JP7394752B2 - トランスジェニック選択方法および組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、合衆国法典第35巻第119条(e)のもとに、2018年1月11日に出願された米国仮出願第62/616,281号、2017年12月20日に出願された米国仮出願第62/608,478号、2018年1月31日に出願された米国仮出願第62/624,629号、2017年10月12日に出願された米国仮出願第62/571,672号の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、コンピュータ可読形式の配列表を含み(ファイル名:J022770007WO00-SEQ-HJD、1.50MBのASCIIテキストファイル、2018年10月3日に作成)、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本開示の一部をなす。
インテイン
選択可能マーカータンパク質
導入遺伝子および他の目的の分子
ベクター
細胞
送達および選択の方法
キット
本開示の追加の実施形態は、以下の番号付けした段落に包含される。
1.真核生物細胞に、
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(i)抗生物質耐性タンパク質のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のN末端断片およびC末端断片の結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、方法。
2.真核生物細胞を、第1および第2のベクターの真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、段落1に記載の方法。
3.全長抗生物質耐性タンパク質を含むトランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、段落2に記載の方法。
4.真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落1から3のいずれか1つに記載の方法。
5.抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、G418、ピューロマイシン、フレオマイシンD1、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落1から4のいずれか1つに記載の方法。
6.インテインが、スプリットインテインである、段落1から5のいずれか1つに記載の方法。
7.スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落6に記載の方法。
8.天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、段落7に記載の方法。
9.DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、段落8に記載の方法。
10.スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインである、段落6に記載の方法。
11.操作されたスプリットインテインが、DnaBインテインから操作される、段落10に記載の方法。
12.操作されたスプリットインテインが、SspDnaB S1インテインである、段落11に記載の方法。
13.操作されたスプリットインテインが、GyrBインテインから操作される、段落12に記載の方法。
14.操作されたスプリットインテインが、SspGyrB S11インテインである、段落13に記載の方法。
15.第1および/または第2の分子が、タンパク質である、段落1から14のいずれか1つに記載の方法。
16.第1および/または第2の分子が、非コーディングリボ核酸(RNA)である、段落1から15のいずれか1つに記載の方法。
17.非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、または短いヘアピンRNA(shRNA)である、段落16に記載の方法。
18.第1および/または第2のベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落1から17のいずれか1つに記載の方法。
19.真核生物細胞に、
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、hygB遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)hygB遺伝子のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子を含む、第2のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼを産生する、方法。
20.第2のhygB遺伝子断片によってコードされるタンパク質断片の最初のアミノ酸が、システインである、段落19に記載の方法。
21.hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸1~89によって特定されるアミノ酸配列を含み、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸90~341によって特定されるアミノ酸配列を含む、
hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸1~200によって特定されるアミノ酸配列を含み、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸201~341によって特定されるアミノ酸配列を含む、
hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸1~53によって特定されるアミノ酸配列を含み、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸54~341によって特定されるアミノ酸配列を含む、
hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸1~240によって特定されるアミノ酸配列を含み、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸241~341によって特定されるアミノ酸配列を含む、
hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸1~292によって特定されるアミノ酸配列を含み、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸293~341によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落23に記載の方法。
22.インテインのN末端断片が、配列番号16によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号17によって特定される、
インテインのN末端断片が、配列番号7によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号8によって特定される、または
インテインのN末端断片が、配列番号18もしくは配列番号9によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号19もしくは配列番号10によって特定される、段落23から21のいずれか1つに記載の方法。
23.真核生物細胞に、
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、bsr遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)bsr遺伝子のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子を含む、第2のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、bsr遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、bsr遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ブラストサイジン-Sデアミナーゼを産生する、方法。
24.bsr遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号4のアミノ酸1~102によって特定されるアミノ酸配列を含み、bsr遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号4のアミノ酸103~140によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落23に記載の方法。
25.インテインのN末端断片が、配列番号16によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号17によって特定される、
インテインのN末端断片が、配列番号7によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号8によって特定される、または
インテインのN末端断片が、配列番号18もしくは配列番号9によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号19もしくは配列番号10によって特定される、段落22または23に記載の方法。
26.真核生物細胞に、
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、pac遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)pac遺伝子のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子を含む、第2のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、pac遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、pac遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ピューロマイシンN-アセチル-トランスフェラーゼを産生する、方法。
27.pac遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号2のアミノ酸1~63によって特定されるアミノ酸配列を含み、pac遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号2のアミノ酸64~199によって特定されるアミノ酸配列を含む、
pac遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号2のアミノ酸1~119によって特定されるアミノ酸配列を含み、pac遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号2のアミノ酸120~199によって特定されるアミノ酸配列を含む、
pac遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号2のアミノ酸1~100によって特定されるアミノ酸配列を含み、pac遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号2のアミノ酸101~199によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落26に記載の方法。
28.インテインのN末端断片が、配列番号16によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号17によって特定される、
インテインのN末端断片が、配列番号7によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号8によって特定される、または
インテインのN末端断片が、配列番号18もしくは配列番号9によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号19もしくは配列番号10によって特定される、段落26または27に記載の方法。
29.真核生物細胞に、
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、neo遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)neo遺伝子のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子を含む、第2のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、neo遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、neo遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長アミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼを産生する、方法。
30.neo遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号3のアミノ酸1~133によって特定されるアミノ酸配列を含み、neo遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号3のアミノ酸134~267によって特定されるアミノ酸配列を含む、または
neo遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号3のアミノ酸1~194によって特定されるアミノ酸配列を含み、neo遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号3のアミノ酸195~267によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落29に記載の方法。
31.インテインのN末端断片が、配列番号16によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号17によって特定される、
インテインのN末端断片が、配列番号7によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号8によって特定される、または
インテインのN末端断片が、配列番号18もしくは配列番号9によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号19もしくは配列番号10によって特定される、段落29または30に記載の方法。
32.真核生物細胞を含む組成物に、
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)蛍光タンパク質のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、蛍光タンパク質のN末端断片の、蛍光タンパク質のC末端断片への結合を触媒して、全長蛍光タンパク質を産生する、方法。
33.真核生物細胞を、第1および第2のベクターの真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、段落51に記載の方法。
34.全長蛍光タンパク質を含むトランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、段落33に記載の方法。
35.真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落32から34のいずれか1つに記載の方法。
36.蛍光タンパク質が、TagCFP、mTagCFP2、Czurite、ECFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3C、mTurquoise、mTurquoise2、モノマーMidoriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、モノマーCzami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、モノマーKusabira-Orange、mKOκ、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mCpple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、およびiRFPから選択される、段落32から35のいずれか1つに記載の方法。
37.インテインが、スプリットインテインである、段落32から36のいずれか1つに記載の方法。
38.スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落37に記載の方法。
39.天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、段落38に記載の方法。
40.DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、段落39に記載の方法。
41.スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインである、段落40に記載の方法。
42.操作されたスプリットインテインが、DnaBインテインから操作される、段落41に記載の方法。
43.操作されたスプリットインテインが、SspDnaB S1インテインである、段落42に記載の方法。
44.操作されたスプリットインテインが、GyrBインテインから操作される、段落42に記載の方法。
45.操作されたスプリットインテインが、SspGyrB S11インテインである、段落44に記載の方法。
46.第1および/または第2の分子が、タンパク質である、段落32から45のいずれか1つに記載の方法。
47.第1および/または第2の分子が、非コーディングリボ核酸(RNA)である、段落32から46のいずれか1つに記載の方法。
48.非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、または短いヘアピンRNA(shRNA)である、段落47に記載の方法。
49.第1および/または第2のベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落32から48のいずれか1つに記載の方法。
50.真核生物細胞に、
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、egfp遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)egfp遺伝子のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子を含む、第2のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、egfp遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、egfp遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長EGFPタンパク質を産生する、方法。
51.egfp遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号5のアミノ酸1~175によって特定されるアミノ酸配列を含み、egfp遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号5のアミノ酸175~239によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落50に記載の方法。
52.インテインのN末端断片が、配列番号16によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号17によって特定される、
インテインのN末端断片が、配列番号7によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号8によって特定される、または
インテインのN末端断片が、配列番号18もしくは配列番号9によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号19もしくは配列番号10によって特定される、段落50または51に記載の方法。
53.真核生物細胞に、
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、mScarlet遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)mScarlet遺伝子のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子を含む、第2のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長mScarletタンパク質を産生する、方法。
54.mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~46によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸47~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、
mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~48によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸49~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、
mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~51によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸52~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、
mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~75によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸76~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、
mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~122によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸123~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、
mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~140によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸141~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、
mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~163によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸164~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落53に記載の方法。
55.インテインのN末端断片が、配列番号16によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号17によって特定される、
インテインのN末端断片が、配列番号7によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号8によって特定される、または
インテインのN末端断片が、配列番号18もしくは配列番号9によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号19もしくは配列番号10によって特定される、段落53または54に記載の方法。
56.(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(i)抗生物質耐性タンパク質のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のN末端断片およびC末端断片の結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、真核生物細胞。
57.真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落56に記載の細胞。
58.抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、G418、ピューロマイシン、フレオマイシンD1、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落56または57に記載の細胞。
59.インテインが、スプリットインテインである、段落56から58のいずれか1つに記載の細胞。
60.スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落59に記載の細胞。
61.天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、段落60に記載の細胞。
62.DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、段落61に記載の細胞。
63.スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインである、段落59に記載の細胞。
64.操作されたスプリットインテインが、DnaBインテインから操作される、段落63に記載の細胞。
65.操作されたスプリットインテインが、SspDnaB S1インテインである、段落64に記載の細胞。
66.操作されたスプリットインテインが、GyrBインテインから操作される、段落65に記載の細胞。
67.操作されたスプリットインテインが、SspGyrB S11インテインである、段落66に記載の細胞。
68.第1および/または第2の分子が、タンパク質である、段落56から67のいずれか1つに記載の細胞。
69.第1および/または第2の分子が、非コーディングリボ核酸(RNA)である、段落56から68のいずれか1つに記載の細胞。
70.非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、または短いヘアピンRNA(shRNA)である、段落69に記載の細胞。
71.第1および/または第2のベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落56から70のいずれか1つに記載の細胞。
72.(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、hygB遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)hygB遺伝子のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子を含む、第2のベクターとを含む細胞であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼを産生する、細胞。
73.第2のhygB遺伝子断片によってコードされるタンパク質断片の最初のアミノ酸が、システインである、段落72に記載の細胞。
74.hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸1~89によって特定されるアミノ酸配列を含み、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸90~341によって特定されるアミノ酸配列を含む、
hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸1~200によって特定されるアミノ酸配列を含み、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸201~341によって特定されるアミノ酸配列を含む、
hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸1~53によって特定されるアミノ酸配列を含み、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸54~341によって特定されるアミノ酸配列を含む、
hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸1~240によって特定されるアミノ酸配列を含み、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸241~341によって特定されるアミノ酸配列を含む、
hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸1~292によって特定されるアミノ酸配列を含み、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸293~341によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落73に記載の細胞。
75.インテインのN末端断片が、配列番号16によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号17によって特定される、
インテインのN末端断片が、配列番号7によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号8によって特定される、または
インテインのN末端断片が、配列番号18もしくは配列番号9によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号19もしくは配列番号10によって特定される、段落72から74のいずれか1つに記載の細胞。
76.(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、bsr遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)bsr遺伝子のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子を含む、第2のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、bsr遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、bsr遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ブラストサイジン-Sデアミナーゼを産生する、真核生物細胞。
77.bsr遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号4のアミノ酸1~102によって特定されるアミノ酸配列を含み、bsr遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号4のアミノ酸103~140によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落76に記載の細胞。
78.インテインのN末端断片が、配列番号16によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号17によって特定される、
インテインのN末端断片が、配列番号7によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号8によって特定される、または
インテインのN末端断片が、配列番号18もしくは配列番号9によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号19もしくは配列番号10によって特定される、段落76または77に記載の細胞。
79.
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、pac遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)pac遺伝子のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子を含む、第2のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、pac遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、pac遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ピューロマイシンN-アセチル-トランスフェラーゼを産生する、真核生物細胞。
80.pac遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号2のアミノ酸1~63によって特定されるアミノ酸配列を含み、pac遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号2のアミノ酸64~199によって特定されるアミノ酸配列を含む、
pac遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号2のアミノ酸1~119によって特定されるアミノ酸配列を含み、pac遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号2のアミノ酸120~199によって特定されるアミノ酸配列を含む、
pac遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号2のアミノ酸1~100によって特定されるアミノ酸配列を含み、pac遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号2のアミノ酸101~199によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落79に記載の細胞。
81.インテインのN末端断片が、配列番号16によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号17によって特定される、
インテインのN末端断片が、配列番号7によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号8によって特定される、または
インテインのN末端断片が、配列番号18もしくは配列番号9によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号19もしくは配列番号10によって特定される、段落79または80に記載の細胞。
82.
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、neo遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)neo遺伝子のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子を含む、第2のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、neo遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、neo遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長アミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼを産生する、真核生物細胞。
83.neo遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号3のアミノ酸1~133によって特定されるアミノ酸配列を含み、neo遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号3のアミノ酸134~267によって特定されるアミノ酸配列を含む、または
neo遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号3のアミノ酸1~194によって特定されるアミノ酸配列を含み、neo遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号3のアミノ酸195~267によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落82に記載の細胞。
84.インテインのN末端断片が、配列番号16によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号17によって特定される、
インテインのN末端断片が、配列番号7によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号8によって特定される、または
インテインのN末端断片が、配列番号18もしくは配列番号9によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号19もしくは配列番号10によって特定される、段落82または83に記載の細胞。
85.
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)蛍光タンパク質のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、蛍光タンパク質のN末端断片の、蛍光タンパク質のC末端断片への結合を触媒して、全長蛍光タンパク質を産生する、真核生物細胞。
86.真核生物細胞を、第1および第2のベクターの真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、段落85に記載の細胞。
87.全長蛍光タンパク質を含むトランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、段落86に記載の細胞。
88.真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落85から87のいずれか1つに記載の細胞。
89.蛍光タンパク質が、TagCFP、mTagCFP2、Czurite、ECFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3C、mTurquoise、mTurquoise2、モノマーMidoriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、モノマーCzami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、モノマーKusabira-Orange、mKOκ、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mCpple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、およびiRFPから選択される、段落85から88のいずれか1つに記載の細胞。
90.インテインが、スプリットインテインである、段落85から89のいずれか1つに記載の細胞。
91.スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落90に記載の細胞。
92.天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、段落91に記載の細胞。
93.DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、段落92に記載の細胞。
94.スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインである、段落93に記載の細胞。
95.操作されたスプリットインテインが、DnaBインテインから操作される、段落94に記載の細胞。
96.操作されたスプリットインテインが、SspDnaB S1インテインである、段落95に記載の細胞。
97.操作されたスプリットインテインが、GyrBインテインから操作される、段落95に記載の細胞。
98.操作されたスプリットインテインが、SspGyrB S11インテインである、段落97に記載の細胞。
99.第1および/または第2の分子が、タンパク質である、段落85から98のいずれか1つに記載の細胞。
100.第1および/または第2の分子が、非コーディングリボ核酸(RNA)である、段落85から99のいずれか1つに記載の細胞。
101.非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、または短いヘアピンRNA(shRNA)である、段落100に記載の細胞。
102.第1および/または第2のベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落85から101のいずれか1つに記載の細胞。
103.
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、egfp遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)egfp遺伝子のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子を含む、第2のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、egfp遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、egfp遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長EGFPタンパク質を産生する、真核生物細胞。
104.egfp遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号5のアミノ酸1~175によって特定されるアミノ酸配列を含み、egfp遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号5のアミノ酸175~239によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落103に記載の細胞。
105.インテインのN末端断片が、配列番号16によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号17によって特定される、
インテインのN末端断片が、配列番号7によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号8によって特定される、または
インテインのN末端断片が、配列番号18もしくは配列番号9によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号19もしくは配列番号10によって特定される、段落103または104に記載の細胞。
106.
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、mScarlet遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子を含む、第1のベクターと、
(b)(ii)mScarlet遺伝子のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子を含む、第2のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長mScarletタンパク質を産生する、真核生物細胞。
107.mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~46によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸47~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、
mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~48によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸49~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、
mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~51によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸52~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、
mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~75によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸76~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、
mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~122によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸123~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、
mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~140によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸141~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、
mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸1~163によって特定されるアミノ酸配列を含み、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号6のアミノ酸164~232によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落106に記載の細胞。
108.インテインのN末端断片が、配列番号16によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号17によって特定される、
インテインのN末端断片が、配列番号7によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号8によって特定される、または
インテインのN末端断片が、配列番号18もしくは配列番号9によって特定され、インテインのC末端断片が、配列番号19もしくは配列番号10によって特定される、段落106または107に記載の細胞。
109.段落85から108のいずれか1つに記載の細胞を含む、組成物。
110.キットであって、
(a)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)抗生物質耐性タンパク質のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターとを含み、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のN末端断片およびC末端断片の結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、キット。
111.抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、G418、ピューロマイシン、フレオマイシンD1、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落110に記載のキット。
112.キットであって、
(a)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)蛍光タンパク質のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターとを含み、
インテインのN末端断片およびC末端断片が、蛍光タンパク質のN末端断片の、蛍光タンパク質のC末端断片への結合を触媒して、全長蛍光タンパク質を産生する、キット。
113.蛍光タンパク質が、TagCFP、mTagCFP2、Czurite、ECFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3C、mTurquoise、mTurquoise2、モノマーMidoriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、モノマーCzami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、モノマーKusabira-Orange、mKOκ、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mCpple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、およびiRFPから選択される、段落112に記載のキット。
114.インテインが、スプリットインテインである、段落110から113のいずれか1つに記載のキット。
115.スプリットインテインが、天然のスプリットインテインまたは操作されたスプリットインテインである、段落114に記載のキット。
116.天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、段落115に記載のキット。
117.DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、段落116に記載のキット。
118.操作されたスプリットインテインが、DnaBインテインまたはGyrBインテインから操作される、段落115に記載のキット。
119.操作されたスプリットインテインが、SspDnaB S1インテインである、段落118に記載のキット。
120.操作されたスプリットインテインが、SspGyrB S11インテインである、段落118に記載のキット。
121.以下の構成要素:緩衝液、塩、クローニング酵素、コンピテント細胞、トランスフェクション試薬、抗生物質、および/または本明細書に記載される方法を実行するための説明書のうちのいずれか1つまたは複数をさらに含む、段落112から120のいずれか1つに記載のキット。
122.真核生物細胞に、
(a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、
(c)(i)抗生物質耐性タンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターと
を送達することを含む方法であって、
第1のインテインのN末端断片およびC末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のN末端断片の、抗生物質耐性タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第2のインテインのN末端断片およびC末端断片が、抗生物質耐性タンパク質の中央断片の、抗生物質耐性タンパク質のC末端断片への結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、方法。
123.真核生物細胞を、第1、第2、および第3のベクターの真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、段落112に記載の方法。
124.全長抗生物質耐性タンパク質を含むトランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、段落123に記載の方法。
125.真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落112から124のいずれか1つに記載の方法。
126.抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、G418、ピューロマイシン、フレオマイシンD1、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落112から125のいずれか1つに記載の方法。
127.抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する、段落126に記載の方法。
128.第1のインテインが、スプリットインテインである、段落112から127のいずれか1つに記載の方法。
129.第2のインテインが、スプリットインテインである、段落112から128のいずれか1つに記載の方法。
130.スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落128または129に記載の方法。
131.天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、段落130に記載の方法。
132.DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、段落131に記載の方法。
133.第1のインテインが、NpuDnaEインテインであり、第2のインテインが、NpuDnaEインテインである、段落132に記載の方法。
134.第1の目的の分子、第2の目的の分子、第3の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、タンパク質である、段落112から133のいずれか1つに記載の方法。
135.第1の目的の分子、第2の目的の分子、第3の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、非コーディングリボ核酸(RNA)である、段落112から133のいずれか1つに記載の方法。
136.非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、または短いヘアピンRNA(shRNA)である、段落135に記載の方法。
137.第1のベクター、第2のベクター、第3のベクター、またはこれらの任意の組合せが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落112から136のいずれか1つに記載の方法。
138.真核生物細胞に、
(a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、hygB遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、hygB遺伝子の中央断片の上流にある、第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、
(c)(i)hygB遺伝子のC末端断片の上流にある、第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターと
を送達することを含む方法であって、
第1のインテインのN末端断片およびC末端断片が、hygB遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、hygB遺伝子の中央断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒し、第2のインテインのN末端断片およびC末端断片が、hygB遺伝子の中央断片によってコードされるタンパク質断片の、hygB遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼを産生する、方法。
139.第1のベクターが、配列番号29によって特定される配列をコードし、第2のベクターが、配列番号61によって特定される配列をコードし、第3のベクターが、配列番号23によって特定される配列をコードする、段落138に記載の方法。
140.第1のベクターが、配列番号21によって特定される配列をコードし、第2のベクターが、配列番号61によって特定される配列をコードし、第3のベクターが、配列番号35によって特定される配列をコードする、段落138に記載の方法。
141.
(a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、
(c)(i)抗生物質耐性タンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
第1のインテインのN末端断片およびC末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のN末端断片の、抗生物質耐性タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第2のインテインのN末端断片およびC末端断片が、抗生物質耐性タンパク質の中央断片の、抗生物質耐性タンパク質のC末端断片への結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、真核生物細胞。
142.哺乳動物細胞である、段落112に記載の真核生物細胞。
143.抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、G418、ピューロマイシン、フレオマイシンD1、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落141または142に記載の真核生物細胞。
144.抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する、段落143に記載の真核生物細胞。
145.第1のインテインが、スプリットインテインである、段落141から144のいずれか1つに記載の真核生物細胞。
146.第2のインテインが、スプリットインテインである、段落142から145のいずれか1つに記載の真核生物細胞。
147.スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落145または146に記載の真核生物細胞。
148.天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、段落147に記載の真核生物細胞。
149.DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、段落148に記載の真核生物細胞。
150.第1のインテインが、NpuDnaEインテインであり、第2のインテインが、NpuDnaEインテインである、段落149に記載の真核生物細胞。
151.第1の目的の分子、第2の目的の分子、第3の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、タンパク質である、段落142から150のいずれか1つに記載の真核生物細胞。
152.第1の目的の分子、第2の目的の分子、第3の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、非コーディングリボ核酸(RNA)である、段落142から150のいずれか1つに記載の真核生物細胞。
153.非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、または短いヘアピンRNA(shRNA)である、段落152に記載の真核生物細胞。
154.第1のベクター、第2のベクター、第3のベクター、またはこれらの任意の組合せが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落142から153のいずれか1つに記載の真核生物細胞。
155.段落142から154のいずれか1つに記載の真核生物細胞を含む、組成物。
156.キットであって、
(a)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、
(c)抗生物質耐性タンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターとを含み、
第1のインテインのN末端断片およびC末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のN末端断片の、抗生物質耐性タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第2のインテインのN末端断片およびC末端断片が、抗生物質耐性タンパク質の中央断片の、抗生物質耐性タンパク質のC末端断片への結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、キット。
157.抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、G418、ピューロマイシン、フレオマイシンD1、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落156に記載のキット。
158.抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する、段落157に記載のキット。
159.第1のインテインが、スプリットインテインである、段落156から158のいずれか1つに記載のキット。
160.第2のインテインが、スプリットインテインである、段落156から159のいずれか1つに記載のキット。
161.スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落159または160に記載のキット。
162.天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、段落161に記載のキット。
163.DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、段落162に記載のキット。
164.第1のインテインが、NpuDnaEインテインであり、第2のインテインが、NpuDnaEインテインである、段落163に記載のキット。
165.第1の目的の分子、第2の目的の分子、第3の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、タンパク質である、段落156から164のいずれか1つに記載のキット。
166.第1の目的の分子、第2の目的の分子、第3の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、非コーディングリボ核酸(RNA)である、段落156から164のいずれか1つに記載のキット。
167.非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、または短いヘアピンRNA(shRNA)である、段落166に記載のキット。
168.第1のベクター、第2のベクター、第3のベクター、またはこれらの任意の組合せが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落156から167のいずれか1つに記載のキット。
169.真核生物細胞に、
(a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、
(c)(i)蛍光タンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターと
を送達することを含む方法であって、
第1のインテインのN末端断片およびC末端断片が、蛍光タンパク質のN末端断片の、蛍光タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第2のインテインのN末端断片およびC末端断片が、蛍光タンパク質の中央断片の、蛍光タンパク質のC末端断片への結合を触媒して、全長蛍光タンパク質を産生する、方法。
170.真核生物細胞を、第1、第2、および第3のベクターの真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、段落169に記載の方法。
171.全長蛍光タンパク質を含むトランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、段落170に記載の方法。
172.真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落169から171のいずれか1つに記載の方法。
173.蛍光タンパク質が、TagCFP、mTagCFP2、Czurite、ECFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3C、mTurquoise、mTurquoise2、モノマーMidoriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、モノマーCzami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、モノマーKusabira-Orange、mKOκ、mScarlet、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mCpple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、およびiRFPから選択される、段落169から172のいずれか1つに記載の方法。
174.蛍光タンパク質が、mScarletである、段落173に記載の方法。
175.第1のインテインが、スプリットインテインである、段落169から174のいずれか1つに記載の方法。
176.第2のインテインが、スプリットインテインである、段落169から175のいずれか1つに記載の方法。
177.スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落175または176に記載の方法。
178.天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、段落177に記載の方法。
179.DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、段落178に記載の方法。
180.第1のインテインが、NpuDnaEインテインであり、第2のインテインが、NpuDnaEインテインである、段落179に記載の方法。
181.第1の目的の分子、第2の目的の分子、第3の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、タンパク質である、段落169から170のいずれか1つに記載の方法。
182.第1の目的の分子、第2の目的の分子、第3の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、非コーディングリボ核酸(RNA)である、段落169から180のいずれか1つに記載の方法。
183.非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、または短いヘアピンRNA(shRNA)である、段落182に記載の方法。
184.第1のベクター、第2のベクター、第3のベクター、またはこれらの任意の組合せが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落169から183のいずれか1つに記載の方法。
185.真核生物細胞に、
(a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、mScarlet遺伝子のN末端断片、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、mScarlet遺伝子の中央断片の上流にある、第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、
(c)(i)mScarlet遺伝子のC末端断片の上流にある、第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターと
を送達することを含む方法であって、
第1のインテインのN末端断片およびC末端断片が、mScarlet遺伝子のN末端断片によってコードされるタンパク質断片の、mScarlet遺伝子の中央断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒し、第2のインテインのN末端断片およびC末端断片が、mScarlet遺伝子の中央断片によってコードされるタンパク質断片の、mScarlet遺伝子のC末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長mScarletタンパク質を産生する、方法。
186.第1のベクターが、配列番号121によって特定される配列をコードし、第2のベクターが、配列番号123によって特定される配列をコードし、第3のベクターが、配列番号125によって特定される配列をコードする、段落185に記載の方法。
187.
(a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、
(c)(i)蛍光タンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
第1のインテインのN末端断片およびC末端断片が、蛍光タンパク質のN末端断片の、蛍光タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第2のインテインのN末端断片およびC末端断片が、蛍光タンパク質の中央断片の、蛍光タンパク質のC末端断片への結合を触媒して、全長蛍光タンパク質を産生する、真核生物細胞。
188.哺乳動物細胞である、段落187に記載の真核生物細胞。
189.蛍光タンパク質が、TagCFP、mTagCFP2、Czurite、ECFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3C、mTurquoise、mTurquoise2、モノマーMidoriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、モノマーCzami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、モノマーKusabira-Orange、mKOκ、mScarlet、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mCpple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、およびiRFPから選択される、段落187または188に記載の真核生物細胞。
190.蛍光タンパク質が、mScarletである、段落189に記載の真核生物細胞。
191.第1のインテインが、スプリットインテインである、段落187から190のいずれか1つに記載の真核生物細胞。
192.第2のインテインが、スプリットインテインである、段落185から191のいずれか1つに記載の真核生物細胞。
193.スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落191または192に記載の真核生物細胞。
194.天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、段落193に記載の真核生物細胞。
195.DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、段落194に記載の真核生物細胞。
196.第1のインテインが、NpuDnaEインテインであり、第2のインテインが、NpuDnaEインテインである、段落195に記載の真核生物細胞。
197.第1の目的の分子、第2の目的の分子、第3の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、タンパク質である、段落185から196のいずれか1つに記載の真核生物細胞。
198.第1の目的の分子、第2の目的の分子、第3の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、非コーディングリボ核酸(RNA)である、段落185から196のいずれか1つに記載の真核生物細胞。
199.非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、または短いヘアピンRNA(shRNA)である、段落198に記載の真核生物細胞。
200.第1のベクター、第2のベクター、第3のベクター、またはこれらの任意の組合せが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落185から199のいずれか1つに記載の真核生物細胞。
201.段落185から200のいずれか1つに記載の真核生物細胞を含む、組成物。
202.キットであって、
(a)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、
(c)蛍光タンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターとを含み、
第1のインテインのN末端断片およびC末端断片が、蛍光タンパク質のN末端断片の、蛍光タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第2のインテインのN末端断片およびC末端断片が、蛍光タンパク質の中央断片の、蛍光タンパク質のC末端断片への結合を触媒して、全長蛍光タンパク質を産生する、キット。
203.蛍光タンパク質が、TagCFP、mTagCFP2、Czurite、ECFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3C、mTurquoise、mTurquoise2、モノマーMidoriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、モノマーCzami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、モノマーKusabira-Orange、mKOκ、mScarlet、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mCpple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、およびiRFPから選択される、段落202に記載のキット。
204.蛍光タンパク質が、mScarletである、段落203に記載のキット。
205.第1のインテインが、スプリットインテインである、段落202から204のいずれか1つに記載のキット。
206.第2のインテインが、スプリットインテインである、段落202から205のいずれか1つに記載のキット。
207.スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落206に記載のキット。
208.天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、段落207に記載のキット。
209.DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、段落208に記載のキット。
210.第1のインテインが、NpuDnaEインテインであり、第2のインテインが、NpuDnaEインテインである、段落209に記載のキット。
211.第1の目的の分子、第2の目的の分子、第3の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、タンパク質である、段落202から210のいずれか1つに記載のキット。
212.第1の目的の分子、第2の目的の分子、第3の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、非コーディングリボ核酸(RNA)である、段落202から210のいずれか1つに記載のキット。
213.非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、または短いヘアピンRNA(shRNA)である、段落212に記載のキット。
214.第1のベクター、第2のベクター、第3のベクター、またはこれらの任意の組合せが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落202から213のいずれか1つに記載のキット。
215.以下の構成要素:緩衝液、塩、クローニング酵素、コンピテント細胞、トランスフェクション試薬、抗生物質、および/または本明細書に記載される方法を実行するための説明書のうちのいずれか1つまたは複数をさらに含む、段落202から214のいずれか1つに記載のキット。
216.トランスジェニック選択方法であって、真核生物細胞を含む組成物に、(a)(i)N末端インテインタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列の上流の、第1の選択可能マーカータンパク質断片(たとえば、抗生物質耐性タンパク質断片または蛍光タンパク質断片)をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、(b)(i)第2の選択可能マーカータンパク質断片(たとえば、抗生物質耐性タンパク質断片または蛍光タンパク質断片)の上流の、C末端インテインタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターとを送達することを含み、N末端インテインタンパク質断片およびC末端インテインタンパク質断片が、第1の選択可能マーカータンパク質断片の、第2の選択可能マーカータンパク質断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、トランスジェニック選択方法。
217.トランスジェニック選択方法であって、真核生物細胞に、(a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質(たとえば、抗生物質耐性タンパク質または蛍光タンパク質)のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、(c)(i)選択可能マーカータンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターとを送達することを含み、第1のインテインのN末端断片およびC末端断片が、選択可能マーカータンパク質のN末端断片の、選択可能マーカータンパク質の中央断片への結合を触媒し、第2のインテインのN末端断片およびC末端断片が、選択可能マーカータンパク質の中央断片の、選択可能マーカータンパク質のC末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、トランスジェニック選択方法。
218.トランスジェニック選択方法であって、真核生物細胞に、(a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質(たとえば、抗生物質耐性タンパク質または蛍光タンパク質)のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質の第1の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、(c)(i)第3のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質の第2の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターと、(d)(i)選択可能マーカータンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第3のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第4のベクターとを送達することを含み、第1のインテインのN末端断片およびC末端断片が、選択可能マーカータンパク質のN末端断片の、選択可能マーカータンパク質の第1の中央断片への結合を触媒し、第2のインテインのN末端断片およびC末端断片が、選択可能マーカータンパク質の第1の中央断片の、選択可能マーカータンパク質の第2の中央断片への結合を触媒し、第3のインテインのN末端断片およびC末端断片が、選択可能マーカータンパク質の第2の中央断片の、選択可能マーカータンパク質のC末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、トランスジェニック選択方法。
219.真核生物細胞を、ベクターの真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、段落216から218のいずれか1つに記載の方法。
220.全長選択可能マーカータンパク質を含むトランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、段落219に記載の方法。
221.真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落216から220のいずれか1つに記載の方法。
222.抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、G418、ピューロマイシン、フレオマイシンD1、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落216から221のいずれか1つに記載の方法。
223.インテインが、スプリットインテインである、段落216から222のいずれか1つに記載の方法。
224.スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落223に記載の方法。
225.天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、段落224に記載の方法。
226.DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、段落225に記載の方法。
227.スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインである、段落223に記載の方法。
228.操作されたスプリットインテインが、DnaBインテインから操作される、段落2278に記載の方法。
229.操作されたスプリットインテインが、SspDnaB S1インテインである、段落228に記載の方法。
230.操作されたスプリットインテインが、GyrBインテインから操作される、段落229に記載の方法。
231.操作されたスプリットインテインが、SspGyrB S11インテインである、段落230に記載の方法。
232.分子が、タンパク質から選択される、段落216から231のいずれか1つに記載の方法。
233.分子が、非コーディングリボ核酸(RNA)から選択される、段落216から231のいずれか1つに記載の方法。
234.非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、および短いヘアピンRNA(shRNA)から選択される、段落233に記載の方法。
235.ベクターが、プラスミドベクターおよびウイルスベクターから選択される、段落216から234のいずれか1つに記載の方法。
(実施例1)
抗生物質耐性マーカー
Gateway適合性レンチウイルスベクター
Intresマーカーの採用を促進するために、本発明者らは、導入遺伝子の便宜的な制限-ライゲーション非依存性LRクロナーゼ組換えのためのGateway適合性レンチウイルスベクターを作製した8(図7A)。TagBPF2およびmCherryを、それぞれ、N-およびC-Intresベクターに組み換えることによって、これらのベクターの機能性を試験し、二重トランスジェニック細胞の強固な選択が見出された(図7B)。Intresベクターの1つの有望な有用性は、異なる蛍光マーカーを細胞に組み入れて、異なる細胞内コンパートメントを標識することである。そのような有用性を探究するために、それぞれ、核およびF-アクチンを標識するNLS-GFPおよびLifeAct-mScarlet 9を、従来的な全長(FL)のスプリットされていないハイグロマイシン選択可能ベクターまたは2マーカートロンのハイグロマイシンIntresベクターへのGateway組換えによってクローニングし、細胞に、いずれかのプラスミドセットを形質導入し、続いて、抗生物質による選択を行った(図7C)。スプリットされていない選択可能プラスミドを形質導入した試料は、単一に標識された細胞および二重に標識された細胞の両方を含んでいたが、一方で、Intresプラスミドを形質導入した細胞は、すべてが二重に標識されていた(図7C)。
蛍光マーカー
スプリットされた蛍光マーカーを、導入遺伝子の選択に使用することができるかどうかを試験するために、mScarlet蛍光タンパク質についてNpuDnaEスプリット点をスクリーニングし(図8A)、非ゲーティング集団における20%未満の二重トランスジェニック細胞と比較して、96%を上回る二重トランスジェニック細胞の富化を可能にする4つのスプリット点、および60%を上回る二重トランスジェニック細胞の富化を可能にする3つの他のスプリット点を特定した(図8B)。
より高度なスプリットマーカー
2マーカートロンのIntres遺伝子に関して特定されたスプリット点を用いて、本発明者らは、より高度なスプリットマーカーの操作に着手した。2つを上回る「連結されていない」導入遺伝子を1つの抗生物質で同時に選択することを可能にするために、マーカー遺伝子を3つまたはそれを上回るマーカートロンに分割するスプリット点の組合せを試験した(図9A~9B)。そのような「Intres連鎖」を可能にするスプリット点の対を特定するために、3つにスプリットされたマーカートロンを、それぞれが、3つの蛍光導入遺伝子TagBFP2、EGFP、またはmCherryのうちの1つを有する、3つのレンチウイルスベクターにクローニングし、これにより、フローサイトメトリーによって選択の有効性を評価することが可能となる(図9C)。ハイグロマイシン耐性遺伝子がもっとも長く、試験のためのスプリット点をもっとも多く提供するため、3マーカートロンのハイグロマイシンIntresを操作することに焦点を当てた。3マーカートロンのハイグロマイシンIntres 2つを、2つの介在NpuDnaEインテインを使用して試験し、第1のインテインにNpuDnaEおよび第2のインテインにSspDnaBを使用して2つを試験し、ならびに第1のインテインにSspDnaBおよび第2のインテインにNpuDnaEを使用して2つを試験した(図9D)。非選択培養物での15%未満の三重トランスジェニック細胞と比較して、ハイグロマイシン選択培養物では、これらの6つの3マーカートロンのハイグロマイシンIntresのうちの5つが、97%を上回る三重トランスジェニック選択を可能にし、残りの1つが80%の三重トランスジェニック選択を可能にした。1個抜きの形質導入を行った試料は、ハイグロマイシン選択後にいずれの生存細胞も得られず、一方でスプリットされていないハイグロマイシンベクターを形質導入した細胞では、選択後にたった7%の三重トランスジェニック細胞しか得られなかった。
AAVS1遺伝子座における両アレルノックイン
CRISPR/Casは、近年、ゲノム操作および編集の強力な技術として出現した。NHEJに媒介される挿入/欠失(インデル)に基づく遺伝子ノックアウトは、高い頻度で発生するが、外因性修復鋳型(標的化構築物としても公知である)を使用した相同組換え修復(HDR)に基づく正確な編集およびノックインは、不十分である。本発明者らは、スプリットされた選択可能マーカーを、AAVS1遺伝子座における両アレルノックインを有する細胞の富化に使用することができるかどうかを試験した。マーカートロンを宿主遺伝子PPP1R12Cのイントロン1内に捕捉するために、標的部位に隣接する相同性アーム、およびスプライシングアクセプター-2Aペプチドを有する標的化構築物を構築した。しかしながら、これらの標的化構築物を使用したCRISPR/Casノックイン実験および2週間の抗生物質による選択後に、いずれの生存細胞も得られなかった(データは示されない)。本発明者らは、宿主遺伝子PPP1R12Cの内在性プロモーターが、抗生物質の作用に対抗するのに十分な抗生物質耐性タンパク質を再構成するためのマーカートロンの十分な発現を作動させなかった可能性があると疑った。したがって、活性をドキシサイクリン(dox)濃度によって滴定することができるTetOプロモーターによって、Intresマーカートロンを発現させる代替的な戦略を試験した。Intresにより媒介される両アレル選択と、全長(FL)のスプリットされていない選択可能マーカーとの比較を可能にするために、複数の異なる標的化構築物設計を実装した。まず、全長(FL)耐性遺伝子(たとえば、Hygro)を、構成的EF1aプロモーター下においてrtTAと一緒に発現させ、dox誘導性TetOプロモーター下において別個の試験Intres(たとえば、Blast Intres)を発現させる(図12B、プラスミド109および110)。これにより、同じ構築物内で、全長およびスプリットされた選択可能マーカーの比較が可能となる。同じTetOプロモーターによって作動される全長マーカーとスプリットされたマーカーとの公平な比較を可能にするために、2つの類似のプラスミド107および108(プラスミド109および110を参照)を構築し、ここで、全長抗生物質耐性遺伝子(Blast)を、TetOプロモーターの下流に置く(図12A)。両アレル標的化の単一細胞定量を可能にするため、および2つの導入遺伝子を2つのAAVS1アレルに組み込むことの実行可能性を示すために、EGFPおよびmScarlet蛍光遺伝子を、自己切断型2Aペプチドを介して、試験するスプリットされたマーカーまたはスプリットされていないマーカーの下流に付加した。同様に、Hygro Intresを試験するために、EF1aおよびTetOにより作動されるマーカーを入れ換え、FL HygroまたはHygro Intresを、TetOの下流に置き、FL BlastをEF1aの下流に置いた(図12C~12D、プラスミド111~114)。Cas9およびAAVS1を標的とするsgRNAを含むpX330-AAVS1(プラスミド106)と、異なる標的化構築物対とを、HEK293T細胞にコトランスフェクトし、次の継代で、抗生物質なし、ブラストサイジンあり、またはハイグロマイシンありで、三連のドキシサイクリン含有培地に分けた。選択の2週間後に、本発明者らは、GFPおよびRFP蛍光のフローサイトメトリー測定によって、両アレル標的化に関して、培養物を分析した(図12E)。予測した通り、非選択培養物は、ごく僅かな(1%未満)両アレルノックインGFP+/RFP+細胞を有した(図12E、選択=なし)。対応するFL抗生物質耐性遺伝子が標的化構築物に存在する場合の抗生物質による選択では、30%未満の両アレルノックイン細胞が得られた(図12E、Blast:TC a、c、d;Hygro:TC a、b、c)。対照的に、対応するIntresが標的化構築物に存在する場合の抗生物質による選択では、75%(図6e、Blast Intres:TC b)および88%(図6e、Hygro Intres:TC d)の両アレルノックイン細胞が得られた。
クローニング
それぞれのマーカートロンの試験プラスミドを生成するために、まず、そのORFを含むGatewayドナープラスミドを生成し、次いで、ピューロマイシン耐性遺伝子を除去しGatewayカセットの下流にIRES-蛍光遺伝子を挿入することによってpLX302(addgene.org/25896/)から導出した、TagBFP2(プラスミド94:pLX-DEST-IRES-TagBFP2)、EGFP(プラスミド95:pLX-DEST-IRES-EGFP)、またはmCherry(プラスミド96:pLX-DEST-IRES-mCherry)レポーターを有するレンチウイルスデスティネーションベクターへと組み換えた。マーカートロン-ORF Gatewayドナープラスミドを、インテインを選択可能マーカーの断片のコーディング配列と組み合わせた後に、配列およびライゲーション独立クローニング(SLIC)(Li, M.Z. & Elledge, S.J. SLIC: a method for sequence-and ligation-independent cloning. Gene Synthesis: Methods and Protocols, 51-59 (2012))によりpCR8-GW-TOPOプラスミドに挿入するネスト融合PCR手順によって、または選択可能マーカーの関連する断片をPCR増幅した後に、SLICによりインテインを含む「足場」プラスミド(プラスミド27~32)に挿入することによってのいずれかで、生成した。インテインをコードするDNA配列を、Homo sapiensのためにコドン最適化し、GBlock(IDT)として合成し、AC1947GBは、NpuDnaEインテインをコードし、AC1949GBは、SspDnaBインテインをコードする。選択可能マーカー断片を、これらのマーカーを含むプラスミドから増幅した。プラスミドについては、表1を参照されたい。
すべての細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)(Lonza)、4%Glutamax(Gibco)、1%ピルビン酸ナトリウム(Gibco)、およびペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Sigma)において培養した。インキュベーター条件は、37℃および5%CO2であった。
pLP1、pLP2、およびVSV-Gのウイルスパッケージングミックスを、Lipofectamine 3000を使用して、それぞれのレンチウイルスベクターとともに、前日に6ウェルプレートにおいて1ウェル当たり1.2×106個の細胞の濃度で播種したLenti-X 293T細胞(ClonTech)にコトランスフェクトした。培地を、トランスフェクションの6時間後に交換し、次いで、一晩インキュベートした。トランスフェクションの28時間後に、ウイルスを含有する培地上清を、45uM PESフィルターを使用して濾過した後、使用するまで、-80℃で保管した。
形質導入の前日に、標的細胞(HEK293T、MCF7、U2-OS)を、12ウェルプレートに、1ウェル当たり1.5×105個の細胞の密度で、播種した。形質導入の前に、培地を、1ウェル当たり1mLの、10μg/mLポリブレンを含有する培地に交換した。それぞれ250μLのウイルス(2つのウイルスを添加した実験試料については、合計500μL)を、それぞれのウェルに添加し、一晩インキュベートした。培地を、感染の24時間後に交換した。感染の4日後に、細胞を、二連のプレートに分けた。感染の5日後に、抗生物質(ハイグロマイシン)を有する培地を、1つの複製プレートのそれぞれのウェルに添加した(他方は、選択なし下で維持した)。抗生物質による選択を2週間継続した後、FACSで分析した。
細胞に、トリプシン処理を行い、培地中に懸濁させた後、HP Z230ワークステーションにおいて、FACSDiVaソフトウェア、バージョン8を使用して、LSRFortessa X-20(BD Bioscience)フローサイトメーターで分析した。5万個の事象が、それぞれの実行で収集された。
構築物および配列
タンパク質=Hygro(1-89)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号20)
アミノ酸配列(配列番号21)
プラスミド4:pLX-NpuDnaE(C)-Hygro(90-341)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Hygro(90-341)
ベクター配列(配列番号22)
アミノ酸配列(配列番号23)
プラスミド5:pLX-Hygro(1-200)-SspDnaB(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Hygro(1-200)-SspDnaB(N)
ベクター配列(配列番号24)
アミノ酸配列(配列番号25)
プラスミド6:pLX-SspDnaB(C)-Hygro(201-341)-IRES-mCherry
タンパク質=SspDnaB(C)-Hygro(201-341)
ベクター配列(配列番号26)
アミノ酸配列(配列番号27)
プラスミド7:pLX-Hygro(1-52)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Hygro(1-52)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号28)
アミノ酸配列(配列番号29)
プラスミド8:pLX-NpuDnaE(C)-Hygro(53-341)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Hygro(53-341)
ベクター配列(配列番号30)
アミノ酸配列(配列番号31)
プラスミド9:pLX-Hygro(1-240)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Hygro(1-240)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号32)
アミノ酸配列(配列番号33)
プラスミド10:pLX-NpuDnaE(C)-Hygro(241-341)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Hygro(241-341)
ベクター配列(配列番号34)
アミノ酸配列(配列番号35)
プラスミド11:pLX-Hygro(1-292)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Hygro(1-292)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号36)
アミノ酸配列(配列番号37)
プラスミド12:pLX-NpuDnaE(C)-Hygro(293-341)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Hygro(293-341)
ベクター配列(配列番号38)
アミノ酸配列(配列番号39)
プラスミド13:pLX-Blast(1-102)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Blast(1-102)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号40)
アミノ酸配列(配列番号41)
プラスミド14:pLX-NpuDnaE(C)-Blast(103-140)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Blast(103-140)
ベクター配列(配列番号42)
アミノ酸配列(配列番号43)
プラスミド17:pLX-Puro(1-119)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Puro(1-119)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号44)
アミノ酸配列(配列番号45)
プラスミド18:pLX-NpuDnaE(C)-Puro(insCys;120-199)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Puro(insCys;120-199)
ベクター配列(配列番号46)
アミノ酸配列(配列番号47)
プラスミド19:pLX-Puro(1-100)-SspDnaB(N-S0)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Puro(1-100)-SspDnaB(N-S0)
ベクター配列(配列番号48)
アミノ酸配列(配列番号49)
プラスミド20:pLX-SspDnaB(C-S0)-Puro(101-199)-IRES-mCherry
タンパク質=SspDnaB(C-S0)-Puro(101-199)
ベクター配列(配列番号50)
アミノ酸配列(配列番号51)
プラスミド21:pLX-Neo(1-133)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Neo(1-133)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号52)
アミノ酸配列(配列番号53)
プラスミド22:pLX-NpuDnaE(C)-Neo(134-267)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Neo(134-267)
ベクター配列(配列番号54)
アミノ酸配列(配列番号55)
プラスミド23:pLX-Neo(1-194)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Neo(1-194)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号56)
アミノ酸配列(配列番号57)
プラスミド24:pLX-NpuDnaE(C)-Neo(195-267)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Neo(195-267)
ベクター配列(配列番号58)
アミノ酸配列(配列番号59)
プラスミド25:pLX-NpuDnaE(C)_Hygro(53-89)-NpuDnaE(N)-IRES-GFP
タンパク質=NpuDnaE(C)_Hygro(53-89)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号60)
アミノ酸配列(配列番号61)
プラスミド26:pLX-NpuDnaE(C)_Hygro(53-239)-NpuDnaE(N)-IRES-GFP
タンパク質=NpuDnaE(C)_Hygro(53-239)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号62)
アミノ酸配列(配列番号63)
プラスミド27:pCR8-BsaI->ccdbCam<-BsaI-NpuDnaE(N)-MD1-68-15(配列番号64)
プラスミド28:pCR8-NpuDnaE(C)_BsaI->ccdbCam<-BsaI-MD1-68-18(配列番号65)
プラスミド29:pCR8-BsaI->ccdbCam<-BsaI-SspDnaE(N)-MD1-68-12(配列番号66)
プラスミド30:pCR8-SspDnaE(C)_BsaI->ccdbCam<-BsaI-MD1-68-13(配列番号67)
プラスミド31:pCR8-BsaI->ccdbCam<-BsaI-SspDnaB(N-S0)-25-135-18(配列番号68)
プラスミド32:pCR8-SspDnaB(C-S0)_BsaI->ccdbCam<-BsaI-25-155-41(配列番号69)
プラスミド33:pLX-mScarlet(1-46)-NpuDnaE(N)_LZA-IRES-TagBFP2
タンパク質=mScarlet(1-46)-NpuDnaE(N)_LZA
ベクター配列(配列番号70)
アミノ酸配列(配列番号71)
プラスミド34:pLX-LZB_NpuDnaE(C)-mScarlet(insCys;47-232)-IRES-TagBFP2
タンパク質=LZB_NpuDnaE(C)-mScarlet(insCys;47-232)
ベクター配列(配列番号72)
アミノ酸配列(配列番号73)
プラスミド35:pLX-mScarlet(1-48)-NpuDnaE(N)_LZA-IRES-TagBFP2
タンパク質=mScarlet(1-48)-NpuDnaE(N)_LZA
ベクター配列(配列番号74)
アミノ酸配列(配列番号75)
プラスミド36:pLX-LZB_NpuDnaE(C)-mScarlet(insCys;49-232)-IRES-GFP
タンパク質=LZB_NpuDnaE(C)-mScarlet(insCys;49-232)
ベクター配列(配列番号76)
アミノ酸配列(配列番号77)
プラスミド37:pLX-mScarlet(1-51)-NpuDnaE(N)_LZA -IRES-TagBFP2
タンパク質=mScarlet(1-51)-NpuDnaE(N)_LZA
ベクター配列(配列番号78)
アミノ酸配列(配列番号79)
プラスミド38:pLX-LZB_NpuDnaE(C)-mScarlet(insCys;52-232)-IRES-GFP
タンパク質=LZB_NpuDnaE(C)-mScarlet(insCys;52-232)
ベクター配列(配列番号80)
アミノ酸配列(配列番号81)
プラスミド39:pLX-mScarlet(1-75)-NpuDnaE(N)_LZA-IRES-TagBFP2
タンパク質=mScarlet(1-75)-NpuDnaE(N)_LZA
ベクター配列(配列番号82)
アミノ酸配列(配列番号83)
プラスミド40:pLX-LZB_NpuDnaE(C)-mScarlet(insCys;76-232)-IRES-GFP
タンパク質=LZB_NpuDnaE(C)-mScarlet(insCys;76-232)
ベクター配列(配列番号84)
アミノ酸配列(配列番号85)
プラスミド41:pLX-mScarlet(1-122)-NpuDnaE(N)_LZA-IRES-TagBFP2
タンパク質=mScarlet(1-122)-NpuDnaE(N)_LZA
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アミノ酸配列(配列番号87)
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プラスミド43:pLX-mScarlet(1-140)-NpuDnaE(N)_LZA-IRES-TagBFP2
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アミノ酸配列(配列番号91)
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アミノ酸配列(配列番号93)
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アミノ酸配列(配列番号95)
プラスミド46:pLX-LZB_NpuDnaE(C)-mScarlet(insCys;164-232)-IRES-GFP
タンパク質=LZB_NpuDnaE(C)-mScarlet(insCys;164-232)
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アミノ酸配列(配列番号99)
プラスミド48:pCR8-mCherry
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プラスミド51:pLX-[TagBFP2]-IRES-Hygro(1-89)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号106)
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プラスミド53:pLX-DEST-IRES-Puro(1-119)-NpuDnaE(N)
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プラスミド54:pLX-DEST-IRES-NpuDnaE(C)-Puro(120-199)
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アミノ酸配列(配列番号111)
プラスミド55:pLX-[TagBFP2]-IRES-Puro(1-119)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号112)
プラスミド56:pLX-[mCherry]-IRES-NpuDnaE(C)-Puro(120-199)
ベクター配列(配列番号113)
プラスミド57:pLX-DEST-IRES-Neo(1-194)-NpuDnaE(N)
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アミノ酸配列(配列番号115)
プラスミド58:pLX-DEST-IRES-NpuDnaE(C)-Neo(195-267)
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ベクター配列(配列番号116)
アミノ酸配列(配列番号117)
プラスミド59:pLX-[TagBFP2]-IRES-Neo(1-194)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号118)
プラスミド60:pLX-[mCherry]-IRES-NpuDnaE(C)-Neo(195-267)
ベクター配列(配列番号119)
プラスミド61:pLX-mScarlet(1-51)-NpuDnaE(N)-LZA-IRES-TagBFP2
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アミノ酸配列(配列番号121)
プラスミド62:pLX-LZB-NpuDnaE(C)-mScarlet(^C,52-163)-NpuDnaE(N)_LZA-IRES-EGFP
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ベクター配列(配列番号122)
アミノ酸配列(配列番号123)
プラスミド63:pLX-LZB-NpuDnaE(C)-mScarlet(^C;164-232)-IRES-EGFP
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アミノ酸配列(配列番号125)
プラスミド64:pLX-Hygro(1-69)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
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プラスミド65:pLX-NpuDnaE(C)-Hygro(^C;70-341)-IRES-mCherry
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アミノ酸配列(配列番号129)
プラスミド66:pLX-Hygro(1-131)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
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アミノ酸配列(配列番号131)
プラスミド67:pLX-NpuDnaE(C)-Hygro(^C;132-341)-IRES-mCherry
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ベクター配列(配列番号132)
アミノ酸配列(配列番号133)
プラスミド68:pLX-Hygro(1-171)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Hygro(1-171)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号134)
アミノ酸配列(配列番号135)
プラスミド69:pLX-NpuDnaE(C)-Hygro(^C;172-341)-IRES-mCherry
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ベクター配列(配列番号136)
アミノ酸配列(配列番号137)
プラスミド70:pLX-Hygro(1-218)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
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ベクター配列(配列番号138)
アミノ酸配列(配列番号139)
プラスミド71:pLX-NpuDnaE(C)-Hygro(^C;219-341)-IRES-mCherry
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ベクター配列(配列番号140)
アミノ酸配列(配列番号141)
プラスミド72:pLX-Hygro(1-259)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Hygro(1-259)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号142)
アミノ酸配列(配列番号143)
プラスミド73:pLX-NpuDnaE(C)-Hygro(^C;260-341)-IRES-mCherry
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ベクター配列(配列番号144)
アミノ酸配列(配列番号145)
プラスミド74:pLX-Hygro(1-277)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Hygro(1-277)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号146)
アミノ酸配列(配列番号147)
プラスミド75:pLX-NpuDnaE(C)-Hygro(^C;278-341)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Hygro(^C;278-341)
ベクター配列(配列番号148)
アミノ酸配列(配列番号149)
プラスミド76:pLX-Puro(1-32)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Puro(1-32)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号150)
アミノ酸配列(配列番号151)
プラスミド77:pLX-NpuDnaE(C)-Puro(^C;33-199)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Puro(^C;33-199)
ベクター配列(配列番号152)
アミノ酸配列(配列番号153)
プラスミド78:pLX-Puro(1-84)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Puro(1-84)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号154)
アミノ酸配列(配列番号155)
プラスミド79:pLX-NpuDnaE(C)-Puro(^C;85-199)-IRES-mCherry
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ベクター配列(配列番号156)
アミノ酸配列(配列番号157)
プラスミド80:pLX-Puro(1-137)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Puro(1-137)-NpuDnaE(N)
ファイル=pLX-[PuroKC3(N)-NpuDnaE(N)-25-131-29”]-IRES-TagBFP2-25-133-6
ベクター配列(配列番号158)
アミノ酸配列(配列番号159)
プラスミド81:pLX-NpuDnaE(C)-Puro(^C;138-199)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Puro(^C;138-199)
ベクター配列(配列番号160)
アミノ酸配列(配列番号161)
プラスミド82:pLX-Puro(1-158)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Puro(1-158)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号162)
アミノ酸配列(配列番号163)
プラスミド83:pLX-NpuDnaE(C)-Puro(^C;159-199)-IRES-mCherry
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ベクター配列(配列番号164)
アミノ酸配列(配列番号165)
プラスミド84:pLX-Puro(1-180)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Puro(1-180)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号166)
アミノ酸配列(配列番号167)
プラスミド85:pLX-NpuDnaE(C)-Puro(^C;181-199)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Puro(^C;181-199)
ベクター配列(配列番号168)
アミノ酸配列(配列番号169)
プラスミド86:pLX-Blast(1-58)-NpuDnaE(N)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Blast(1-58)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号170)
アミノ酸配列(配列番号171)
プラスミド87:pLX-NpuDnaE(C)-Blast(59-140)-IRES-mCherry
タンパク質=NpuDnaE(C)-Blast(59-140)
ベクター配列(配列番号172)
アミノ酸配列(配列番号173)
プラスミド88:pLX-NpuDnaE(C)-HygroBA-SspDnaB(N-S0)-IRES-EGFP
タンパク質=NpuDnaE(C)-Hygro(53-200)-SspDnaB(N-S0)
ベクター配列(配列番号174)
アミノ酸配列(配列番号175)
プラスミド89:pLX-SspDnaB(C-S0)-Hygro(201-341)-IRES-mCherry
タンパク質=SspDnaB(C-S0)-Hygro(201-341)
ベクター配列(配列番号176)
アミノ酸配列(配列番号177)
プラスミド90:pLX-NpuDnaE(C)-Hygro(90-200)-SspDnaB(N-S0)-IRES-EGFP
タンパク質=NpuDnaE(C)-Hygro(90-200)-SspDnaB(N-S0)
ベクター配列(配列番号178)
アミノ酸配列(配列番号179)
プラスミド91:pLX-Hygro(1-200)-SspDnaB(N-S0)-IRES-TagBFP2
タンパク質=Hygro(1-200)-SspDnaB(N-S0)
ベクター配列(配列番号180)
アミノ酸配列(配列番号181)
プラスミド92:pLX-SspDnaB(C-S0)-Hygro(201-240)-NpuDnaE(N)-IRES-EGFP
タンパク質=SspDnaB(C-S0)-Hygro(201-240)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号182)
アミノ酸配列(配列番号183)
プラスミド93:pLX-SspDnaB(C-S0)-Hygro(201-292)-NpuDnaE(N)-IRES-EGFP
タンパク質=SspDnaB(C-S0)-Hygro(201-292)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号184)
アミノ酸配列(配列番号185)
プラスミド94:pLX-DEST-IRES-TagBFP2(配列番号186)
プラスミド95:pLX-DEST-IRES-EGFP(配列番号187)
プラスミド96:pLX-DEST-IRES-mCherry(配列番号188)
プラスミド97:pLX-Hygro-IRES-TagBFP2
ベクター配列(配列番号189)
プラスミド98:pLX-Hygro-IRES-mCherry
ベクター配列(配列番号190)
プラスミド99:pLX-Puro-IRES-TagBFP2
ベクター配列(配列番号191)
プラスミド100:pLX-Puro-IRES-mCherry
ベクター配列(配列番号192)
プラスミド101:pLX-Hygro-IRES-EGFP
ベクター配列(配列番号193)
プラスミド102:pLX-NLS_GFP-IRES-Hygro
ベクター配列(配列番号194)
プラスミド103:pLX-LifeAct_mCherry-IRES-Hygro
ベクター配列(配列番号195)
プラスミド104:pLX-NLS_GFP-IRES-Hygro(1-89)-NpuDnaE(N)
ベクター配列(配列番号196)
プラスミド105:pLX-LifeAct_mScarlet-IRES- NpuDnaE(C)-Hygro(90-341)
ベクター配列(配列番号197)
プラスミド106:pX330-AAVS1
sgRNAスペーサー配列:gACCCCACAGTGGGGCCACTA(最初のgは、ゲノムと一致しない)(配列番号198)
ベクター配列(配列番号199)
プラスミド107:pAAVS1-Nst-EF1aHygro2ArtTA3(-)_TetO-Blast-P2A-EGFP
ベクター配列(配列番号200)
プラスミド108:pAAVS1-Nst-EF1aHygro2ArtTA3(-)_TetO-Blast-P2A-mScarlet
ベクター配列(配列番号201)
プラスミド109:pAAVS1-Nst-EF1aHygro2ArtTA3(-)_TetO-Blast(1-102)_NpuDnaE(N)-P2A-EGFP
ベクター配列(配列番号202)
プラスミド110:pAAVS1-Nst-EF1aHygro2ArtTA3(-)_TetO-NpuDnaE(C)_Blast(103-140)-P2A-mScarlet
ベクター配列(配列番号203)
プラスミド111:pAAVS1-Nst-EF1aBlast2ArtTA3(-)_TetO-Hygro-P2A-NTR-E2A-EGFP
ベクター配列(配列番号204)
プラスミド112:pAAVS1-Nst-EF1aBlast2ArtTA3(-)_TetO-Hygro-P2A-NTR-E2A-mCherry
ベクター配列(配列番号205)
プラスミド113:pAAVS1-Nst-EF1aBlast2ArtTA3(-)_TetO- Hygro(1-89)-NpuDnaE(N)-P2A-NTR-E2A-EGFP
ベクター配列(配列番号206)
プラスミド114:pAAVS1-Nst-EF1aBlast2ArtTA3(-)_TetO- NpuDnaE(C)-Hygro(90-341)-P2A-NTR-E2A-mCherry
ベクター配列(配列番号207)
プラスミド115:pLX-Hygro(1-89)_NpuDnaE(N)_LZA-IRES-TagBFP2
タンパク質=Hygro(1-89)-NpuDnaE(N)-LZA
ベクター配列(配列番号208)
アミノ酸配列(配列番号209)
プラスミド116:pLX-LZB_NpuDnaGEP(C)_Hygro(90-200)_SspDnaB(N-S0)-IRES-GFP
タンパク質=LZB-NpuDnaGEP(C)-Hygro(90-200)-SspDnaB(N-S0)
ベクター配列(配列番号210)
アミノ酸配列(配列番号211)
プラスミド117:pLX-SspDnaB(C-S0)_Hygro(201-240)_NpuDnaE(N)_LZA-IRES-GFP
タンパク質=SspDnaB(C-S0)-Hygro(201-240)-NpuDnaE(N)-LZA
ベクター配列(配列番号212)
アミノ酸配列(配列番号213)
プラスミド118:pLX-LZB_NpuDnaGEP(C)_Hygro(241-341)-IRES-mCherry
タンパク質=LZB-NpuDnaGEP(C)-Hygro(241-341)
ベクター配列(配列番号214)
アミノ酸配列(配列番号215)
AC1947GB(配列番号216)
AC1949GB(配列番号217)
pCR8-ccdbCam(配列番号218)
参考文献
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
真核生物細胞に、
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(i)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片の上流にある、前記インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと
を送達することを含む方法であって、
前記インテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の前記N末端断片および前記C末端断片の結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、方法。
(項目2)
前記真核生物細胞を、前記第1および第2のベクターの前記真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記全長選択可能マーカータンパク質を含む前記トランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、項目1から3のいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
前記選択可能マーカータンパク質が、抗生物質耐性タンパク質である、項目1から4のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
前記抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、G418、ピューロマイシン、フレオマイシンD1、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記抗生物質耐性タンパク質が、hygB遺伝子、bsr遺伝子、pac遺伝子、またはneo遺伝子によってコードされる、項目5または6に記載の方法。
(項目8)
前記選択可能マーカータンパク質が、蛍光タンパク質である、項目1から4のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記蛍光タンパク質が、TagCFP、mTagCFP2、Czurite、ECFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3C、mTurquoise、mTurquoise2、モノマーMidoriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、モノマーCzami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、モノマーKusabira-Orange、mKOκ、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mScarlet、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mCpple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、およびiRFPから選択される、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記インテインが、スプリットインテインである、項目1から9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記スプリットインテインが、天然のスプリットであり、必要に応じて、天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択され、必要に応じて、前記DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインであり、必要に応じて、前記操作されたスプリットインテインが、DnaBインテインまたはGyrBインテインから操作され、必要に応じて、前記操作されたスプリットインテインが、SspDnaB S1インテインまたはSspGyrB S11インテインである、項目10に記載の方法。
(項目13)
前記第1および/または第2の分子が、タンパク質または非コーディングリボ核酸(RNA)であり、必要に応じて、前記非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、または短いヘアピンRNA(shRNA)である、項目1から12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記第1および/または第2のベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、項目1から13のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
(a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(i)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片の上流にある、前記インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
前記インテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の前記N末端断片および前記C末端断片の結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、真核生物細胞。
(項目16)
キットであって、
(a)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片の上流にある、前記インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターとを含み、
前記インテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の前記N末端断片および前記C末端断片の結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、キット。
(項目17)
真核生物細胞に、
(a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、
(c)(i)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターとを送達することを含む方法であって、
前記第1のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質のN末端断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記中央断片への結合を触媒し、前記第2のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記C末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、方法。
(項目18)
前記真核生物細胞を、前記第1、第2、および第3のベクターの前記真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、項目19に記載の方法。
(項目19)
前記全長選択可能マーカータンパク質を含む前記トランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、項目18に記載の方法。
(項目20)
(a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、
(c)(i)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターとを含む真核生物細胞であって、
前記第1のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質のN末端断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記中央断片への結合を触媒し、前記第2のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記C末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、真核生物細胞。
(項目21)
キットであって、
(a)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第1のベクターと、
(b)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第2のベクターと、
(c)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第3のベクターとを含み、
前記第1のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質のN末端断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記中央断片への結合を触媒し、前記第2のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記C末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、キット。
Claims (29)
- (a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードする第1の導入遺伝子を含む、第1のベクターと、
(b)(i)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片の上流にある、前記インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードする第2の導入遺伝子を含む、第2のベクターと
含む、前記第1のベクターと前記第2のベクターとを真核生物細胞の集団に送達することを含む方法において使用するためのキットであって、
前記第1の導入遺伝子は前記第2の導入遺伝子と異なり、
前記第1の導入遺伝子が前記第1の目的の分子をコードし、前記第2の導入遺伝子が、前記第1の目的の分子とは異なる前記第2の目的の分子をコードし、
前記インテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の前記N末端断片および前記C末端断片の結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生し、
前記集団の単一の真核生物細胞が、前記選択可能マーカータンパク質、前記第1の目的の分子、および前記第2の目的の分子を発現する、
キット。 - 前記方法が、前記真核生物細胞を、前記第1および第2のベクターの前記真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、請求項1に記載のキット。
- 前記方法が、前記全長選択可能マーカータンパク質を含む前記トランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、請求項2に記載のキット。
- 前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、請求項1から3のいずれか1項に記載のキット。
- 前記選択可能マーカータンパク質が、抗生物質耐性タンパク質である、請求項1から4のいずれか1項に記載のキット。
- 前記抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、G418、ピューロマイシン、フレオマイシンD1、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、請求項5に記載のキット。
- 前記抗生物質耐性タンパク質が、hygB遺伝子、bsr遺伝子、pac遺伝子、またはneo遺伝子によってコードされる、請求項5または6に記載のキット。
- 前記選択可能マーカータンパク質が、蛍光タンパク質である、請求項1から4のいずれか1項に記載のキット。
- 前記蛍光タンパク質が、TagCFP、mTagCFP2、Czurite、ECFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3C、mTurquoise、mTurquoise2、モノマーMidoriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、モノマーCzami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、モノマーKusabira-Orange、mKOκ、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mScarlet、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mCpple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、およびiRFPから選択される、請求項8に記載のキット。
- 前記インテインが、スプリットインテインである、請求項1から9のいずれか1項に記載のキット。
- 前記スプリットインテインが、天然のスプリットインテリンである、請求項10に記載のキット。
- 前記スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインである、請求項10に記載のキット。
- 前記第1および/または第2の目的の分子が、タンパク質または非コーディングリボ核酸(RNA)である、請求項1から12のいずれか1項に記載のキット。
- 前記第1および/または第2のベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、請求項1から13のいずれか1項に記載のキット。
- (a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードする第1の導入遺伝子を含む、第1のベクターと、
(b)(i)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片の上流にある、前記インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードする第2の導入遺伝子を含む、第2のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
前記第1の導入遺伝子は前記第2の導入遺伝子と異なり、
前記第1の導入遺伝子が前記第1の目的の分子をコードし、前記第2の導入遺伝子が、前記第1の目的の分子とは異なる前記第2の目的の分子をコードし、
前記インテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の前記N末端断片および前記C末端断片の結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生し、
前記真核生物細胞が、前記全長抗生物質耐性タンパク質、前記第1の目的の分子、および前記第2の目的の分子を発現する、真核生物細胞。 - (a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードする第1の導入遺伝子を含む、第1のベクターと、
(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードする第2の導入遺伝子を含む、第2のベクターと、
(c)(i)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードする第3の導入遺伝子を含む、第3のベクターとを含む、前記第1のベクターと前記第2のベクターと前記第3のベクターとを真核生物細胞の集団に送達することを含む方法において使用するためのキットであって、
前記第1の導入遺伝子は前記第2の導入遺伝子と異なり、前記第1の導入遺伝子は前記第3の導入遺伝子と異なり、前記第2の導入遺伝子は前記第3の導入遺伝子と異なり、
前記第1の導入遺伝子が前記第1の目的の分子をコードし、前記第2の導入遺伝子が前記第2の目的の分子をコードし、前記第3の導入遺伝子が前記第3の目的の分子をコードし、
前記第1の目的の分子は前記第2の目的の分子とは異なり、前記第1の目的の分子は前記第3の目的の分子とは異なり、前記第2の目的の分子は前記第3の目的の分子とは異なり、
前記第1のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質のN末端断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記中央断片への結合を触媒し、前記第2のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記C末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生し、
前記第1の目的の分子、前記第2の目的の分子および前記第3の目的の分子が異なる導入遺伝子によりコードされ、
前記集団の単一の真核生物細胞が、前記全長選択可能マーカータンパク質、前記第1の目的の分子、前記第2の目的の分子、および前記第3の目的の分子を発現する、
キット。 - 前記方法が、前記真核生物細胞を、前記第1、第2、および第3のベクターの前記真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、請求項16に記載のキット。
- 前記方法が、前記全長選択可能マーカータンパク質を含む前記トランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、請求項17に記載のキット。
- (a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードする第1の導入遺伝子を含む、第1のベクターと、
(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードする第2の導入遺伝子を含む、第2のベクターと、
(c)(i)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードする第3の導入遺伝子を含む、第3のベクターとを含む真核生物細胞であって、
前記第1の導入遺伝子は前記第2の導入遺伝子と異なり、前記第1の導入遺伝子は前記第3の導入遺伝子と異なり、前記第2の導入遺伝子は前記第3の導入遺伝子と異なり、
前記第1の導入遺伝子が前記第1の目的の分子をコードし、前記第2の導入遺伝子が前記第2の目的の分子をコードし、前記第3の導入遺伝子が前記第3の目的の分子をコードし、
前記第1の目的の分子は前記第2の目的の分子とは異なり、前記第1の目的の分子は前記第3の目的の分子とは異なり、前記第2の目的の分子は前記第3の目的の分子とは異なり、
前記第1のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質のN末端断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記中央断片への結合を触媒し、前記第2のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記C末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生し、前記真核生物細胞が、前記全長選択可能マーカータンパク質、前記第1の目的の分子、前記第2の目的の分子、および前記第3の目的の分子を発現する、真核生物細胞。 - (a)(i)インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードする第1の導入遺伝子を含む、第1のベクター
を含む組成物であって、前記組成物を真核生物細胞の集団に送達することを含む方法において使用するための組成物であり、前記組成物が、
(b)(i)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片の上流にある、前記インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードする第2の導入遺伝子を含む、第2のベクターと
組み合わせて送達されることを特徴とし、
前記第1の導入遺伝子は前記第2の導入遺伝子と異なり、
前記第1の導入遺伝子が前記第1の目的の分子をコードし、前記第2の導入遺伝子が、前記第1の目的の分子とは異なる前記第2の目的の分子をコードし、
前記インテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の前記N末端断片および前記C末端断片の結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生し、前記集団の単一の真核生物細胞が、前記選択可能マーカータンパク質、前記第1の目的の分子、および前記第2の目的の分子を発現する、
組成物。 - (a)(i)選択可能マーカータンパク質のC末端断片の上流にある、インテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードする第1の導入遺伝子を含む、第1のベクター
を含む組成物であって、前記組成物を真核生物細胞の集団に送達することを含む方法において使用するための組成物であり、前記組成物が、
(b)(i)前記インテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードする第2の導入遺伝子を含む、第2のベクターと
組み合わせて送達されることを特徴とし、
前記第1の導入遺伝子は前記第2の導入遺伝子と異なり、
前記第1の導入遺伝子が前記第1の目的の分子をコードし、前記第2の導入遺伝子が、前記第1の目的の分子とは異なる前記第2の目的の分子をコードし、
前記インテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の前記N末端断片および前記C末端断片の結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生し、前記集団の単一の真核生物細胞が、前記全長選択可能マーカータンパク質、前記第1の目的の分子、および前記第2の目的の分子を発現する、
組成物。 - (a)(i)第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードする第1の導入遺伝子を含む、第1のベクター
を含む組成物であって、前記組成物を真核生物細胞の集団に送達することを含む方法において使用するための組成物であり、前記組成物が、
(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードする第2の導入遺伝子を含む、第2のベクター、および
(c)(i)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードする第3の導入遺伝子を含む、第3のベクター
と組み合わせて送達されることを特徴とし、
前記第1の導入遺伝子は前記第2の導入遺伝子と異なり、前記第1の導入遺伝子は前記第3の導入遺伝子と異なり、前記第2の導入遺伝子は前記第3の導入遺伝子と異なり、
前記第1の導入遺伝子が前記第1の目的の分子をコードし、前記第2の導入遺伝子が前記第2の目的の分子をコードし、前記第3の導入遺伝子が前記第3の目的の分子をコードし、
前記第1の目的の分子は前記第2の目的の分子とは異なり、前記第1の目的の分子は前記第3の目的の分子とは異なり、前記第2の目的の分子は前記第3の目的の分子とは異なり、
前記第1のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質のN末端断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記中央断片への結合を触媒し、前記第2のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記C末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生し、前記集団の単一の真核生物細胞が、前記全長選択可能マーカータンパク質、前記第1の目的の分子、前記第2の目的の分子、および前記第3の目的の分子を発現する、
組成物。 - (a)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードする第1の導入遺伝子を含む、第1のベクター
を含む組成物であって、前記組成物を真核生物細胞の集団に送達することを含む方法において使用するための組成物であり、前記組成物が、
(b)(i)前記第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードする第2の導入遺伝子を含む、第2のベクター、および(c)(i)前記選択可能マーカータンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードする第3の導入遺伝子を含む、第3のベクター
と組み合わせて送達されることを特徴とし、
前記第1の導入遺伝子は前記第2の導入遺伝子と異なり、前記第1の導入遺伝子は前記第3の導入遺伝子と異なり、前記第2の導入遺伝子は前記第3の導入遺伝子と異なり、
前記第1の導入遺伝子が前記第1の目的の分子をコードし、前記第2の導入遺伝子が前記第2の目的の分子をコードし、前記第3の導入遺伝子が前記第3の目的の分子をコードし、
前記第1の目的の分子は前記第2の目的の分子とは異なり、前記第1の目的の分子は前記第3の目的の分子とは異なり、前記第2の目的の分子は前記第3の目的の分子とは異なり、
前記第1のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質のN末端断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記中央断片への結合を触媒し、前記第2のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記C末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生し、前記集団の単一の真核生物細胞が、前記全長選択可能マーカータンパク質、前記第1の目的の分子、前記第2の目的の分子、および前記第3の目的の分子を発現する、
組成物。 - (a)(i)選択可能マーカータンパク質のC末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第1のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第3の目的の分子をコードする第3の導入遺伝子を含む、第1のベクター
を含む組成物であって、前記組成物を真核生物細胞の集団に送達することを含む方法において使用するための組成物であり、前記組成物が、
(b)(i)第2のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質のN末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第1の目的の分子をコードする第1の導入遺伝子を含む、第2のベクター、および
(c)(i)前記第1のインテインのN末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第2のインテインのC末端断片をコードするヌクレオチド配列、および(ii)第2の目的の分子をコードする第2の導入遺伝子を含む、第3のベクターと
組み合わせて送達されることを特徴とし、
前記第1の導入遺伝子は前記第2の導入遺伝子と異なり、前記第1の導入遺伝子は前記第3の導入遺伝子と異なり、前記第2の導入遺伝子は前記第3の導入遺伝子と異なり、
前記第1の導入遺伝子が前記第1の目的の分子をコードし、前記第2の導入遺伝子が前記第2の目的の分子をコードし、前記第3の導入遺伝子が前記第3の目的の分子をコードし、
前記第1の目的の分子は前記第2の目的の分子とは異なり、前記第1の目的の分子は前記第3の目的の分子とは異なり、前記第2の目的の分子は前記第3の目的の分子とは異なり、
前記第2のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質のN末端断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記中央断片への結合を触媒し、前記第1のインテインの前記N末端断片および前記C末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記C末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生し、前記集団の単一の真核生物細胞が、前記全長選択可能マーカータンパク質、前記第1の目的の分子、前記第2の目的の分子、および前記第3の目的の分子を発現する、
組成物。 - 前記天然のスプリットインテインが、DnaEインテインから選択される、請求項11に記載のキット。
- 前記DnaEインテインが、Synechocystis sp.DnaE(SspDnaE)インテインおよびNostoc punctiforme(NpuDnaE)インテインから選択される、請求項25に記載のキット。
- 前記操作されたスプリットインテインが、DnaBインテインまたはGyrBインテインから操作される、請求項12に記載のキット。
- 前記操作されたスプリットインテインが、SspDnaB S1インテインまたはSspGyrB S11インテインである、請求項27に記載のキット。
- 前記非コーディングRNAが、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、短い干渉RNA(siRNA)、または短いヘアピンRNA(shRNA)である、請求項13に記載のキット。
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