. 플레이트를 37℃에서 적어도 2 시간 동안 10 μg/ml의 PBS 중의 αCD3(UCHT1; BD Pharmingen) 및 αCD28(CD28.2; BD Pharmingen)로 코팅하였다. 전기천공 24시간 후, 세포를 재현탁시키고, 코팅되지 않은 웰 플레이트로 옮겼다. 전기천공 3-4일 후, T 세포를 FACS 및 T7 엔도뉴클레아제 I 검정에 의해 분석하였다.

편집된 T 세포의 FACS 분석. 세포 표면 염색을 얼음 상에서 15분 동안 αCXCR4-APC(12G5; BD Pharmingen) 및 αPD-1-PE(EH12.2H7; Biolegend)로 수행하였다. 세포를 항체의 항체-매개 내재화 및 분해를 최소화시키기 위해 세포 분류때까지 염색 절차 전체에 걸쳐 4℃에서 유지시켰다. 세포를 FACS Aria Illu (Becton Dickinson)를 이용하여 분류하였다.

표적 영역의 PCR 증폭. 100 μl의 Quick Extraction 용액(Epicenter)에 재현탁된 5x10⁴ - 2x10⁵개의 세포를 첨가하여 세포를 용해시키고, 유전체 DNA를 추출하였다. 세포 용해질을 20분 동안 65℃ 및 이후 20분 동안 95℃에서 인큐베이션하고, -20℃에서 보관하였다. 유전체 DNA의 농도를 NanoDrop(Thermo Scientific)에 의해 결정하였다.

CXCR4 또는 PD-1 표적 부위를 함유하는 유전체 영역을 하기 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭시켰다. CXCR4에 대해: 정방향 5'- AGA GGA GTT AGC CAA GAT GTG ACT TTG AAA CC -3' (SEQ ID NO:9) 및 역방향 5'- GGA CAG GAT GAC AAT ACC AGG CAG GAT AAG GCC -3' (SEQ ID NO:10)(938 bp). PD-1에 대해: 정방향 5'- GGG GCT CAT CCC ATC CTT AG-3' (SEQ ID NO:22) 및 역방향 5'- GCC ACA GCA GTG AGC AGA GA-3' (SEQ ID NO:23)(905 bp). 둘 모두의 프라이머 세트를 상동성 아암 외부에서 어닐링함으로써 HDR 주형을 증폭시키는 것을 피하도록 설계하였다. PCR 반응물은 제조업체의 프로토콜에 따라 고 GC 완충액 중 200 ng의 유전체 DNA 및 Kapa Hot 스타트 고-충실도 중합효소(Kapa Biosystems)를 함유하였다. 써모사이클러 설정은 5분 동안 95℃의 1회 주기, 20초 동안 98℃, 15초 동안 CXCR4에 대해 62℃ 또는 PD-1에 대해 68℃ 및 1분 동안 72℃의 35회 주기, 및 1분 동안 72℃의 1회 주기로 구성되었다. PCR 생성물을 SYBR Safe(Life Technologies)를 함유하는 2% (w/v) 아가로스 젤에서 정제하였다. PCR 생성물을 QIAquick 젤 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 아가로스 젤로부터 용리시켰다. PCR DNA의 농도를 NanoDrop 장치(Thermo scientific)로 정량하였다. T7 엔도뉴클레아제 I 및 HindIII 분석을 위해 200 ng의 PCR DNA를 사용하였다. 도 7e에 대해, PCR 생성물을 TOPO Zero Blunt PCR Cloning 키트(Invitrogen)로 클로닝하고, 생거 시퀀싱을 위해 제공하였다.

T7 엔도뉴클레아제 I 검정에 의한 편집 효율의 분석. 편집 효율을 T7 엔도뉴클레아제 I 검정에 의해 평가하였다. T7 엔도뉴클레아제 I은 야생형 및 돌연변이체 DNA 가닥의 하이브리드화로부터 발생하는 미스매치된 헤테로듀플렉스 DNA를 인지하고 절단한다. 하이브리드화 반응은 KAPA 고 GC 완충액 및 50 mM KCl 중 200 ng의 PCR DNA를 함유하였고, 다음과 같은 설정으로 써모사이클러에서 수행하였다: 95℃, 10분, -2℃/초에서 95-85℃, 1분 동안 85℃, -2℃/초에서 85-75℃, 1분 동안 75℃, -2℃/초에서 75-65℃, 1분 동안 65℃, -2℃/초에서 65-55℃, 1분 동안 55℃, -2℃/초에서 55-45℃, 1분 동안 45℃, -2℃/초에서 45-35℃, 1분 동안 35℃, -2℃/초에서 35-25℃, 1분 동안 25℃, 및 4℃에서 유지. 완충액 2 및 5 유닛의 T7 엔도뉴클레아제 I(NEB)을 첨가하여 재어닐링된 DNA를 분해하였다. 37℃에서 1시간의 인큐베이션 후, 반응을 10분 동안 70℃에서 6x 블루 젤 로딩 염료(Thermo Scientific)로 켄칭시켰다. 생성물을 SYBR gold(Life technologies)를 함유하는 2% 아가로스 젤에 용해시켰다. DNA 밴드 강도를 Image Lab을 이용하여 정량하였다. 편집 백분율을 식 (1 - (1 - (b + c / a + b + c))¹ ^/2 ) x 100을 이용하여 계산하였고, 여기서 "a"는 DNA 기질의 밴드 강도이고, "b" 및 "c"는 절단 생성물이다. PD-1 T7E1 검정(도 12d)의 정량화를 위해, DNA 기질의 강도를 모든 조건에서 관찰된 2개의 큰 밴드의 합계로 계산하였다. T7E1 검정을 기초로 한 전체 편집 %의 계산은 절단 효율의 평가만 가능하게 한다.

HindIII 제한 절단에 의한 HDR의 분석. HDR 주형을 표적화된 유전자 유전자좌로 HindIII 제한 부위를 도입시키도록 설계하였다. CXCR4 유전자좌로의 HindIII 부위의 성공적인 도입을 시험하기 위해, 938 bp 영역을 프라이머 5'- AGA GGA GTT AGC CAA GAT GTG ACT TTG AAA CC -3' (SEQ ID NO:9) 및 5'- GGA CAG GAT GAC AAT ACC AGG CAG GAT AAG GCC -3' (SEQ ID NO:10)을 이용하여 PCR 증폭시켰다. PD-1 유전자좌에 대해, 905 bp 영역을 프라이머 5'- GGG GCT CAT CCC ATC CTT AG -3' (SEQ ID NO:22) 및 5'- GCC ACA GCA GTG AGC AGA GA-3' (SEQ ID NO:23)을 이용하여 증폭시켰다. 반응물은 CutSmart 완충액(NEB) 중 200 ng의 PCR DNA 및 10 유닛의 HindIII High Fidelity로 구성되었다. 37℃에서 2시간의 인큐베이션 후, 반응을 10분 동안 70℃에서 1 부피의 젤 로딩 염료로 켄칭시켰다. 생성물을 SYBR gold(Life technologies)를 함유하는 2% (w/v) 아가로스 젤에 용해시켰다. 밴드 강도를 Image Lab을 이용하여 정량하였다. HDR의 백분율을 식 (b + c / a + b +c) x 100을 이용하여 계산하였고, 여기서 "a"는 DNA 기질의 밴드 강도이고, "b" 및 "c"는 절단 생성물이다.

표적내 및 표적외 부위의 딥 시퀀싱 분석. CXCR4 표적내 및 2개의 표적외 유전자에 대한 Cas9 표적 부위가 측접된 유전체 영역을 하기 나열된 프라이머를 이용하여 2-단계 PCR 방법에 의해 증폭시켰다. CXCR4 표적내(5'- ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNC TTC CTG CCC ACC ATC TAC TCC ATC ATC TTC TTA ACT G-3' (SEQ ID NO:24) 및 5'- GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TNN NNN CAG GTA GCG GTC CAG ACT GAT GAA GGC CAG GAT GAG GAC-3' (SEQ ID NO:25)), 표적외 #1 (POU 도메인, 클래스 2, 전사 인자 1 아이소형 1 [POU2F1] 유전자좌; 5'- ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNG CTA TAA TAG TAC AAG TAT ATG TTA AAT AAG AGT CAT AGC ATG-3' (SEQ ID NO:26) 및 5'- GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TNN NNN CTG GCT TTA TAT ATA TAC ATA GAT AGA CGA TAT AGA TAG C-3' (SEQ ID NO:27)) 및 표적외 #2 (글루타메이트 수용체 1 아이소형 1 전구체 [GRIA1] 유전자좌; 5'- ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN NNC CTG GTC CCA GCC CAG CCC CAG CTA TTC AGC ATC C-3' 및 5'- GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TNN NNN ACT CTG CAC TGG TAT ATC AAT ACA CTT GTT TTT CTC ATC CC-3' (SEQ ID NO:28)). 먼저, 편집 및 대조군 샘플로부터의 유전체 DNA의 100-150 ng을 제조업체의 프로토콜에 따라 Kapa Hot start 고-충실도 중합효소(Kapa Biosystems)를 이용하여 PCR 증폭시켰다. 써모사이클러 설정은 5분 동안 95℃의 1회 주기 및 20초 동안 98℃, 15초 동안 63℃ 및 15초 동안 72℃의 15-20회 주기, 및 1분 동안 72℃의 1회 주기로 구성되었다. 생성된 앰플리콘을 2%(w/v) 아가로스 젤에서 분리시키고, SYBR Gold로 염색하고, Qiagen 젤 추출 키트를 이용하여 젤 추출하였다.

Illumina TruSeq Universal 어댑터(5'- AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3'; SEQ ID NO:29) 및 변형된 Illumina RNA PCR 바코드 프라이머(5'- CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT-Index- GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC T-3'; SEQ ID NO:30)을 Kapa Hot start 고-충실도 중합효소(Kapa Biosystems)를 이용하여 두번째 PCR 단계에서 앰플리콘에 부착시켰다. 써모사이클러 설정은 30초 동안 98℃의 1회 주기, 20초 동안 98℃, 15초 동안 65℃ 및 15초 동안 72℃의 8-10회 주기, 및 5분 동안 72℃의 1회 주기로 구성되었다. 생성된 앰플리콘을 2%(w/v) 아가로스 젤에서 분리시키고, SYBR Gold로 염색하고, Qiagen 젤 추출 키트를 이용하여 젤 추출하였다. 바코드화되고 정제된 DNA 샘플 Qubit 2.0 형광측정기(Life Technologies)에 의해 정량하고, BioAnalyzer(Agilent)에 의해 크기를 분석하고, qPCR에 의해 정량하고, 등몰 비로 푸울링시켰다. 시퀀싱 라이브러리를 Illumina HiSEq 2500으로 시퀀싱하였다.

딥-시퀀싱 데이터의 분석. HDR 주형으로부터 발생한 독특한 12 nt를 함유한 시퀀싱 판독을 추출하고, HDR 주형-유래 서열을 함유하지 않은 것과는 별도로 분석하였다. 대체된 12 nt를 함유하지 않은 모든 판독을 참조 hg19 유전체에 정렬시켰고, 대체된 12 nt를 함유한 모든 판독을 Burrows-Wheeler Aligner(BWA)를 이용하여 예상 치환을 갖는 변형된 hg19 유전체에 정렬시켰다. 이후, samtools mpileup 유틸리티를 사용하여 CXCR4 유전자의 각각의 위치에 맵핑된 판독의 전체 수를 정량하고, CIGAR 문자열을 시험하는 사용자 정의 스크립트를 사용하여 각각의 판독에 대한 삽입 및 결실의 수 및 위치를 평가하였다. 삽입 효율을 CXCR4 RNP(HDR 주형 없음)를 이용한 실험에서 (절단 부위로부터 삽입 +/- 100 bp를 갖는 판독의 수) / (절단 부위로부터 판독 +/-의 전체 수)로 평가하였다. CXCR4 RNP(HDR 주형 없음)를 이용한 실험에 대한 결실 효율을 (절단 부위로부터 결실 +/- 100 bp를 갖는 판독의 수) / (절단 부위로부터 판독 +/-의 전체 수)로 평가하였다. CXCR4 RNP + HDR 주형을 이용한 실험에 대해, 삽입 및 결실 효율을 HDR로부터 유래된 12 nt 대체를 함유하지 않는 판독만을 기초로 하여 계산하였다(이들은 도 10b에 제시된 분획임). 전체 편집 효율을 (절단 부위로부터 삽입결실 +/- 100 bp를 갖는 판독의 수) / (절단 부위로부터 판독 +/-의 전체 수)로 평가하였다. HDR 효율을 (절단 부위로부터 HindIII 부위 +/- 100bp를 함유하는 판독의 수) / (절단 부위로부터 판독 +/- 100 bp의 전체 수)로 평가하였다. 삽입 및 결실 크기의 분포를 절단 부위로부터의 영역 +/- 20 bp에 대해 평가하였다. 딥 시퀀싱 데이터는 NCBI Sequence Read Archive(SRA, BioProject: SUB996236)에서 이용 가능하다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California Marson, Alexander Doudna, Jennifer Bluestone, Jeffrey Schumann, Kathrin Lin, Steven <120> PROTEIN DELIVERY IN PRIMARY HEMATOPOIETIC CELLS <130> 081906-0970785 (219910PC) <150> US 62/110,187 <151> 2015-01-30 <150> US 62/209,711 <151> 2015-08-25 <150> PCT/US2016/015836 <151> 2016-01-29 <160> 110 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CXCR4 sequence positions 84-88 <400> 1 Asp Leu Leu Phe Val 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic mutated CXCR4 sequence positions 84-88 <400> 2 Glu Ser Leu Asp Pro 1 5 <210> 3 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer SLKS3 <400> 3 taatacgact cactatagga agcgtgatga caaagagggt tttagagcta tgctggaaac 60 agcatagcaa gttaaaataa gg 82 <210> 4 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer SLKS1 <400> 4 gcaccgactc ggtgccactt tttcaagttg ataacggact agccttattt taacttgcta 60 tgctgtttcc agc 73 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer T25 <400> 5 taatacgact cactatag 18 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer SLKS1 <400> 6 gcaccgactc ggtgccactt tttcaag 27 <210> 7 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer SLKS4 <400> 7 taatacgact cactatagag gagcctcgcc cagctggagt tttagagcta tgctggaaac 60 agcatagcaa gttaaaataa gg 82 <210> 8 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic HDR template sequence <400> 8 gggcaatgga ttggtcatcc tggtcatggg ttaccagaag aaactgagaa gcatgacgga 60 caagtacagg ctgcacctgt cagtggccga aagcttggat cccatcacgc ttcccttctg 120 ggcagttgat gccgtggcaa actggtactt tgggaacttc ctatgcaagg cagtccatgt 180 catctacaca gt 192 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CXCR4 forward primer <400> 9 agaggagtta gccaagatgt gactttgaaa cc 32 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CXCR4 reverse primer <400> 10 ggacaggatg acaataccag gcaggataag gcc 33 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic FOXP3 Target 1 forward primer <400> 11 ttcaaatact ctgcactgca agccc 25 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic FOXP3 Target 1 reverse primer <400> 12 catgtacctg tgttcttggt gtgtgt 26 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic FOXP3 Target 2 forward primer <400> 13 gctgacattt tgactagctt tgtaaagctc tgtgg 35 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic FOXP3 Target 2 reverse primer <400> 14 tctccccgac ctcccaatcc c 21 <210> 15 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic PD-1 sgRNA <400> 15 taatacgact cactatagcg actggccagg gcgcctgtgt tttagagcta tgctggaaac 60 agcatagcaa gttaaaataa gg 82 <210> 16 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic ultramer sequence CXCR4_1 <400> 16 taatacgact cactatagga agcgtgatga caaagagggt tttagagcta tgctggaaac 60 agcatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 120 gtg 123 <210> 17 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic ultramer sequence CXCR4_2 <400> 17 caccgactcg gtgccacttt ttcaagttga taacggacta gccttatttt aacttgctat 60 gctgtttcca gcatagctct aaaaccctct ttgtcatcac gcttcctata gtgagtcgta 120 tta 123 <210> 18 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic ultramer sequence PD-1_1 <400> 18 taatacgact cactatagcg actggccagg gcgcctgtgt tttagagcta tgctggaaac 60 agcatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 120 gtgc 124 <210> 19 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic ultramer sequence PD-1_2 <400> 19 gcaccgactc ggtgccactt tttcaagttg ataacggact agccttattt taacttgcta 60 tgctgtttcc agcatagctc taaaacacag gcgccctggc cagtcgctat agtgagtcgt 120 atta 124 <210> 20 <211> 191 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic PD-1 HDR template sequence <400> 20 aacctgacct gggacagttt cccttccgct cacctccgcc tgagcagtgg agaaggcggc 60 actctggtgg ggctgctcca ggcatgcaga taatgaaagc ttctggccag tcgtctgggc 120 ggtgctacaa ctgggctggc ggccaggatg gttcttaggt aggtggggtc ggcggtcagg 180 tgtcccagag c 191 <210> 21 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CXCR4 HDR control template sequence <400> 21 ttcaaaacta gcgtcagggg ctcgatttac tcgggacttg ctacaacatc gcagtcacgc 60 gcacgatcct tccaggattg gaggtggact tagataaagc ttccgtgtgc accgtataga 120 ttcgttgatg caggctattc ccgtgatccc acgcggaggt gatggagcgt caagcatagc 180 tagcacagat ga 192 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic PD-1 forward primer <400> 22 ggggctcatc ccatccttag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic PD-1 reverse primer <400> 23 gccacagcag tgagcagaga 20 <210> 24 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CXCR4 on-target primer <220> <221> misc_feature <222> (34)..(38) <223> N is A, C, G or T <400> 24 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnnct tcctgcccac catctactcc 60 atcatcttct taactg 76 <210> 25 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CXCR4 on-target primer <220> <221> misc_feature <222> (35)..(39) <223> N is A, C, G or T <400> 25 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnc aggtagcggt ccagactgat 60 gaaggccagg atgaggac 78 <210> 26 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CXCR4 off-target primer <220> <221> misc_feature <222> (35)..(39) <223> N is A, C, G or T <400> 26 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnc tggctttata tatatacata 60 gatagacgat atagatagc 79 <210> 27 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CXCR4 off-target primer <220> <221> misc_feature <222> (34)..(38) <223> N is A, C, G or T <400> 27 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnncc tggtcccagc ccagccccag 60 ctattcagca tcc 73 <210> 28 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CXCR4 off-target primer <220> <221> misc_feature <222> (35)..(39) <223> N is A, C, G or T <400> 28 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnna ctctgcactg gtatatcaat 60 acacttgttt ttctcatccc 80 <210> 29 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic adapter primer <400> 29 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58 <210> 30 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic barcode primer <400> 30 caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatct 58 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 31 cctcctcttt gtcatcacgc ttc 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 32 gaagcgtgat gacaaagagg agg 23 <210> 33 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic reference sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 33 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 34 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 34 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 35 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 35 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 36 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 36 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 37 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 37 gtttgccatg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 38 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 38 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 39 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 39 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagtcgg ccactgacag 60 gtgcagcctg ta 72 <210> 40 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 40 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 41 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 41 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgggagg tcggccactg acaggtgcag 60 cctgta 66 <210> 42 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 42 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc ctgta 75 <210> 43 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 43 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 44 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic reference sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 44 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 45 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 45 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 46 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 46 gtggcaaact ggtactttgg gaacttccta tgcaaggcag tccatgtcat ctacacagtc 60 aacctctaca gcagtgtc 78 <210> 47 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 47 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaaggagg tcggccactg 60 acaggtgcag cctgta 76 <210> 48 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 48 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgacg ctgacaggtg ccgcctgtac 60 ttgtccgtca tgcgtctc 78 <210> 49 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 49 gtttgccacg gcatcaactg cccagaagga agtcgtgctc tgacaggagg aggccggcct 60 tggacatgtg gcttctga 78 <210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 50 gtttgccacg gccactgaca ggtgcagcct gta 33 <210> 51 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 51 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgata ggaggtcggc cactgacagg 60 tgcagcctgt a 71 <210> 52 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 52 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 53 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 53 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaaggacg tccgccgctg 60 agaggtgcag gctgta 76 <210> 54 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 54 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaaaggag gtcggccact 60 gacaggtgca gcctgta 77 <210> 55 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic reference sequence for CRCX4-lo control <400> 55 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 56 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 56 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 57 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 57 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 58 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 58 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 59 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 59 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 60 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 60 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 61 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 61 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 62 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 62 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 63 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 63 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 64 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 64 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 65 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 65 gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg acaaagagga ggtcggccac 60 tgacaggtgc agcctgta 78 <210> 66 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic donor sequence <400> 66 aagcttggat cc 12 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic FOXP3 Target 2 primer <400> 67 tcatggctgg gctctccagg ggg 23 <210> 68 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic FOXP3 Target 2 primer <400> 68 ccccctggag agcccagcca tga 23 <210> 69 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic FOXP3 Target 1 primer <400> 69 ccctccagct gggcgaggct cct 23 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic FOXP3 Target 1 primer <400> 70 aggagcctcg cccagctgga ggg 23 <210> 71 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic HDR template sequence <400> 71 tagtaagctt 10 <210> 72 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sgRNA target (3) sequence for PD-1 exon 2 <400> 72 ccacgctcat gtggaagtca cgcccgttgg gcagttgtgt gacacggaag cgg 53 <210> 73 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 84 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 84 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagtcggcca ctgacaggtg 60 cagc 64 <210> 85 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 85 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 86 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 86 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aggaggtcgg ccactgacag 60 gtgcagc 67 <210> 87 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-hi <400> 87 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgggaggtcg gccactgaca ggtgcagc 58 <210> 88 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic reference sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 88 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 89 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 89 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 90 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 90 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aaaggaggtc ggccactgac 60 aggtgcagc 69 <210> 91 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 91 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aaggaggtcg gccactgaca 60 ggtgcagc 68 <210> 92 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 92 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatagga ggtcggccac tgacaggtgc 60 agc 63 <210> 93 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 93 tgccacggcc actgacaggt gcagc 25 <210> 94 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for Cas9 RNP treated CRCX4-lo <400> 94 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatg 37 <210> 95 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic reference sequence for CRCX4-lo control <400> 95 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 96 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 96 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 97 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 97 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 98 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 98 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 99 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 99 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 100 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 100 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 101 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 101 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 102 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 102 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 103 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 103 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 104 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic locus sequence for CRCX4-lo control <400> 104 tgccacggca tcaactgccc agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga 60 caggtgcagc 70 <210> 105 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic Cas9 sequence <400> 105 caaagtacca gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg gaagcgtgat gacaaagagg 60 aggtcggcca ctgacaggtg cagcctgtac ttgtccgtca tg 102 <210> 106 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic Cas9 sequence <400> 106 caaagtacca gtttgccacg gcatcaactg cccagaaggg aagcgtgatg agaaagagga 60 ggtcggccac tgacaggtgc agcctgtact tgtcctgcat g 101 <210> 107 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic Cas9 sequence <400> 107 caaagtacca gtttgccacg gcatcaactg cccagaagg 39 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic target sequence <400> 108 cgactggcca gggcgcctgt ggg 23 <210> 109 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic target sequence <400> 109 cccacaggcg ccctggccag tcg 23 <210> 110 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic PD-1 HDR template sequence <400> 110 ttcgaaagta a 11

Claims

a) Cas9 리보핵산단백질 복합체, 이중 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형, 및 단리된 세포를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계로서, Cas9 리보핵산단백질 복합체가 Cas9 뉴클레아제 도메인 및 가이드 RNA를 포함하고, 가이드 RNA가 단리된 세포의 유전체의 표적 영역에 특이적으로 하이브리드화되며, 주형은 50, 75 또는 100 염기(b) 또는 염기쌍(bp) 내지 110, 120, 125, 150, 200, 225 또는 250 b 또는 bp의 길이를 가지는, 단계; 및 b) 전기천공을 통해 Cas9 리보핵산단백질 복합체 및 DNA 주형을 단리된 세포 내에 도입시키는 단계를 포함하는, 세포의 유전체를 편집하는 방법으로서, 세포가 단리된 일차 조혈 세포 또는 단리된 일차 조혈 줄기 세포인, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법이 적어도 20%의 유전체 편집 효율을 제공하는 방법.
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제 1항에 있어서, a)의 제공 단계 전에 세포가 무한증식되거나 형질전환되지 않고, b)의 도입 단계 후에 세포가 무한증식되거나 형질전환되지 않는 방법.
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제 1항에 있어서, 전기천공이 반응 혼합물을 캐쏘드(cathode)와 애노드(anode) 사이의 챔버에 위치시키는 단계, 및 캐쏘드와 애노드 사이에 20 kV/m 내지 100 kV/m의 전압 전위를 적용하는 단계를 포함하는 방법.
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제 1항에 있어서, 반응 혼합물 내의 Cas9 리보핵산단백질 복합체가 0.25 μM 내지 5 μM 또는 0.9 μM 내지 1.8 μM의 농도로 존재하는 방법.
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제 1항에 있어서, 반응 혼합물이 1 x 10⁵ 내지 4 x 10⁵개의 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포를 함유하는 방법.
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제 1항에 있어서, 세포가 일차 조혈 세포인 방법.
제 23항에 있어서, 일차 조혈 세포가 면역 세포인 방법.
제 24항에 있어서, 면역 세포가 T 세포인 방법.
제 25항에 있어서, T 세포가 조절성 T 세포, 효과기 T 세포, 또는 나이브 T 세포인 방법.
제 26항에 있어서, 조절성 T 세포, 효과기 T 세포, 또는 나이브 T 세포가 CD4⁺ T 세포인 방법.
제 25항에 있어서, T 세포가 CD4⁺CD25^hiCD127^lo 조절성 T 세포, FOXP3⁺ T 세포, CD4⁺CD25^loCD127^hi 효과기 T 세포, 및 CD4⁺CD25^loCD127^hiCD45RA^hiCD45RO^- 나이브 T 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
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제 25항에 있어서, T 세포가 재조합 항원 수용체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 반응 혼합물이 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형을 포함하며, 상기 방법이 세포 내로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형을 도입시키는 단계를 포함하는 방법.
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제 37항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형이 재조합 항원 수용체, 이의 일부, 또는 이의 성분을 인코딩하는 방법.
제 1항, 제 2항, 제 4항, 제14항, 제 19항, 제 21항, 제23항 내지 제 28항, 제 36항, 제 37항 및 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포이며, 상기 방법이 b)의 도입 단계 후에 반응 혼합물을 CD3 효능제 및 CD28 효능제를 함유하는 배양 배지로 옮기고 세포를 배양하는 단계 c)를 추가로 포함하는 방법.
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제 43항에 있어서, 상기 방법이 c)의 배양 단계 후에 반응 혼합물을 CD3 효능제 또는 CD28 효능제를 함유하지 않는 배양 배지로 옮기고 세포를 배양하는 단계 d)를 추가로 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, Cas9 리보핵산단백질 복합체가 Cas9 뉴클레아제 또는 Cas9 닉카제(nickase)를 포함하는 방법.
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제 1항에 있어서, Cas9 리보핵산단백질 복합체가 제한 엔도뉴클레아제 또는 닉카제에 융합된 Cas9 뉴클레아제 도메인을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, Cas9 리보핵산단백질 복합체가 전사 조절인자 또는 염색질 변형제에 융합된 Cas9 뉴클레아제 도메인을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 반응 혼합물이 적어도 2개의 구조적으로 상이한 Cas9 리보핵산단백질 복합체를 포함하는 방법.
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복수의 단리된 일차 조혈 세포 또는 단리된 일차 조혈 줄기 세포로서, 복수의 단리된 세포가 Cas9을 인코딩하는 핵산 및 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 핵산을 함유하지 않고, 복수의 단리된 세포 중 적어도 20%가 Cas9 리보핵산단백질 복합체 및 이중 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형을 함유하며, DNA 주형은 50, 75 또는 100 염기(b) 또는 염기쌍(bp) 내지 110, 120, 125, 150, 200, 225 또는 250 b 또는 bp의 길이를 가지는, 복수의 단리된 일차 조혈 세포 또는 단리된 일차 조혈 줄기 세포.
복수의 단리된 일차 조혈 세포 또는 단리된 일차 조혈 줄기 세포로서, 복수의 단리된 세포가 Cas9을 인코딩하는 핵산을 함유하지 않고, 복수의 단리된 세포 중 적어도 20%가 Cas9 리보핵산단백질 복합체 및 이중 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형을 함유하며, DNA 주형은 50, 75 또는 100 염기(b) 또는 염기쌍(bp) 내지 110, 120, 125, 150, 200, 225 또는 250 b 또는 bp의 길이를 가지는, 복수의 단리된 일차 조혈 세포 또는 단리된 일차 조혈 줄기 세포.
복수의 단리된 일차 조혈 세포 또는 단리된 일차 조혈 줄기 세포로서, 복수의 단리된 세포가 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 핵산을 함유하지 않고, 복수의 단리된 세포 중 적어도 20%가 Cas9 리보핵산단백질 복합체 및 이중 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형을 함유하며, DNA 주형은 50, 75 또는 100 염기(b) 또는 염기쌍(bp) 내지 110, 120, 125, 150, 200, 225 또는 250 b 또는 bp의 길이를 가지는, 복수의 단리된 일차 조혈 세포 또는 단리된 일차 조혈 줄기 세포.
제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 세포 중 적어도 20% 또는 30%는 표적 유전체 영역에서 이중 가닥 절단, 또는 NHEJ 또는 HDR 복구된 이중 가닥 절단을 함유하는, 복수의 단리된 일차 조혈 세포 또는 단리된 일차 조혈 줄기 세포.
제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 일차 조혈 세포인, 복수의 단리된 일차 조혈 세포 또는 단리된 일차 조혈 줄기 세포.
제63항에 있어서, 일차 조혈 세포는 면역 세포인, 복수의 단리된 일차 조혈 세포 또는 단리된 일차 조혈 줄기 세포.
제64항에 있어서, 면역 세포는 T 세포인, 복수의 단리된 일차 조혈 세포 또는 단리된 일차 조혈 줄기 세포.
제65항에 있어서, T 세포는 조절성 T 세포, 효과기 T 세포, 또는 나이브 T 세포인, 복수의 단리된 일차 조혈 세포 또는 단리된 일차 조혈 줄기 세포.
제37항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 DNA 주형이 9μM 내지 180μM 의 농도로 존재하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법이 적어도 10%, 또는 적어도 14%의 일차 조혈 세포 또는 일차 조혈 줄기 세포 주형 지시형 유전체 편집 효율을 제공하는, 방법.