CN115135370A - 电穿孔模块和仪器 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了球状填充晶格电穿孔装置，其被配置为用作独立单元或在自动化多模块细胞处理环境中使用，并被配置为减少细胞处理时间和细胞存活。

Description

电穿孔模块和仪器

相关案例

本国际PCT申请要求2020年1月27日提交的USSN 62/966,088的优先权。

发明领域

本公开内容涉及在各种电穿孔装置中使用的用外源物质转化细胞的球状填充晶格(sphere-packing lattice)。利用球状填充晶格的电穿孔装置可以被配置为独立的电穿孔模块，或被配置为自动化多模块细胞处理仪器中的一个模块。

发明背景

在以下讨论中，将出于背景和介绍的目的描述某些物品和方法。本文包含的任何内容不被解释为对现有技术的“承认”。本申请人明确地保留根据情况证明根据可适用的法定条文由本文引用的物品和方法不构成现有技术的权利。

细胞膜构成细胞内外分子和离子运输的主要屏障。电穿孔，也称为电透化，在存在脉冲电场的情况下显著增加细胞膜的通透性。传统的电穿孔系统得到了广泛的应用；然而，传统的系统要求高的电流输入，并遭受不利的环境条件，诸如电场畸变、局部pH变化、金属离子溶解和过度发热，所有这些都可能导致低电穿孔效率和/或低细胞生存力。传统的用于细胞转染的电穿孔方法要求外源分子以大量过量(即以“高拷贝数”)供应以克服递送过程的相对低效。因此，每个电穿孔反应通常局限于单一种类的有效载荷分子(即“单重递送”)。此外，传统的电穿孔系统不容易自动化或合并到自动化细胞处理系统中，在该自动化细胞处理系统中电穿孔只是所执行的许多过程中的一个过程。

因此，存在对能够以高效和自动化的方式转化多个细胞的改进的电穿孔组合物、方法和自动化多模块细胞处理系统的需求。本发明解决此需求。

发明概述

提供本概述是为了以简化的形式介绍概念的选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。该概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优势将是从下面撰写的详述，包括附图中阐明的和所附的权利要求中限定的那些方面明显的。

本公开内容提供了包含晶格形成珠、试剂束(reagent bundle)和细胞的球状填充晶格，其中球状填充晶格可用于各种用于转化细胞的电穿孔装置中。电穿孔装置可配置为用作独立电穿孔装置或用在自动化多模块细胞处理环境中。球状填充晶格利用晶格形成珠，所述晶格形成珠尺寸均匀并自组装成晶体样的晶格。试剂束被固定在小得足以适合于晶体样晶格的间隙区域的珠或其他基底(例如试剂递送基底)上，并且其中试剂束包含待递送到细胞中的外源物质(例如DNA、RNA、蛋白质、核蛋白复合物)的多个克隆拷贝。

在使细胞电穿孔时使用球状填充晶格有两个主要优点。首先，通过将细胞和外源物质聚集到晶格间隙空间，增加了细胞附近的外源物质的“有效”浓度，而不影响培养基中外源物质的总量。由于外源物质可增加电导率(如在例如DNA的情况下)，可添加到电穿孔装置的总外源物质的上限由细胞可承受的电流/焦耳加热的量确定。使用球状填充晶格的电穿孔通过增加递送到细胞的外源物质的量而不影响培养基的体积电导率(bulkconductivity)，从而减少培养基的加热并增加细胞的生存力来改进转化或转染效率。第二，球状填充通过将单个试剂束分区成由晶格形成珠物理隔离的间隙晶格区域，从而创造局部环境，使多种独特的试剂类型能够同时递送到细胞(即，“多重化的”试剂递送)。

因此，在一些实施方案中，提供了用于转化或转染细胞的方法，包括：提供细胞、晶格形成珠和试剂递送基底在培养基中的球状填充组合物，其中试剂递送基底的尺寸被确定为适合于由晶格形成珠形成的晶格的间隙区域；触发试剂从试剂递送基底的释放；以及向细胞、晶格形成珠和试剂的球状填充组合物提供电脉冲。

在一些方面，该方法还包括以下步骤：在第二提供步骤之后，使晶格解构；和从解构的晶格收集细胞。

在一些方面，试剂束包含外源物质的多个克隆拷贝，并且在一些方面，外源物质是DNA、RNA、蛋白质或核蛋白复合物。在一些方面，试剂束包含不同的外源物质；也就是说，一些试剂束可以包含试剂A，一些试剂束可以包含试剂B，一些试剂束可以包含试剂C，等等，多达并包含100万种或更多种不同试剂(诸如核酸或蛋白文库的不同成员)。

在该方法的一些方面，试剂递送基底选自聚合物微粒、陶瓷微粒或水凝胶微粒，并且在一些方面，聚合物颗粒是聚苯乙烯珠，水凝胶颗粒包括交联聚合物，并且交联聚合物选自聚丙烯酰胺、聚乙二醇或海藻酸盐。

在一些方面，晶格形成珠是聚合物水凝胶，并且在一些方面，聚合物水凝胶选自聚丙烯酰胺、聚乙二醇、海藻酸盐或明胶。

通常，晶格形成珠的直径为75μm至250μm，或直径为125μm至150μm。

在一些实施方案中，从试剂束释放试剂由化学触发物、光子触发物、电触发物或温度触发物触发。在一些方面，化学触发物是酶促触发物、pH触发物或竞争性结合反应触发物，光子触发物是UV或可见光，并且电触发物是电场诱导的囊泡失稳。

在一些方面，细胞、晶格形成珠和试剂递送基底的组合物的体积在10μL和500μL之间。

在一些方面，试剂递送基底的直径为20μm至90μm，并且在一些方面，试剂递送基底的直径为30μm至50μm。

令人惊讶的是，已经发现缺乏试剂束的系统，其中待递送到细胞的试剂(例如，外源物质)不通过试剂束递送，而是存在于在其中悬浮细胞和晶格形成珠的培养基中。因此，在替代实施方案中，提供了用于转化或转染细胞的方法，包括：提供细胞、晶格形成珠和外源物质在培养基中的球状填充组合物；以及向细胞、晶格形成珠和试剂的球状填充组合物提供电脉冲。另外的步骤包括，在第二提供步骤之后，使晶格解构；和从解构的晶格收集细胞。

下面更详细地描述本发明的这些方面和其他特征和优势。

附图简述

从以下对说明性实施方案的详细描述，结合附图，将更充分地理解本公开内容的前述和其他特征和优点，在附图中：

图1A是用于在球状填充晶格中使细胞电穿孔的方法的简化框图。图1B在简化图中描绘了在有效载荷(例如，试剂)释放之前和之后，具有晶格形成珠、细胞和试剂束的球状填充晶格。

图2A-图2D描绘了用来产生编辑的细胞的自动化多模块仪器及其模块和部件。

图3A-图3K描绘了示例性流通式电穿孔装置(FTEP)的结构和部件，球状填充晶格可以流过该装置以转化细胞。

图4A和图4B描绘了试剂筒的示例性实施方案的结构和部件。

图5A描绘了与细胞生长模块一起使用的旋转生长瓶的一种实施方案。图5B图示了细胞生长模块中的旋转生长瓶的一种实施方案的透视图。图5C描绘了来自图5B的细胞生长模块的剖视图。图5D图示了与LED、检测器和温度调节部件耦合的图5B的细胞生长模块。

图6A描绘了用于在切向流过滤模块(例如，细胞生长和/或浓缩模块)中使用的渗余物(上图)和渗透物(下图)构件，以及组装成切向流组件(下图)的渗余物构件和渗透物构件。图6B描绘了切向流过滤模块的储库组件的两个侧面透视图。图6C-图6E描绘了具有流体端口和气动端口以及适合于图6B所示的储库组件的密封垫的示例性的顶部。

图7A描绘了用于使细胞单个化(singulating)、编辑细胞和使细胞标准化的工作流程的简化图。图7B-图7D描绘了固体壁分离孵育和标准化(solid wall isolationincubation and normalization，SWIIN)模块的实施方案。图7E描绘了还包括加热器和加热盖的图7B-图7D中的SWIIN模块的实施方案。

图8是使用FTEP在球状填充晶格中转化细胞的自动化多模块细胞编辑的示例性方法的流程图。

图9是示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化框图。

图10是在用于递归编辑的这种案例中使用的示例性自动化多模块细胞处理仪器的替代实施方案的简化框图。

图11是示例性自动化多模块细胞处理仪器的又一种实施方案的简化流程图。

图12显示了使用125μm聚丙烯酰胺珠(例如，晶格形成珠)和40μm聚苯乙烯珠(例如，试剂束)通过大量混合这些珠的浆料形成的自组装球状填充晶格。

图13A和图13B是显示聚丙烯酰胺水凝胶珠的显微照片，其中荧光标记的DNA保留在珠之间的间隙区域内。图13C是表明在有和没有聚丙烯酰胺水凝胶珠的情况下含有DNA的培养基的电导率相同的柱状图。

图14是显示在有球状填充晶格的培养基中用荧光标记的DNA对HEK293细胞的转化效率与在没有球状填充晶格的培养基中的转化效率相当的柱状图。

应当理解，附图不必按比例绘制，并且相同的附图标记是指相同的特征。

详细描述

除非明确声明或者特征或功能与另外的实施方案不兼容，否则结合本文描述的方法、装置或仪器的一种实施方案描述的所有功能意在适用于本文描述的方法、装置和仪器的另外的实施方案。例如，在结合一种实施方案明确描述给定特征或功能但没有结合替代实施方案明确提及该特征或功能的情况下，应当理解，除非该特征或功能与替代实施方案不兼容，否则该特征或功能可以结合替代实施方案来部署、利用或实现。

除非另外指出，否则本文描述的技术的实践可以采用分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和遗传工程技术的常规技术和描述，这些都在本领域从业的人员的技术内。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册，诸如Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第4版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,(2014)；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人编著,(2017)；Neumann等人,Electroporation and Electrofusion in CellBiology,Plenum Press,New York,1989；和Chang等人,Guide to Electroporation andElectrofusion,Academic Press,California(1992)，所有文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。核酸引导的核酸酶技术可以见于，例如，Genome Editing andEngineering from TALENs and CRISPRs to Molecular Surgery,Appasani和Church(2018)；以及CRISPR:Methods and Protocols,Lindgren和Charpentier,2015；这两篇文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

注意，除非上下文另外清楚指示，如本文和所附的权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“细胞”是指一个或更多个细胞，并且提及“该系统”包括提及本领域技术人员已知的等同步骤、方法和装置，等等。此外，应当理解，本文可以使用的术语诸如“左”、“右”、“顶”、“底”、“前”、“后”、“侧”、“高度”、“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“内部(interior)”、“外部(exterior)”、“内(inner)”、和/或“外(outer)”等仅描述参考点，并且不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的方向或配置。此外，术语诸如“第一”、“第二”、“第三”等仅标识如本文公开的许多部分、部件、步骤、操作、功能和/或参考点中的一个，并且同样不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的配置或方向。

此外，术语“约”、“接近”、“略小(minor)”和类似术语通常是指在某些实施方案中包括20％、10％或优选地5％的差额内的识别值的范围，以及它们之间的任何值。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同含义。出于描述和公开可以与本文描述的发明结合使用的设备、制剂和方法的目的，本文提及的所有的出版物通过引用并入。

在提供值的范围情况下，应理解，在该范围的上限值和下限值之间的每一个中间值和该规定的范围内的任何其他规定的值或中间值被涵盖在本发明内。这些较小的范围的上限值和下限值可以独立地被包括在较小的范围内，并且也被涵盖在本发明内，受限于规定的范围内的任何特定地排除的限值。在规定的范围包括限值中的一个或两个的情况下，那些所包括的限值中的任一个或两个排除的范围也被包括在本发明中。

在以下的描述中，阐述了许多具体细节，以提供对本发明的更充分理解。然而，对本领域技术人员将明显的是，可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下实践本发明。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，未描述本领域技术人员熟知的特征和程序。本文使用的术语意在具有如由本领域普通技术人员理解的平白且普通的含义。

如本文使用的术语“互补”是指核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对，并且特别地是指彼此形成氢键的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接，并且胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包含被描述为与指定的第二核苷酸序列具有“互补性百分比”或“同源性百分比”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％的互补性，指示序列的10个核苷酸中的8个、10个核苷酸中的9个或10个核苷酸中的10个与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3’-TCGA-5’与核苷酸序列5’-AGCT-3’是100％互补的；并且核苷酸序列3’-TCGA-5’与核苷酸序列5’-TAGCTG-3’的区域是100％互补的。

术语DNA“控制序列”统指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点、核定位序列、增强子等，它们共同地提供编码序列在接受者细胞中的复制、转录和翻译。只要选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和(对于一些组分)翻译，则并非所有这些类型的控制序列都需要存在。

如本文使用的，术语“供体DNA”或“供体核酸”是指被设计成通过使用核酸引导的核酸酶的同源重组将DNA序列修饰(插入、缺失、取代)引入基因座的核酸。对于同源指导的修复，供体DNA必须与基因组靶序列中的“切割位点”或待编辑位点侧翼的区具有足够的同源性。一条或更多条同源臂的长度将取决于，例如，所做修饰的类型和尺寸。在许多情况下，并且优选地，供体DNA将与基因组靶基因座具有两个序列同源性区(例如，两个同源臂)。优选地，“插入物(insert)”区或“DNA序列修饰”区(期望引入细胞中的基因组靶基因座的核酸修饰)将位于两个同源区之间。DNA序列修饰可以改变一个特定位点或多于一个特定位点处的靶基因组DNA序列的一个或更多个碱基。改变可以包括改变靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对。缺失或插入可以是靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对的缺失或插入。

如本文使用的，“富集”是指通过单个化，任选地诱导编辑，并且使单个化或大体上单个化的细胞生长成终末尺寸(terminal-sized)的集落(例如，集落生长的饱和或标准化)来富集编辑的细胞。可选地，“富集”可以通过在细胞处于对数生长阶段结束时或在细胞刚刚进入生长衰老后诱导编辑，对主体液体培养物进行。诱导编辑需要诱导核酸酶、gRNA或二者的转录。

术语“引导核酸”或“引导RNA”或“gRNA”是指包含以下的多核苷酸：1)能够与基因组靶基因座杂交的引导序列和2)能够与核酸引导的核酸酶相互作用或复合的支架序列。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间的序列相似性，或者在本公开内容的上下文中，更常见地是指两个核酸分子之间的序列相似性。术语“同源区”或“同源臂”是指供体DNA上与靶基因组DNA序列具有一定程度同源性的区域。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述每个序列可以出于比较的目的而被对齐。当比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置处是同源的。序列之间的同源性程度随着序列共有的匹配或同源位置数而变化。

“可操作地连接”指其中如此描述的组分被配置以执行它们的通常功能的元件布置。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能够影响编码序列的转录，并且在一些情况下，能够影响编码序列的翻译。只要控制序列起作用以指导编码序列的表达，控制序列不必与编码序列邻接。因此，例如，不翻译但转录的间插序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。事实上，这样的序列不必驻留于同一连续DNA分子(即染色体)上，并且仍可以具有引起调控改变的相互作用。

“启动子”或“启动子序列”是能够与RNA聚合酶结合并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、小核RNA(small nuclear RNA)或核仁小RNA(smallnucleolar RNA)、引导RNA或由任何类别的任何RNA聚合酶I、II或III转录的任何种类的RNA)的转录的DNA调控区。启动子可以是组成型或诱导型，并且在一些实施方案中，特别地在许多其中采用富集的实施方案中，核酸引导的核酸酶编辑系统的至少一种组分的转录处于诱导型启动子的控制下。

如本文使用的术语“选择标记(selectable marker)”是指引入细胞中的、赋予适于人工选择的性状的基因。一般使用的选择标记是本领域普通技术人员熟知的。可以采用药物选择标记，诸如氨苄青霉素/羧苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、利福平、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素和G418。在其他实施方案中，选择标记包括但不限于糖类诸如鼠李糖；人类神经生长因子受体(用MAb检测，诸如美国专利第6,365,373号中描述的)；截短的人类生长因子受体(用MAb检测)；突变体人类二氢叶酸还原酶(DHFR；可用荧光MTX底物)；分泌型碱性磷酸酶(SEAP；可用荧光底物)；人类胸苷酸合酶(TS；赋予对抗癌剂氟脱氧尿苷的抗性)；人类谷胱甘肽S-转移酶α(GSTA1；将谷胱甘肽与干细胞选择性烷化剂白消安缀合；CD34+细胞中的化学保护性选择标记)；造血干细胞中的CD24细胞表面抗原；赋予对N-膦酰乙酰基-L-天冬氨酸(PALA)的抗性的人类CAD基因；人类多耐药性-1(MDR-1；可通过增加的耐药性选择或通过FACS富集P-糖蛋白表面蛋白)；人类CD25(IL-2α；可通过Mab-FITC检测)；甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT；可通过卡莫司汀(carmustine)选择)；和胞苷脱氨酶(CD；可通过Ara-C选择)。如本文使用的“选择性培养基”是指向其中添加了针对选择标记进行选择(selects for or against selectablemarkers)的化学化合物或生物部分的细胞生长培养基。

如本文所用，短语“球状填充晶格”是指包含晶格形成珠、试剂束和细胞的浆料。“晶格形成珠”是指在球状填充晶格中负责形成晶格的主要珠基底。“试剂束”是指试剂最初在其上或在其中成束并从其释放试剂的珠、囊泡或其他基底。

术语“靶基因组DNA序列”、“靶序列”或“基因组靶基因座”是指体外或体内，细胞或细胞群体的核酸(例如基因组)中的期望使用核酸引导的核酸酶编辑系统对至少一个核苷酸进行改变的任何基因座。靶序列可以是基因组基因座或染色体外基因座。

“载体”是包含待递送至细胞和/或在细胞中表达的期望的一种序列或更多种序列的多种核酸中的任一种。载体通常由DNA构成，但是RNA载体也是可用的。载体包括但不限于质粒、F粘粒(fosmids)、噬菌粒、病毒基因组、YAC、BAC、合成染色体等。如本文使用的，短语“引擎载体”包含用于本公开内容的核酸引导的核酸酶系统和方法中的核酸酶的编码序列。在细菌系统中，引擎载体还可以包含λRed重组工程系统或其等同物。引擎载体通常还包含可选择标记。如本文使用的，短语“编辑载体”包含供体核酸和gRNA编码序列，所述供体核酸任选地包括对靶序列的改变，所述改变在编辑发生后阻止核酸酶在靶序列中的PAM或间隔区(spacer)处结合。编辑载体还可以包括可选择标记和/或条形码。在一些实施方案中，可以将引擎载体和编辑载体组合；即，所有编辑和选择元件都可以在单个载体上找到。此外，引擎载体和编辑载体包含可操作地连接至例如核酸酶编码序列、重组工程系统编码序列(如果存在)、供体核酸、引导核酸和一种或更多种选择标记的控制序列。

发明总述

电穿孔是一种广泛使用的细胞膜透化方法，其通过用电刺激在细胞膜中暂时产生孔来实现。电穿孔的应用包括将外源物质诸如DNA、RNA或肽递送到各种细胞，诸如哺乳动物细胞(包括人类细胞)、植物细胞、古细菌、酵母、其他真核细胞、细菌和其他细胞类型。此外，细胞类型的混合物也可以在单次运行中电穿孔；例如大肠杆菌(E.coli)菌株的混合物、其他细菌菌株的混合物、酵母菌株的混合物、哺乳动物细胞的混合物。电刺激也可用于杂交瘤或其他融合细胞的产生中的细胞融合。在典型的电穿孔程序期间，将细胞悬浮在有利于细胞存活的缓冲液或培养基中。对于细菌细胞电穿孔，通常使用低电导培养基诸如水、甘油溶液等降低瞬时高电流产生的热量。细胞和待电穿孔到细胞中的物质(统称为“细胞样品”)然后被放置在嵌有两个用于放电的扁平电极的比色皿中。例如，Bio-Rad(Hercules,CA)制造了GENE PULSER XCELL^TM系列产品，以对比色皿中的细胞进行电穿孔。传统上，电穿孔要求高场强。

本公开内容提供了实现高效且低毒的细胞电穿孔的电穿孔组合物、方法、模块和自动化多模块仪器，其中电穿孔装置利用包含晶格形成球状水凝胶珠、试剂“束”或递送基底和细胞的球状填充晶格组合物。球状填充晶格组合物对电穿孔装置是不可知的，因为可以使用标准比色皿，或者，如以下详述的，可使用流通式电穿孔装置。此外，无论使用哪种电穿孔装置，球状填充晶格都允许与机器人液体操作仪器一起使用。这样的自动化仪器包括但不限于来自Tecan(Mannedorf,Switzerland)、Hamilton(Reno,NV)、Beckman Coulter(Fort Collins,CO)等的现成的自动化液体操作系统。

在电穿孔过程期间，使用足够实现物质电穿孔进入细胞的电压是重要的，但电压不能太大，因为太大的功率会降低细胞的生存力。例如，要电穿孔人类细胞系的悬液，对4mm间隙比色皿中的0.2ml样品需要200伏的电压，由约1000μF的电容器进行指数放电。然而，如果把同样的0.2ml细胞悬液放在具有2cm电极距离(比色皿间隙距离的5倍)的较长的容器中，则所需电压将是1000伏，但只需要40μF(1000μF的1/25)的电容器，因为由电容器产生的电能遵循以下等式：

E＝0.5U² C

其中E是电能，U是电压，并且C是电容。

本公开内容的球状填充晶格组合物允许在相对短的时间量内的高细胞转化速率。球状填充晶格包含晶格形成珠(例如，尺寸均匀的球状水凝胶珠)、试剂束(例如，包含试剂的试剂递送基底)和细胞，其中球状填充晶格组合物可在用于转化细胞的各种电穿孔装置中使用。使用球状填充晶格的主要优点之一是，通过将细胞和外源物质(例如试剂束)聚集到晶格内的间隙区域中，增加了细胞附近的外源物质的“有效”浓度而不影响培养基中外源物质的总量。因为外源物质(例如，DNA)可以增加培养基的电导率，可添加到电穿孔装置的总外源物质的上限由细胞可承受的电流/焦耳加热的量确定。使用球状填充晶格组合物的电穿孔通过增加递送到细胞的外源物质的量而不影响培养基的体积电导率，导致减少的培养基加热和增加的细胞生存力来改进转化或转染效率。

细胞转化的速率取决于细胞类型和被转化细胞的数量。例如，对于大肠杆菌，电穿孔装置可提供每分钟10³个至10¹²个细胞、每分钟10⁴个至10¹⁰个、每分钟10⁵个至10⁹个或每分钟10⁶个至10⁸个的细胞转化速率。通常，10⁷个至10⁸个酵母细胞经历转化并且每轮转化10⁴个至10⁵个被转化，并且10⁹-10¹⁰个细菌细胞经历转化并且每轮转化10⁶个至10⁷个被转化。电穿孔装置还允许使用平行装置在单个转化程序中转化1个细胞到10¹¹个细胞范围的细胞批次。

示例性球状填充晶格组合物和方法

本公开内容涉及包含水凝胶晶格形成珠、试剂束(例如，试剂递送基底)和细胞的球状填充晶格，其中球状填充晶格组合物可在各种用于转化细胞的电穿孔装置中使用。电穿孔装置可配置为用作独立电穿孔装置或用于在如下文详细描述的自动化多模块细胞处理环境中使用。球状填充晶格组合物利用尺寸均匀并自组装成晶体样的晶格的晶格形成珠。试剂束包含小到足以适合于晶体样晶格的间隙区域的珠或其它基底，其中试剂束可逆地包含将被递送到细胞中的外源物质(例如DNA、RNA、蛋白质、核蛋白复合物)的克隆拷贝。

图1A是用于在球状填充晶格中使细胞电穿孔的方法100的简化的框图。在第一步骤中，制备有效载荷102。“有效载荷”是待递送到(例如，转化或转染到)细胞中的外源物质。外源物质包括DNA、RNA、siRNA、肽、蛋白质、抗体、药物、核糖核蛋白、小分子如激素、细胞因子、趋化因子、药物、药物前体或其他物质。制备包括将外源物质制备或官能化成适合于可逆地装载到试剂递送基底上以形成试剂束的状态104。在这些方法中，可逆装载是指能够将外源物质或有效载荷偶联到试剂递送基底以形成试剂束，同时能够在电穿孔过程之前从试剂递送基底主动或被动地释放外源物质或有效载荷。在本文的方法中，主动释放是优选的并且包括例如化学释放、光子释放或电释放。例如，试剂束可包含高拷贝数的克隆DNA序列，该克隆DNA序列物理地拴系到固体基底如珠或限制在囊泡诸如乳液或脂质体中。试剂束基底的尺寸可以相对于晶格形成珠的尺寸来调节，使得只有一个试剂束适合于每个间隙分区，从而形成二元球状填充晶格。这样的结构能够实现外源物质向分区中的超级泊松装载。在填充到晶格中后，试剂束在电穿孔前不久被触发释放其有效载荷。合适的试剂递送基底包括聚合物微粒或陶瓷微粒，诸如聚苯乙烯珠(供应商包括例如Thermo Fisher、Sigma-Aldrich Spherotech和Polysciences)或由交联聚合物诸如聚丙烯酰胺、聚乙二醇或海藻酸盐等组成的水凝胶微粒，其中珠的直径为20μm至100μm，或直径为30μm至80μm，或直径为40μm至75μm。例如，有效载荷物质诸如DNA可以用对基底表面材料有反应性的化学部分来修饰，其中，例如，修饰可通过例如Integrated DNA Technologies,Inc.,(IDT,CoralvilleIA)商购获得。可选地，有效载荷分子可以直接在基底表面上诸如经由固相PCR合成或扩增，并且在某些情况下，可以从单个模板分子开始向珠表面上扩增，以确保整个珠表面的克隆性。可选地，在颗粒合成期间，DNA或其他有效载荷分子可以交联到基底颗粒的整个体积中。对于物理地拴系到试剂基底的试剂分子，可将不稳定部分(例如，光或化学不稳定)引入基底材料或基底-有效载荷连接化学，使得可从外部触发分子的释放。试剂有效载荷也可以通过在液滴或脂质囊泡中的区室化来成束而无固相固定。

在形成试剂束104后，通过将细胞与试剂束和高浓度的晶格形成球状水凝胶珠混合106来制备用于转化或转染的细胞悬液(例如，培养基中的细胞)。尽管球状填充晶格组合物流动性好到足以允许颗粒流动，但球状填充晶格组合物的一致性可以不同。“细胞”包括各种粘附细胞或悬浮细胞，诸如哺乳动物细胞(包括人类细胞)、植物细胞、古细菌、酵母、其他真核细胞、细菌和其他细胞类型。晶格形成球状水凝胶珠具有均匀的尺寸，并优选地由具有低电导率的材料制成，所述材料是弹性体以促进紧密填充的颗粒流动、是生物相容性的并且对外源物质诸如DNA、蛋白质和核糖核蛋白是不透性的。合适的晶格形成珠包括聚合物水凝胶，诸如聚丙烯酰胺、聚乙二醇、海藻酸盐、明胶等，其中珠的直径为75μm至250μm，或直径为100μm至200μm，或直径为125μm至150μm。由于电穿孔培养基中的晶格形成水凝胶珠与细胞和试剂束形成球状填充晶格(例如，通过沉降或离心)，晶格形成珠被填充成晶体样晶格，其中细胞和待递送到细胞的外源物质被隔离在珠之间的间隙体积中。间隙区域的体积和数量取决于晶格形成珠的类型和尺寸。此外，控制晶体样晶格的组装速率增加了形成均匀晶格的可能性。

在步骤108，提供从试剂束释放有效载荷(例如，外源物质)的条件。同样，主动触发物是优选的，以便能够在转化或转染之前可靠地释放试剂有效载荷。合适的触发物包括化学触发物，如酶促、pH或竞争性结合反应；光子触发物，诸如响应于UV或可见光的释放；或电触发物，诸如电场诱导的囊泡失稳，或温度触发物。在试剂有效载荷从试剂束释放后，提供条件以使细胞电穿孔110。在电穿孔之后，任选地允许细胞恢复，并解构球状填充晶格和收集细胞112。晶格形成珠和试剂束基底可以经由过滤、离心或磁分离与细胞分离。

图1B描绘了在有效载荷(例如，试剂)释放之前(左)和之后(右)，具有细胞和试剂束的示例性球状填充晶格。在图1B的左侧，可以看到晶格形成珠150；试剂束152a、152b、152c、152d、152e和152f(其中可以存在一种或更多种且不同量的每种类型的试剂束)；和细胞154。在有效载荷释放(例如，试剂从试剂束152释放)之后，在图1B的右侧看到晶格形成珠150；试剂束153a、153b、153c、153d、153e和153f(它们现在被描绘为试剂的扩散圈)；和细胞154。注意，尽管在该示例性实施方案中，所有晶格形成珠或球体尺寸相同，但球体形成晶格可以由不同尺寸的晶格形成珠形成。关键是，调整晶格形成球的尺寸——以及如果使用一个以上尺寸的珠，珠尺寸的相对比例——以形成具有适当尺寸的间隙区域的晶格以容纳试剂束。在一些实施方案中，将相等数量的不同试剂束添加到球状填充晶格；即，将相等数量或浓度的试剂束1、试剂束2、试剂束3、试剂束4等至试剂束X添加到球状填充晶格。然而，在其他实施方案中，添加不同量的不同试剂束以形成球状填充晶格。

球状填充晶格的体积可以在10μL到1mL之间，或在50μL到750μL之间，或在100μL到500μL之间。用于悬浮细胞和在球状填充晶格中使用的培养基或缓冲液可以是用于被转化或转染的细胞类型的任何适合的培养基或缓冲液，诸如SOC、MEM、DMEM、IMDM、RPMI、Hanks、PBS和林格氏溶液。此外，由于在转化或转染之前必须使细胞成为电感受态，缓冲液也可以包含甘油或山梨醇，并且还可以包含表面活性剂。对于大多数真核细胞的电穿孔，培养基或缓冲液通常含有盐以保持适当的渗透压。培养基或缓冲液中的盐也使培养基导电。对于非常小的原核细胞诸如细菌的电穿孔，有时使用水或10％甘油作为低电导培养基以允许非常高的电场强度。在那种情况下，待递送的带电分子仍然使基于水的培养基比基于脂的细胞膜更导电，并且培养基仍然可以被粗略地认为是导电的，特别是与细胞膜相比。

同样，使用球状填充晶格有两个主要优点。首先，通过将细胞和外源物质聚集到晶格间隙，增加了细胞附近的外源物质的“有效”浓度，而不影响培养基中外源物质的总量。由于外源物质可增加电导率(例如DNA)，可添加到电穿孔装置的总外源物质的上限由细胞可承受的电流/焦耳加热的量确定。使用球状填充晶格的电穿孔通过增加递送到细胞的外源物质的量而不影响培养基的体积电导率来改进转化或转染，导致减少的培养基加热和增加的细胞生存力。第二，球状填充还能够以分区的形式进行多重化的试剂递送，因为每个间隙区域都通过晶格形成珠与相邻区域隔离。

令人惊讶的是，还已发现缺乏试剂束的系统，其中待递送到细胞的试剂不是通过试剂束递送，而是存在于其中悬浮细胞和晶格形成珠的培养基中；也就是说，作为“有效载荷”的DNA、RNA、siRNA、肽、蛋白质、抗体、药物、核糖核蛋白、小分子如激素、细胞因子、趋化因子、药物和药物前体等不是在试剂束上递送的。同样，通过将细胞和外源物质聚集到晶格间隙，增加了细胞附近的外源物质或有效载荷的“有效”浓度，而不影响培养基中外源物质的总量。因此，在替代实施方案中，提供了用于转化或转染细胞的方法，包括：提供细胞、晶格形成珠和试剂在培养基中的球状填充组合物；以及向细胞、晶格形成珠和试剂的球状填充组合物提供电脉冲。

核酸指导的核酸酶基因组编辑总述

通过本文描述的方法转化的细胞可在核酸指导的核酸酶(例如RNA引导的核酸酶)基因组编辑中使用，这在活细胞中产生基因组编辑。与适当的合成的引导核酸在细胞中复合的核酸引导的核酸酶可以在期望的位置处切割细胞的基因组。引导核酸有助于核酸引导的核酸酶识别和切割特定靶序列处的DNA。通过操纵引导核酸的核苷酸序列，核酸引导的核酸酶可以被编程为靶向任何DNA序列用于裂解，只要适当的前间区邻近基序(protospaceradjacent motif,PAM)在附近。在某些方面，核酸引导的核酸酶编辑系统可以使用组合起来发挥引导核酸的作用的两个分开的引导核酸分子，例如CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。在其他方面，引导核酸可以是包含crRNA序列和tracrRNA序列二者的单个引导核酸。

通常，引导核酸(例如，gRNA)可以与相容的核酸引导的核酸酶复合，并且然后可以与靶序列杂交，从而将核酸酶指导至靶序列。引导核酸可以是DNA或RNA；可选地，引导核酸可以包含DNA和RNA二者。在一些实施方案中，引导核酸可以包含修饰的或非天然存在的核苷酸。在引导核酸包含RNA的情况下，gRNA可以由多核苷酸分子诸如质粒、线性构建体上的DNA序列编码，或者编码序列可以驻留在编辑盒内。用于gRNA的序列可以处于组成型启动子的控制下，或者在一些实施方案中并且优选地，处于如下描述的诱导型启动子的控制下。

引导核酸包含引导序列，其中引导序列是与靶序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且指导复合的核酸引导的核酸酶与靶序列的序列特异性结合的多核苷酸序列。引导序列和对应的靶序列之间的互补性程度在使用合适的比对算法进行最佳比对时是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可以通过使用用于比对序列的任何合适的算法来确定。在一些实施方案中，引导序列的长度是约或多于约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、75个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，引导序列的长度为少于约75个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个核苷酸。优选地，引导序列是10-30个或15-20个核苷酸长，或者长度是15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。

在本发明的方法和组合物中，引导核酸作为待由质粒或载体表达的序列提供，并且包含引导序列和支架序列二者作为启动子控制下的(并且在一些实施方案中，诱导型启动子控制下的)单一转录物。通过改变引导序列使得引导序列与期望的靶序列互补，从而允许引导序列和靶序列之间的杂交，可以将引导核酸工程化成靶向期望的靶序列。通常，为了在靶序列中产生编辑，gRNA/核酸酶复合体与如由引导RNA确定的靶序列结合，并且核酸酶识别与靶序列邻近的前间区邻近基序(PAM)序列。靶序列可以是对原核细胞或真核细胞而言为内源或外源的任何多核苷酸，或体外的任何多核苷酸。例如，靶序列可以是驻留于真核细胞的细胞核中的多核苷酸。靶序列可以是编码基因产物(例如，蛋白)的序列或非编码序列(例如，调控多核苷酸、内含子、PAM或“垃圾”DNA(“junk”DNA))。

引导核酸可以是编码供体核酸的编辑盒的一部分。可选地，引导核酸可以不是编辑盒的一部分，而是可以被编码在引擎或编辑载体骨架上。例如，可以首先将编码引导核酸的序列组装或插入载体骨架中，随后将供体核酸插入例如编辑盒中。在其他情况下，可以首先将例如编辑盒中的供体核酸插入或组装到载体骨架中，随后插入编码引导核酸的序列。在又其他情况下，编码引导核酸和供体核酸(例如，插入编辑盒中)的序列同时但分开插入或组装到载体中。在又其他实施方案中，编码引导核酸的序列和编码供体核酸的序列二者均包含在编辑盒中。

靶序列与前间区突变(PAM)相关，前间区突变(PAM)是由gRNA/核酸酶复合体识别的短核苷酸序列。用于不同的核酸引导的核酸酶的精确优选的PAM序列和长度要求不同；然而，PAM通常是与靶序列邻近或接近的2-7个碱基对序列，并且取决于核酸酶，可以在靶序列的5’或3’。核酸引导的核酸酶的PAM相互作用结构域的工程化可以允许改变PAM特异性、改进靶位点识别保真度、降低靶位点识别保真度或增加核酸引导的核酸酶的多功能性。在某些实施方案中，靶序列的基因组编辑既将期望的DNA改变引入靶序列，例如细胞的基因组DNA，又去除靶序列中的前间区突变(PAM)区，使靶序列中的前间区突变(PAM)区突变或失活。使靶序列处的PAM失活排除了对该靶序列处细胞基因组的另外的编辑，例如，在后续轮的编辑中随后暴露于与合成的引导核酸复合的核酸引导的核酸酶时。因此，具有期望的靶序列编辑和改变的PAM的细胞可以使用与合成的引导核酸复合的核酸引导的核酸酶来选择，所述合成的引导核酸与靶序列互补。没有经历第一编辑事件的细胞的基因组会被切割，引起双链DNA断裂，并且因此这些细胞会无法继续存活。包含期望的靶序列编辑和PAM改变的细胞的基因组不会被切割，因为这些编辑的细胞不再包含必需的PAM位点，并且因此会继续生长和繁殖。

核酸引导的核酸酶可以识别的靶序列的范围受将特定PAM定位于期望的靶序列附近的需要限制。因此，以基因组编辑必需的精度靶向编辑通常可能是困难的。已经发现，核酸酶可以非常好地识别一些PAM(例如，典型PAM(canonical PAM))，而不太好或较差地识别其他PAM(例如，非典型PAM)。因为本文公开的某些方法允许在未编辑细胞的背景中鉴定编辑的细胞(参见例如，图7A-图7E及其描述)，所以方法允许在PAM未达最佳的情况下鉴定编辑的细胞；即，即使编辑效率非常低，本文用于鉴定编辑的细胞的方法也允许鉴定编辑的细胞。此外，因为编辑更容易被鉴定，本发明的方法扩大了可以被编辑的靶序列的范围，包括其中基因组编辑与功能较弱的PAM相关的细胞。

至于核酸引导的核酸酶编辑系统的核酸酶组分，编码核酸引导的核酸酶的多核苷酸序列可以被密码子优化以在特定细胞类型，诸如古细菌、原核细胞或真核细胞中表达。真核细胞可以是酵母、真菌、藻类、植物、动物或人类的细胞。真核细胞可以是特定生物体的细胞或来源于特定生物体的细胞，所述特定生物体诸如哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、犬或非人类哺乳动物(包括非人类灵长类动物)。待采用的核酸引导的核酸酶的选择取决于许多因素，诸如在靶序列中待进行何种类型的编辑，以及适当的PAM是否位于期望的靶序列附近。本文描述的方法中使用的核酸酶包括但不限于Cas 9、Cas 12/CpfI、MAD2或MAD7或其他MAD酶(MADzyme)。与引导核酸一样，核酸酶可以由载体(例如，引擎载体)上的DNA序列编码，并且处于组成型或诱导型启动子的控制下。在一些实施方案中，编码核酸酶的序列处于诱导型启动子的控制下，并且该诱导型启动子可以与控制引导核酸转录的诱导型启动子分开但相同；即，分开的诱导型启动子驱动核酸酶和引导核酸序列的转录，但是这两个诱导型启动子可以是相同类型的诱导型启动子(例如，二者都是pL启动子)。可选地，控制核酸酶表达的诱导型启动子可以与控制引导核酸转录的诱导型启动子不同；即，例如，核酸酶可以处于pBAD诱导型启动子的控制下，并且引导核酸可以处于pL诱导型启动子的控制下。

核酸引导的核酸酶系统的另一组分是供体核酸。在一些实施方案中，供体核酸与引导核酸在同一多核苷酸(例如，编辑载体或编辑盒)上，并且可以(但不必然)处于与引导核酸相同的启动子的控制下(例如，驱动引导核酸和供体核酸二者转录的单一启动子)。供体核酸被设计成用作与靶序列同源重组的模板，该靶序列被作为gRNA/核酸酶复合体的一部分的核酸引导的核酸酶切口或裂解。供体核酸多核苷酸可以具有任何合适的长度，诸如约或多于约20个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、500个或1000个核苷酸的长度。在某些优选的方面，供体核酸可以以20-300个核苷酸之间，更优选地50-250个核苷酸之间的寡核苷酸提供。供体核酸包含与靶序列的一部分互补的区域(例如同源臂)。当最佳比对时，供体核酸与靶序列重叠(互补)例如约20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或更多个核苷酸。在许多实施方案中，供体核酸包含位于供体核酸和靶模板之间的突变或差异的侧翼的两个同源臂(与靶序列互补的区域)。供体核酸包含与靶序列相比的至少一个突变或改变，诸如与靶序列相比的插入、缺失、修饰或其任何组合。

通常，供体核酸以编辑盒提供，其被插入到载体骨架中，其中载体骨架可以包含驱动gRNA转录的启动子和gRNA编码序列，或者载体骨架可以包含驱动gRNA转录的启动子，但不包含gRNA本身。此外，可以有多于一个，例如两个、三个、四个或更多个引导核酸/供体核酸盒插入到编辑载体中，其中每个引导核酸处于分开的不同启动子、分开的相似启动子的控制下，或者其中所有引导核酸/供体核酸对处于单个启动子的控制下。在一些实施方案中，驱动gRNA和供体核酸(或驱动多于一个gRNA/供体核酸对)转录的启动子是诱导型启动子，并且驱动核酸酶转录的启动子也是诱导型启动子。关于编辑盒的另外的信息，参见USPN9,982,278；USPN 10,240,167；USPN 10,266,849；USPN 10,351,877；USPN 10,364,442；和USPN 10,435,715；以及USSN 16/275,465和USSN 16/551,517。

除了供体核酸之外，编辑盒可以包含一个或更多个引物位点。引物位点可以用于通过使用寡核苷酸引物扩增编辑盒；例如，如果引物位点位于编辑盒的一个或更多个其他组分的侧翼。

此外，如以上描述的，供体核酸可以任选地包含除了相对于靶序列的至少一个突变之外的一个或更多个PAM序列改变，所述改变使靶序列中的PAM位点突变、缺失或失活。靶序列中的PAM序列改变使PAM位点对核酸引导的核酸酶“免疫”，并且如果相同的核酸酶被使用，保护靶序列在随后轮的编辑中不被进一步编辑。

此外，编辑盒可以包含条形码。条形码是对应于供体DNA序列的独特DNA序列，使得条形码可以鉴定对对应靶序列进行的编辑。条形码通常包含四个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，编辑盒包含代表例如供体核酸的全基因或全基因组文库的供体核酸的集合。编辑盒的文库被克隆到载体骨架中，其中，例如，每个不同的供体核酸与不同的条形码相关。

此外，在一些实施方案中，编码核酸引导的核酸酶系统的组分的表达载体或盒还编码包含一个或更多个细胞核定位序列(NLS)诸如约或多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个NLS的核酸引导的核酸酶。在一些实施方案中，工程化核酸酶包含氨基末端处或其附近的NLS、羧基末端处或其附近的NLS，或其组合。

引擎载体和编辑载体包含可操作地连接至待转录的组分序列的控制序列。如上陈述的，驱动核酸引导的核酸酶编辑系统的一个或更多个组分例如gRNA和核酸酶中的一个或二者转录的启动子可以是诱导型的。已经开发了用于植物、微生物和动物细胞(包括哺乳动物细胞)中的受控基因表达的许多基因调控控制系统，包括pL启动子(通过CI857阻遏物的热失活诱导)、pBAD启动子(通过将阿拉伯糖添加至细胞生长培养基中诱导)和鼠李糖诱导型启动子(通过将鼠李糖添加至细胞生长培养基中诱导)。其他系统包括四环素控制的转录激活系统(Tet-On/Tet-Off，Clontech,Inc.(Palo Alto,CA)；Bujard和Gossen,PNAS,89(12):5547-5551(1992))、Lac开关诱导型系统(Wyborski等人，Environ Mol Mutagen,28(4):447-58(1996)；DuCoeur等人，Strategies 5(3):70-72(1992)；美国专利第4,833,080号)、蜕皮素诱导型基因表达系统(No等人，PNAS,93(8):3346-3351(1996))、cumate基因开关系统(Mullick等人，BMC Biotechnology,6:43(2006))、和他莫昔芬诱导型基因表达(Zhang等人，Nucleic Acids Research,24:543-548(1996))以及其他。在本文描述的模块和仪器中使用的本发明方法中，优选的是，至少一种核酸引导的核酸酶编辑组分(例如核酸酶和/或gRNA)处于通过温度升高而被激活的启动子的控制下，因为这样的启动子允许启动子通过温度增加而被激活，并且通过温度降低而失去活性，从而“关闭”编辑过程。因此，在启动子通过温度降低而失去活性的情况下，细胞中的编辑可以被关闭，而无需更换培养基；无需去除例如培养基中用于诱导编辑的诱导型生化物质(inducible biochemical)。

自动化多模块细胞处理仪器和模块

本公开内容涉及可在独立电穿孔装置中使用的转化细胞的方法，或者该方法可在作为自动化多模块细胞处理仪器中的一个模块的电穿孔装置或模块中执行。具有电穿孔的自动化多模块细胞处理仪器可用于以受控、包含和可复制的方式处理许多不同类型的细胞，包括细菌细胞、哺乳动物细胞、非哺乳动物真核细胞、酵母细胞、真菌、古细菌等。

自动化细胞编辑仪器

图2A描绘了例如通过本文描述的方法执行转化细胞并执行核酸引导的核酸酶基因编辑的示例性自动化多模块细胞处理仪器200。例如，仪器200可以并且优选地被设计为用于在实验室环境中使用的独立台式仪器。仪器200可以包括可重复使用部件和一次性部件的混合物，用于在细胞中进行自动化基因组裂解和/或编辑时进行各种集成的过程而无人工干预。图示了机架(gantry)202，机架202提供了自动化机械运动系统(致动器)(未示出)，该自动化机械运动系统(致动器)向例如自动化(即，机器人)液体操作系统258提供XYZ轴运动控制，该自动化液体操作系统258包括例如空气置换移液器232，这允许多个模块之间的细胞处理而无人工干预。在一些自动化多模块细胞处理仪器中，空气置换移液器232由机架202移动，并且各种模块和试剂筒保持静止；然而，在其他实施方案中，液体操作系统258可以保持静止而各种模块和试剂筒移动。自动化多模块细胞处理仪器200中还包括试剂筒210，其包括储库212和转化模块230(例如，关于图3A-图3N详细描述的流通式电穿孔装置)，以及洗涤储库206、细胞输入储库251和细胞输出储库253。洗涤储库206可以被配置成容纳大的管，例如洗涤溶液，或者在整个迭代过程中通常使用的溶液。尽管在图2A中，两个试剂筒210包括洗涤储库206，但是洗涤储库也可以被包括在洗涤筒中，其中试剂筒和洗涤筒是分开的筒。在这样的情况下，除了插入其中的消耗品(包含在各种插入件中的试剂或其他组分)之外，试剂筒210和洗涤筒204可以是相同的。(参见例如图4A和图4B。)

在一些实施方式中，试剂筒210是用于在自动化多模块细胞处理/编辑仪器200中使用的包含试剂和细胞的一次性套件。例如，在启动细胞处理前，使用者可以在自动化多模块细胞编辑仪器200的机箱(chassis)内打开和定位每个包含各种期望的插入件和试剂的试剂筒210。此外，每个试剂筒210可以插入机箱中的容器(receptacle)中，该容器具有适合于容纳在其中的试剂的不同温度区。

图2A中还图示了机器人液体操作系统258，包括机架202和空气置换移液器232。在一些实例中，机器人操作系统258可以包括自动化液体操作系统，诸如由Mannedorf,Switzerland的Tecan Group Ltd.、Reno,NV的Hamilton Company(参见，例如，WO2018015544A1)或Fort Collins,CO.的Beckman Coulter,Inc.(参见，例如，US20160018427A1)制造的那些。移液器吸头可以在移液转移吸头供应装置(未示出)中提供，用于与空气置换移液器232一起使用。

在一些实施方式中，试剂筒210的插入件或部件标记有机器可读标记(未示出)，诸如条形码，用于由机器人操作系统258识别。例如，机器人液体操作系统258可以扫描每个试剂筒210内的一个或更多个插入件以确认内容物。在其他实施方式中，机器可读标记可以标记在每个试剂筒210上，并且自动化多模块细胞编辑仪器200的处理系统(未示出，但参见图2B的元件237)可以基于机器可读标记鉴定储存材料地图。在图2A中图示的实施方案中，细胞生长模块包括细胞生长瓶218(下文关于图5A-图5D更详细描述)。另外看到的是TFF模块222(下文关于图6A-图6E进行了详细描述)和选择模块220。作为图2A的自动化多模块细胞处理仪器200的一部分，还图示了在本文关于图7A-图7E描述的单个化模块240(例如，此处示出的固体壁分离、孵育和标准化装置(SWIIN装置))，该单个化模块240由例如机器人液体操作系统258和空气置换移液器232供应。另外看到的是选择模块220。还注意三个散热器255的放置。

图2B是图2A中描绘的示例性多模块细胞处理仪器200的内容物的简化展示。例如，基于筒的源材料(诸如在试剂筒210中)可以被定位于仪器200的平台(deck)上的指定区域中，以供空气置换移液器232获取(access)。多模块细胞处理仪器200的平台可以包括保护槽，使得从仪器200的任何模块溢出(spilling)、滴落或溢流(overflowing)的污染物容纳在保护槽的边缘(lip)内。还看到试剂筒210，其显示为设置有热组件211，热组件211可以产生适合不同区域的温度区。注意，试剂筒之一还包括流通式电穿孔装置230(电穿孔)，由电穿孔接口(例如歧管臂(manifold arm))和致动器231供应。还看到具有与热组件225相邻的TFF模块222，其中TFF模块由TFF接口(例如歧管臂)和致动器233供应。热组件225、235和245包含热电装置，诸如Peltier装置，以及散热器、风扇和冷却器。旋转生长瓶218在生长模块234内，其中生长模块由两个热组件235供应。在220看到选择模块。还看到SWIIN模块240，其包括SWIIN筒241，其中SWIIN模块还包括热组件245、照明243(在该实施方案中为背光)、蒸发和冷凝控制249，并且其中SWIIN模块由SWIIN接口(例如，歧管臂)和致动器247供应。在该视图中还看到触摸屏显示器201、显示器致动器203、照明205(多模块细胞处理仪器200两侧各一个)和照相机239(多模块细胞处理仪器200两侧各一个照明装置)。最后，元件237包括电子器件，诸如电路控制板、高压放大器、电源和电源输入；以及气动器件(pneumatics)，诸如泵、阀和传感器。

图2C图示了用作自动化多模块细胞编辑仪器200的桌面版本的多模块细胞处理仪器200的前透视图。例如，机箱290可以具有约24-48英寸的宽度、约24-48英寸的高度和约24-48英寸的深度。机箱290可以并且优选地被设计成容纳自动化细胞处理中使用的所有模块和一次性供应装置，并且在没有人工干预的情况下执行所需的所有过程；即，机箱290被配置成提供集成的、独立的自动化多模块细胞处理仪器。如图2C中图示的，机箱290包括触摸屏显示器201、冷却格栅264，冷却格栅264允许空气经由内部风扇(未示出)流动。触摸屏显示器向使用者提供关于自动化多模块细胞编辑仪器400的处理状态的信息，并接受来自使用者的输入用于进行细胞处理。在该实施方案中，机箱290由可调节的支脚270a、270b、270c和270d提升(支脚270a-270c在该图2C中示出)。例如，可调节的支脚270a-270d允许在机箱290下方的另外的气流。

在一些实施方式中，机箱290内部是关于图2A和图2B描述的大部分或全部部件，包括沿着机架设置的机器人液体操作系统、包括流通式电穿孔装置的试剂筒210、细胞生长模块234中的旋转生长瓶218、切向流过滤模块222、SWIIN模块240以及用于各种模块的接口和致动器。此外，机箱290容纳控制电路、液体操作管、气泵控制器、阀、传感器、热组件(例如，加热和冷却单元)和其他控制机构。有关多模块细胞编辑仪器的实例，参见2019年4月9日颁发的USPN 10,253,316；2019年6月25日颁发的USPN 10,329,559；2019年6月18日颁发的USPN 10,323,242；2019年9月24日颁发的USPN 10,421,959；2019年11月5日颁发的USPN10,465,185；2019年12月31日颁发的USPN 10,519,437；以及2019年10月29日提交的USSN16/666,964；和2019年11月12日提交的USSN 16/680,643，这些全部通过引用以其整体并入本文。

转化装置

本文公开的球状填充晶格组合物可在流通式电穿孔装置(FTEP装置)中以及电穿孔比色皿中使用。图3A-图3C图示了FTEP组件。图3A到图3C分别是包括六个共同连接的FTEP装置350的FTEP组件3500的俯透视图、仰透视图和仰视图。图3A描绘了布置在单个的、整体成型的注射成型基底356上的六个FTEP单元350。六个FTEP单元350中的每一个具有界定入口的孔352和界定出口的孔354。此外，在每个FTEP单元上可以看到两个电极通道378中的一个。图3B是FTEP组件3500的仰透视图，仰透视图其中图3A的六个共同连接的FTEP装置350布置在单个基底356上。可见六个入口孔352，每个流通式电穿孔单元350一个入口孔，并且在最左侧的FTEP单元可见一个出口孔354。在图3B中还可以看到每个FTEP单元350的入口302、出口304、流动通道306，流动通道306包括五个区域：入口过滤区306a、入口近端区306b、中心区306c、出口近端区306d和出口过滤区306e(在该图3B中只有中心区306c被标记，但参见图3C和图3D)。每个FTEP单元还包括位于流动通道306的中心区306c两侧的两个电极308。

图3C是图3A和图3B的六个共同连接的FTEP装置350的FTEP组件3500的仰视图。在图3C中描绘了布置在单个基底356上的六个FTEP单元350，其中每个FTEP单元350包括入口302、出口304、流动通道306，流动通道306包括五个区域：入口过滤区306a、入口近端区306b、中心区106c、出口近端区306d和出口过滤区306e。每个FTEP单元还包括位于流动通道306的中心区306c两侧的两个电极308。在制造了六个FTEP单元350后，它们可以在所描绘的划线上彼此分离(例如，“断裂”)并且一次使用一个；可选地，FTEP单元可在并行使用两个或更多个FTEP单元350的实施方案中使用。

FTEP装置的基底、入口孔、出口孔、过滤器和障碍物阵列可以由许多材料制成，这取决于FTEP装置是要重复使用、高压灭菌还是一次性使用，材料包括不锈钢、硅、玻璃、树脂、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚砜和聚氨酯、这些和其他聚合物的共聚物。类似地，装置中的通道的壁可以由任何合适的材料，包括硅酮、树脂、玻璃、玻璃纤维、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚砜和聚氨酯、这些和其他聚合物的共聚物制成。优选的材料包括结晶苯乙烯、环烯烃聚合物(COP)和环烯烃共聚物(COC)，这允许除了电极和例如底部和/或上部密封膜(如果存在)之外，FTEP装置可以通过注射成型整体形成。

本文描述的FTEP装置(或FTEP装置的部分)可以经由各种技术产生或制造，例如作为整个装置或通过产生熔合或以其他方式耦合的结构层。例如，对于金属FTEP装置，制造可以包括精密机械加工或激光加工；对于硅FTEP装置，制造可以包括干法或湿法蚀刻；对于玻璃FTEP装置，制造可以包括干法或湿法蚀刻、喷粉(powderblasting)、喷砂或光结构化；以及对于塑料FTEP装置，制造可以包括热成型、注射成型、热压花或激光加工。FTEP装置的部件可以单独制造并且然后组装，或者FTEP装置的某些部件(或者甚至除了电极之外的整个FTEP装置)可以作为单个实体制造(例如，使用3D打印)或模制(例如，使用注射成型)，在模制之后添加其他部件。例如，壳体和通道可以被制造或模制成单个实体，电极随后被添加以形成FTEP单元。在一些实施方案中，膜或平坦基底可用于密封装置的底部。在一些实施方案中，膜由与FTEP装置相同的材料制成，在这种情况下，例如，晶体苯乙烯、环烯烃聚合物(COP)或环烯烃共聚物(COC)。FTEP装置也可以形成为两个或更多个平行层，例如，具有水平通道和过滤器的层、具有垂直通道的层以及具有入口端口和出口端口的层，这些层被单独制造和/或模制并在制造之后组装。

在特定方面，可以使用电路板作为基底来制造FTEP装置，其中电极、过滤器和/或流动通道以期望的配置形成在电路板上，并且包含例如一个或更多个入口通道和出口通道和/或流动通道的装置的剩余壳体作为单独的层形成，然后密封到电路板上。将壳体的顶部密封到电路板上提供了本公开内容的FTEP装置的不同元件的期望配置。此外，可以在单个基底上平行地制造两个至许多个FTEP装置(多达48个或更多个)，然后彼此其后分离或者并行使用。在某些实施方案中，FTEP装置是可重复使用的，并且在一些实施方案中，FTEP装置是一次性的。在另外的实施方案中，FTEP装置可以是可高压灭菌的。

电极308可以由任何合适的金属，诸如铜、不锈钢、钛、铝、黄铜、银、铑、金或铂或石墨形成。一种优选的电极材料是合金303(UNS330300)奥氏体不锈钢。施加的电场可以破坏由金属(如铝)制成的电极。如果期望多次使用(例如，非一次性)FTEP装置，即不同于一次性的一次使用FTEP装置，电极板可以涂有对电化学腐蚀耐受的金属。导电涂层，如贵金属，例如金，可用于保护电极板。

FTEP装置的总尺寸可以是3cm到15cm长，或4cm到12cm长，或5cm到10cm长。FTEP装置的总宽度可以是1cm到7.5cm，或者1.5cm到5cm，或者2cm到4cm。

在其中储库用于将细胞和外源物质引入FTEP装置的FTEP装置的实施方案中，储库的体积范围为100μL至15mL，或500μL至10mL，或1mL至10mL。FTEP中的流量范围为每分钟0.01mL至5.0mL，或每分钟0.05mL至3.0mL，或每分钟0.1mL至2.5mL，或每分钟0.2mL至2.0mL。FTEP装置中的压力范围为1-30psi，或2-10psi，或3-5psi。

为了避免电极之间的场强不同，电极应当平行排列。此外，电极的表面应当尽可能光滑，而无针孔或峰。具有1μm至10μm的粗糙度Rz的电极是优选的。在本发明的另一种实施方案中，流通式电穿孔装置包括至少一个另外的电极，该电极向FTEP装置施加地电位。

电极配置为输送1-50kV/cm或5-40kV/cm或10-25kV/cm。电极间距越大，需要提供的电压越多；此外，所输送的电压当然取决于被穿孔的细胞的类型、细胞悬浮在其中的培养基(例如，形成球体的晶格组合物)、电穿孔通道的尺寸以及电极的长度和直径。有许多不同的脉冲形式可用于FTEP装置，包括指数衰减波、方波或矩形波、任意波形或波形的选定组合。一种常见的脉冲形式是指数衰减波，通常通过使有负载的电容器向细胞样品放电而产生。可以通过将电感器连接到细胞样品使得初始峰值电流可以被衰减来使指数衰减波变得不那么陡峭。当以指定顺序使用多个波形时，它们可以是同一方向(直流电)或不同方向(交流电)。使用交流电可以是有益的，因为细胞的两个表面(topical surface)而不是只有一个表面可以用于分子传输，并且交流电可以防止电解。脉冲发生器可由数字或模拟面板控制。在一些实施方案中，方波形式是优选的，并且在其他实施方案中，方波之前的初始波尖峰是优选的。

FTEP装置可配置为电穿孔在10μL至1mL，或50μL至750μL，或100μL至500μL，以及优选地10μL至100μL之间的细胞样品体积。用于形成球状形成晶格组合物以电穿孔到细胞中用于电穿孔过程的培养基或缓冲液可以是适合用于被转化或转染的细胞类型的任何培养基或缓冲液，诸如SOC、MEM、DMEM、IMDM、RPMI、Hanks、PBS和林格氏溶液。此外，由于在转化或转染之前必须使细胞成为电感受态，缓冲液也可以包含甘油或山梨醇，并且还可以包含表面活性剂。对于大多数真核细胞的电穿孔，培养基或缓冲液通常含有盐以保持适当的渗透压。培养基或缓冲液中的盐也使培养基导电。对于非常小的原核细胞诸如细菌的电穿孔，有时使用水或10％甘油作为低电导培养基以允许非常高的电场强度。在那种情况下，待递送的带电分子仍然使基于水的培养基比基于脂的细胞膜更导电，并且培养基仍然可以被粗略地认为是导电的，特别是与细胞膜相比。

此外，FTEP装置可以包括推拉气动装置以允许多次(multi-pass)电穿孔程序；即，对于一次电穿孔，待电穿孔的球状填充晶格组合物中的细胞可以从入口被“拉”向出口，然后对于另一次电穿孔，细胞从流通式FTEP装置的出口端被“推”向入口端，以再次在电极之间通过。这个过程可以重复一次到许多次。可选地，FTEP可用于穿孔细胞的顺序等份；例如，在第一次中对第一体积的细胞进行穿孔，然后将第一体积转移到恢复，然后在第二次中对第二体积的细胞进行穿孔，然后将第二体积转移到恢复，依此推及第三、第四和第五体积或更多体积。

图3D是的FTEP装置350的放大仰视图，其中标记了流动通道区域。FTEP装置350包括入口302、出口304、流动通道306，流道306包括五个区域：入口过滤区306a、入口近端区306b、中心区306c、出口近端区306d和出口过滤区306e。两个电极308位于流动通道306的中心区306c的两侧。还看到坡道(ramp)374a和374b。入口302近端的坡道374a减小了从电极308近端的坡道374a的区域向流动通道306的中心区306c近端的坡道374a的区域行进的流动通道306的横截面积。出口304近端的坡道374b增加了从流动通道306的中心区306c近端的坡道374b的区域向电极308行进的流动通道306的横截面积。通道高度是可以用来调谐电场强度的参数。在恒定的外加电压，电场强度可以通过减小细胞通过的流动通道的横截面积来增加。例如，随着流动通道高度的减小，电场强度增加。类似地，如上文描述的，当障碍物阵列中的障碍物之间的间距变小时，电场强度增加。因此，任选的坡道起到增加电场强度以实现增强电穿孔效率的目的。坡道374a和374b可以类似地配置(尽管以镜像)或者可以具有不同的配置。坡道的长度范围可以从0.3mm至2.0mm，或者从0.5mm至1.5mm，或者从0.8mm至1.0mm。坡道374的宽度W优选地等于通道的宽度W，诸如约1.0cm至7.5cm，或1.5cm至5cm，或2cm至4cm。坡道374a将流动通道306的中心区306c的截面高度从1000μm降低到400μm，或从750μm降低到300μm，并且坡道374b将流动通道306的中心区306c到电极308的截面高度从400μm增加到1000μm，或从300μm增加到750μm。另外，坡道374a和374b的配置可以是流动通道高度从较大截面高度到较小截面高度的平滑过渡，或者坡道374a和374b的配置可以是阶梯式的。例如，对于坡道374a，，第一阶梯可以将中心区306c的截面高度减小25μm用于中心区306c的长度X，然后，下一阶梯可以将中心区306c的截面高度再减小25μm用于中心区306c的长度Y。坡道374b的配置可以匹配(镜像)坡道374a的配置，或者可以不同于坡道374a的配置。

根据待电穿孔的细胞类型(例如细菌、酵母、哺乳动物)和电极的配置，流动通道中电极之间的距离可以变化很大。自每个电极108的中点的长度L1为约1mm至15mm，或2mm至12mm，3mm至10mm，或4mm至8mm。

图3E-图3G描绘了被配置成插入例如试剂筒中的流通式电穿孔装置插入件308的三个侧面透视图。在图4A所描绘的试剂筒400的实施方案中，流通式电穿孔装置406位于试剂筒400中(还看到试剂筒210，其中流通式电穿孔装置230是图2A中的自动化多模块细胞处理仪器200的一个部件)；而在替代实施方案中，电穿孔模块可以与试剂筒分离。电穿孔包括入口孔352(在图3E和图3F中被覆盖)和出口孔354(在图3E和图3F中也被覆盖)，以及电极通道378的外部。电穿孔装置插入件308包括突片(tab)317和外凸缘(outer flange)307二者。图3G描绘了具有盖305的电穿孔装置插入件308，盖305用于例如运输并在使用之前保持电穿孔装置306无菌。电穿孔插入件可以由任何适当的材料制成；然而，在大多数实施方案中，插入件是一次性的，因此通常由生物相容性塑料包括聚氯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜和聚氨酯，以及这些聚合物和其他聚合物的共聚物制造。

图3H-图3K提供电穿孔插入件308的另外视图。图3H是容纳入口孔352、出口孔354和电极通道378的电穿孔插入件308的横截面。电穿孔插入件308包括外凸缘307、电穿孔盖305和突片317，当插入试剂筒中时，突片317构造成与试剂筒中的例如突片接合构件(未示出)接合。还示出了电穿孔盖305，在该实施方案中，其是用于维持电穿孔无菌直到准备使用的可撕下的箔片、膜或其他类型的密封件。图3I是图3H所示的电穿孔插入件308的俯视图。可见电穿孔插入件盖或密封件305(其保护并保持电穿孔装置在使用前无菌，并且可由使用者移除)、数据373和机器可读标记375。数据373可以包括诸如批号、序列号、产品号、过期日期或与电穿孔插入件308有关的其他数据的信息。机器可读标记375可以是条形码、QR码、数据矩阵码(纠错型条形码)、RFID或其他类型的机器可读标记，由位于自动化多模块细胞处理仪器中的一个或更多个成像传感器(例如，条形码扫描仪、照相机等)(未示出)检测，以例如确认电穿孔插入件308的内容物并任选地控制其操作。图3K是电穿孔插入件盖305(见图3I)被移除的电穿孔插入件308的俯视图。同样，可以看到数据373、机器可读标记375和电穿孔306。此外，看到电穿孔306的电极通道378。

如前所述，球状填充晶格组合物对电穿孔装置不可知。尽管关于在FTEP装置中的使用进行了描述，但球状填充晶格组合物也可在标准比色皿中使用。比色皿从许多供应商，包括VWR(Radnor,PA)、Bio-Rad,Inc.(Hercules,CA)、Bulldog Bio(Portsmith,NH)、SigmaAldrich(St.Louis,MO)和Starna(Atascadero,CA)普遍可得。

试剂筒

图4A描绘了可在自动化多模块细胞处理仪器中使用的包括电穿孔装置206的示例性组合试剂筒400(“筒”或“试剂筒”)。筒400包括主体402、试剂容器或储库404以及电穿孔装置406。筒400可以是一次性的，或者可以被配置成可重复使用。筒400可以由任何合适的材料制成，包括不锈钢、铝、纸或其他纤维，或塑料，包括聚氯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜和聚氨酯，以及这些聚合物和其他聚合物的共聚物。如果筒是一次性的，优选地其由塑料或纸制成。优选地，用于制造筒的材料是导热的，因为在某些实施方案中，筒400接触加热或冷却试剂容器或储库404中的试剂的热装置(未示出)。在一些实施方案中，热装置是Peltier装置或热电冷却器。试剂容器或储库404可以是如图4A所示其中插入试剂的单独管的容器，其中插入一个或更多个共同连接的管的容器(例如，共同连接的一排四个管插入试剂容器中)或者试剂容器可以在没有插入的管的情况下容纳试剂，试剂直接分配到容器或储库中。此外，试剂筒400中的容器404可以被配置为管、共同连接的管和试剂的直接填充的任何组合。

在一种实施方案中，试剂筒400的试剂容器或储库404被配置成容纳各种尺寸的管，包括例如250ml管、25ml管、10ml管、5ml管和Eppendorf(例如，微量离心)管。在又一种实施方案中，所有容器可以被配置为容纳相同尺寸的管，例如5ml管，并且储库插入件可以用于容纳试剂储库中的较小管。在又另一种实施方案中，特别是在试剂筒400是一次性的实施方案中，试剂储库404在没有插入管的情况下容纳试剂。在该一次性实施方案中，试剂筒可以是套件的一部分，其中试剂筒预先填充有试剂，并且容器或储库用例如箔、膜、热封丙烯酸树脂等密封，并呈现给消费者，然后其中试剂筒可以在自动化多模块细胞处理仪器中使用。包含在试剂筒400中的试剂将根据工作流程而变化；也就是说，试剂将根据细胞在自动化多模块细胞处理仪器中所经历的过程而变化。关于在自动化多模块细胞处理仪器中特定使用的试剂筒的各种实施方案，参见2019年8月13日颁发的USPN 10,376,889；2019年9月10日颁发的USPN 10,406,525；及2019年11月19日颁发的USPN 10,478,822。

图4B描绘了包含在图4A的试剂筒中的试剂的示例性矩阵配置440，其中该矩阵实施方案是4×4试剂矩阵。通过矩阵配置，使用者(或编程的处理器)可以为给定的过程定位合适的试剂。也就是说，试剂，诸如细胞样品、酶、缓冲液、核酸载体、表达盒、反应组分(诸如例如MgCl₂、dNTP、等温核酸组装试剂、缺口修复试剂等)、洗涤溶液、乙醇和用于核酸纯化和分离的磁珠等，位于矩阵240中已知的位置。例如，试剂位于位置A1(210)、A2(211)、A3(212)、A4(213)、B1(214)、B2(215)等等，在该实施方案中，直到位置D4(225)。图4A被标记以示出几个储库404对应于矩阵440的位置；见容器410、411、412、413、421和425。尽管图4A的试剂筒400和图4B的矩阵配置440示出了4×4矩阵，但试剂筒和电穿孔装置的矩阵可以是任何配置，例如2×2、2×3、2×4、2×5、2×6、3×3、3×5、4×6、6×7，或包括非对称配置的任何其他配置，或取决于预期工作流程所需试剂的两个或更多个不同的矩阵。

在图4A所示的试剂筒400的优选实施方案中，试剂筒包括可由处理器(未示出)读取的脚本(未示出)，用于经由液体操作装置(图2A的232处所示的ADP头)分配试剂，并控制包含在试剂筒400内的电穿孔装置。此外，作为自动化多模块细胞处理仪器中的一个部件的试剂筒400可以包括指定由自动化多模块细胞处理仪器执行的两个、三个、四个、五个、十个或更多个过程或者甚至指定由自动化多模块细胞处理仪器执行的所有过程的脚本。在某些实施方案中，试剂筒是一次性的，并且预包装有定制为执行特定细胞处理方案(例如，基因组编辑或蛋白产生)的试剂。因为试剂筒内容物不同，而自动化多模块细胞处理仪器的部件可以不变，所以与特定试剂筒关联的脚本与所使用的试剂和所执行的细胞处理相匹配。因此，例如，试剂筒可以预包装有用于基因组编辑的试剂和指定用于在诸如关于图2A-图2C所述的自动化多模块细胞处理仪器中执行基因组编辑的过程步骤的脚本(或基于例如试剂筒中的更新的试剂修改预编程脚本的步骤的脚本)。

例如，图4A的试剂筒400可以包括用于以下的脚本：从储库A2(411)移液电感受态的细胞，将细胞转移到电穿孔装置406，从储库C3(420)移液含有编辑载体的核酸溶液，将核酸溶液转移到电穿孔装置，启动电穿孔过程一段指定时间，然后将被穿孔的细胞移动到试剂盒中的储库D4(425)，或者移动到另一个模块诸如在图2A的自动化多模块细胞处理仪器中的旋转生长瓶(例如，参见图2A的218)。在另一个实例中，试剂筒可以包括用于以下的脚本：将包含载体的核酸溶液从储库C3(420)、储库C4(421)中包含编辑寡核苷酸盒的核酸溶液和等温核酸组装反应混合物从A1(410)移液转移到等温核酸组装/脱盐储库。脚本还可以指定由自动化多模块细胞处理仪器中的其他模块执行的过程步骤。例如，脚本可以指定，将等温核酸组装/脱盐模块加热到50℃30分钟，以产生组装的等温核酸产物；和经由基于磁珠的核酸纯化(所述核酸纯化涉及一系列移液转移)对组装的等温核酸产物进行脱盐，以及将储库B2(415)中的磁珠、储库B3(416)中的乙醇洗液和储库C1(418)中的水混合到等温核酸组装/脱盐储库(在图2A中未见)。

旋转细胞生长模块

图5A示出了用于与本文描述的细胞生长装置一起使用的旋转生长瓶500的一种实施方案。旋转生长瓶是光学透明的容器，具有用于接收液体培养基和细胞的开口端504、限定用于使细胞生长的主容器的中心瓶区506、限定至少一个光路510的锥形至收缩区(tapered-to-constricted region)518、封闭端516和驱动接合机构512。旋转生长瓶具有中心纵轴520，瓶围绕该中心纵轴520旋转，并且光路510通常垂直于瓶的纵轴。第一光路510被定位于锥形至收缩区518的下收缩部分。任选地，旋转生长瓶500的一些实施方案在锥形至收缩区518的锥形区中具有第二光路508。该实施方案中的两个光路都被定位于旋转生长瓶中不断地填充有细胞培养物(细胞+生长培养基)并且不受生长瓶旋转速度影响的区。第一光路510比第二光路508短，允许在瓶中细胞培养物的OD值处于高水平时(例如，在细胞生长过程的较后期)OD值的灵敏测量，而第二光路508允许在瓶中细胞培养物的OD值处于低水平时(例如，在细胞生长过程的较早期)OD值的灵敏测量。还示出了边缘502，边缘502允许旋转生长瓶位于生长模块(未示出)中并且还允许使用者容易操作。

在旋转生长瓶的一些配置中，旋转生长瓶具有设置在旋转生长瓶内、从旋转生长瓶的内壁朝向中心瓶区506的中心延伸的两个或更多个“桨”或内部特征。在一些方面，桨或特征的宽度随着旋转生长瓶的尺寸或体积而变化，并且范围可以为旋转生长瓶直径的1/20至刚好大于1/3、或旋转生长瓶直径的1/15至1/4、或旋转生长瓶直径的1/10到1/5。在一些方面，桨的长度随着旋转生长瓶的尺寸或体积而变化，并且范围可以为旋转生长瓶500主体长度的4/5至1/4、或旋转生长瓶中心体区506长度的3/4至1/3、或旋转生长瓶500中心体区506长度的1/2至1/3。在其他方面，可以有在水平或垂直布置的旋转生长瓶的主体的内表面上设置的凸起特征同心行；并且在其他方面，可以在旋转生长瓶的主体的内表面上设置凸起特征螺旋配置。在替代方面，凸起特征同心行或螺旋配置可以被设置在旋转生长瓶的柱(post)或中心结构上。尽管以上描述了具有两个桨，但是旋转生长瓶500可以包括3个、4个、5个、6个或更多桨，以及多达20个桨。桨数取决于例如旋转生长瓶500的尺寸或体积。桨可以对称地布置为从瓶的内壁延伸到瓶的内部的单个桨，或者桨可以对称地布置成以一组2个、3个、4个或更多个桨的组(例如，一对桨与另一对桨相对)从瓶的内壁延伸到瓶的内部。在另一种实施方案中，桨可以从旋转生长瓶的中部向外朝向旋转生长瓶的壁延伸，例如从旋转生长瓶内部的柱或其他支持结构延伸。

驱动接合机构512与马达(未示出)接合以使瓶旋转。在一些实施方案中，马达驱动驱动接合机构512，使得旋转生长瓶仅在一个方向上旋转，并且在其他实施方案中，旋转生长瓶在第一方向上旋转第一时间量或周期性，在第二方向(即，相对方向)上旋转第二时间量或周期性，并且该过程可以重复，使得旋转生长瓶(和细胞培养物内容物)经历振荡运动。此外，使用者可以选择培养物是否经历振荡及振荡的周期性。第一时间量和第二时间量可以相同或可以不同。时间量可以是1秒、2秒、3秒、4秒、5秒或更多秒，或者可以是1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或更多分钟。在另一种实施方案中，旋转生长瓶可以在细胞生长的早期阶段以第一周期性(例如，每60秒)振荡，并且旋转生长瓶可以然后在细胞生长的后期阶段以与第一周期性不同的第二周期性(例如，每一秒)振荡。

旋转生长瓶500可以是可重复使用的，或者优选地，旋转生长瓶是可消耗的。在一些实施方案中，旋转生长瓶是可消耗的，并预先填充有生长培养基地提供至使用者，其中瓶在开口端504处用箔或膜密封件密封。以这样的方式包装的填充培养基的旋转生长瓶可以是用于与独立细胞生长装置或与作为自动化多模块细胞处理仪器一部分的细胞生长模块一起使用的套件的一部分。为了将细胞引入到瓶中，使用者仅需要移液出期望体积的细胞，并且使用移液吸头刺穿瓶的箔或膜密封件。开口端504可以任选地包括延伸边缘502，以与细胞生长装置(未示出)重叠并接合。在自动化系统中，旋转生长瓶500可以用条形码或其他标识手段加标签，该条形码或其他标识手段可以被作为自动化仪器的一部分的扫描仪或照相机(未示出)读取。

旋转生长瓶500的体积和细胞培养物(包括生长培养基)的体积可以有很大变化，但是旋转生长瓶500的体积必须足够大，以使生长瓶中的细胞培养物在瓶旋转时获得适当通气和产生足量的细胞。在实践中，旋转生长瓶500的体积范围可以为1-250ml、2-100ml、5-80ml、10-50ml或12-35ml。同样，细胞培养物(细胞+生长培养基)的体积应适当，以允许旋转生长瓶中适当通气。因此，细胞培养物的体积应是生长瓶体积的约5％-85％或生长瓶体积的20％-60％。例如，对于35ml的生长瓶，细胞培养物的体积会是约1.8ml至约27ml或5ml至约21ml。

旋转生长瓶500优选由生物相容的光学透明材料制成，或者包括一条或更多条光路的瓶的至少一部分是透明的。此外，制造旋转生长瓶的材料应能够冷却至约4℃或更低，以及加热至约55℃或更高，以适应基于温度的细胞测定和在低温的长期储存二者。此外，用于制造瓶的材料必须能够承受高达55℃的温度，而在旋转时不会变形。合适的材料包括玻璃、环烯烃共聚物(COC)、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜、聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。优选的材料包括聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯。在一些实施方案中，旋转生长瓶通过例如注射成型或挤压低成本地制造。

图5B-图5D示出了包括旋转生长瓶500的细胞生长模块550的实施方案。图5B是细胞生长模块550的一种实施方案的透视图。图5C描绘了来自图5B的细胞生长模块550的剖视图。在两幅图中，可见旋转生长瓶500被定位于主壳体526内，其中旋转生长瓶500的延伸边缘502在主壳体526上方延伸。此外，两幅图中都示出了端壳体522、下壳体532和凸缘524。凸缘524用于将细胞生长装置/模块附接至加热/冷却装置或另一结构(未示出)。图5C描绘了另外的细节。在图5C中，上轴承542和下轴承530被示出定位于主壳体526中。上轴承542和下轴承530支持旋转生长瓶500的垂直装载。下壳体532容纳驱动马达536。图5C的细胞生长装置550包括两条光路：主光路534和次光路530。光路534对应于定位于旋转生长瓶的锥形至收缩部分的收缩部分中的光路510，并且光路530对应于旋转生长瓶的锥形至收缩部分的锥形部分中的光路508。光路510和光路508未在图5C中示出，但是可见于例如图5A中。除了光路534和光路530之外，还存在照亮一条或更多条光路的发射板528，以及在光穿过旋转生长瓶500中的细胞培养液后检测光的检测器板546。

在一些实施方案中，用于使旋转生长瓶500旋转的驱动马达536是具有内置驱动控制器的无刷DC型驱动马达，所述内置驱动控制器可以被设置为将恒定每分钟转数(RPM)保持在0RPM和约3000RPM之间。可选地，可以使用其他马达类型，诸如步进(stepper)、伺服(servo)、刷式DC等。任选地，驱动马达506还可以具有允许旋转方向反转的方向控制以及感测和报告实际RPM的转速计。马达由处理器(未示出)根据例如被编程到处理器中的标准方案和/或使用者输入进行控制，并且马达可以被配置成改变RPM以引起细胞培养物的轴向进动，从而增强混合，例如以防止细胞团聚、增加通气和优化细胞呼吸。

细胞生长装置/模块550的主壳体526、端壳体522和下壳体532可以由任何合适的稳健材料制成，包括铝、不锈钢和其他导热材料，包括塑料。这些结构或其部分可以通过各种技术产生，例如金属制造、注射成型、产生熔合的结构层，等等。尽管在一些实施方案中设想旋转生长瓶500是可重复使用的，但是优选地是可消耗的，细胞生长装置550的其他部件优选地是可重复使用的，并且可以发挥作为独立台式装置或如此处作为多模块细胞处理仪器中的模块的功能。

细胞生长系统的处理器(未示出)可以被编程为具有待用作生长细胞培养物的“空白”或对照的信息。“空白”或对照是仅包含细胞生长培养基的容器，产生100％的透射率和0OD，而细胞样品会将光线偏转并且会具有较低的透射率百分比和较高的OD。随着细胞在培养基中生长并且变得更稠密，透射率会降低并且OD会增加。细胞生长系统的处理器可以被编程为使用与细胞培养(不论，例如，哺乳动物细胞、细菌细胞、动物细胞、酵母细胞等)中通常使用的生长培养基相称的空白的波长值。可选地，第二分光光度计和容器可以包括在细胞生长系统中，其中第二分光光度计用于以指定的间隔读取空白。

图5D图示了作为组件的一部分的细胞生长装置/模块550，包括与光源590、检测器592和热电部件594耦合的图5B的细胞生长装置550。将旋转生长瓶500插入细胞生长装置550中。光源590和检测器592的部件(例如，诸如，具有覆盖5-log的增益控制的光电二极管)与细胞生长装置550的主壳体耦合。图示了容纳使旋转生长瓶旋转的马达的下壳体532，以及将细胞生长装置固定至组件的凸缘524之一。还图示了Peltier装置或热电部件594。在该实施方案中，热控制通过经由下壳体532的基部上的凸缘504将细胞生长装置500附接至热电部件594并与热电部件594电一体化来实现。热电冷却器/装置594能够将热量“泵”至接合处(junction)的任一侧，根据电流的方向冷却表面或加热表面。在一种实施方案中，使用热敏电阻测量主壳体的温度，并且然后通过标准的电子比例积分微分(PID)控制器回路，将旋转生长瓶500控制在约+/-0.5℃。

在某些实施方案中，安装在后部的电源输入模块包含安全性保险丝和通断开关(on-off switch)，该通断开关当接通电源时，为内部AC和DC供电器(未示出)供电，启动处理器。使用600nm发光二极管(LED)(未示出)以编程的时间间隔完成光密度(OD)的测量，该发光二极管(LED)已经通过光学器件(optic)成列布置(columnated)到包含感兴趣的细胞的旋转生长瓶的下收缩部分中。光继续通过收集光学器件到达检测系统，该检测系统由(数字)增益控制硅光电二极管组成。通常，光密度通常显示为光衰减器的功率传输因子(powertransmission factor)的以10为底数的对数的绝对值：OD＝-log10(断电/通电)。由于OD是光学衰减的度量，即吸收、散射和反射的总和，细胞生长装置OD测量记录了总的功率传输，因此随着细胞生长和群体变得稠密，OD(信号损失)也会增加。OD系统针对OD标准进行预校准，这些值存储在可由测量程序访问的板载存储器中。

在使用时，通过刺穿箔或膜密封件，将细胞接种(细胞可以从例如自动化液体操作系统或由使用者移出)到旋转生长瓶500的预先填充生长培养基中。细胞生长装置550的编程软件设置用于生长的控制温度，通常为30℃，然后缓慢启动旋转生长瓶的旋转。细胞/生长培养基混合物由于离心力缓慢垂直向上移动至壁，允许旋转生长瓶将混合物的大表面面积暴露于正常的氧气环境。生长监测系统以预设或预编程的时间间隔采取连续读取OD或OD测量。这些测量值存储在内部存储器中，并且如果需要，软件将测量值对比时间绘图，以展示生长曲线。如果需要增强混合，例如为了优化生长条件，可以改变瓶旋转的速度以引起液体的轴向进动，和/或可以以编程的间隔进行完全的方向改变。可以对生长监控编程，以在预先确定的OD时自动终止生长阶段，并且然后将混合物快速冷却至较低温度，以抑制进一步生长。

细胞生长装置550的一个应用是不断地测量生长细胞培养物的光密度。所描述的细胞生长装置的一个优点是光密度可以连续测量(动力学监测)或以特定时间间隔测量；例如每5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒或60秒，或者每1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。虽然已经在测量生长细胞培养物的光密度(OD)的上下文中描述了细胞生长装置，然而鉴于本说明书的教导，本领域技术人员应理解，除了细胞培养物OD之外或者代替细胞培养物OD，可以测量其他细胞生长参数。例如，使用可见光、UV或近红外光(NIR)的光谱学允许监测细胞培养物中营养物和/或废弃物的浓度。此外，可以使用光谱测量来同时定量多种化学物质。不对称的化学物质可以通过鉴定NIR中的特征性吸收特征来定量。相比之下，对称的化学物质可以容易地使用拉曼光谱学定量。许多关键代谢物，诸如葡萄糖、谷氨酰胺、氨和乳酸，具有不同的IR中的光谱特征，使得它们可以被容易地定量。样品吸收的光的量和频率可以与样品中存在的化学物质的类型和浓度相关。这些测量类型中的每一种都提供特定的优点。FT-NIR提供最大的光穿透深度，并且可以用于较厚的样品。FT-mid-IR(MIR)提供了可更容易地辨别为对某些分析物有特异性的信息，因为这些波长更接近基本IR吸收。当由水引起的干扰被最小化时，FT-拉曼是有利的。其他光谱特性可以经由例如介电阻抗谱学、可见荧光、荧光偏振或发光来测量。此外，细胞生长装置可以包括用于测量例如溶解氧、二氧化碳、pH、电导率等的另外的传感器。

细胞浓缩模块

如上文关于旋转生长瓶和细胞生长模块描述的，为了获得足够数量的用于转化或转染的细胞，细胞通常在适合感兴趣的细胞生长的培养基中生长至特定的光密度；然而，为了有效转化或转染，期望减少细胞体积，并经由缓冲液或培养基交换使细胞为感受态。因此，在用于以上所列的过程的细胞处理系统中所期望的一个子部件或模块是能够生长、进行缓冲液交换和/或浓缩细胞并使它们为感受态从而可以用工程化或编辑细胞基因组所需的核酸转化或转染它们的模块或部件。

图6A示出了渗余物构件622(上图)、渗透物构件620(中图)和切向流组件610(下图)，切向流组件610包括渗余物构件622、膜624(未见于图6A中)和渗透物构件620(也是未见的)。在图6A中，渗余物构件622包括切向流动通道602，该切向流动通道602具有蛇形构造，该蛇形构造从渗余物构件622的一个下角(具体地，在渗余物端口628处)开始横穿并向上然后向下并横穿渗余物构件622，终止于第二渗余物端口628处的渗余物构件622的另一个下角。在渗余物构件622上还看到能量导向器691，该能量导向器691围绕膜或过滤器(未见于该图6A中)所处的区域，并且在通道602的区域之间相互交叉。在该实施方案中，能量导向器691与渗透物/滤液构件620上的能量导向器部件691(在右侧)配合，并经由其用于促进渗余物构件622与渗透物/滤液构件620的超声波焊接或结合。另外，可以看到埋头孔623，两个在渗余物构件622的底部，一个在渗余物构件622的顶部中间。埋头孔623用于将切向流组件610耦合到储库组件(未见于该图6A中，但参见图6B)。

渗透物/滤液构件620在图6A的中部可见，并且除了能量导向器691之外，渗透物/滤液构件620还包括用于每个底角处的渗余物端口628的通孔(其与渗余物构件622的底角处的渗余物端口628的通孔配合)，以及位于渗透物构件620的顶部和中心的切向流动通道602和两个渗透物/滤液端口626。该实施方案中的切向流动通道602结构具有蛇形构造和波状几何形状，尽管也可以使用其他几何形状。渗透物构件620还包括埋头孔623，与渗余物构件620上的埋头孔623一致。

在图6A的底部是切向流组件610，其包括位于与渗透物构件620组件的顶部的渗余物构件622。在该视图中，渗余物构件622在视图的“顶部”，膜(未见于组件的该视图中)将邻近渗余物构件622并在其下方，并且渗透物构件620(未见于组件的该视图中)邻近膜并在其下方。再次看到埋头孔623，在埋头孔623处渗余物构件622和渗透物构件620中的埋头孔一致并配置成与设置在储库组件(未见于图6A中，但参见图6B)上的埋头孔的螺纹或配合元件配合。

膜或过滤器设置在渗余物构件和渗透物构件之间，其中流体可以流过膜，但是细胞不能，并因此被保留在设置在渗余物构件中的流动通道中。适用于TFF装置/模块的过滤器或膜是耐溶剂的、在过滤期间无污染并且能够保留感兴趣细胞的类型和尺寸的那些。例如，为了保留小细胞类型，诸如细菌细胞，孔径可以低至0.2μm，然而对于其他细胞类型，孔径可以高至20μm。事实上，可用于TFF装置/模块中的孔径包括具有以下尺寸的过滤器：0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm以及更大。过滤器可以由任何合适的非反应性材料制成，包括纤维素混合酯(硝酸纤维素和乙酸纤维素)(CME)、聚碳酸酯(PC)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、玻璃纤维，或如在激光或电化学蚀刻的情况下的金属基材。

通道结构602的长度可以根据待生长的细胞培养物的体积和待浓缩的细胞培养物的光密度而变化。通道结构的长度通常为60mm至300mm，或70mm至200mm，或80mm至100mm。流动通道402的截面形状可以是圆形、椭圆形、卵形、方形、矩形、梯形或不规则的。如果是方形、矩形或另一种具有大体上直边的形状，截面可以是约10μm至1000μm宽，或200μm至800μm宽，或300μm至700μm宽，或400μm至600μm宽；和约10μm至1000μm高，或200μm至800μm高，或300μm至700μm高，或400μm至600μm高。如果流动通道102的截面大体上是圆形、卵形或椭圆形的，则通道的半径可以是按水力半径约50μm至1000μm，或者按水力半径5μm至800μm，或者按水力半径200μm至700μm，或者按水力半径300μm至600μm宽，或者按水力半径约200μm至500μm。此外，渗余物422和渗透物620构件中的通道的体积可以根据每个构件中通道的深度而不同。

图6B示出了配置成与图6A中所见的切向流组件610一起使用的储库组件650的前透视图(上图)和后透视图(下图)。在前透视图中看到的(例如，“前”是储库组件650耦合到图6A中所见的切向流组件610的一侧)是渗透物储库654任一侧上的渗余物储库652。还看到渗透物端口626、渗余物端口628和用于埋头孔623的三个螺纹或配合元件625(埋头孔623未见于该图6B中)。用于埋头孔623的螺纹或配合元件625被配置成将切向流组件610(见于图6A中)配合或耦合到储库组件650。可选地或另外，紧固件、声波焊接或热融柱(heatstakes)可用于将切向流组件610配合或耦合到储库组件650。此外，看到覆盖储库组件650顶部的密封垫645。关于图6E详细描述了密封垫645。在图6B的左侧是储库组件650的后部透视图，其中“后”是储库组件650的未耦合到切向流组件的一侧。看到渗余物储库652、渗透物储库654和密封垫645。

TFF装置可以由可以在其中磨铣通道(和通道分支)的包括以下的任何稳健材料制成：不锈钢、硅、玻璃、铝或塑料，所述塑料包括环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜和聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。如果TFF装置/模块是一次性的，优选地它由塑料制成。在一些实施方案中，用于制造TFF装置/模块的材料是导热的，使得细胞培养物可以被加热或冷却至期望的温度。在某些实施方案中，TFF装置使用上文提及的适于这种大规模生产技术的材料通过以下形成：精密机械加工、激光加工、放电加工(用于金属装置)；湿法或干法蚀刻(用于硅装置)；干法或湿法蚀刻、粉末或喷砂、光结构化(photostructuring)(用于玻璃装置)；或热成型、注射成型、热压花、或激光加工(用于塑料装置)。

图6C描绘了图6B所示的储库组件650的俯视图。图6D描绘了用于图6B所示的储库组件650的盖644，并且图6E描绘了在操作中设置在图6B所示的储库组件650的盖644上的密封垫645。图6C是储库组件650的俯视图，示出了两个渗余物储库652的顶部，在渗透物储库654的一侧各一个。还看到凹槽632和流体通道634，凹槽632与气动端口(未示出)配合，流体通道634位于渗余物储库652的底部，流体通道634经由用于渗透物构件620和膜624(也未示出)中的渗余物端口的通孔将渗余物储库652与渗余物端口628(未示出)流体地耦合。图6D描绘了被配置成设置在储库组件650顶部的盖644。盖644在渗余物储库652和渗透物/滤液储库654的顶部具有圆形开孔。同样，在渗余物储库652的底部可以看到流体通道634，其中流体通道634将渗余物储库652与渗余物端口628(未示出)流体地耦合。还示出了用于每个渗余物储库652和渗透物/滤液储库654的三个气动端口630。图6E描绘了密封垫645，该密封垫645被配置成设置在储库组件650的盖644上。可见用于每个渗余物储库652和用于渗透物/滤液储库654的三个流体传输端口642。同样，示出了用于每个渗余物储库652和用于渗透物/滤液储库654的三个气动端口630。

用于细胞生长的总工作流程包括将待生长的细胞培养物装载到第一渗余物储库中，任选地使空气或合适的气体鼓泡通过细胞培养物，使细胞培养物通过或流经第一渗余物端口，然后切向通过TFF通道结构，同时通过渗透物端口606之一或二者收集培养基或缓冲液，通过第二渗余物端口604将细胞培养物收集到第二渗余物储库中，任选地向细胞培养物中添加另外的或不同的培养基，并任选地使空气或气体鼓泡通过细胞培养物，然后重复所述过程，全部同时连续地或以期望的间隔测量例如渗余物储库中细胞培养物的光密度。使用600nm发光二极管(LED)以编程的时间间隔完成光密度(OD)的测量，该发光二极管(LED)已经通过光学器件成列布置到包含生长细胞的一个或更多个渗余物储库中。光继续通过收集光学器件到达检测系统，该检测系统由(数字)增益控制硅光电二极管组成。通常，光密度显示为光衰减器的功率传输因子的以10为底数的对数的绝对值：OD＝-log10(断电/通电)。由于OD是光学衰减的度量，即吸收、散射和反射的总和，TFF装置OD测量记录了总的功率传输，因此随着细胞生长和群体变得稠密，OD(信号损失)也会增加。OD系统针对OD标准进行预校准，这些值存储在可由测量程序访问的板载存储器中。

在通道结构中，将流动通道分叉的膜将细胞保留在膜的一侧(渗余物侧622)，并且允许不需要的培养基或缓冲液流动跨过膜进入装置的滤液或渗透物侧(例如，渗透物构件620)。将空气或其他合适的气体鼓泡通过细胞培养物，既能通气又能混合培养物以促进细胞生长。在该过程期间，在流过通道结构期间被去除的培养基通过渗透物/滤液端口606去除。可选地，细胞可以在鼓泡或搅拌下在一个储库中生长，而不使细胞从一个储库通过TFF通道到达另一个储库。

用于使用TFF装置/模块的细胞浓缩的总工作流程涉及使细胞培养物或细胞样品切向流过通道结构。如同细胞生长过程，将流动通道分叉的膜将细胞保留在膜的一侧，并且允许不需要的培养基或缓冲液流动跨过膜进入装置的渗透物/滤液侧(例如，渗透物构件620)。在该过程中，培养基或缓冲液中的固定体积的细胞被驱动通过装置，直至细胞样品被收集到一个渗余物端口604中，并且已经通过膜的培养基/缓冲液通过渗透物/滤液端口606之一或二者收集。所有类型的原核细胞和真核细胞——黏附细胞和非黏附细胞二者——均可以在TFF装置中生长。黏附细胞可以在悬浮在流过TFF装置的培养基中的珠或其他细胞支架上生长。

用于将细胞悬浮在细胞浓缩装置/模块中的培养基或缓冲液可以是用于被转化或转染的细胞类型的任何合适的培养基或缓冲液，诸如LB、SOC、TPD、YPG、YPAD、MEM、DMEM、IMDM、RPMI、Hanks、PBS和林格氏溶液，其中培养基可以提供在作为套件的一部分的试剂筒中。对于黏附细胞的培养，细胞可以置于珠、微载体或悬浮在培养基中的其他类型的支架上。大多数正常的哺乳动物组织来源的细胞——除了那些来自造血系统的细胞——是锚定依赖性的，并且需要表面或细胞培养支持物才能正常增殖。在本文描述的旋转生长瓶中，利用了微载体技术。特定用途的微载体通常具有100-300μm的直径，并且具有略大于培养基密度的密度(因此便于细胞和培养基的容易分离，例如用于培养基交换)，然而密度也必须足够低，以允许载体在最小搅拌速率完全悬浮，从而避免对细胞的流体动力损伤。有许多不同类型的微载体可用，并且不同的微载体针对不同类型的细胞进行了优化。有带正电荷的载体，诸如Cytodex 1(基于葡聚糖，GE Healthcare)、DE-52(基于纤维素，Sigma-AldrichLabware)、DE-53(基于纤维素，Sigma-Aldrich Labware)和HLX 11-170(基于聚苯乙烯)；胶原蛋白-或ECM-(细胞外基质)涂层载体，诸如Cytodex 3(基于葡聚糖，GE Healthcare)或HyQ-sphere Pro-F 102-4(基于聚苯乙烯，Thermo Scientific)；无电荷载体，如Hyq-sphere P 102-4(Thermo Scientific)；或基于明胶(Cultisphere，Percell Biolytica)或纤维素(Cytopore，GE Healthcare)的大孔载体。

在细胞生长和浓缩过程二者中，使细胞样品通过TFF装置并在一个渗余物端口604中收集细胞，同时在一个渗透物/滤液端口606中收集培养基，这被认为是细胞样品的“一次通过”。渗余物储库之间的转移“翻转”了培养物。对于给定的通过，分别收集细胞和培养基的渗余物端口和渗透物端口位于TFF装置/模块的同一端，流体连接被布置成使得渗余物和渗透物/滤液侧存在两个不同的流动层，但是如果渗余物端口604位于装置/模块的渗余物构件上(即，细胞被驱动通过膜上方的通道，并且滤液(培养基)通过膜下方的通道部分)，渗透物/滤液端口606会位于装置/模块的渗透物构件上，并且反之亦然(即，如果细胞样品被驱动通过膜下方的通道，滤液(培养基)通过膜上方的通道部分)。由于用于通过TFF装置的流动通道转移细胞培养物和流体的高压，重力的影响可以忽略不计。

在生长和浓缩过程的任一种中的一次“通过”结束时，细胞样品通过渗余物端口604并进入渗余物储库(未示出)而被收集。为了启动另一次“通过”，细胞样品再次通过TFF装置，这次的流动方向与第一次通过相反。细胞样品通过渗余物端口604并进入渗余物储库(未示出)而被收集，该储库位于装置/模块与渗余物端口604相对的一端上，渗余物端口604在第一次通过期间用于收集细胞。同样地，在第二次通过时通过膜的培养基/缓冲液通过渗透物端口606或通过两个端口收集，所述渗透物端口606位于装置/模块与渗透物端口606相对的一端上，所述渗透物端口606在第一次通过期间用于收集滤液。重复使渗余物(浓缩的细胞样品)通过装置/模块的该交替过程，直至细胞已经生长至期望的光密度，和/或浓缩到期望的体积，并且两个渗透物端口(即，如果存在多于一个)可以在通过期间打开以减少操作时间。此外，缓冲液交换可以通过以下实现：将期望的缓冲液(或新鲜培养基)添加至渗余物储库中的细胞样品，然后启动另一次“通过”，并且重复该过程，直至旧的培养基或缓冲液被稀释并过滤掉并且细胞驻留在新鲜培养基或缓冲液中。注意，缓冲液交换和细胞生长可以(并且通常确实)同时发生，并且缓冲液交换和细胞浓缩可以(并且通常确实)同时发生。有关TFS的另外的信息和替代实施方案，参见例如，2019年9月5日提交的USSN 16/516,701。

作为以上描述的TFF模块的替代物，可以采用包括中空过滤器的细胞浓缩模块。适用于在本公开内容中使用的过滤器的实例包括膜过滤器、陶瓷过滤器和金属过滤器。过滤器可以以任何形状使用；过滤器例如可以是圆柱形的或者基本上是平坦的。优选地，使用的过滤器是膜过滤器，最优选中空纤维过滤器。术语“中空纤维”意指包括管式膜。管的内径为至少0.1mm，更优选地至少0.5mm，最优选地至少0.75mm，并且管的内径优选地为至多10mm，更优选地至多6mm，最优选地至多1mm。包含中空纤维的过滤器模块可从多家公司，包括G.E.Life Sciences(Marlborough,MA)和InnovaPrep(Drexel,MO)商购获得。可以在本方法和系统中使用、修改使用或改造使用的中空纤维过滤系统的具体实例包括但不限于USPN9,738,918；USPN 9,593,359；USPN 9,574,977；USPN 9,534,989；USPN 9,446,354；USPN 9,295,824；USPN 8,956,880；USPN 8,758,623；USPN 8,726,744；USPN 8,677,839；USPN 8,677,840；USPN 8,584,536；USPN 8,584,535；和USPN 8,110,112。

核酸组装模块

本公开内容的包含电穿孔的自动化多模块细胞编辑仪器的某些实施方案任选地包括核酸组装模块。核酸组装模块被配置为接受和组装将使用电穿孔穿孔到期望的细胞中并促进期望的基因组编辑事件所必需的核酸。通常，术语“载体”是指能够将与其相连的期望的核酸转运到细胞中的核酸分子。载体包括但不限于为单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或更多个游离末端、没有游离末端(例如，环状)的核酸分子；包含DNA、RNA或二者的核酸分子；以及本领域已知的其他种类的多核苷酸。载体的一种类型是“质粒”，质粒是指可以诸如通过标准分子克隆技术将另外的DNA区段插入其中的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中来源于病毒的DNA或RNA序列存在于载体中用于包装成病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、和腺相关病毒)。病毒载体还包含用于转染到宿主细胞中的由病毒携带的多核苷酸。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中后被整合到宿主细胞的基因组中，并且从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”或“编辑载体”。在重组DNA技术中具有实用性的常见表达栽体通常呈质粒的形式。另外的载体包括F粘粒、噬菌体、BAC、YAC和其他合成染色体。

重组表达载体可以包含呈适于在宿主细胞中转录核酸，并且对于一些核酸序列，翻译和表达核酸的形式的核酸，这意味着重组表达载体包含一个或更多个调控元件，所述调控元件可以基于待被用于表达的宿主细胞来选择，所述调控元件被可操作地连接至待被表达的核酸序列。在重组表达载体中，“可操作地连接”意指感兴趣的核苷酸序列以以下方式连接至一个或更多个调控元件：允许核苷酸序列的转录，并且对于一些核酸序列，允许核苷酸序列的翻译和表达(例如，在体外转录/翻译系统中，或者当载体被引入宿主细胞中时在宿主细胞中)。合适的重组和克隆方法在美国公布第2004/0171156号中公开，其内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，调控元件被可操作地连接至可靶向核酸酶系统的一个或更多个元件，以驱动可靶向核酸酶系统的一个或更多个组分的转录，并且对于一些核酸序列，驱动可靶向核酸酶系统的一个或更多个组分的翻译和表达。

此外，编码核酸引导的核酸酶的多核苷酸序列可以针对特定细胞诸如原核细胞或真核细胞中的表达被密码子优化。真核细胞可以是酵母、真菌、藻类、植物、动物或人类的细胞。真核细胞可以是特定生物体的细胞或来源于特定生物体的细胞，所述特定生物体诸如哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、犬或非人类哺乳动物，包括非人类灵长类动物。此外或可选地，载体可以包括可操作地连接至当被转录时形成引导RNA的多核苷酸序列的调控元件。

核酸组装模块可以被配置成以自动化方式执行许多种不同的核酸组装技术。可以在所公开的自动化多模块细胞编辑仪器的核酸组装模块中执行的核酸组装技术包括但不限于那些使用限制性内切核酸酶的组装方法，包括PCR、BioBrick组装(USPN 9,361,427)、IIS型克隆(例如，GoldenGate组装，欧洲专利申请公布EP 2 395 087A1)和连接酶循环反应(de Kok,ACS Synth Biol.,3(2):97-106(2014)；Engler等人,PLoS One,3(11):e3647(2008)；和USPN 6,143,527)。在其他实施方案中，由所公开的自动化多模块细胞编辑仪器执行的核酸组装技术是基于核酸相邻部分之间的重叠的，例如Gibson

、CPEC、SLIC、连接酶循环等。另外的组装方法包括酵母中的缺口修复(Bessa,Yeast,29(10):419-23(2012))、gateway克隆(Ohtsuka,Curr Pharm Biotechnol,10(2):244-51(2009))；USPN5,888,732；和USPN 6,277,608)和拓扑异构酶介导的克隆(Udo,PLoS One,10(9):e0139349(2015)；和USPN 6,916,632)。这些和其他核酸组装技术描述于例如，Sands和Brent,CurrProtoc Mol Biol.,113:3.26.1–3.26.20(2016)。

核酸组装模块根据自动化多模块细胞编辑仪器中使用的核酸组装类型进行温度控制。例如，当在核酸组装模块中使用PCR时，该模块包括允许温度在变性、退火和延伸步骤之间循环的热循环能力。当在核酸组装模块中使用单温度组装方法(例如等温组装方法)时，该模块提供达到并保持在优化所进行的特定组装过程的温度的能力。这些温度和维持这些温度的持续时间可以通过由脚本执行的一组预编程的参数确定，或者由使用者使用自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统手动控制。

在一种实施方案中，核酸组装模块是使用单一等温反应执行组装的模块。某些等温组装方法可以基于序列同一性同时组合多达15个核酸片段。在一些实施方案中，组装方法提供包含与邻近核酸片段约20-40个碱基的重叠的待组装的核酸。片段与三种酶(外切核酸酶、聚合酶和连接酶)的混合物连同缓冲液组分混合。因为过程是等温的，并且可以使用单个反应容器以1步或2步法进行，等温组装反应非常适合在自动化多模块细胞编辑仪器中使用。1步法允许使用单步等温过程组装多达五个不同的片段。将片段和酶的主混合物组合，并且在50℃孵育多达1小时。为了产生具有多达15个片段的更复杂的构建体或为了掺入100bp至多达10kb的片段，通常使用2步，其中2步反应需要两次分开添加主混合物；一次用于外切核酸酶和退火步骤，并且第二次用于聚合酶和连接步骤。

细胞富集模块

本公开内容的一个任选的方面提供了用于核酸引导的核酸酶基因组编辑的自动化模块和仪器，所述自动化模块和仪器对其基因组已经被正确编辑的细胞实施富集技术。富集模块执行使用细胞单个化和标准化以减少编辑的和未编辑的细胞之间的生长竞争的方法，或者使用利用在细胞生长期间的特定时间诱导编辑的方法。单个化克服了来自未编辑的细胞或包含赋予生长优点或缺点的编辑的细胞的生长偏倚(growth bias)。方法、模块和仪器可以应用于所有细胞类型，包括古细菌、原核细胞和真核(例如酵母、真菌、植物和动物)细胞。

细胞集落的单个化、或大体上单个化、诱导编辑和标准化导致在鉴定编辑的细胞方面与现有技术方法相比2-250×、10-225×、25-200×、40-175×、50-150×、60-100×或5-100×的增益，并且产生了包含基因组文库的成阵列的或汇集的编辑的细胞。此外，可以利用方法、模块和仪器来产生迭代编辑系统，以产生组合文库，鉴定罕见的细胞编辑，并且使高通量富集应用能够鉴定编辑活动。

本文描述的组合物和方法改进了核酸引导的核酸酶编辑系统，其中使用核酸引导的核酸酶(例如，RNA引导的核酸酶)来编辑生物体的基因组中的特定靶区域。图7A描绘了固体壁装置7050和用于在固体壁装置中的微孔中使细胞单个化的工作流程，其中在该工作流程中，gRNA和核酸酶之一或二者处于诱导型启动子的控制下。在图(i)的左上方，描绘了具有微孔7052的固体壁装置7050。固体壁装置7050的部分7054在(ii)示出，还描绘了微孔7052。在(iii)，示出了固体壁装置7050的侧截面，并且已经对微孔7052进行了装载，其中在该实施方案中已经发生了泊松装载(poisson loading)；即，每个微孔具有一个细胞(例如，微孔7052、7056)或不具有细胞，并且任何一个微孔具有多于一个细胞的可能性低。然而，请注意，在替代实施方案中，根据文库的复杂性，可以执行大体上单个化——将细胞划分为每个分区少于20个细胞、并且更优选地每个分区少于10个细胞的小“组”。在(iv)，图示了工作流程7040，其中具有微孔7052的基底7050显示出每个微孔具有一个细胞的微孔7056、微孔中没有细胞的微孔7057以及微孔中具有两个细胞的一个微孔7060。在步骤7051中，允许微孔中的细胞倍增约2-50倍以形成克隆集落(v)，然后通过加热基底(例如，用于温度诱导的编辑)或使化学物质在基底下方或上方流动(例如，用于化学诱导的编辑的糖、抗生素)或通过将固体壁装置移动至不同的培养基来诱导编辑7053，如果固体壁装置放置在形成微孔7052的底部的流体可渗透膜上，则特别地容易。在诱导编辑7053后，已经被编辑的细胞集落中的许多细胞由于由有效编辑(active editing)引起的双链切割而死亡，并且对于确实存活但必须在编辑后修复和恢复的编辑的细胞可能存在生长延滞(微孔7058)，其中不经历编辑的细胞茁壮成长(微孔7059)(vi)。允许所有细胞生长以继续建立集落并且标准化，其中微孔7058中编辑的细胞的集落在尺寸和/或细胞数方面赶上不经历编辑的微孔7059中的细胞(vii)，这是由于细胞衰老而未编辑的细胞达到稳定期。在细胞集落被标准化后，或者可以发生微孔中所有细胞的汇集，在这种情况下，通过消除来自非编辑细胞(non-editedcells)和来自编辑的适应度效应的偏倚，使细胞富集编辑的细胞；可选地，在编辑后监测微孔中的集落生长，并且鉴定和选择(例如“择优选取(cherry picked)”)缓慢生长的集落(例如微孔7058中的细胞)，产生甚至更为富集的编辑的细胞。

在使细胞生长时，所使用的培养基当然取决于被编辑的细胞类型例如细菌、酵母或哺乳动物。例如，用于细菌生长的培养基包括LB、SOC、M9基本培养基和Magic培养基；用于酵母细胞生长的培养基包括TPD、YPG、YPAD和合成基本培养基；并且用于哺乳动物细胞生长的培养基包括MEM、DMEM、IMDM、RPMI和Hanks。

可用于执行图7A中描绘的方法的模块是固体壁分离、孵育和标准化(SWIIN)模块。图7B由分解俯透视图描绘了SWIIN模块750的实施方案。在SWIIN模块750中，渗余物构件形成在SWIIN模块部件顶部的底端，并且渗透物构件形成在SWIIN模块部件底部的顶端。

图7B中的SWIIN模块750自上而下包括储库密封垫或盖758、渗余物构件704(其中渗余物流动通道在该图7B中不可见)、与过滤器(过滤器未见于图7B中)锻造的穿孔构件701、包括集成储库(渗透物储库752和渗余物储库754)的渗透物构件708、以及密封渗透物储库752和渗余物储库754底部的两个储库密封件762。可以看到渗透物通道760a设置在渗透物构件708的顶部，由蛇形通道760a的凸起部分776限定，还可以看到超声波突出部(ultrasonic tabs)764设置在渗透物构件708的顶部。在该图7B中看不到在穿孔构件701上形成孔的穿孔；然而，看到容纳超声波突出部764的通孔766。此外，支持物770设置在SWIIN模块750的任一端，以支持SWIIN模块750，并将渗透物构件708和渗余物构件704提升到储库752和储库754上方，以使进入从渗透物储库到蛇形通道760a的流体路径或从渗余物储库到蛇形通道760b的流体路径(在该图7B中看不到这两个流体路径)的气泡或空气最小化。

在该图7B中，可以看到，除了不横穿渗透物构件708的包括渗透物储库752和渗余物储库754的部分之外，设置在渗透物构件708顶部的蛇形通道760a在渗透物构件708的大部分长度以及渗透物构件708的大部分宽度上横穿渗透物构件708。如本文中关于渗余物构件或渗透物构件中的分配通道所使用的，“大部分长度”意指渗余物构件或渗透物构件长度的约95％，或渗余物构件或渗透物构件长度的约90％、85％、80％、75％或70％。如本文中关于渗余物构件或渗透物构件中的分配通道所使用的，“大部分宽度”意指渗余物构件或渗透物构件宽度的约95％，或渗余物构件或渗透物构件宽度的约90％、85％、80％、75％或70％。

在SWIIN模块的该实施方案中，穿孔构件包括通孔，以容纳设置在渗透物构件上的超声波突出部。因此，在该实施方案中，穿孔构件由316不锈钢制成，并且穿孔形成微孔的壁，而过滤器或膜用于形成微孔的底部。通常，穿孔(微孔)直径为约150μm-200μm，并且穿孔构件为约125μm深，导致微孔具有约2.5nl的体积，总共约200,000个微孔。微孔之间的距离是中心至中心约279μm。虽然此处微孔具有约2.5nl的体积，但微孔的体积可以是1nl至25nl，或优选地2nl至10nl，并且甚至更优选地2nl至4nl。至于过滤器或膜，像前面描述的过滤器一样，适合使用的过滤器是耐溶剂的、在过滤期间无污染，并且能够保留感兴趣细胞的类型和尺寸。例如，为了保留小细胞类型，诸如细菌细胞，孔径可以低至0.10μm，然而对于其他细胞类型(例如，诸如对于哺乳动物细胞)，孔径可以高至10.0μm-20.0μm或更大。事实上，可用于细胞浓缩装置/模块中的孔径包括具有以下尺寸的过滤器：0.10μm、0.11μm、0.12μm、0.13μm、0.14μm、0.15μm、0.16μm、0.17μm、0.18μm、0.19μm、0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm以及更大。过滤器可以由任何合适的材料制成，包括纤维素混合酯(硝酸纤维素和乙酸纤维素)(CME)、聚碳酸酯(PC)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙或玻璃纤维。

配合的蛇形通道的截面形状可以是圆形、椭圆形、卵形、方形、矩形、梯形或不规则的。如果是方形、矩形或具有大体上直边的另一种形状，截面可以是约2mm到15mm宽，或者3mm到12mm宽，或者5mm到10mm宽。如果配合的蛇形通道的截面大体上是圆形、卵形或椭圆形，通道的半径可以是按水力半径约3mm到20mm，或者按水力半径5mm到15mm，或者按水力半径8mm到12mm。

蛇形通道760a和760b可以具有大致相同的体积，或者蛇形通道760a和760b可以具有不同的体积。例如，蛇形通道的每个“侧面”或部分760a、760b可以具有例如2mL的体积，或者渗透物构件708的蛇形通道760a可以具有2mL的体积，并且渗余物构件704的蛇形通道760b可以具有例如3mL的体积。蛇形通道中的流体体积范围可以是约2mL至约80mL、或约4mL至60mL、或5mL至40mL、或6mL至20mL(注意，这些体积适用于包括例如50-500K穿孔构件的SWIIN模块)。储库的体积范围可以是5mL至50mL、或7mL至40mL、或8mL至30mL或10mL至20mL，并且所有储库的体积可以相同或储库的体积可以不同(例如，渗透物储库的体积大于渗余物储库的体积)。

渗透物构件708和渗余物构件704的蛇形通道部分760a和760b分别为约200mm长、130mm宽和4mm厚，尽管在其他实施方案中，渗余物构件和渗透物构件的长度可为75mm至400mm，或长度可为100mm至300mm，或长度可为150mm至250mm；宽度可为50mm至250mm，或宽度可为75mm至200mm，或宽度可为100mm至150mm；以及厚度可为2mm至15mm，或厚度可为4mm至10mm，或厚度可为5mm至8mm。实施方案渗余物(和渗透物)构件可以由PMMA(聚(甲基丙烯酸甲酯))制成，或者可以使用其他材料，包括聚碳酸酯、环烯烃共聚物(COC)、玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚砜、聚氨酯以及这些和其他聚合物的共聚物。优选地，至少渗余物构件由透明材料制成，使得细胞可以被可视化(例如，参见图7E及其描述)。例如，通过例如基于具有相差的空孔图像的密度变化测量，或者如果例如使用发色标记(chromogenicmarker)，诸如发色蛋白，来给细胞添加可区分的颜色，摄像机可以用于监测细胞生长。尽管也可以使用荧光细胞标记(fluorescent cell markers)、荧光蛋白和化学发光细胞标记(chemiluminescent cell markers)，但发色标记诸如blitzen蓝、dreidel蓝绿、virginia紫、vixen紫、prancer紫、tinsel紫、maccabee紫、donner品红、cupid粉、seraphina粉、scrooge橙和leor橙(Chromogenic Protein Paintbox，均可从ATUM(Newark,CA)获得)避免了使用荧光的需要。

因为渗余物构件优选地是透明的，所以SWIIN模块中的集落生长可以通过自动化装置，诸如JoVE(ScanLag^TM system,Cambridge,MA)销售的装置进行监测(也参见Levin-Reisman等人,Nature Methods,7:737-39(2010))。例如哺乳动物细胞的细胞生长可以通过例如由IncuCyte(Ann Arbor,MI)销售的生长监测器来监测(也参见，Choudhry,PLos One,11(2):e0148469(2016))。此外，可以采用自动化集落选取仪，诸如由例如TECAN(Pickolo^TMsystem,Mannedorf,Switzerland)；Hudson Inc.(RapidPick^TM,Springfield,NJ)；Molecular Devices(QPix 400^TM system,San Jose,CA)；以及Singer Instruments(PIXL^TMsystem,Somerset,UK)销售的那些。

由于SWIIN模块的加热和冷却，冷凝物可能积聚在渗余物构件上，这可能干扰正在生长的细胞集落的精确可视化。SWIIN模块750的冷凝可以通过例如在SWIIN模块750的(例如渗余物构件)的顶部上移动加热的空气，或者通过在渗余物构件704的至少蛇形通道部分760b上应用透明加热盖来控制。参见例如图7E及下文对其的描述。

在SWIIN模块750中，细胞和培养基——以适于穿孔构件的微孔中细胞的泊松或大致上泊松分布的稀释度——从渗余物构件704中的端口流入蛇形通道760b，并且细胞在微孔中沉淀，同时培养基通过过滤器进入渗透物构件708中的蛇形通道760a。由于细胞不能穿过过滤器703，细胞被保留在穿孔构件701的微孔中。合适的培养基可以通过渗透物端口711引入渗透物构件708。培养基向上流过过滤器703，以滋养穿孔构件701的微孔(穿孔)中的细胞。此外，缓冲液交换可以通过循环培养基通过渗余物和渗透物构件来实现。在操作中，细胞被沉积到微孔中，生长初始的例如2-100次倍增，编辑通过例如将SWIIN的温度升高到42℃以诱导温度诱导型启动子来诱导，或者通过从渗透物构件中去除生长培养基并用包含诱导诱导型启动子的化学组分的培养基替换生长培养基来诱导。

在编辑已经发生后，可以降低SWIIN的温度，或者可以去除诱导培养基并用缺乏化学组分的新鲜培养基替换，从而使诱导型启动子失活。然后，细胞在SWIIN模块750中继续生长，直到微孔中细胞集落的生长被标准化。对于标准化方案，在集落被标准化后，通过向渗透物构件蛇形通道760a施加并从而向过滤器703施加流体或空气压力(或二者)，将集落从微孔中冲洗出来并汇集。可选地，如果期望择优选取，监测微孔中细胞集落的生长，并直接选择缓慢生长的集落；或者，快速生长的集落被消除。

图7C是具有渗余物构件和穿孔构件的SWIIN模块的部分横截面的俯透视图。在该图7C中，可以看到，蛇形通道760a设置在渗透物构件708的顶部，由凸起部分776限定，并且除了不横穿渗透物构件708的包括渗透物和渗余物储库的部分之外(注意，只能看到一个渗余物储库752)，在渗透物构件708的大部分长度和宽度上横穿渗透物构件708。从左向右移动，储库密封垫758设置在渗余物构件704的集成储库盖778(盖未见于该图7C中)上。密封垫758包括储库进入孔732a、732b、732c和732d，以及气动端口733a、733b、733c和733d。在最左端还有支持物770。可以看到设置在渗透物储库752下方的两个储库密封件762中的一个。除了渗余物构件在横截面中，穿孔构件701和过滤器703(过滤器703未见于该图7C中)也是横截面。注意，在SWIIN模块750的右端和限定蛇形通道760a的通道转弯的凸起部分776上设置有多个超声波突出部764，包括延伸穿过穿孔构件701的通孔766的超声波突出部764。在渗透物构件708的末端远端储库752、754处也有支持物770。

图7D是组装的SWIIN模块750的侧面透视图，从右至左包括，储库密封垫758，其设置在集成储库盖778(未示出)上，集成储库盖778为渗余物构件704的集成储库盖778。密封垫758可以由橡胶、硅酮、丁腈橡胶、聚四氟乙烯、诸如聚三氟氯乙烯的塑料聚合物或其他柔性可压缩材料制成。密封垫758包括储库进入孔732a、732b、732c和732d，以及气动端口733a、733b、733c和733d。渗透物构件708的支持物770也在最左端。此外，可以看到渗透物储库752以及一个储库密封件762。在最右端是第二支持物770。

在大多数实施方式中，期望对生长在SWIIN的孔中的细胞集落进行成像，例如，以监测细胞生长和装置性能二者，并且成像对于择优选取实施方式是必要的。实时监测SWIIN中的细胞生长需要背光、渗余物板(顶板)冷凝管理和系统水平的温度控制、气流和热管理方法。在一些实施方式中，成像采用具有足够分辨率的照相机或CCD器件，以能够对单个孔成像。例如，在一些配置中，使用具有9像素间距的相机(即，每个孔的中心到中心有9个像素)。在一些实施方式中，处理图像可以利用灰度读取图像，从低到高对每个像素进行评级，其中没有细胞的孔会是最亮的(由于来自背光的完全或接近完全的光透射)，并且具有细胞的孔会是暗的(由于细胞阻挡来自背光的光透射)。在处理图像之后，进行阈值处理(thresholding)以确定哪些像素会被识别为(called)“亮”或“暗”，进行斑点寻找以找到亮像素并将它们排列成块，并且然后将斑点排列在对应于斑点的六边形像素网格上。在排列后，通过例如观察斑点中间的一个或更多个像素、在随机或预设位置观察若干个至许多像素、或者对斑点中的X个像素取平均值来提取每个孔的强度度量。此外，可以减去背景强度。阈值处理再次用于将每个孔识别为阳性(例如，含有细胞)或阴性(例如，孔中没有细胞)。成像信息可以以若干方式使用，包括在监测细胞生长的时间点拍摄图像。监测细胞生长可用于，例如，去除快速生长细胞的“松饼顶部(muffin tops)”，然后去除所有细胞或如上文描述地按“轮”去除细胞，或从特定孔(例如，缓慢生长的细胞集落)中回收细胞；可选地，可以鉴定包含快速生长细胞的孔，并且可以将覆盖快速生长细胞集落的UV区域投射(或用快门光栅化)到SWIIN上，以照射或抑制这些细胞的生长。成像也可用于确保蛇形通道760中的适当流体流动。

图7E描绘了图7B-图7D中的SWIIN模块的实施方案，所述SWIIN模块还包括热管理系统，该热管理系统包括加热器和加热盖。加热器盖促进成像所需的冷凝管理。组件798包括截面中纵向可见的SWIIN模块750，其中可以看到一个渗透物储库752。盖794紧邻SWIIN模块750上方设置，并且背光780紧邻SWIIN模块750下方设置，这允许成像。在背光和SWIIN模块的下方和邻近是绝缘体782，其设置在散热器784上。在该图7E中，散热器的散热片在页面的外面。此外，还有轴流风扇786和散热器788，以及两个热电冷却器792和控制气动器件、热电冷却器、风扇、电磁阀等的控制器790。箭头表示进入单元的冷空气和从单元移除的热空气。应注意，加热控制允许许多不同类型的细胞(原核和真核)以及例如对温度敏感的细胞株的生长，并且允许使用温度敏感的启动子。温度控制允许调整方案以解决转化效率、细胞生长和生存力的差异。关于固体壁分离孵育和标准化装置的更多细节，参见2019年4月30日提交的USSN 16/399,988；2019年6月26日提交的USSN 16/454,865；2019年8月14日提交的USSN 16/540,606；2019年10月9日提交的USSN 16/597,826；和2019年10月9日提交的USSN16/597,831。关于替代的分离、培养和标准化模块，参见2019年8月8日提交的USSN 16/536,049。

细胞生长装置的使用

图8是用于使用自动化多模块细胞编辑仪器诸如图2A-图2C中图示的系统的示例性方法800的流程图。例如，处理系统指导方法800的处理阶段。例如，软件脚本可以识别用于每个处理阶段的设置和用于移动机器人操作系统以进行方法800的动作的指令。在一些实施方案中，软件指令脚本可以由提供至自动化多模块细胞编辑仪器的试剂筒来识别。例如，试剂筒可以包括机器可读标记，诸如条形码或QR码，包括存储在自动化多模块细胞编辑仪器的存储器中的脚本的标识。在另一实例中，试剂筒可以包含嵌入在机器可读标记诸如射频(RF)标签中的可下载脚本。在其他实施方案中，使用者可以识别脚本，例如通过经由有线或无线连接将脚本下载至自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统，或者通过自动化多模块细胞编辑仪器的使用者界面选择存储的脚本。在特定实例中，自动化多模块细胞编辑仪器可以包括用于提交使用者设置和启动细胞处理的触摸屏界面。同样，自动化多模块细胞处理仪器是独立的仪器，并且在脚本、试剂储库和液体操作系统之间以完全自动化的方式促进活细胞编辑，而无需人为干预。

在一些实施方式中，方法800开始于将细胞转移至细胞生长模块(802)。生长模块可以是可适于自动化的任何生长模块，诸如，例如，关于图5B-图5D描述的细胞生长模块550。在特定实例中，处理系统可以指导机器人操作系统将细胞转移到生长模块，诸如通过机器人操作系统将细胞从试剂筒转移到生长模块。在一些实施方案中，生长瓶可以包含生长培养基，并且例如作为套件的一部分来提供。在其他实施方案中，生长瓶可以填充有例如经由液体操作装置从试剂容器转移的培养基。

在一些实施方案中，在转移细胞(例如，从试剂筒或从添加至仪器的瓶)前，可以在位于为细胞指定的位置的瓶或其他容器上扫描机器可读标记，以确认瓶或容器被标记为包含细胞。此外，机器可读标记可以指示提供至仪器的细胞类型。在一些实施方案中，细胞的类型可以使仪器选择特定处理脚本(例如，用于机器人操作系统以及多种模块的设置和启动的一系列指令)。

在一些实施方式中，细胞在生长模块中生长至期望的光密度(804)。例如，处理系统可以管理生长模块的温度设置，用于在生长周期期间孵育细胞。处理系统还可以从生长模块接收指示光密度的传感器信号，并且分析传感器信号以监控细胞的生长。在一些实施方案中，使用者可以设置用于管理细胞生长的生长参数。例如，温度和细胞的搅动程度。此外，在一些实施方案中，可以向使用者更新关于生长过程的信息。在一些实例中，更新可以包括在自动化多模块细胞编辑仪器的使用者界面上呈现的消息、至使用者手机号码的文本消息、至电子邮件账户的电子邮件消息、或者传输至在便携式电子装置(例如，手机、平板电脑等)上执行的应用程序的消息。在一些实施方案中，响应于该消息，使用者可以修改参数，诸如温度，以调节细胞生长。例如，使用者可以通过自动化多模块细胞编辑仪器的使用者界面或者通过与自动化多模块细胞编辑仪器通信的便携式计算装置应用程序，诸如使用者界面(参见例如图2C的触摸屏显示器201)，提交更新的参数。

尽管关于光密度进行了描述，但是在其他实施方式中，生长模块内的细胞生长可以使用细胞密度和生理状态的不同测量来监测，所述不同测量诸如，在一些实例中，pH、溶解氧、释放的酶、声学特性和电学特性。

在一些实施方式中，在达到期望的光密度(804)后，细胞从生长模块转移至过滤模块或细胞洗涤和浓缩模块(806)。例如，机器人操作系统可以将细胞从生长模块转移至细胞浓缩模块。例如，细胞浓缩模块可以(并且通常)被设计成赋予细胞电感受态。参见以上与TFF装置有关的图6A-图6D。在过滤模块或细胞洗涤和浓缩模块中赋予细胞电感受态并洗脱(808)。细胞可以使用洗涤溶液洗脱。例如，细胞可以使用来自试剂供应装置的试剂洗脱。

在细胞被赋予电感受态并悬浮在适当体积的培养基中，诸如50μL至7.5mL、或100μL至5mL、或150μL至2.5mL用于转化(808)后，试剂束和晶格形成珠被添加到细胞中以形成球状填充晶格。球状填充晶格被转移到例如电穿孔模块的入口孔中(812)。例如，机器人操作系统可以将细胞从细胞浓缩装置或模块转移到电穿孔模块812。

在一些实施方式中，将核酸在自动化多模块细胞编辑仪器之外制备。例如，组装的载体或其他核酸组装物或载体或其他核酸可被预装载在试剂递送基底上以形成试剂束，并在运行方法800中的转化过程和其他过程之前由使用者作为试剂包括在例如试剂筒810中。如果在试剂筒中提供，试剂束被转移以与电感受态细胞和晶格形成珠混合。

球状填充晶格中的细胞在电穿孔模块中用可逆地偶联到试剂递送基底(例如，试剂束)的编辑载体文库转化。在转移缓冲液或培养基、晶格形成珠或试剂束至细胞之前，可以在位于为试剂指定的位置的瓶或其他容器或储库上扫描机器可读标记，以确认瓶、容器或储库的内容物。此外，机器可读标记可以指示提供至仪器的试剂类型。在一些实施方案中，使用的试剂的类型可以使仪器选择特定处理脚本(例如，适于特定缓冲液或培养基的转化模块的设置和启动)。对于细菌细胞电穿孔，可以使用低电导培养基诸如水或甘油溶液降低瞬时高电流的热量产生。对于酵母细胞，可以使用山梨醇溶液。对于哺乳动物细胞电穿孔，可以将细胞悬浮在高导电性培养基或缓冲液，诸如MEM、DMEM、IMDM、RPMI、Hanks、PBS、HBSS、HeBS和林格氏溶液中。在特定实例中，机器人操作系统可以将缓冲液溶液从试剂筒转移至电穿孔模块。如关于图3A-图3K描述的，电穿孔装置可以是一次性电穿孔装置和/或电穿孔装置可以作为试剂筒的一部分提供。可选地，电穿孔装置可以是单独的模块。此外，球状填充晶格组合物是对电穿孔装置不可知的，这意味着本领域中已知的大多数电穿孔装置可用于转化或转染球状填充晶格中的细胞。

在转化后，细胞任选地被稀释并转移至例如第二生长/恢复/编辑模块(816)，诸如关于图5A-图5D描述的细胞生长模块。例如，机器人操作系统可以通过吸管或移液器接口将转化的细胞转移至第二生长模块。在另一实例中，机器人操作系统可以将包含转化的细胞的瓶从转化模块的室转移至第二生长模块的室。

在一些实施方案中，第二生长模块用作恢复模块，允许细胞从转化过程中恢复并与晶格形成珠分离。在其他实施方案中，细胞可以在被运输至第二生长模块前被提供至分开的恢复和分离模块。在恢复期间，第二生长模块允许转化的细胞摄取，并且在某些方面，将引入的核酸整合到细胞的基因组中。第二生长模块可以被配置成在使用者定义的最适合细胞生长的任何温度，优选地在25℃、30℃或37℃孵育细胞。

在一些实施方案中，第二生长模块用作选择模块，基于抗生素或其他试剂选择转化的细胞。在一个实例中，RNA引导的核酸酶(RGN)蛋白系统用于选择，以裂解没有接受期望编辑的细胞的基因组。在抗生素选择剂的实例中，抗生素可以被添加至第二生长模块以进行选择。合适的抗生素抗性基因包括，但不限于，基因，诸如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、刀豆氨酸抗性基因、杀稻瘟素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。例如，机器人操作系统可以通过吸管或移液器接口将抗生素转移至第二生长模块。在一些实施方案中，通过使用裂解增强剂诸如去污剂、通过低氧洗涤(hyponic wash)的渗透胁迫、温度、酶、蛋白酶、噬菌体、还原剂或离液剂来有助于去除死细胞背景。例如，处理系统可以改变环境变量，诸如温度，以诱导选择，而机器人操作系统可以递送另外的材料(例如，去污剂、酶、还原剂等)来有助于选择。在其他实施方案中，通过过滤去除细胞和/或交换培养基被用于降低死细胞背景。

在另外的实施方案中，除了应用选择或作为应用选择的替代方案，第二生长模块用作编辑模块，允许在转化的细胞中进行基因组编辑。可选地，在其他实施方案中，细胞在恢复后、分离后和选择后(如果进行的话)被转移至分开的编辑模块。作为编辑模块，第二生长模块例如，通过促进引入的核酸的表达诱导细胞的基因组的编辑。核酸酶和/或编辑盒核酸的表达可以涉及化学、光、病毒或温度诱导方法中的一种或更多种。例如，第二生长模块可以被配置成在温度诱导过程期间加热或冷却细胞。在特定说明中，细胞可以通过在42℃-50℃加热来诱导。进一步说明，然后细胞可以在诱导后冷却至0℃-10℃。在化学或病毒诱导的实例中，可以将诱导剂转移至第二生长模块以诱导编辑。如果在编辑期间将诱导型核酸酶和/或编辑盒引入细胞，则它可以通过引入诱导物分子来诱导。在一些实施方式中，诱导剂或诱导物分子通过机器人操作系统例如通过移液器或吸管接口转移至第二生长模块。

在一些实施方式中，如果不期望另外的细胞编辑(818)，可以将细胞从第二细胞生长模块或编辑模块转移至储存单元，用于后续从自动化多模块细胞编辑仪器中取出(820)。例如，机器人操作系统可以通过吸管或移液器接口将细胞转移至储存单元。在另一实例中，机器人操作系统可以将包含细胞的瓶从第二生长模块的室转移至储存单元内的瓶或管。

在一些实施方式中，如果期望另外的细胞编辑(818)，则可以将细胞转移到生长模块(802)，生长到期望的OD(804)，转移到细胞浓缩模块(806)，然后浓缩并使其成为电感受态(808)。此外，在一些实施方案中，新组装的核酸样品可由核酸组装模块制备并装载到试剂递送基底上，以在此时形成试剂束，或者，可选地，第二试剂束可从例如试剂筒直接引入细胞。在递归编辑前，在一些实施方案中，自动化多模块细胞编辑仪器可能需要由使用者提供另外的材料，例如，通过引入一个或更多个分开的试剂瓶或筒。

在第二轮编辑期间，步骤可以相同，也可以不同。例如，在一些实施方案中，在随后执行步骤804时，选择性生长培养基被转移至生长模块，以使得能够从第一轮编辑中选择被编辑的细胞。机器人操作系统可以从位于为选择性生长培养基指定的位置的试剂筒中的瓶或容器转移选择性生长培养基。在转移选择性生长培养基前，可以在位于为选择性生长培养基指定的位置的瓶或其他容器或储库上扫描机器可读标记，以确认瓶、容器或储库的内容物。此外，机器可读标记可以指示提供至仪器的选择性生长培养基的类型。在一些实施方案中，选择性生长培养基的类型可以使仪器选择特定处理脚本(例如，适于特定选择性生长培养基的生长模块的设置和启动)。关于图10描述了递归编辑工作流程的特定实例。

在一些实施方式中，方法800可以安排引入材料的时间和/或与使用者的时间表相协调地完成编辑循环或生长循环。例如，自动化多模块细胞编辑仪器可以向使用者提供调度一个或更多个细胞处理循环(例如，一个或更多个递归编辑)的完成的能力，使得方法800以在使用者的优选时间完成为目标来实施。例如，时间调度可以通过使用者界面来设置。仅作为说明，使用者可以将第一循环的完成设置为4:00PM，使得使用者可以向自动化多模块细胞编辑仪器提供另外的材料筒，以能够实现另一轮细胞编辑的过夜处理。因此，使用者可以对程序定时，使得两个或更多个循环可以被编程在特定时间段(例如24小时时间段)内。

在一些实施方式中，在整个方法800中，自动化多模块细胞编辑仪器可以提醒使用者其当前状态。例如，使用者界面可以呈现处理的当前阶段的图形指示。在特定实例中，自动化多模块细胞处理仪器的正面可以覆盖有使用者界面(例如，触摸屏)，该使用者界面呈现描绘细胞处理的当前状态的动画图形。使用者界面还可以呈现与当前处理阶段相关的任何使用者和/或默认设置(例如，温度设置、时间设置等)。在某些实施方式中，状态可以经由无线通信控制器传递至使用者。

尽管图示为特定系列的操作，但是在其他实施方案中，方法800中可以包括更多或更少的步骤。例如，在一些实施方案中，在接合每一轮编辑前，可以对储库、试剂筒和/或瓶的内容物进行筛选，以确认适当的材料可用于进行处理。例如，在一些实施方案中，一个或更多个成像传感器(例如，条形码扫描仪、照相机等)可以确认自动化多模块细胞编辑仪器壳体内不同位置的内容物。在一个实例中，多个成像传感器可以设置在自动化多模块细胞编辑仪器的壳体内，每个成像传感器被配置成检测一种或更多种材料(例如，机器可读标记诸如条形码或QR码、材料的形状/尺寸等)。在另一个实例中，至少一个成像传感器可以由机器人操作系统移动至多个位置，以检测一种或更多种材料。在另外的实施方案中，一个或更多个重量传感器可以检测一次性或可更换材料的存在或不存在。在说明性实例中，转移吸头供应装置保持器可以包括重量传感器，以检测吸头是否已经装载到区域中。在另一个说明性实例中，光学传感器可以检测液体废弃物的水平已经达到阈值水平，则需要在继续细胞处理前去除，或如果还没有达到处理的最小水平，则添加液体。在一些实施方式中，要求另外的材料、去除废弃物供应装置或其他使用者干预(例如，手动清理一个或更多个元件等)呈现在自动化多模块细胞编辑仪器的使用者图形界面上。在一些实施方式中，自动化多模块细胞编辑仪器例如通过软件应用程序、电子邮件或文本消息，联系使用者请求新材料或其他人工干预。

图9是包括用于富集编辑的细胞的模块940的示例性自动化多模块细胞处理仪器的一种实施方案的简化框图。细胞处理仪器900可以包括壳体944、待转化或转染的细胞的储库902和生长模块(细胞生长装置)904。将待转化的细胞从储库902转移至生长模块904进行培养，直至细胞达到靶OD。在细胞达到靶OD后，生长模块904可以冷却或冷冻细胞以供后续处理，或者细胞可以转移至细胞浓缩模块930，在细胞浓缩模块930处细胞被赋予电感受态并浓缩至用于细胞转化的最佳体积。在浓缩后，细胞然后被添加到晶格形成珠和试剂束，以形成球状填充晶格，并转移到流通式电穿孔模块905(例如，转化/转染模块)。

除了用于储存细胞的储库902之外，自动化多模块细胞处理仪器900可以包括用于储存编辑寡核苷酸盒的储库916和用于储存表达载体骨架的储库918。将编辑寡核苷酸盒和表达载体骨架二者均从试剂筒转移至核酸组装模块920，在核酸组装模块920处编辑寡核苷酸盒被插入表达载体骨架中。组装的核酸可以转移到任选的纯化模块922中，用于脱盐和/或制备用于转化的组装的核酸所需的其他纯化和/或浓缩程序。可选地，预组装的核酸，例如编辑载体，可以储存在储库916或918中。在由纯化模块922执行的过程完成后，组装的核酸与试剂递送基底偶联以形成试剂束，并且然后被转移到例如电穿孔装置905，电穿孔装置905已经包含球状填充晶格，其中细胞生长到靶OD并通过细胞浓缩模块930被赋予电感受态。在电穿孔装置905中，触发试剂束以释放组装的核酸，并将组装的核酸引入细胞。电穿孔后，细胞被转移到合一的恢复/稀释/选择模块910。

在恢复、与晶格形成珠和试剂递送基底分离以及任选地选择之后，细胞被转移到单个化、选择、生长、诱导、编辑和标准化模块940，在那里细胞被稀释和区室化，使得每个区室平均有一个细胞。在单个化后，细胞在例如选择性培养基中生长预先确定的倍增倍数。在建立了这些初始集落后，诱导编辑，并且允许编辑的细胞建立集落，集落生长至终末尺寸(例如，集落被标准化)。在一些实施方案中，编辑由处于诱导型启动子控制下的一种或更多种编辑组分诱导。在一些实施方案中，诱导型启动子通过温度升高而被激活，并且通过温度降低而“失活”。可选地，在单个化装置是包括形成微孔的底的过滤器的固体壁装置的实施方案中，固体壁装置可以转移至包含具有激活诱导的编辑的组分的培养基的板(例如琼脂板或甚至液体培养基)，然后转移至使编辑失活的培养基。在集落生长至终末尺寸后，集落被汇集。同样，单个化克服了来自未编辑的细胞的生长偏倚和来自不同编辑的适应度作用的生长偏倚。

恢复、稀释、分离、选择、单个化、诱导、编辑和生长模块可以全部是分开的，可以如图9中示出的排列和组合，或者可以以其他配置排列或组合。在某些实施方案中，所有的恢复、选择、单个化、生长、编辑和标准化都在固体壁装置中进行。可选地，如果需要，恢复、选择和稀释在分开的容器(模块)中的液体培养基中进行，然后转移至固体壁单个化/生长/诱导/编辑/标准化模块。

在标准化的细胞集落被汇集后，细胞可以储存在例如储存模块912中，在储存模块912中细胞可以保持在例如4℃，直至细胞被取回914用于进一步研究。可选地，细胞可以在另一轮编辑中使用。多模块细胞处理仪器900由处理器942控制，处理器942被配置成基于使用者输入、如由一个或更多个脚本指导或作为使用者输入或脚本的组合来操作仪器900。处理器942可以控制仪器900的各个模块的定时、持续时间、温度和操作以及试剂的分配。例如，处理器942可以在转化后使细胞冷却，直至编辑是期望的，此时温度可以升高至有利于基因组编辑和细胞生长的温度。处理器可以被编程有使用者可以从中选择的标准协议参数，使用者可以手动指定一个或更多个参数，或者与试剂筒相关的一个或更多个脚本可以指定一个或更多个操作和/或反应参数。此外，处理器942可以通知使用者(例如，经由智能电话或其他装置的应用程序)细胞已经达到靶OD，以及向使用者更新多模块细胞处理仪器900中的各个模块中的细胞的进展。

自动化多模块细胞处理仪器900是核酸酶指导的基因组编辑系统，并且可以在单个编辑系统(例如，在单个编辑过程中将一个或更多个编辑引入细胞基因组)中使用。下文描述的，图10的系统被配置成执行顺序编辑，例如，依次使用不同的核酸酶指导的系统在细胞中提供两个或更多个基因组编辑；和/或递归编辑，例如利用单个核酸酶指导的系统在细胞中依次引入两个或更多个基因组编辑。

图10图示了多模块细胞处理仪器1000的另一种实施方案。该实施方案描绘了对细胞群体进行递归基因编辑的示例性系统。与图9中示出的实施方案一样，细胞处理仪器1000可以包括壳体1044、用于储存待转化或转染的细胞的储库1002和细胞生长模块(包括例如旋转生长瓶)1004。将待转化的细胞从储库转移至细胞生长模块1004进行培养，直至细胞达到靶OD。在细胞达到靶OD后，生长模块可以冷却或冷冻细胞以供后续处理，或者将细胞转移至细胞浓缩模块1060，在细胞浓缩模块1060处细胞经历缓冲液交换并被赋予电感受态，并且细胞的体积可以显著减低。在细胞被浓缩到适当的体积后，将细胞与晶格形成珠和试剂束混合以形成球状填充晶格，并且然后将球状填充晶格转移到电穿孔装置或模块1008。除了用于储存细胞的储库之外，多模块细胞处理仪器1000还包括用于储存预组装有编辑寡核苷酸盒的载体的储库1052。预组装的核酸载体与试剂递送基底组合以形成试剂束，然后转移到已经包含细胞和晶格形成珠的电穿孔装置1008。在电穿孔装置1008中，将核酸电穿孔到细胞中。在电穿孔之后，细胞被转移到分离、恢复(和任选地稀释)模块1056，在那里细胞与晶格形成珠分离，并被允许在转化后短暂地恢复。

在恢复后，可以将细胞转移至储存模块1012，在储存模块1012处可以将细胞储存在例如4℃以供后续处理，或者可以将细胞稀释并转移至选择/生长/诱导/编辑模块/装置1058。允许细胞生长，并且然后通过提供诱导编辑的条件(例如温度、添加诱导或阻遏化学物质)诱导编辑。注意，选择/生长/诱导和编辑模块可以是相同的模块或装置，其中所有过程都在例如固体壁单个化装置中进行，或者选择和/或稀释可以在分开的容器中发生，然后将细胞转移至诱导/编辑模块。作为在例如固体壁装置中单个化的替代方案，可以使转化的细胞在主体液体中生长并且编辑可以在主体液体中被诱导(参见例如，2019年8月20日提交的USSN 16/545,097)。在推定编辑的细胞被汇集后，它们可以经历另一轮编辑，另一轮编辑开始于生长、细胞浓缩和处理以赋予电感受态，以及经由电穿孔装置/模块1008被另一编辑盒中的又一供体核酸转化。

在电穿孔装置1008中，选自第一轮编辑的细胞被第二组编辑寡核苷酸(或其他类型的寡核苷酸)转化，并且重复该循环，直至细胞已经被期望数的例如编辑盒转化和编辑。图10中例示的多模块细胞处理仪器1000由处理器1042控制(处理器1042被配置成基于使用者输入来操作仪器)或者由包括与试剂筒相关的至少一个脚本在内的一个或更多个脚本来控制。处理器1042可以控制各个过程的定时、持续时间和温度，试剂的分配以及仪器1000的各个模块的其他操作。例如，脚本或处理器可以控制细胞、试剂、载体和编辑寡核苷酸的分配；哪些编辑寡核苷酸用于细胞编辑且按什么顺序；恢复和表达模块中使用的时间、温度和其他条件，细胞生长模块中读取OD的波长，细胞生长到的靶OD，以及细胞达到靶OD的靶时间。此外，处理器可以被编程为通知使用者(例如，经由应用程序)自动化多模块细胞处理仪器中细胞的进展。

鉴于本公开内容，对于本领域普通技术人员来说明显的是，所描述的过程可以是递归和多重化的；即，细胞可以经历关于图10描述的工作流程，然后所得到的编辑的培养物可以经历另一轮(或若干轮或许多轮)使用不同编辑载体的另外的编辑(例如递归编辑)。例如，来自第一轮编辑的细胞可以被稀释，并且由编辑载体A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体B组合，由编辑载体A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体C组合，由编辑载体A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体D组合，等等，用于第二轮编辑。在第二轮后，可以使双重编辑的细胞中的每一种的等分试样经历第三轮编辑，其中，例如，将AB编辑的、AC编辑的、AD编辑的细胞各自的等分试样与另外的编辑载体(诸如编辑载体X、Y和Z)组合。即，双重编辑的细胞AB可以与载体X、Y和Z组合并且由载体X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的编辑细胞ABX、ABY和ABZ；双重编辑的细胞AC可以与载体X、Y和Z组合并且由载体X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的细胞ACX、ACY和ACZ；并且双重编辑细胞AD可以与载体X、Y和Z组合并且由载体X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的细胞ADX、ADY和ADZ，等等。

在该过程中，可以执行编辑的许多排列和组合，产生非常多样的细胞群体和细胞文库。在任何递归过程中，“处治(cure)”先前的引擎载体和编辑载体(或者单个载体系统中的单个引擎+编辑载体)都是有利的。“处治”是其中将在先前一轮编辑中使用的一个或更多个载体从转化的细胞消除的过程。处治可以通过以下完成：例如使用处治质粒裂解一个或更多个载体从而使编辑载体和/或引擎载体(或单个的、合二为一的载体)无功能；经由细胞生长稀释细胞群体中的一个或更多个载体(即细胞经历的生长周期越多，保留编辑载体或引擎载体的子细胞就越少)，或者通过例如利用编辑载体或引擎载体(或合二为一的引擎+编辑载体)上的热敏感复制起点。用于处治的条件将取决于用于处治的机制；即，在这个实例中，处治质粒如何裂解编辑和/或引擎质粒。

图11是包括例如用于诱导的编辑和富集编辑的细胞的主体液体生长模块(bulkliquid growth module)的示例性自动化多模块细胞处理仪器1100的一种实施方案的简化框图。(参见例如，2019年8月20日提交的USSN 16/545,097。)细胞处理仪器1100可以包括壳体1144、待转化或转染的细胞的储库1102和生长模块(细胞生长装置)1104。将待转化的细胞从储库1102转移至生长模块1104进行培养，直至细胞达到靶OD。在细胞达到靶OD后，生长模块可以冷却或冷冻细胞以供后续处理，或者可以将细胞转移到细胞浓缩模块1130，在那里细胞被赋予电感受态并浓缩到与试剂束和晶格形成珠组合的最佳体积以形成球状填充晶格组合物。在形成后，球状填充晶格组合物然后被转移到电穿孔模块1108(例如，转化/转染模块)。

除了用于储存细胞的储库1102之外，仪器1100可以包括用于储存编辑盒或试剂束的储库1116和用于储存表达载体骨架的储库1118。如果存在，将编辑寡核苷酸盒和表达载体骨架二者均从试剂筒转移至核酸组装模块1120，在核酸组装模块1120处编辑寡核苷酸盒被插入表达载体骨架中。组装的核酸可以被转移到任选的纯化模块1122中，用于脱盐和/或其他纯化，并与试剂递送基底组合以形成试剂束。在试剂束形成后，它们与电感受态细胞和晶格形成珠混合，并转移到例如电穿孔装置或模块1108。在电穿孔装置1108中，组装的核酸被引入细胞。电穿孔后，细胞被转移到合一的分离/恢复/选择模块1110。

在恢复、与晶格形成珠分离以及任选地选择之后，细胞被转移到生长、诱导和编辑模块(主体液体培养)1140。允许细胞生长直至细胞达到稳定生长期(或接近稳定生长期)，然后通过诱导核酸酶和gRNA之一或二者的转录诱导编辑。在一些实施方案中，通过处于诱导型启动子控制下的核酸酶和gRNA之一或二者的转录诱导编辑。在一些实施方案中，诱导型启动子是pL启动子，其中启动子通过温度升高而被激活，并通过温度降低而“失活”。

恢复、选择、生长、诱导、编辑和储存模块可以全部是分开的，可以如图11中示出的排列和组合，或者可以以其他配置排列或组合。在某些实施方案中，恢复和选择在一个模块中进行，并且生长、编辑和再生长在分开的模块中进行。可选地，恢复、选择、生长、编辑和再生长在单个模块中进行。

在细胞被编辑和再生长(例如，从编辑中恢复)后，细胞可以被储存在例如储存模块1112中，在储存模块1112中细胞可以被保持在例如4℃，直至细胞被取回(例如，细胞取回1114)用于进一步研究。可选地，细胞可以在另一轮编辑中使用。多模块细胞处理仪器1100由处理器1142控制，处理器1142被配置成基于使用者输入、如由一个或更多个脚本指导或作为使用者输入或脚本的组合来操作仪器。处理器1142可以控制仪器1100的各个模块的定时、持续时间、温度和操作以及试剂的分配。例如，处理器1142可以在转化后使细胞冷却，直至编辑是期望的，此时温度可以升高至有利于基因组编辑和细胞生长的温度。处理器可以被编程有使用者可以从中选择的标准协议参数，使用者可以手动指定一个或更多个参数，或者与试剂筒相关的一个或更多个脚本可以指定一个或更多个操作和/或反应参数。此外，处理器可以通知使用者(例如，经由智能电话或其他装置的应用程序)细胞已经达到靶OD，以及向使用者更新多模块系统中的各个模块中的细胞的进展。

实施例

提出以下实施例，以便为本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，且以下实施例并不意在限制发明人视作其发明的范围，它们也不意在代表或暗示下文的实验是进行的所有实验或仅有的实验。本领域的技术人员应该明白，可以在对具体方面中所示的发明作出许多变化和/或修饰而不脱离本发明所广泛描述的精神或范畴。因此，本文的方面在各个方面中被认为是说明性的而非限制性的。

实施例I：球状填充晶格的形成与表征

展示了使用聚丙烯酰胺珠，溶液相质粒向填充的晶格中的HEK293T细胞中的电穿孔。图12显示了使用125μm聚丙烯酰胺珠(例如，晶格形成珠)和40μm聚苯乙烯珠(例如，试剂束)通过大量混合具有不同半径的珠的浆料形成的自组装球状填充晶格。

接着显示，当将荧光标记的DNA添加到晶格形成珠中时，其集中到珠之间的间隙区域，并且珠对DNA是不透性的。图13A和图13B是显示聚丙烯酰胺水凝胶珠的显微照片，其中荧光标记的DNA保留在珠之间的间隙分区。此外，测量了有晶格形成珠和无晶格形成珠时培养基的电导率。图13C是表明有(EP培养基/GB晶格)和没有(EP培养基)聚丙烯酰胺水凝胶珠的含有DNA的培养基的电导率大致相同的柱状图。

接着显示，HEK293细胞在使用聚丙烯酰胺晶格形成珠的球状填充晶格中电穿孔时，具有至少等效的转染效率，并表现出较高的平均荧光强度。图14是显示培养基中和在球状填充晶格中用荧光标记的DNA对HEK293细胞的转化效率与没有球状填充晶格的转化效率相当的柱状图。

实施例II：全自动化单重RGN指导的编辑运行

用本公开内容的自动化多模块仪器成功地进行了使用MAD7核酸酶的单重自动化基因组编辑。参见美国专利第9,982,279号；和2018年6月30日提交的USSN 16/024,831；2018年6月30日提交的USSN 16/024,816；2018年9月28日提交的USSN 16/147,353；2018年9月30日提交的USSN 16/147,865；以及2018年6月30日提交的USSN 16/147,871。

经由Gibson

将ampR质粒骨架和lacZ_F172*编辑盒组装成包括在自动化仪器中的等温核酸组装模块中的“编辑载体”。lacZ_F172功能性敲除lacZ基因。“lacZ_F172*”指示编辑发生在lacZ氨基酸序列中的第172个残基处。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。将组装的编辑载体和重组工程化就绪(recombineering-ready)的电感受态大肠杆菌细胞转移到转化模块中进行电穿孔。将细胞和核酸合并，并且允许混合1分钟，并且进行电穿孔30秒。穿孔脉冲的参数是：电压，2400V；长度，5ms；间隔，50ms；脉冲数，1；极性，+。转移脉冲的参数是：电压，150V；长度，50ms；间隔，50ms；脉冲数，20；极性，+/-。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，并且允许其在包含氯霉素的SOC培养基中恢复。1小时后将羧苄青霉素添加至培养基中，并且允许细胞恢复另外2小时。恢复后，将细胞保持在4℃，直至由使用者取回。

在自动化处理和恢复后，将细胞的等分试样铺板在补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和羧苄青霉素的MacConkey琼脂基础上，并且使其生长直至出现集落。白色集落代表功能性编辑的细胞，紫色集落代表未编辑的细胞。所有液体转移都由自动化多模块细胞处理仪器的自动化液体操作装置进行。

自动化处理的结果是约1.0E⁰³个总细胞被转化(与常规台式的结果相当)，并且编辑效率是83.5％。通过对细胞基因组的编辑的区域测序确认白色集落中的lacZ_172编辑。此外，通过网络摄像头远程观察自动化细胞处理的步骤，并且发送文本消息来更新自动化处理程序的状态。

实施例III：全自动化递归编辑运行

使用自动化多模块细胞处理系统成功地实现了递归编辑。经由Gibson

将ampR质粒骨架和lacZ_V10*编辑盒组装成包括在自动化系统中的等温核酸组装模块中的“编辑载体”。与lacZ_F172编辑类似，lacZ_V10编辑功能性敲除lacZ基因。“lacZ_V10”指示编辑发生在lacZ氨基酸序列中的氨基酸位置10处。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。将第一组装的编辑载体和重组工程化就绪的电感受态大肠杆菌细胞转移到转化模块中进行电穿孔。将细胞和核酸合并，并且允许混合1分钟，并且进行电穿孔30秒。穿孔脉冲的参数是：电压，2400V；长度，5ms；间隔，50ms；脉冲数，1；极性，+。转移脉冲的参数是：电压，150V；长度，50ms；间隔，50ms；脉冲数，20；极性，+/-。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，允许其在包含氯霉素的SOC培养基中恢复。1小时后将羧苄青霉素添加至培养基中，并且使细胞生长另外2小时。然后将细胞转移至离心模块中，并且然后进行培养基交换。将细胞重悬在包含氯霉素和羧苄青霉素的TB中，使细胞在TB中生长至2.7的OD600，然后将其浓缩并且使其成为电感受态。

在细胞生长期间，在等温核酸组装模块中制备第二编辑载体。第二编辑载体包含卡那霉素抗性基因，并且编辑盒包含galK Y145*编辑。如果成功，galK Y145*编辑赋予细胞摄取和代谢半乳糖的能力。由galK Y154*盒产生的编辑在第154个氨基酸残基处引入终止密码子，将酪氨酸氨基酸改变为终止密码子。该编辑使galK基因产物为非功能性的，并且抑制细胞代谢半乳糖的能力。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使第二编辑载体产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。使用与以上详述的相同参数，将组装的第二编辑载体和电感受态大肠杆菌细胞(用第一编辑载体转化并且针对第一编辑载体选择)转移到转化模块进行电穿孔。

电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，允许其在包含羧苄青霉素的SOC培养基中恢复。恢复后，将细胞保持在4℃直至取回，之后将细胞的等分试样铺板在补充有氯霉素和卡那霉素的LB琼脂上。为了定量lacZ和galK编辑二者，在两种培养基类型上产生复制斑块板：1)补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的MacConkey琼脂基础，和2)补充有半乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的MacConkey琼脂基础。所有液体转移都由自动化多模块细胞处理系统的自动化液体操作装置进行。

在该递归编辑实验中，筛选的集落中的41％具有lacZ和galK编辑二者，其结果与使用“台式”或手动方法获得的双重编辑效率相当。

虽然本发明通过许多不同形式的实施方案来满足，但是如结合本发明的优选的实施方案详细描述的，应理解本公开内容应被认为是对本发明的原理的示例而不意在将本发明局限于本文说明和描述的具体实施方案。本领域的技术人员可以作出许多变化而不脱离本发明的精神。本发明的范围将通过附加的权利要求和它们的等同物判断。摘要和标题不应被解释为限制本发明的范围，因为它们的目的是使适当的机构以及一般公众能够迅速确定本发明的一般性质。在以下的权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则其中列举的特征或要素都不应该被解释为根据35U.S.C.§112,

6的手段加功能的限定。

Claims (30)

1.一种用于转化或转染细胞的方法，包括：

提供细胞、晶格形成珠和试剂递送基底在培养基中的球状填充组合物，其中所述试剂递送基底的尺寸被确定为适合于由所述晶格形成珠形成的晶格的间隙区域；

触发试剂从所述试剂递送基底的释放；和

向细胞、晶格形成珠和试剂的所述球状填充组合物提供电脉冲。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：在所述第二提供步骤之后，

使所述晶格解构；和

从解构的晶格收集细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂束包含外源物质的多个克隆拷贝。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述外源物质是DNA、RNA、蛋白质或核蛋白复合物。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述试剂束包含不同的外源物质。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂递送基底选自聚合物微粒、陶瓷微粒或水凝胶微粒。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述聚合物微粒是聚苯乙烯珠。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述水凝胶微粒包括交联聚合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述交联聚合物选自聚丙烯酰胺、聚乙二醇或海藻酸盐。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述晶格形成珠是聚合物水凝胶。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述聚合物水凝胶选自聚丙烯酰胺、聚乙二醇、海藻酸盐或明胶。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述晶格形成珠的直径为75μm至250μm。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述晶格形成珠的直径为125μm至150μm。

14.根据权利要求1所述的方法，其中试剂从所述试剂束的释放由化学触发物、光子触发物、电触发物或温度触发物触发。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述化学触发物是酶促触发物、pH触发物或竞争性结合反应触发物。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述光子触发物是UV或可见光。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述电触发物是电场诱导的囊泡失稳。

18.根据权利要求1所述的方法，其中细胞、晶格形成珠和试剂递送基底的所述球状填充组合物的体积在10μL和500μL之间。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂递送基底的直径为20μm至90μm。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述试剂递送基底的直径为30μm至50μm。

21.一种用于转化或转染细胞的方法，包括：

提供细胞、晶格形成珠和外源物质在培养基中的球状填充组合物；和

向细胞、晶格形成珠和试剂的所述球状填充组合物提供电脉冲。

22.根据权利要求21所述的方法，还包括以下步骤：在所述第二提供步骤之后，

使所述晶格解构；和

从解构的晶格收集细胞。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述外源物质是DNA、RNA、蛋白质或核蛋白复合物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述外源物质是DNA、RNA、蛋白质或核蛋白复合物中任何一种的混合物。

25.根据权利要求21所述的方法，其中所述晶格形成珠是聚合物水凝胶。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述聚合物水凝胶选自聚丙烯酰胺、聚乙二醇、海藻酸盐或明胶。

27.根据权利要求21所述的方法，其中所述晶格形成珠的直径为75μm至250μm。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述晶格形成珠的直径为125μm至150μm。

29.根据权利要求21所述的方法，其中试剂从所述试剂束的释放由化学触发物、光子触发物、电触发物或温度触发物触发。

30.根据权利要求1所述的方法，其中细胞、晶格形成珠和试剂递送基底的所述球状填充组合物的体积在10μL和500μL之间。

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