CN114259506B - Cmklr+间充质干细胞在制备用于治疗强直性脊柱炎的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CMKLR⁺间充质干细胞在制备用于治疗强直性脊柱炎的药物中的应用，涉及药物新用途的技术领域。本发明提供的CMKLR⁺间充质干细胞在制备用于治疗强直性脊柱炎的药物中的应用，本发明通过单细胞测序鉴定并分离出CMKLR⁺BMSCs，首次发现CMKLR⁺BMSCs是MSC负责执行免疫调节功能的亚群，具有较好的临床治疗效果且安全性更高，不仅为制备用于治疗强直性脊柱炎的药物提供了一种新来源，同时也发掘出了CMKLR⁺BMSCs新的药用价值。

Description

CMKLR+间充质干细胞在制备用于治疗强直性脊柱炎的药物中 的应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及CMKLR+间充质干细胞在制备用于治疗强直性脊柱炎的药物中的应用。

背景技术

强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)是一种常见的自身免疫性疾病，在我国患病率较高，约为0.2～0.54％。AS属高致残性疾病，随着疾病的发展患者将逐渐丧失生活和劳动能力，给患者及家庭带来了沉重的心理和经济负担。AS主要临床表现为炎症性背痛和脊柱强直，其核心病理特征为慢性炎症，但具体的分子生物学机制仍未阐明。由于发病机制不清，当前的AS治疗手段难以改善病人的整体预后情况，且存在许多副作用：非甾体类抗炎药(NSAIDs)尽管可以缓解部分患者的炎症水平，但也具有较大胃肠道、心血管副作用；改善风湿病情类药物(DMARDs)仅用于治疗AS患者外周关节症状，而对中轴骨症状无效；包括TNF-α拮抗剂在内的多种生物制剂是近年来AS治疗上的重大突破，但临床上仍有部分患者使用TNF-α拮抗剂治疗无效或不耐受，同时长时间使用TNF-α拮抗剂会大大增加感染、肿瘤的风险。因此，临床亟需阐明AS发病的分子生物学机制，研发安全、有效的AS治疗新方法。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)由Friedenstein等首次发现于1976年，作为骨髓造血微环境的壁龛细胞，对造血干细胞具有重要的支持作用。近年来的研究发现，MSCs广泛存在于全身结缔组织中，以骨髓中最为丰富，除了具有支持造血的功能外，还具有强大的免疫调节能力及多向分化能力(成骨、成脂、成软骨分化)，参与机体内免疫调控、组织发育等功能。由于低免疫原性的特点，MSCs可用于静脉输注、局部注射等治疗，具有广阔的临床应用前景。多项研究已证实，MSCs不仅可有效治疗系统性红斑狼疮、心肌炎、移植物抗宿主病等疾病，也可以应用于骨缺损重建、软组织修复等组织与再生医学工程中，取得良好效果。申请人本团队在国内外首次注册并开展同种异体间充质干细胞静脉输注难治性强直性脊柱炎的临床研究，证实MSCs可安全、有效治疗强直性脊柱炎，后续也有一些研究团队陆续报道，证实MSC可用于AS的治疗。

然而，我们针对前期的临床研究结果发现，当前MSC输注治疗AS的有效性为50～60％，与当前生物制剂药物类似，仍有进一步提升空间。此外，MSC输注过程中患者存在发热、过敏等副作用，其安全性也有待进一步提高。在前期的基础与临床研究中均发现，不同来源样本间MSCs的功能和生物学特性差异较大，这可能与MSCs中存在较大的异质性密切相关，而这种异质性可能就是造成MSC输注治疗有效性有待提高的重要原因之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，CMKLR⁺间充质干细胞在制备用于治疗强直性脊柱炎的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：CMKLR⁺间充质干细胞在制备用于治疗强直性脊柱炎的药物中的应用。

同种异体骨髓间充质干细胞(BMSCs)静脉输注可以安全、有效治疗强直性脊柱炎(AS)，但ASAS20总体有效缓解率为50～60％，仍有进一步提升空间。进一步实验结果发现，CMKLR⁺BMSCs是BMSCs中重要的免疫调节功能亚群，具有强大的免疫调节能力。我们推测，分选CMKLR⁺BMSCs可以一方面提升AS治疗效果，另一方面减少混杂细胞输注带来的不良效果。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述CMKLR⁺间充质干细胞为CMKLR⁺骨髓间充质干细胞。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述CMKLR⁺骨髓间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：

(1)从骨髓混合液中分离纯化骨髓间充质干细胞；

(2)扩增骨髓间充质干细胞；

(3)采用抗体孵育骨髓间充质干细胞，并通过流式细胞仪进行分选，得所述CMKLR⁺骨髓间充质干细胞。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述抗体为FITC-CMKLR抗体。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述CMKLR⁺间充质干细胞通过静脉输注治疗强直性脊柱炎。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述CMKLR⁺间充质干细胞的治疗剂量为1*10⁵个细胞/g体重。

本发明还提供一种用于治疗强直性脊柱炎的药物组合物，所述药物组合物包含上述的CMKLR⁺间充质干细胞。

作为本发明所述的用于治疗强直性脊柱炎的药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

本发明的有益效果：本发明提供的CMKLR+间充质干细胞在制备用于治疗强直性脊柱炎的药物中的应用，本发明通过单细胞测序鉴定并分离出CMKLR⁺BMSCs，首次发现CMKLR⁺BMSCs是MSC负责执行免疫调节功能的亚群，具有较好的临床治疗效果且安全性更高，不仅为制备用于治疗强直性脊柱炎的药物提供了一种新来源，同时也发掘出了CMKLR⁺BMSCs新的药用价值。

附图说明

图1为小鼠的脊柱和关节HE染色图；

图2为小鼠的脊柱和关节的microCT图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1 CMKLR⁺骨髓间充质干细胞的制备

(1)志愿者筛选及骨髓采集：选取20～30周岁志愿者，按要求的项目进行体检，体检合格后预约抽取30ml骨髓。骨髓采集：a.穿刺部位选择：髂前上棘1-2cm处；b.被穿刺者取仰卧位；c.消毒穿刺区域的皮肤；d.在穿刺点用1％普鲁卡因做皮肤、皮下、骨膜麻醉；e.将骨髓穿刺针的固定器固定在离针尖1～1.5cm处用左手拇指和食指将髂嵴两旁的皮肤拉紧并固定。以右手持针向骨面垂直刺入。当针头接触骨质后，穿刺针左右移动，缓缓钻入骨质。当感到阻力减少且穿刺针已固定在骨内直立以不倒时为止；f.拔出针心，接上无菌干燥的50ml注射器，适当用力抽吸，即有少量红色骨髓液进入注射器。吸取20～30ml左右骨髓液。g.取得骨髓液后，将注射器及穿刺针迅速拔出。在穿刺位置盖以消毒纱布，按压1～2分钟后胶布固定。

(2)间充质干细胞的分离纯化：将收集的骨髓混合液用细胞分离液分离，用无血清培养基培养、贴壁。在25cm²的培养瓶中，用无血清培养基培养混合细胞，隔天吸取半量上清液，弃去，再滴入新鲜无血清培养基，轻拿轻放，勿振动细胞，以免影响贴壁；待MSCs贴壁后，摇动瓶底，将细胞悬液转入新瓶中，二次贴壁，原瓶中加入含因子的培养基继续培养。

(3)间充质干细胞的体外扩增：a.将需要那传代的细胞从CO²培养箱中取出，在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，吸弃瓶内的培养基；b.向培养内加入无菌PBS 3ml，之后水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使PBS能够浸润到培养平面上所都的面积，吸弃PBS；c.重复步骤2一次，之后向瓶内加入消化液2ml，轻微震荡后放入37℃CO²培养箱中孵育1min；d.孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，如还有部分细胞未消化下来，可在生物安全柜内用移液管吸起消化液，吹打培养平面；e.向消化下细胞的培养瓶中加入3ml含10％血清的完全培养基终止消化，然后将培养瓶中的液体转入15ml离心管中，300g离心5min；f.离心完成后，弃上清，用2ml完全培养基重悬细胞，将重悬后的培养基转入2个25cm²培养瓶，每个培养瓶各1ml，提前向每个培养瓶中各加入4ml完全培养基；g.水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使细胞均匀分部在培养平面上，然后将培养瓶置于CO²培养箱中静置培养。

(4)CMKLR⁺骨髓间充质干细胞的分选：a.培养的MSC进行消化，并用500ul的PBS缓冲液重悬；b.每管细胞加入FITC-CMKLR抗体10ul，避光混匀孵育30min；c.每管加入PBS缓冲液3ml，充分混匀后，1500rpm离心10min；d.弃去上清，200ul PBS缓冲液重悬，通过流式细胞仪进行细胞分选，以不孵育抗体的MSC和同型对照作为阴性对照，选择阳性CMKLR亚群进行收集，以生理盐水进行重悬。

实施例2

本实施例采用实施例1制备的CMKLR⁺骨髓间充质干细胞、未经分选的骨髓间充质干细胞对患强直性脊柱炎的小鼠进行治疗。

(1)AS小鼠模型的构建：选取8周龄自发型类风湿性关节炎(SKG)小鼠，腹腔注射3mg curdlan，构建AS小鼠模型。

(2)间充质干细胞静脉输注：将AS小鼠分为三组，分别为CMKLR⁺骨髓间充质干细胞治疗组、骨髓间充质干细胞治疗组和对照组。CMKLR⁺骨髓间充质干细胞治疗组小鼠每周注射一次CMKLR⁺骨髓间充质干细胞，每次注射量为1*10⁵个细胞/g体重，连续治疗4周；骨髓间充质干细胞治疗组小鼠每周注射一次骨髓间充质干细胞，每次注射量为1*10⁵个细胞/g体重，连续治疗4周；对照组小鼠每周注射一次相同量的PBS，连续治疗4周。

(3)治疗效果评价：治疗后每周收集各组AS小鼠的血清，分别检测ESR、CRP、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-23的含量，以评估其当前体内炎症水平，并通过HE染色、microCT观察小鼠脊柱和关节的炎症与病理性成骨情况。

(4)结果如表1～6、图1～2所示。

表1 C-反应蛋白(CRP)水平(mg/L)变化

表2红细胞沉降率(ESR)水平(mm/h)变化

ESR(mm/h)	治疗前	1周	2周	3周	4周
						CMKLR+MSC组	84.3±9.9	75.1±11.6	53.2±7.0	26.1±6.1	15.8±3.3
MSC组	89.3±10.1	78.8±9.1	67.2±8.1	48.4±5.1	27.1±3.6
						PBS组	90.7±11.7	84.1±10.6	78.8±6.9	89.2±7.9	86.8±11.5

表3 TNF-α水平(pg/ml)变化

TNF-α(pg/ml)	治疗前	1周	2周	3周	4周
						CMKLR+MSC组	34.8±4.8	25.1±4.7	15.2±3.0	6.3±1.0	5.0±0.9
MSC组	36.9±3.9	30.7±5.5	28.4±3.9	20.8±3.8	12.8±2.1
						PBS组	38.4±5.1	34.9±7.0	35.6±4.1	33.7±5.7	32.2±3.7

表4 IL-6水平(pg/ml)变化

IL-6(pg/ml)	治疗前	1周	2周	3周	4周
						CMKLR+MSC组	105.3±21.4	86.3±11.9	55.0±16.3	23.7±5.1	19.8±4.1
MSC组	116.1±23.2	108.3±18.1	78.8±9.0	51.4±7.3	31.7±4.8
						PBS组	107.3±20.0	112.1±18.2	108.4±19.7	113.2±15.3	102.7±19.2

表5 IL-17水平(pg/ml)变化

表6 IL-23水平(pg/ml)变化

IL-23(pg/ml)	治疗前	1周	2周	3周	4周
						CMKLR+MSC组	45.2±6.7	35.8±2.9	22.2±2.3	10.1±1.8	11.2±2.3
MSC组	43.6±7.1	40.6±3.7	36.4±3.8	30.1±4.2	20.1±3.2
						PBS组	45.3±5.1	52.9±7.0	43.7±3.9	44.0±5.2	56.7±6.3

由表1～6可知，相比对照组，BMSCs组和CMKLR⁺BMSCs组小鼠体内的ESR、CRP、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-23均显著降低，说明BMSCs和CMKLR⁺BMSCs均能抑制AS小鼠体内炎症水平，改善局部成骨情况，且由表中数据可知，CMKLR⁺BMSCs组抑制炎症能力比BMSCs组更强。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1. CMKLR⁺骨髓间充质干细胞在制备用于治疗强直性脊柱炎的药物中的应用，所述CMKLR⁺骨髓间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：

从骨髓混合液中分离纯化骨髓间充质干细胞；

扩增骨髓间充质干细胞；

采用FITC-CMKLR抗体孵育骨髓间充质干细胞，并通过流式细胞仪进行分选，以不孵育抗体的MSC和同型对照作为阴性对照，选择阳性CMKLR亚群进行收集，得所述CMKLR⁺骨髓间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CMKLR⁺骨髓间充质干细胞通过静脉输注治疗强直性脊柱炎。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CMKLR⁺骨髓间充质干细胞的治疗剂量为1×10⁵个细胞/g体重。

4.一种用于治疗强直性脊柱炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含CMKLR⁺骨髓间充质干细胞；所述CMKLR⁺骨髓间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：

从骨髓混合液中分离纯化骨髓间充质干细胞；

扩增骨髓间充质干细胞；

采用FITC-CMKLR抗体孵育骨髓间充质干细胞，并通过流式细胞仪进行分选，以不孵育抗体的MSC和同型对照作为阴性对照，选择阳性CMKLR亚群进行收集，得所述CMKLR⁺骨髓间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料。