KR100947821B1

KR100947821B1 - 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법 및 이를 위한분화용 배지

Info

Publication number: KR100947821B1
Application number: KR1020080002458A
Authority: KR
Inventors: 이수만; 박수정
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2008-01-09
Filing date: 2008-01-09
Publication date: 2010-03-15
Also published as: KR20090076483A

Abstract

본 발명은 CD73 양성, CD90 양성, CD105 양성, 및 CD166 양성을 나타내는 인간의 중간엽 줄기 세포를 골아세포(osteoblast)로 분화시키는 방법에 있어서, 골아세포 분화용 배지에 푸코이단(fucoidan)을 가하여 얻어진 배지 중에서 상기 중간엽 줄기 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법 및 이를 위한 분화용 배지를 제공한다.

본 발명에 따른 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법은 해조 다당체인 푸코이단 존재하에서 수행됨으로써, 분화기간을 50% 이상 크게 단축할 수 있다. 즉, 약 4주 가량 소요되던 분화기간을 2주로 크게 단축시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 분화방법은 덱사메타손 등의 사이토카인 즉, 분화유도 물질의 사용을 배제할 수 있으므로, 얻어진 골아세포를 인체에 이식할 경우 제기될 수 있는 안전성 문제를 회피할 수 있다.

중간엽 줄기세포, 푸코이단, 골아세포, 분화

Description

중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법 및 이를 위한 분화용 배지{Method for the differentiation of mesenchymal stem cells to osteoblasts and medium for the differentiation thereof}

본 발명은 중간엽 줄기 세포를 골아세포로 분화시키는 방법 및 상기 분화 방법에 사용되는 분화용 배지에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포는 골수, 제대혈, 지방조직 등으로부터 분리할 수 있는 세포로서, 조직의 재생에 중요한 역할을 하는, 인체 조직세포로 분화되기 직전의 원시세포를 말한다. 상기 중간엽 줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 혈관, 간 등으로 분화가 가능한 세포이다.

중간엽 줄기세포는 세포 수가 적고 증식이 어려운 단점이 있지만, 획득이 용이하고 배아 줄기세포와 달리 이미 성장한 인체조직에서 추출하기 때문에 윤리논쟁에서 자유롭다. 중간엽 줄기세포를 추출할 수 있는 많은 조직 중, 가장 대표적인 조직은 골수와 제대혈, 태아 조직, 지방조직 등이 있다. 이 중, 지방유래 중간엽 줄기세포는 골수유래 중간엽 줄기세포와 같은 특성을 지니면서 지방 흡입술 시술 후 버려지는 조직으로부터 얻을 수 있고 비교적 분리가 용이하다는 장점을 가지고 있다.

현재, 줄기세포를 조직공학적으로 이용하기 위한 방법에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 중간엽 줄기 세포를 분화시키기 위한 유도물질들이 이식 후 인체에 영향을 줄 수 있기 때문에 안전성에 있어서 문제를 야기할 수 있다.

한편, 푸코이단은 식용으로 이용하고 있는 미역, 다시마 등의 갈조류에서 발견된 수용성 식이섬유의 일종으로서, 대표적으로는 암세포의 세포 사멸 활성을 갖는다고 보고된 바 있다. 푸코이단을 암세포에 처리하면 DNA가 작은 절편으로 잘리면서 세포의 사멸이 이루어진다. 이러한 세포 사멸의 과정은 암세포에서는 일어났으나, 줄기세포에 푸코이단을 처리한 경우에는 일어나지 않는다. 푸코이단에 의한 암세포의 사멸에 대한 기전은 많은 연구가 진행되고 있으나, 푸코이단이 줄기세포의 성장 및 분화능 등에 영향을 주는 과정에 대해서는 전혀 밝혀진 바 없다.

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[문헌 10] 일본특허공개 평04-91027

[문헌 11] 미국특허공개 제2006/0051316호

본 발명자들은 중간엽 줄기 세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있는 다양한 분화유도체로서, 생체 적합성이 있는 천연물에 대하여 다양한 검색을 수행한 결과, 인체에 무해한 해조 다당체인 푸코이단이 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화를 효과적으로 촉진한다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 푸코이단을 이용한 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 분화방법에 사용되는 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, CD73 양성, CD90 양성, CD105 양성, 및 CD166 양성을 나타내는 인간의 중간엽 줄기 세포를 골아세포(osteoblast)로 분화시키는 방법에 있어서, 골아세포 분화용 배지에 푸코이단(fucoidan)을 가하여 얻어진 배지 중에서 상기 중간엽 줄기 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법이 제공된다.

상기 푸코이단은 0.1 ∼ 5 mg/ml의 농도로 첨가될 수 있다. 상기 골아세포 분화용 배지에 푸코이단을 가하여 얻어진 배지는 푸코이단, 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS), 덱사메타손, β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 및 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈(low-glucose) DMEM 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청, 0.1 μM의 덱사메타손, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있다.

또한, 상기 골아세포 분화용 배지에 푸코이단을 가하여 얻어진 배지는 분화유도물질을 함유하지 않는 배지일 수 있으며, 바람직하게는 푸코이단, 우태혈, β-글리세로포스페이트, 및 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있다.

본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포는 골수, 제대혈, 또는 지방 유래의 중간엽 줄기 세포일 수 있으며, 바람직하게는 지방 유래의 중간엽 줄기 세포일 수 있다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 골아세포 분화용 배지에 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단(fucoidan)을 가하여 얻어진, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지 가 제공된다.

상기 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지는 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 우태혈청, 덱사메타손, β-글리세로포스페이트, 및 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청, 0.1 μM의 덱사메타손, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있다.

또한, 상기 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지는 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 우태혈청, β-글리세로포스페이트, 및 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있다.

본 발명은 CD73 양성, CD90 양성, CD105 양성, 및 CD166 양성을 나타내는 인 간의 중간엽 줄기 세포를 골아세포(osteoblast)로 분화시키는 방법에 있어서, 골아세포 분화용 배지에 푸코이단(fucoidan)을 가하여 얻어진 배지 중에서 상기 중간엽 줄기 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법을 포함한다.

본 명세서에서, 상기 "푸코이단(fucoidan)"은 식용으로 이용하고 있는 미역, 다시마 등의 갈조류에서 발견된 수용성 식이섬유의 일종으로 건조 갈조류당 약 4-5% 함유되어 있으며, 항혈전생성, 항암, 항염증, 항알러지, 항치매, 항바이러스, 항당뇨, 항비만 활성을 갖는 것으로 보고된 바 있다. 푸코이단은 황산화된 푸코우즈-함유 다당류(sulfated fucose-containing polysaccharides)를 총칭한다. 푸코이단은 이를 함유하는 갈조류로부터 종래의 방법(일본특허공개 평04-91027 등)에 따라 얻을 수 있다. 푸코이단은 글루쿠론산-함유 푸코이단(glucuronic acid-containing fucoidan, U-fucoidan) 및 글루쿠론산-비함유 푸코이단(glucuronic acid non-containing fucoidan, F-fucoidan)으로 나눌 수 있으며, 본 명세서에서 상기 "푸코이단(fucoidan)"은 이들 모두를 포함한다. 또한, 푸코이단은 갈락토오스, 우론산, 만노스, 자일로스 등과 결합된 형태로 존재할 수 있으며, 본 명세서에서 상기 "푸코이단(fucoidan)"은 상기 형태의 푸코이단을 모두 포함한다. 상기 푸코이단의 분자량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 약 20만 정도일 수 있으나, 당쇄 등에 의해 다양한 분자량을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 분화방법은 골아세포 분화용 배지에 푸코이단(fucoidan)을 가하여 얻어진 배지 중에서 상기 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

상기 배지 중 푸코이단의 함량은 0.1 ∼ 5 mg/ml, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 mg/ml 의 농도로 첨가될 수 있다. 상기 푸코이단이 건조 분말 형태일 경우, 필요할 경우, 상기 푸코이단을 배지에 가한 후, 필터(예를 들어, 0.45 um 필터)로 여과하여 사용할 수도 있다.

또한, 상기 골아세포 분화용 배지는 중간엽 줄기 세포를 골아세포로 분화시키는데 사용되는 통상의 배지, 예를 들어, 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS), 덱사메타손, β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 및 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈(low-glucose) DMEM 배지에 푸코이단을 가하여 얻어진 배지일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 분화방법에 사용되는 배지는 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청, 0.1 μM의 덱사메타손, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있다.

본 발명에 따른 분화방법은 상기와 같이 푸코이단을 사용함으로써 분화기간을 50% 이상 크게 단축할 수 있을 뿐만 아니라, 덱사메타손 등의 사이토카인 즉, 분화유도 물질의 사용을 배제할 수도 있다. 즉, 본 발명의 분화방법에 사용되는 배지는 분화유도물질을 함유하지 않는 배지. 예를 들어 덱사메타손-비함유(dexamethasone-free) 배지일 수 있다. 일 예로서, 본 발명의 분화방법에 사용되는 배지는 푸코이단, 우태혈, β-글리세로포스페이트, 및 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산 이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있다.

본 발명의 분화방법은 성체 세포 유래의 중간엽 줄기 세포 모두에 적용될 수 있다. 즉, 성체 세포 유래의 중간엽 줄기 세포는 모두 면역학적 표현형이 D73 양성, CD90 양성, CD105 양성, 및 CD166 양성인 특성을 갖는다. 따라서, 상기 면역학적 표현형이 D73 양성, CD90 양성, CD105 양성, 및 CD166 양성의 특성을 갖는 한, 다양한 성체 세포 유래의 중간엽 줄기 세포, 예를 들어 골수, 제대혈, 또는 지방 유래의, 바람직하게는 지방(지방세포 또는 조직) 유래의 중간엽 줄기 세포에 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명은 또한 골아세포 분화용 배지에 0.1 ∼ 5 mg/ml, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 mg/ml의 푸코이단(fucoidan)을 가하여 얻어진, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지는 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS), 덱사메타손, β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 및 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈(low-glucose) DMEM 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS), 0.1 μM의 덱사메타손, 10 mM의 β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있다.

또한, 상기 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지는 덱사메타손 등의 사이토카인 즉, 분화유도 물질이 배제된 배지일 수 있으며, 예를 들어 덱사메타 손-비함유(dexamethasone-free) 배지일 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지는 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 우태혈청, β-글리세로포스페이트, 및 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명을 제한하는 것이 아니다.

실시예 1: 인간 지방조직에서 중간엽 줄기세포의 분리

피하지방 제거 시술을 받은 환자로부터 동의를 얻고, 해당 환자로부터 지방흡인(liposuction)방법을 통하여 제거되어 버려지는 지방조직을 수거하였다. 수거된 지방 조직을 칼슘과 포타슘이 포함되지 않은 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)로 3회 세척하였다. 0.075% 콜라게나아제를 처리하고 37℃ 배양기에서 1시간 동안 방치하여 지방조직을 와해시키고 세포를 분리하였다. 우태혈청이 포함된 DMEM 배지를 콜라게네이즈와 동량 첨가하여 250g의 속도로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 가라앉은 침전물에 0.16M NH₄Cl 을 10분간 처리하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구를 제거한 조직에 250g의 속도로 10분간 원심분리하여 얻은 침전물에 DMEM을 넣어 현탁시킨 후, 지름 10cm의 조직배양 접시에 1 X 10⁵씩 분주하여 3~4 일 동안 배양 후 섬유아세포 형태를 나타내는 세포를 선별하여 세포의 상태에 따라(즉, 세포가 70∼80% 가량 조직배양 접시를 채웠을 때) 계대배양 하였다.

실시예 2: 중간엽 줄기세포의 면역학적 표현형 확인

실시예 1에서 얻어진 중간엽 줄기 세포의 면역학적 표현형을 확인하기 위하여 FACS 분석을 실시하였다. 지방조직으로부터 분리하여 4∼5회 계대배양한 후, 얻어진 세포들을 트립신-EDTA를 처리하여 배양 접시로부터 분리·수집하여 각각 1X10⁴씩 1.5ml 튜브에 담아 칼슘과 포타슘이 포함되지 않은 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)로 3회 세척하였다. 중간엽 줄기세포의 특정 마커로 사용될 수 있는 항체들을 각각의 튜브에 처리하여 1시간 동안 방치한 후 FACS용 튜브에 옮겨, FACS 분석기로 세포 표면의 표현형을 확인하였다. 상기 항체로서, 양성 마커로 CD73(PE), CD90(FITC), CD105(FITC), CD166(FITC)을 사용하였고, 음성 마커로는 HLA-DR(FITC), CD34(PE), CD45(PE)을 사용하였다.

상기 FACS 분석 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 지방조직으로부터 분리된 중간엽 줄기 세포는 종래에 골수 유래의 중간엽 줄기 세포와 동일하게, CD73(PE), CD90(FITC), CD105(FITC), 및 CD166(FITC)에 양성을 나타내었으며, HLA-DR(FITC), CD34(PE), 및 CD45에 음성을 나타내었다.

실시예 3: 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화유도

지방조직유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 확인하기 위해, 5∼6회의 계대를 거친 중간엽 줄기세포가 70∼80%가량 채워진 배양 접시에 골아세포 분화유도용 배지를 첨가하고, 주 2회 배지를 교체하며 4주간 배양하였다. 상기 골아세포 분화유도용 배지의 조성은 다음과 같다: 10 %의 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS, Sigma사), 0.1 μM의 덱사메타손(Sigma사), 10 mM의 β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate, Sigma사), 및 0.05 mM의 아스코르브산(Sigma사)이 보충된 저-글루코오즈(low-glucose) DMEM 배지(Gibco BRL사).

실시예 4: 푸코이단을 처리하여 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화유도

푸코이단을 0.1 mg/ml의 농도로 처리한 DMEM 배지를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일한 방법으로 2 주 동안 중간엽 줄기세포의 분화를 유도하였다. 배지를 교환해 줄 때마다, 동일하게 푸코이단을 0.1 mg/ml의 농도로 처리하였다.

시험예 1. 분화유도된 세포의 현미경 관찰

실시예 3 및 4에서 분화유도시킨 세포를 광학 현미경으로 관찰한 결과는 도 2와 같다. 도 2는 실시예 3 및 4에서 2 주간 분화 유도 후 측정한 결과이다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 푸코이단을 함유한 분화용 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하여 분화를 유도할 경우, 2 주만에 골아세포로의 분화가 효과적으로 유도되었음을 알 수 있다. 이에 반하여, 푸코이단을 함유하지 않는 분화용 배지를 사용한 경우에는 2 주 동안 거의 분화가 이루어지지 않았으며(도 2의 가운데), 4 주간 분화를 유도하였을 때 어느 정도의 분화가 이루어짐을 확인하였다 (데이터 미기재).

시험예 2: 분화 확인을 위한 칼슘 침착 측정

실시예 3 및 4에서 2 주간의 분화유도 후, silver-nitrate 염색을 이용한 von Kossa's method(문헌 10)에 따라 Mineralized matrix staining을 통하여, 중간엽 줄기세포가 2주 후 골아세포(osteoblast)로 분화되었는지 여부를 측정하였다. 그 결과는 도 3과 같다.

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 푸코이단을 처리하여 분화를 유도할 경우 효과적으로 중간엽 줄기 세포가 골아세포로 분화되는 것이 촉진되는 것을 알 수 있다.

시험예 3: 골아세포 마커 유전자 발현양상 측정

지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 분화를 확인하기 위해 RT-PCR을 통하여 유전자 발현을 확인하였다. 골아세포로의 분화 마커로 사용되는 유전자로서 콜라겐 타입 I(collagen type I), 오스테오폰틴(Osteopontin), 및 알카라인 포스파테이즈( alkaline phosphatase)를 확인하였다. 각각의 프라이머 및 Tm(Melting temperature)등의 PCR 조건은 하기 표 1과 같고, 그 결과는 도 4와 같다.

유전자	프라이머		서열번호	Tm(℃)
Col I	정방향	5'-GGACACAATGGATTGCAAGG-3'	1	60
Col I	역방향	5'-TAACCACTGCTCCACTCTGG-3'	2	60
OP	정방향	5'-AGCCAGGACTCCATTGACTCGAAC-3'	3	68
OP	역방향	5'-GTTTCAGCACTCTGGTCATCCAGC-3'	4	68
ALP	정방향	5'-ACCATTCCCACGTCTTCACATTTG-3'	5	57
ALP	역방향	5'-AGACATTCTCTCGTTCACCGCC-3'	6	57

도 4에 알 수 있는 바와 같이, 아무 처리도 하지 않은 중간엽 줄기세포 대조군(control)의 경우 분화 마커로 사용되는 유전자가 전혀 발현되지 않았으며, 중간엽 줄기세포에 푸코이단을 처리한 군은 OP와 ALP의 약한 발현을 관찰할 수 있었고, Col I이 강하게 발현되는 것을 확인했다. 또한 분화용 배지와 푸코이단을 함께 처리한 경우, 기존의 분화용 배지와 비교하여 Col I, OP 및 ALP가 강하게 발현하는 양상을 나타냈다. 중간엽 줄기세포에 푸코이단을 첨가한 군과 기존의 분화용 배지를 처리한 군 사이의 유전자 발현양상을 비교했을 때, 분화용 배지보다 배양 배지에 푸코이단을 첨가한 군의 Col I 발현이 강하게 나타났다. 따라서 푸코이단의 첨가에 의해 골아세포로의 분화가 촉진되었음을 알 수 있다.

실시예 5: 덱사메타손-비함유 배지에 푸코이단을 처리하여 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화유도

5∼6회의 계대를 거친 중간엽 줄기세포가 70∼80%가량 채워진 배양 접시에 골아세포 분화유도용 배지에 푸코이단을 처리하여 얻어진 배지를 첨가하고, 주 2회 배지를 교체하며 2주간 배양하였다. 상기 배지의 조성은 다음과 같다: 0.1 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS, Sigma사), 10 mM의 β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate, Sigma사), 및 0.05 mM의 아스코르브산(Sigma사)이 보충된 저-글루코오즈(low-glucose) DMEM 배지(Gibco BRL사). 배지를 교환해 줄 때마다, 동일하게 푸코이단을 0.1 mg/ml의 농도로 처리하였다.

시험예 4. 칼슘 침착 측정 및 골아세포 마커 유전자 발현양상 측정

실시예 3 및 실시예 5에서 2 주간의 분화유도 후, 시험예 2 및 4와 동일한 방법으로 칼슘 침착 및 골아세포 마커 유전자 발현양상을 측정한 결과는 도 5 및 6과 같다.

도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 푸코이단을 처리하여 분화를 유도할 경우 덱사메타손 등의 분화유도물질을 가하지 않음에도 불구하고 효과적으로 중간엽 줄기 세포가 골아세포로 분화되는 것을 알 수 있다. 또한, 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 푸코이단의 첨가에 의해 골아세포로의 분화가 효과적으로 유도되는 것을 알 수 있다.

도 1은 지방조직으로부터 분리한 중간엽 줄기 세포에 대한 면역학적 표현형 분석결과이다.

도 2는 푸코이단 처리 및 비처리 조건에서 지방조직에서 분리한 중간엽 줄기세포를 2 주간 분화 유도시킨 후, 광학 현미경으로 측정한 결과이다.

도 3은 푸코이단 처리 및 비처리 조건에서 지방조직에서 분리한 중간엽 줄기세포를 2 주간 분화 유도시킨 후, 골아세포로의 분화를 silver-nitrate 염색 방법으로 측정한 결과이다.

도 4는 골아세포로 분화 유도된 중간엽 줄기세포의 RNA를 분리하여 골아세포의 특정 마커 유전자를 PT-PCR로 측정한 결과이다.

도 5는 덱사메타손-비함유 배지에서 푸코이단 처리 및 비처리 조건에서 지방조직에서 분리한 중간엽 줄기세포를 2 주간 분화 유도시킨 후, 골아세포로의 분화를 silver-nitrate 염색 방법으로 측정한 결과이다.

도 6은 덱사메타손-비함유 배지에서 푸코이단 처리하였을 때, 골아세포로 분화 유도된 중간엽 줄기세포의 RNA를 분리하여 골아세포의 특정 마커 유전자를 PT-PCR로 측정한 결과이다.

<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for the differentiation of mesenchymal stem cells to osteoblasts and medium for the differentiation thereof <130> PN0150 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggacacaatg gattgcaagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 taaccactgc tccactctgg 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agccaggact ccattgactc gaac 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtttcagcac tctggtcatc cagc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 accattccca cgtcttcaca tttg 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agacattctc tcgttcaccg cc 22

Claims

CD73 양성, CD90 양성, CD105 양성, 및 CD166 양성을 나타내는 인간의 중간엽 줄기 세포를 골아세포(osteoblast)로 분화시키는 방법에 있어서, 골아세포 분화용 배지에 푸코이단(fucoidan)을 가하여 얻어진 배지 중에서 상기 중간엽 줄기 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법.
제1항에 있어서, 상기 푸코이단이 0.1 ∼ 5 mg/ml의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
제1항에 있어서, 상기 골아세포 분화용 배지에 푸코이단을 가하여 얻어진 배지가 푸코이단, 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS), 덱사메타손, β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 및 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈(low-glucose) DMEM 배지임을 특징으로 하는 분화방법.
제3항에 있어서, 상기 골아세포 분화용 배지에 푸코이단을 가하여 얻어진 배지가 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청, 0.1 μM의 덱사메타손, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지임을 특징으로 하는 분화방법.
제1항에 있어서, 상기 골아세포 분화용 배지에 푸코이단을 가하여 얻어진 배지가 분화유도물질을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 분화방법.
제5항에 있어서, 상기 골아세포 분화용 배지에 푸코이단을 가하여 얻어진 배지가 푸코이단, 우태혈, β-글리세로포스페이트, 및 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지임을 특징으로 하는 분화방법.
제6항에 있어서, 상기 골아세포 분화용 배지에 푸코이단을 가하여 얻어진 배지가 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지임을 특징으로 하는 분화방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 골수, 제대혈, 또는 지방 유래의 중간엽 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 분화방법.
제8항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 지방 유래의 중간엽 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 분화방법.
골아세포 분화용 배지에 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단(fucoidan)을 가하여 얻어진, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지.
제10항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지가 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 우태혈청, 덱사메타손, β-글리세로포스페이트, 및 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지임을 특징으로 하는 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지.
제11항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지가 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청, 0.1 μM의 덱사메타손, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지임을 특징으로 하는 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지.
제10항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지가 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 우태혈청, β-글리세로포스페이트, 및 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지임을 특징으로 하는 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지.
제13항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지가 0.1 ∼ 5 mg/ml의 푸코이단, 10 %의 우태혈청, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지임을 특징으로 하는 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화용 배지.