CN102793721A

CN102793721A - 人骨髓间充质干细胞在制备治疗强直性脊柱炎药物中的应用

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Publication number: CN102793721A
Application number: CN2012102557218A
Authority: CN
Inventors: 沈慧勇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-07-23
Filing date: 2012-07-23
Publication date: 2012-11-28

Abstract

本发明公开了人骨髓间充质干细胞在制备治疗强直性脊柱炎药物中的应用。本发明针对AS患者MSC免疫调节能力下降，不能抑制Th17和上调Treg，使Th17/Treg比例失平衡导致全身处于炎性状态，同时AS患者MSC成骨能力增强，造成AS患者病理性成骨，而这都是造成强直性脊柱炎的潜在病因。本发明通过对AS患者静脉输注健康人骨髓间充质干细胞BMSCs，调节紊乱的免疫功能，并通过抑制MSC的病理性成骨，减缓或改变疾病进程。患者效果十分明显，病人病情改善情况令人满意，可帮助患者减少甚至停用NSAID等药物，并且安全有效、无任何不良副作用。人骨髓间充质干细胞BMSCs来源广，治疗费用较为合理。因此将人骨髓间充质干细胞BMSCs应用在制备治疗强直性脊柱炎药物中具有巨大的社会和经济效益。

Description

人骨髓间充质干细胞在制备治疗强直性脊柱炎药物中的应用

技术领域：

本发明属于医学领域，具体涉及一种人骨髓间充质干细胞在制备治疗强直性脊柱炎药物中的应用。

背景技术：

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种常见的自身免疫性疾病，主要累及中轴关节及肌腱附着点，以炎性背痛和不对称外周关节炎为主要症状，好发于青年，大多数23~30岁发病，男女比例约为2：1。来自欧洲的报道称AS患病率为0.15%-1.8%，我国对12个省、市的120，451汉族人的流行病学调查数据显示AS的患病率为0.2%-0.54%。AS主要病理特征为自身免疫性炎症和病理性成骨，属高致残性疾病，随着疾病的发展可导致严重的功能障碍，给患者带来了沉重的心理和经济负担，但至今仍无治愈性治疗手段。现有的治疗手段主要包括：

1.症状缓解药物

1.1非甾体抗炎药(NSAIDs)

NSAIDs通过抑制环氧化酶(COX)活性以减少花生四烯酸代谢成为前列腺素，从而控制炎症和减轻关节肿痛。虽然NSAID消肿止痛起效快，是传统治疗AS的一线药物，但是个体差异较大，并且停药后症状易反跳，长期使用胃肠道反应较重。更为重要的是NSAIDs仅能缓解症状，并不能减缓患者病理性成骨，改变疾病进程。

1.2糖皮质激素(GC)

其作用机制为抑制细胞及体液免疫，能迅速有效地减轻炎症。本药应用于症状明显且不能被NSAID药物控制的患者，但其副作用较NSAID更为严重，长期应用可干扰下丘脑一垂体一肾上腺轴，使患者出现免疫力低下、向心性肥胖，以及增加患者心血管风险。

2.改善病情抗风湿药物(DMARD)

2.1甲氨喋呤(MTX):

本品通过竞争性抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸不能被还原成活性的四氢叶酸，导致DNA合成受阻，抑制肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1(IL-1)等细胞因子的表达，发挥抗炎作用。但该药起效缓慢（4~6周起效），用药至少维持半年，同时该药可造成叶酸缺乏，从而产生骨髓移植以及口腔溃疡等副作用。

2.2柳氮磺胺吡啶(SASP)

SASP为5-氨基水杨酸和磺胺吡啶通过偶氮键连结的酸性化合物，该药抗炎作用好，可减缓关节破坏的进程，并可降低血清IgA水平。但两项大规模多中心临床研究证实除非AS患者伴有严重的外周关节症状，否则SASP并不能改善患者情况，同时SASP还会造成恶心、呕吐、头痛、皮疹、造血功能障碍降低、肝肾功能异常等。

3生物制剂

TNF-α拮抗剂的问世被认为是近年来AS治疗最重要的进展，TNF-α拮抗剂通过中和TNF，抑制其与TNF受体结合，从而实现其抗炎作用。现阶段主要应用的TNF-α拮抗剂主要有2种：依那西普和英夫利昔单抗。但TNF-α拮抗剂价格高昂，同时其疗效个体差异较大。而且可造成感染，引发视神经炎、多发性硬化等神经系统病变，并加重充血性心力衰竭等。相关研究表明TNF-α拮抗剂并不能减缓AS患者病理性成骨过程。

但它们均为非治愈性药物，且可造成胃肠道反映、感染，甚至骨髓抑制，肝肾功能异常等严重副作用。正因为现存治疗方法存在以上诸多不足。因此找到一种安全、有效且可改变疾病进程的治疗方法显得尤为重要。

1976年Friedenstein等首次描述骨髓中存在间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）并证实其对造血干细胞的增殖和分化具有支持作用。MSC主要存在于全身的结缔组织中，以骨髓的含量最丰富，其具有向中胚层多种组织如骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织甚至神经外胚层的神经组织等分化的潜能。

目前尚未筛选到MSC特有的标记分子，但一致的观点认为SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD102等呈阳性，而CD14、CD34和CD45等造血谱系分子表达阴性。由于MSC不表达主要组织相容性复合体(MHC)II分子、CD40、CD80、CD86等共刺激分子，不表达或极低水平表达MHC I，MSC不易被宿主T细胞识别，并能逃脱宿主免疫系统的排斥，因此认为MSC具有低免疫原性，并将其广泛应用于心肌病、肝脏疾病及神经系统疾病中。Strauer等选择18例陈旧性心肌梗死患者，病程5个月~8.5年，经冠状动脉注射自体MSC（间充质干细胞），3个月后复查时发现梗死区面积减少30%，左心室射血分数升高15%，梗死壁运动速率升高57%，而对照组的以上三个指标与治疗前相比无明显变化。Moham adnejad等利用MSC治疗4例晚期肝硬化患者，患者平均年龄47岁，且都具有慢性肝衰竭，门脉高压症状，彩超显示患者肝硬化，血清白蛋白、胆红素明显异常，晚期肝病模型(model for end stage liver disease,MELD)评分大于16。抽取患者自体骨髓，并培养至细胞量为10.2×10⁶~6.0×10⁶后，用20ml生理盐水混悬细胞，经肘静脉缓慢注射。随访1年发现所有患者均存活，且所有患者均未出现急性肾衰竭、肝脏失代偿加重及肝脏肿块等并发症。其中3例患者的肝功能明显改善，MELD评分下降，并以术后6个月时效果最显著。Mazzini等治疗一组肌萎缩侧索硬化患者，取骨髓培养MSC，溶于2ml自体脑脊液后注射入脊髓，随访3年，无死亡、脑脊髓的容积、结构改变和异常细胞增殖现象发生。

于此同时越来越多的证据表明MSCs具有强大的免疫调节及抑制炎症反应的能力，早在2002年人们已经发现MSCs可通过抑制T细胞的增殖发挥其免疫抑制作用，近期的研究已证明MSCs还可通过调节B淋巴细胞、NK细胞及树突状细胞来发挥其免疫调节作用，其免疫调节及炎症抑制功能的发挥有赖于其分泌的各种因子和/或细胞间接触。MSCs被广泛用于输注治疗自身免疫相关疾病，国内外众多科研院所不仅证明了MSCs输注的安全性，同时证明了其对自身免疫性疾病的可靠疗效。2005年Garcia-Olmod等对5例合并瘘管的克罗恩病（Cronh disease）患者进行了自体MSC治疗的I期临床试验，除1例患者由于MSC体外培养受到细菌污染而退出试验，其余4例共8处瘘管接受了自体MSC瘘管局部注射，随访12~30个月（平均22个月）后，6处瘘管完全闭合，另2处部分闭合。Le Blanc K等人在欧洲进行的一项多中心的II期临床试验证明：对55例对激素耐药的急性GVHD患者使用了MSC，尽管使用的MSC来源不同，包括HLA全相合、半相合或HLA完全不相合的第三方供者，而且有的患者接受了多名供者的MSC，但经治疗后30例患者获得了完全反应，2年后，获得完全反应的患者中有53%仍存活，而对MSC治疗无反应的2年生存率仅有16%，结果还显示，MSC供者的不同来源并不影响治疗结果。

同样，强直性脊柱炎AS患者也存在着免疫紊乱的情况：Yang等人的实验证明，与正常人相比，AS患者体内的IL-23及IL-17水平明显上升，而这可能是HLA-B27阳性等遗传因素及各种环境因素综合作用产生。Wendling D等人也发现IL-17在RA患者和AS患者的关节滑液中有着较高的表达。而且在AS和RA患者外周血的研究中也发现了Th17细胞的增多。

发明内容：

本发明的目的是提供人骨髓间充质干细胞在制备治疗强直性脊柱炎药物中的应用。

本发明人在体外实验发现强直性脊柱炎AS患者的外周血及坏死股骨头局部IL-17和IL-23等炎性因子的含量明显高于正常人；同时还观察到AS患者外周血Th17细胞增多，Treg细胞降低，Th17/Treg比例升高，全身处于炎性状态。另外经实验证实虽然AS患者MSC在增殖、分化及迁移能力等方面与正常人MSC没有任何差异，但是AS患者MSC存在明显的免疫调节能力异常，表现为混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，MLR）中AS患者MSC较正常人MSC抑制淋巴细胞增殖的能力明显下降。因此，经体内试验和体外试验研究，AS患者体内确实存在免疫紊乱，并且患者自身体内MSC也发生了免疫调节的异常，导致AS患者体内免疫紊乱不能得到干预和纠正，体内炎性情况得以持续和加剧，反过来又进一步恶化和加重病情。

本发明通过对AS患者静脉输注健康人骨髓间充质干细胞BMSCs，患者的治疗效果十分明显，病人病情改善情况令人满意：绝大多数AS患者全身炎性情况明显降低、病变关节疼痛程度明显减弱、个人活动范围和强度明显增强；部分原先服药的AS患者在接受细胞治疗后停药数月病情仍不复发；少数对NSAIDs和TNF拮抗剂（如益赛普）等无效的AS患者经过输注正常人骨髓间充质干细胞BMSCs治疗后临床症状改善情况显著。另外，静脉输注正常人骨髓间充质干细胞BMSCs治疗AS患者起效快、持续时间久：病人在接受细胞输注1个月后治疗效果十分明显，相当长时间可持续发挥治疗作用。临床试验也证实静脉输注正常人骨髓间充质干细胞BMSCs治疗AS患者具有安全有效、无任何不良副作用的特点：目前为止尚未发现任何一例接受静脉输入健康人骨髓间充质干细胞BMSCs治疗的AS病人发生排斥反应、过敏反应、休克甚至出现死亡。

由此可见，人骨髓间充质干细胞BMSCs能应用在制备治疗强直性脊柱炎药物中。

本发明的人骨髓间充质干细胞BMSCs属于现有技术，可通过现有技术的方法得到人骨髓间充质干细胞BMSCs。

本发明针对AS患者MSC免疫调节能力下降，不能抑制Th17和上调Treg，使Th17/Treg比例失平衡导致全身处于炎性状态，同时AS患者MSC成骨能力增强，造成AS患者病理性成骨，而这都是造成强直性脊柱炎的潜在病因。基于以上两点本发明通过对AS患者静脉输注健康人骨髓间充质干细胞BMSCs，调节紊乱的免疫功能，并通过抑制MSC的病理性成骨，减缓或改变疾病进程。患者效果十分明显，病人病情改善情况令人满意，可帮助患者减少甚至停用NSAID等药物，并且安全有效、无任何不良副作用。人骨髓间充质干细胞BMSCs来源广，治疗费用较为合理。因此将人骨髓间充质干细胞BMSCs应用在制备治疗强直性脊柱炎药物中具有巨大的社会和经济效益。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、人骨髓间充质干细胞BMSCs的制备

人骨髓间充质干细胞BMSCs取自20~30岁的健康志愿者，行髂后上棘骨髓穿刺，每次采集20ml。根据梯度离心原理，在445g、20℃的条件下采用Ficoll离心30min，分离骨髓中的有核细胞，通过对人骨髓间充质干细胞BMSCs在培养皿的附壁特性进行筛选、培养及纯化，具体步骤为：培养液为：低糖型DMEM培养基，含体积分数10%胎牛血清，以及2U/L青霉素、链霉素。在37℃，5%CO2条件下培养48h后，更换培养液并去除悬浮细胞，并在以后每3~4天进行一次相似操作。

当细胞融合度到80%时进行细胞传代：用PBS对上述细胞洗涤，之后使用胰酶消化，当贴壁细胞变为游离时，终止消化，离心后弃去上清，用PBS洗涤一次后，将细胞接种于培养液中，在37℃，5%CO2条件下进行传代培养，当细胞扩增进入第3代时，使用质量分数0.25%的胰蛋白酶+1mmol/L EDTA(Sigma，USA)消化后混悬于L-DMEM+10%FBS(美国GIBCO公司及中国杭州四季清公司)培养液中，由此得到人骨髓间充质干细胞BMSCs，待用。

二、人骨髓间充质干细胞BMSCs输注

对AS患者进行连续4周的人骨髓间充质干细胞BMSCs静脉注射，每周1次，人骨髓间充质干细胞BMSCs的用量为1×10⁶MSCs/kg（体重），于10ml生理盐水中悬混，并由患者肘静脉缓慢注入。之后根据患者临床症状和实验室检查适当调整治疗方案。

三、人骨髓间充质干细胞BMSCs输注治疗AS患者疗效评价体系：

1、主观评价：

Pain-VAS(疼痛视觉模拟评分)——评估治疗前后患者疼痛改善情况；

BAS-G(Bath强直性脊柱炎总体评分)——评估治疗前后患者病情总体改善情况；

BASFI(Bath强直性脊柱炎功能指数评分)——评估治疗前后患者机体功能改善情况；

BASDAI(Bath强直性脊柱炎病情活动指数评分)——评估治疗前后患者病情活动程度变化情况；

2、临床指标：

外周血检测CRP、ESR、TNF-α、IL-17、IL-23、BMP——评价治疗前后患者全身炎性状态变化情况；

流式细胞术分析CD4+T细胞、CD8+T细胞、Th17细胞、Treg细胞、NK细胞比例——评价治疗前后患者淋巴细胞数量及亚群比例变化情况；

脊柱活动度（包括扩胸度、枕墙距、耳墙距、踝间距、颈椎活动度、腰椎侧弯度、修订版Schober检查）—评估治疗前后患者脊柱活动度改善情况；

3、影像学检查：

全脊柱及双侧骶髂关节正侧位X片——影像学评估治疗前后患者中轴关节病情改善情况；

全脊柱及双侧骶髂关节MRI——影像学评估治疗前后患者中轴关节病情改善情况；

ASspiMRI评估（强直性脊柱炎MRI评估）——评价治疗前后患者影像学上病情改善情况。

四、应用骨髓间充质干细胞BMSCs治疗强直性脊柱炎

纳入标准：根据New York Diagnostic Criteria确诊强直性脊柱炎。

排除标准：1、感染或有感染高风险的；2、肿瘤及肿瘤前期；3、严重伴随症状，如心脑血管疾病、肝肾及血液疾病；5、孕妇及哺乳期妇女。

治疗方案：连续4周给予患者静脉输注1×10⁶/kg（体重）的BMSCs。

检测指标：完成4周的BMSCs注射后，检测患者的CRP、ESR、ASDAS-CRP、BASDAI、BASFI及血、大便、尿常规等。

1、应用人骨髓间充质干细胞BMSCs治疗15个TNFα拮抗剂抵抗的强直性脊柱炎患者

对15个TNFα拮抗剂抵抗的强直性脊柱炎患者分别第0天、第1周、第2周、第3周给予患者肘静脉输注1×10⁶BMSCs/kg（体重）的上述人骨髓间充质干细胞BMSCs后。患者ASDAS-CRP评分从治疗前的4.0±0.5降到2.4±0.5。而BASFI评分也从5.3±1.1降到3.7±0.9，关节肿胀数从治疗前的21个降到13个。ASAS20达到100%，ASAS40达到60%（见表1）。对输注人骨髓间充质干细胞BMSCs的患者进行了为期8周的随访，在随访中除了个别患者有注射点疼痛的症状外，无其他不适。同时包括血常规、尿常规、大便常规、肝功能在内的相关实验室和影像学检查也未发现明显异常。由此说明，AS患者静脉注射人骨髓间充质干细胞BMSCs，其治疗效果十分明显，病人病情改善情况令人满意，可帮助患者减少甚至停用NSAID等药物，并且安全有效、无任何不良副作用。

表1：MSC治疗后患者各项指标改变

	ASDAS-CRP	BASDAI	BASFI	ESR(mm/h)	CRP mg/L
						基础值	4.0±0.5	3.5±1.3	5.3±1.1	52.6±24.0	50.4±24.1
1w	3.7±0.5	3.0±1.2	4.9±1.	47.8±22.4	46.5±23.0
						2w	3.4±0.5	2.6±1.1	4.4±1.1	42.1±22.1	40.9±21.7
3w	2.9±0.5	2.0±1.1	4.0±1.0	37.3±19.3	31.1±19.7
						4w	2.4±0.5	1.4±1.0	3.7±0.9	33.1±17.8	21.9±18.2
8w	2.6±0.6	1.7±1.0	3.8±0.9	31.5±17.4	26.1±19.0

2、患者：麦XX，男，32岁，工人。因“腰背部僵硬双膝肿胀7月余，加重伴乏力3天”来我院就诊。患者7月前无明显诱因出现腰背部僵硬，晨起明显，活动后好转，每次持续约45min。同时自觉双膝肿胀，活动受限。查体：患者脊柱各向活动受限，双侧膝关节均一肿大，屈曲困难。实验室检查：ESR57mm/h、CRP54mg/L。X线显示：双侧骶髂关节间隙模糊，骨桥生成，腰椎小关节模糊。ASDAS-CRP评分5.1，BASDAI4.0，BASFI5.9。连续3周给予患者输注1×10⁶/kg（体重）人骨髓间充质干细胞BMSCs后，患者腰背部僵硬及双膝肿胀情况明显减轻，复查ESR35mm/h、CRP29mg/L，ASDAS-CRP评分2.5，BASDAI2.0，BASFI3.9。

Claims

1.人骨髓间充质干细胞在制备治疗强直性脊柱炎药物中的应用。