WO2013180431A1

WO2013180431A1 - 피알피를 유효성분으로 포함하는 세포 부착능 및 귀소능 증진용 조성물

Info

Publication number: WO2013180431A1
Application number: PCT/KR2013/004642
Authority: WO
Inventors: 조현철; 김향
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2013-12-05
Also published as: KR20130133612A; US20150118210A1

Abstract

본 발명은 PRP(Platelet-Rich Plasma)를 유효성분으로 포함하는 세포 부착능 및 귀소능 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명은 PRP를 유효성분으로 포함하는 조성물을 생체외 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포의 부착능 및 귀소 능을 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 이식하고자 하는 세포 또는 세포를 이식하고자 하는 부위에 PRP를 전처리하거나, PRP를 이식하고자 하는 세포와 혼합하여 생체내 부위에 이식하면 이식 부위에서 세포의 부착능이 증가하며, 이식 부위에서 손상부위로 세포의 귀소능이 증가한다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

피알파 * 유효성분으로^ᅵ호함하는 세 ί.부착능 및 귀소능 층진용 조성

5 ¾^■

【기술분야 Ϊ

휸 발¾은 PRP* 유 &성 으로 포함하는 세표.부 ^능 ¾ ^소.

진용조성 «에 관한 이다.

10

【배경기술】

최 ¾어: 세포 처: m치료에 이용하는세 치¾기ᅳ 의;약의 새로 패러다¾이 다：^.. 여 1 근아 포,，： ¾。：서 1 ,： 장세 ,섬 뼤 치방 ¾ ， '뉴런, s..등괴 = 같은' ¾화된 ¾직ᅵ 특이적

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그러나, 세 치료^ 임상 적용에 했어^ .가장 요하면 :서 일반적 인 ^제는 세포의 귀소 (homing신체 내: 손상된 조직:이나 부위를 ^아가는- 20 것을 의미함) 및. 생착 (engrafting) 능력이 부족하다는 ¾파 손상되거나 질병. 을 가진 조직 또는 기관와 아노.아키^ (aiioikis) 및 가혹한 미세환경' f 다양^: 한 원인에 의해 이식 ¾ 세포의 생존능 이 1어진다는 것이다 (13). 특히 SDF-1의_. 수용체인 CXCR4와 같은 귀소 수용체가 배양된 간엽세 ¾에서는 사라지 _'기 때문에 백혈구 및 조혈모세표와 비교하였을 때, 귀소에 있어서 비 25 효율적이다 (14).

그러므로, 관심 조직으로 세포흩 표적화하고. 생착시키는 것은 성^적 인 세포 치료에서 증요하다 특히 특정 조직으로의 귀소 능력이 증가된 세포 는 치료 효과를 달성하는데 요구되는 세포의 숫자를 현저하게 줄일 수 있으 며, 귀소 능력의 중가로 인해 세포 배양에 필요한 시간, 비용 및 노력을 줄

30 일 수 있으며 환자에게서도 보다좋은 예후를 기대할 수 있다.

종래 세포의 귀소 및 생착 능력을 증가시키는 다음과 같은 몇 가지

대체용지 (규칙 제 26조) 방법이 알려져 있다: 1) CXCR4와 같은 귀소 수용체의 유전적 암호화 (15， 16), 2) 세포 표면 글리칸의 화학적 엔지니어링 (17)， 3) 2중 특이성 항체 또 는 팔미트산화 단백질 G 또는 A를 통해 세포 표면에 항체 접합 (18) 및 4) 특정 귀소 수용체의 발현을 자극시키는 배양 조건 이용 (19).

세포 치료의 활성화를 위해 생착능 및 귀소능을 증대시킬 수 있는 물 질의 개발이 요구된다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용 이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명 의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

【발명의 상세한설명】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 PRP를 유효성분으로 포함하는 세포 부착 능 및 귀 소능 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 PRP를 유효성분으로 포함하는 조성물을 생체 외 분리된 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포의 부착능 및 귀소능을 개 선하는 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구 범위에 의해 보다 명확하게 된다. 【과제의 해결 수단】

한 양태에서 본원은 PRP(Platelet-Rich Plasma)를 유효성분으로 포 함하는 세포 부착능 및 귀소 (homing)능 증진용 조성물을 제공한다. 본원에 따른 조성물에 포함되는 PRP는 본원에 따른 조성물이 처리되는 세포의 종 류， 생화학적 특징， 이식되는 부위 등에 따라 달라질 수 있으며， 본원에 따른 효과를 달성할 수 있도록 포함된다. 일 구현예에서는 혈장 1 마이크로리터 당 약 2 X 10⁵ - 3 X 10⁸ 개의 혈소판을 포함한다.

본원에 따른 조성물은 이식을 통해， 근골격게의 손상 (injury), 병변ᅳ 또는 질환의 재건 복구 및 /또는 치료에 사용될 수 있다. 일 구현예에서는 줄기세포， 특히 다능성 줄기세포 (multipotent stem cells), 를 들면 다능성 중간엽줄기세포， 다능성 조혈모줄기세포， 다능성 신 경줄기세포， 다능성 내피줄기세포， 다능성 상피줄기세포， 다능성 표피줄기세 포， 역분화 줄기세포， 다능성 근육줄기세포， 다능성 성 체 줄기세포， 다능성 췌장줄기세포， 다능성 심근줄기세포， 다능성 혈관줄기세포， 다능성 모낭줄기 세포， 다능성 각막줄기세포， 다능성 지방줄기세포， 다능성 제대 /제대혈 줄기 세포， 다능성 치 아줄기세포， 다능성 간줄기세포 및 다능성 암줄기세포를 포 함하나， 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 세포의 부착능 및 귀소능을 향상 또는 개선을 위하여 생체외 (in vitro) 분리 된 세포의 전처 리에 사용될 수 있으며， 전처 리된 세포는 세포가 이식 될 생체내 부위에 이식된다. 본원에 따른 조성물은 상기 세포를 이식 하고자 하는 생체내 부위에 또는 상기 세포와 흔합하여 생체내 부위에 적용될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 조성물을 분리된 세포 및 /또는 상 기 세포가 이식될 생체내 부위에 처 리하는 단계를 포함하는 세포의 부착능 및 귀소능을 증진하는 방법을 제공한다.

다른 양태에서 본원은 또한 세포 부착능 및 귀소 (homing)능 증진용 으로 사용되는 PRP (Platelet-Rich Plasma)를 제공한다.

【발명의 효과】

본 발명 의 특징 및 이 점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 PRP를 유효성분으로 포함하는 세포 부착능 및 귀소능 증진용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명에 따르면， 이식하고자 하는 세포 또는 세포를 이식하고 자 하는 부위에 PRP를 전처 리하거나， PRP를 이식하고자 하는 세포와 흔합 하여 생체내 부위 에 이식하면 이식 부위에서 세포의 부착능이 증가하며 , 이 식 부위에서 손상 부위로 세포의 귀소능이 증가한다.

(c) 본 발명은 본 발명의 조성물을 생체외 분리된 세포에 처 리하는 단계를 포함하는 세포의 부착능 및 귀소능을 개선하는 방법을 제공한다. 【도면의 간단한설명】

도 1은 손상 정도에 따른 골연골 조각 (osteochondral plugs)의 조직 학적 차이를 H&E 염색을 수행하여 확인한 그림이다. 손상 정도에 따른 등 급은 다음과 같다: 등급 0， 정상 연골 등급 1， 연골두께의 50% 미만으로 손 상 또는 병변 진행 등급 2， 연골두께의 50%를 초과하여 손상 또는 병변 진 행 등급 3， 손상 또는 병변이 연골하골까지 진행되어 연골하골이 노출된 병 변.

도 2는 2% 아가로스 겔에 골연골 조각의 준비 및 배치를 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 3은 엑스 비보 귀소 (homing) 및 생착 (engraf tment) 분석법에 대 한 실험디자인을 나타낸 모식도이다.

도 4는 플라스틱 배양 접시에 부착된 골수 간엽줄기세포를 현미경으 로 관찰한사진이다.

도 5는 골수 간엽줄기세포 부착에 대한 PRP의 효과를 확인한 그림이 다.

도 6은 플라스틱 배양 접시에 부착된 연골세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 7은 연골세포 부착에 대한 PRP의 효과를 확인한 그림이다.

도 8은 엑스 비보에서 골수 간엽줄기세포의 귀소 및 생착 효과에 대 한 PRP의 효과를 확인한 그림이다.

도 9는 엑스 비보에서 골수 간엽줄기세포의 귀소 및 생착 효과에 대 한 PRP의 효과를 확인한 공초점 현미경 사진이다.

【발명의 실시를위한형태】

본 발명자들은 세포의 부착능 및 귀소능을 효과적으로 향상시킬 수 있는 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 PRP를 세포에 처리 하면 궁극적으로 세포의 부착 및 귀소능력이 매우 효과적으로 향상되는 것 을 발견함으로써 , 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 PRP를 유효성분으로 포함하는 세포 부착능 및 귀소능 증진용 조성물에 관한 것 이다.

본원에 따른 조성물은 특히 세포의 부착능 및 귀소능을 향상시 키기 위해 PRP를 이용하는 것 이다.

혈소판은 그들의 과립 내부에 세가지 중복 단계 (염증단계 (inflammatory phase), 영 양단계 (trophic phase) 및 리모델링 (remodeling)) 를 포함하는 조직 치료 또는 재생과 관련된 염증, 성장인자， 사이토카인， 케 모카인， 접 착 단백질， 단백질 분해효소 및 항-단백질 분해효소 등 다양한 생 활성 물질을 포함한다 (1-3). 염증단계는 상처를 입은 후 2-3일까지 지속되 며， 이 단계에서는 상처부위 의 백혈구 혈관외 유출 및 축적， 단핵구 /대식세 포 활성화가 특징 적으로 나타난다. 신혈관형성은 새로운 조직에 혈류를 촉진 하여 대시 · 활성을 증진시 키기 위해 진행되며， 내피세포는 혈관형성을 시 작하 기 위해 영 양 (trophic) 또는 동화 (anabolic) 단계에서 활성화된다. 세포는 지 지 체로써 피브린 기 질을 이용하여 이동 및 분열하며 콜라겐ᅳ 프로테오글리 칸 및 세포외 기 질의 다른 요소들을 생산하도톡 분화한다. 리모델링 단계에서는 세포 밀도가 감소하며， 손상된 조직 의 전체 대사 활성 이 감소한다. 각 단계 에서， 특이 적 인 신호전달 활성은 단계의 지속 기간을 제한하고 다음 단계로 의 진행을 촉진하는 다른 내생적 신호 (endogenous signals)에 의 해 침묵되 거나 균형 이 맞춰진다.

PRP(Platelet-Rich Plasma)는 혈소판 농축물로 마이크로리터 당 1,000 X 10³ 개이상의 혈소판올 포함하며， 전혈 (whole blood)과 비교하여 혈 소판을 3-5배 더 포함하고 있다 (4). PRP는 생리학적 레벨보다 높은 농도에 서 혈소판 과립내 다양한 생활성 물질올 분비할 수 있다 (5). 또한， PRP는 혈 관 내 손상된 부분을 재건 및 재생하는 기능을 가지고 있기 때문에 성장인 자를 고농축하여 피부재생을 촉진시 키거나 증식치료 (prolotherapy)와 같이 조직 의 재생을 촉진시 키는 촉진제 (stimulants)로 사용하여 피부나 조직 (인대， 건)을 재건 및 재생하므로 관절염， 만성허 리통증， 골반통， 어깨나 무릎인대 손상 등에 효과가 있다고 알려져 있다. PRP는 처음에 악안면 및 성 형수술 분야로 대중화되 었으나 (4)， 현재는 뼈 (6), 연골 (7), 건 (tendon)(8), 인대 (9) 및 근육 (10， 11)과 같은 다양한 조직 의 치료 및 재생을 촉진하고 증진시 키는 것 으로 알려져 있다. 그러나， PRP의 조직 치료에 대한 효과 및 메카니즘에 대 한 연구는 거의 없는 실정 이다 (12). 본 명세서에서 사용된 용어， "PRP(Platelet-Rich Plasma)"는 혈소판 농축물을 말하몌 정상적으로 혈액에서 발견되는 혈소판 농도보다 높은 수준 을 의미한다. 예컨대， 혈소판 농도가 정상 혈액에서의 농도보다 2배， 5배， 10 배， 100배 또는 그 이상일 수 있다.

PRP는 혈소판 이외에 다른 혈액 성분들을 포함할 수 있다. PRP에서 혈소판은 50% 또는 그 이상， 75% 또는 그 이상， 80% 또는 그 이상， 95% 또는 그 이상， 99%또는 그 이상일 수 있다. 혈소판 이외 요소는 혈장， 성장 인자， 백혈구 세포 및 /또는 어떠한 혈액 요소일 수 있다. PRP는 자가조직 (autologous), 동종 이계 (allogeneic) 또는 혈소판 및 /또는 혈장의 원천으로 부터 수득할 수 있다. 바람직하게는 자가 혈장으로부터 수득한다. PRP는 다 양한 동물로부터 수득할 수 있으며， 바람직하게는 인간이다. 본 발명에서， PRP는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 수득 할 수 있다. 사용 시 또는 사용에 앞서 PRP를 활성화시키거나 젤화 등 물리 적 특성을 변화시키는 단계 (예컨대， 트름빈 및 칼슘 처리， 콜라겐 처리， 피 브리노겐을 피브린으로 전환시키는 특정 물질 예를 들어 바트록소빈 둥의 뱀독 등의 처리)를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 따르면， 본 발명의 PRP는 혈장 약 1 마이크 로리터 당 바람직하게는 약 2 X 10⁵ - 3 X 10⁸ 혈소판을 포함하고， 보다 바 람직하게는 약 1 X 10⁶ - 1 X 10⁷의 혈소판을 포함하며， 보다 더 바람직하게 는 약 1 X 10⁶ - 5 X 10⁶ 개의 혈소판을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "부착능"은 세포가 이식부위에 효율적으 로 부착 (adhesion) 또는 생착하는 능력을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사 용된 용어 "세포 부착능 증진"은 세포 이식 효율이 개선되어 목표 조직으로 의 향상된 세포 점착 및 이식거부의 감소 등의 결과가 나타나는 것을 의미 한다.

본 명세서에서 용어"귀소능 "은 세포가 이식부위로부터 손상부위로 효 율적으로 이동하는 귀소 능력 (homing ability)을 말한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물을 배양 접시에 이 식한 세포에 처리하거나， 세포에 전처리 한 후 배양 접시에 이식하면 세포의 부착능이 현저히 증가한다. 또한， 본 발명의 조성물을 전처리한 세포를 손상 된 조직 에 처 리하면 손상된 부위로의 세포 이동이 증가한다.

본 발명의 조성물을 세포 이식 에 사용될 수 있는 다양한 세포에 적용 될 수 있으며， 본원의 조성물이 적용될 수 있는 세포는 줄기세포， 간세포, 췌 장 세포 /췌장모세포， 신장세포， 갑상선세포， 폐세포， 심근세포，근육세포 /근육 모세포 /근위성세포， 골세포 /조골세포 /골모세포 /파골세포， 연골세포 /연골모세 포， 건세포， 인대세포， 활액막세포， 섬유아세포， 피부세포， 내피세포， 모세포 조혈세포， 생식세포， 지 방세포， 상피세포， 피부세포， 진피세포， 모낭세포 /모모 세포 /모기 질세포，신경세포 /신경모세포， 면역세포， 각막세포 또는 망막세포를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서는 줄기세포 또는 연골 세포이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용되는 줄기세포는 다능성 줄기세포이고， 보다 바람직하게는 다능성 중간엽줄기세포， 다능성 조혈모줄기세포， 다능성 신경줄기세포， 다능성 내피줄기세포， 다능성 상피줄기세포， 다능성 표피줄기세포， 역분화 줄기세포, 다능성 근육줄기세포， 다능성 성체 줄기세포， 배아 줄기 세포, 다능성 췌장즐기세포， 다능성 심근줄 기세포， 다능성 혈관줄기세포, 다능성 모낭줄기세포, 다능성 각막줄기세포， 다능성 지방줄기세포， 다능성 제대 /제대혈 줄기세포, 다능성 치아줄기세포， 다능성 간줄기세포 또는 다능성 암줄기세포이며， 보다 더 바람직하게는 다능 성 중간엽줄기세포이다.

본 발명 의 바람직 한 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 손상된 세 포의 재생을 개선시 킨다. 본 발명 의 조성물을 처 리하면 세포의 귀소능이 증 가하여 치료용 세포의 손상된 세포 또는 조직으로의 이동이 증가하고， 치료 용 세포의 이동으로 인해 손상된 세포 또는 조직의 재생이 개선된다.

본 발명의 바람직 한 구현예에 따르면， 본 발명 의 조성물은 세포의 부 착능 및 귀소능을 개선하기 위하여 생체외 (in vitro) 분리 된 세포를 생체외 에 서 전처 리하는데 이용될 수 있다. 하기의 실시 예에서 입증된 바와 같이， 생 체외 분리된 세포에 PRP를 전처 리 한 후, 이 러 한 세포를 이식하면 세포의 부 착능이 현저하게 증가한다.

본 발명의 바람직 한 구현 예에 따르면， 생체외 분리된 세포는 줄기세 포， 간세포， 췌장세포 /췌장모세포， 신장세포， 갑상선세포_ᅤ 폐세포, 심근세포， 근육세포 /근육모세포 /근위성세포， 골세포 /조골세포 /골모세포 /파골세포， 연골 세포 /연골 모세포， 건세포， 인대세포, 활액막세포 섬유아세포， 피부세포， 내 피세포， 모세포， 조혈세포， 생식세포， 지방세포， 상피세포， 피부세포, 진피세 포， 모낭세포 /모모세포 /모기질세포, 줄기세포 또는 연골세포이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 전처리는 5분—3시간， 보다 바람직하게는 10분— 2 시간， 보다 더 바람직하게는 10분 -30분 동안 실시한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "생체외"는 세포를 살아있는 유기체로부 터 제거하고 그 유기체의 외부 (예컨대， 시험관내)에서 조작하는 과정을 지칭 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 세포를 이 식하고자 하는 생체내 부위에 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 세포를 이식하고자 하는 생체내 부위에 먼저 적용시킨 다음， 세포를 이식하면 해당 부위의 세포 부착능 및 귀소능이 증가된 상태이므로 이식한 세포의 생착률 이 증가하고， 이식 부위로세포의 이동이 효과적으로 유도된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 이식하고 자 하는 세포와 흔합하여 생체내 부위에 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물 을 이식하고자 하는 세포에 전처리한 후， 적용하고자 하는 생체내 부위에 이 식하면 이식한 세포의 증가된 부착능으로 인해 생착률이 증가한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 이식에 이용되는 세포는 줄기 세포， 간세포， 췌장세포 /췌장모세포, 신장세포， 갑상선세포， 폐세포， 심근세포， 근육세포 /근육모세포 /근위성세포, 골세포 /조골세포 /골모세포 /파골세포， 연골 세포 /연골모세포， 건세포， 인대세포， 활액막세포， 섬유아세포， 피부세포， 내피 세포， 모세포， 조혈세포, 생식세포， 지방세포, 상피세포， 피부세포， 진피세포， 모낭세포 /모모세포 /모기질세포， 신경세포 /신경모세포， 면역세포, 각막세포 또 는 망막세포이고， 보다 바람직하게는 줄기세포 또는 연골세포이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 본 발명의 조성물이 적용된 세 포는 손상된 조직으로의 증가된 귀소능을 갖는다. 본 발명에 따르면 손상된 골연골 조각에 본 발명의 조성물을 전처리한 세포를 처리하면 세포가 골연 골 조각의 손상 및 퇴행성 변화가 진행된 연골 표면으로 효과적으로 이동하 며， 특히 손상 정도가 심한 조직으로 세포의 이동이 증가한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상기 조성물을 생체외 분 리된 세포 및 /또는 세포를 이식하고자 하는 생체내 부위에 처리하는 단계를 포함하는 세포의 부착능 및 귀소능을 개선하는 방법을 제공한다. 상기 방법 은 상기 처 리 돤 세포를 세포 치료가 필요한 부위에 이식하는 단계를 추가로 포함한다. 본 방법에서 상기 생체외 분리 된 세포는 앞서 언급한 바와 같다. 이하， 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명 하기 위 한 것으로， 본 발명 의 요지 에 따라 본 발명 의 범 위 가 이들 실시 예에 의 해 제한되 지 않는다는 것은 당업 계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예 ]

[실험재료 및 방법 ]

간엽줄기세포 (Mesenchymal stem cells)

인간 간엽줄기세포는 표준 절차를 준수하여 골수로부터 추출하였다. Ficoll-PaqueTM PREMIUM를 이용하여 원심 분리를 통해 단핵 세포를 분리 하고， 2회 세척 한 후 10% 우태아혈청 (HyCIone, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), 100 U/ml 페니 실린 /100 ug/ml 스트렙토마이신 (HyCIone, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, 미국)을 추가적으 로 포함하는 DMEM-LG(HyClone, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, 미국)에 부유시 키고 1X 10⁶ 세포 /cm² 로 분주한 다음， 37°C, 5% C0₂ 가습 조건에서 배양하였다. 배지는 세포 분주 후 1일 또는 2일에 교체하고 그 다음부터는 3일마다 교체하였다. 약 80%의 세포군집 (confluence)을 나 타내면 1 :3의 비율로 계대배양하였다. 연골세포 (Chondrocytes)

연골은 칼슘 및 마그네슘이 첨가되지 않은 PBS(phosphate buffered saline, DPBS)로 세척하여 잘게 간 후， 항생제 -항진균제 용액 (100 U/mL 페 니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신 및 0.25 mg/ml 암포테리신 B; Life Technologies)을 포함하는 DMEM(high— glucose Dulbecco ' s Modified Eagle's Medium, Life Technologies, Rockville, MD)에 0.6% 콜라겐분해효 소 (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 37 ^°C에서 6시간 동안 연골세포 가 방출되도록 하였다. 100 mm 나일론 체 (BD, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 갈리지 않은 연골을 제거 한 후， 원심분리하여 연골세포를 수득하고 2회 세척 한 후， 10% 우태아혈청 (FBS, Life Technologies), 25 mg/ml L-아 스코르브산 (Sigma) 및 100 U/ml 페니실린 /100 g/ml 스트렙토마이신 (HyClone; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 추가적으로 포함하는 DMEM으로 부유시 킨 다음， 100 mm 조직 배양접 시 에 분주하고 37°C, 5% C0₂ 가습 조건에서 7일간 배양하였다. 배지는 세포 분주 후 1일 또는 2일에 교체하고 그 다음부터는 3일마다 교체하였다. 약 80%의 세포군 집 (confluence)을 나타내면 1 :3의 비율로 계대배양하였다. 세포는 부착 실험 어 1 이용하기 전에 트립신- EDTA(0.25% 트립신, 0.53 mM EDTA; Life Technologies)를 5분간 처 리하여 분리시 키 고， 배양배지로 2회 세척 한 후 배 지 , PBS 또는 PRP로 부유시 켰다. 2-5회 계대 배양된 세포를 실험 에 사용하 였다.

PRP 준비

PRP는 표준 수집 프로그램에 따라 백혈구제거 세트 (COBE spectra LRS Turbo; Caridian BCT, Lakewood, CO, USA)를 갖는 혈소판분리 반출 시스템을 이용하여 환자들로부터 수득하였다 (20). 최종산물에서 혈소판의 농 도는 마이크로리터 당 1,400 X 103 이 었다. 제조사의 지시에 따라 항웅혈제 로써 식 염수 및 ACDA(anti-coagulant acid citrate dextrose)를 준비하였다. 전혈구 수 (complete blood counts)를 측정하기 위해 분주하였다. 실험 수행 을 위해 PRP 내 혈소판 수는 마이크로리터 당 1，000 X 10³ 으로 조정하였 고 (20)， 필요에 따라 회석하거나 농축하여 사용하였다. PRP를 활성화시 키기 위해 166.7 IU/ml 트롬빈 (Re yon Pharmaceutical, 한국)을 포함하는 10% 칼 슘 글루콘산염을 1: 10 부피 /부피로 PRP에 첨가하였다. 대조군 세포에는 식 염수만을 처 리하였다.

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인 비트로 귀소 (homing) 및 생착 (engraftment) 분석법

세포는 식 염수 (대조군)로 부유시 키거나， PRP를 세포에 처 리하거나 또 는 플레이트로 이식하기 전에 세포에 전처 리하였다: 대조군， 식 염수로 부유 시킴 PRP, PRP로 부유시 킴 10분간 PRP를 전처 리 (전처 리는 세포 이식 전에 세포를 PRP로 부유시는 것을 의 미 함)， 이식 전 세포에 10분간 PRP를 전처 리함 30분간 PRP 전처 리， 이식 전 세포에 30분간 PRP를 전처 리 함. 48-웰 플레이트에 세포를 분주하고 2.5， 5， 10， 15， 20， 30 및 60분 동안 37°C, 5% C0₂ 가습 조건에서 배양하였다. 각 시 간별로 비 -부착세포를 제거 하기 위해 2회 세척하였다. 부착세포의 수는 이 미지 프로세싱 프로그램을 이용하여 측 정하였다. 액스 비보 귀소 및 생착 분석법

실험 디자인은 도 3에 나타낸 바와 같다. 골연골 디스크 준비

골연골 조직편 (Osteochondral block)은 공지된 방법에서 조금 수정된 방법에 따라 무릎관절 치환수술올 받는 환자의 근위 경 골 (proximal tibia)로 부터 절단하였다. 근위 경골의 관절연골 표면을 관찰하고， 관찰 부위를 수정 된 국제연골재생학회 (International Cartilage Repair Society, ICRS) 등급에 따라 손상 정도를 평가하였다: 등급 0, 정상 연골 등급 1， 연골두께의 50% 미만으로 손상 또는 병 변 진행 등급 2ᅳ 연골두께의 50%를 초과하여 손상 또는 병 변 진행 등급 3， 손상 또는 병 변이 연골하골까지 진행되 어 연골하골 이 노출된 병 변.

골연골 조각 (osteochondral plug)은 관상톱바 (Trephine burr)를 이용 하여 원통형 (지름 4.0 mm 및 높이 4.0 mm)이 되도록 절단하였다. 등급에 따른 관절연골 표면의 대표적 인 조직학적 특징은 도 1과 같다. 골연골 조각 은 -8CTC에 보관하였으며， 사용하기 1시 간 전에 DPBS에 담가 상온에서 녹 였다. 시각적 등급 평 가에 따른 가변성은 수차례 등급 평가 (샘플 수령시 2차 례 등급 평 가 실시， 디스크로 절단하고 실험에 이용할 때 모든 샘플을 확인 함)를 수행하여 극복하였다. 골연골 조각은 2% 아가로스를 이용하여 35 mm 배양 접 시에 이식 하였다 (도 2).500 ml 병 에 2 g의 아가로스를 넣은 후 100 ml의 0.5 X TBE 버퍼를 넣고 잘 흔합하고， 전자렌지에서 2분간 가열하여 아 가로스를 용해시 킨 후 식히고 35 mm 배양 접시 바닥이 잠기도록 조심히 부 었다. 골연골 조각은 배양 접시 벽면의 위쪽을 향하도록 배치하였다: 둥급 0 의 조각은 4분면에서 우측 상단， 둥급 1의 조각은 우측 하단, 등급 2의 조각 은 좌측 하단， 등급 3의 좌측 상단. 골연골조각에서세포의 귀소 및생착

골수 유래 간엽 즐기세세포를 배양접시로부터 떼어낸 후， DPBS로 2 회 세척하고 5 X 10⁶ 세포 /ml 농도가 되도록 DMEM-LG로 부유시켰다. 1 mM 칼세인 AM 스특을 첨가하고 조심스럽게 흔합한 후， 30분간 37°C에서 배양하였다. 세포는 DPBS로 2회 세척한 후 식염수 (대조군)로 부유시키거나， PRP를 처리하였다: 대조군， 식염수로 부유시킴 PRP, PRP로 부유시킴 10분 간 PRP 전처리， 이식 전 10 분간 세포에 PRP를 전처리함 30분간 PRP 전 처리， 이식 전 30분간 세포에 PRP를 전 처리함. 세포를 골연골 조각이 담긴 배양 접시에 1.0 X 10⁴ 세포 /mm² 로 분주하고， 15분 동안 37°C, 5% C0₂ 가 습 조건에서 배양하였다. 배양 후 배양 접시를 4회 세척한 다음， 형광을 확 인하기 위해 스캐너 (typhoon 9410 scanner, GE Healthcare)로 이미지를 촬 영하였다. 이미지는 ImageQuant로 정량화하였다. 골연골 조각은 lx PBS(4% 파라포름알데히드 포함)를 포함하는 96 웰 플레이트에 관절연골 표 면이 풀레이트의 아래쪽에 오도록 이동시켰다. 세포는 공초점 레이저현미경 (Carl Zeiss, 독일)를 이용하여 촬영하였다. 이미지는 이미지 분석시스템 (Carl Zeiss, 독일)을 이용하여 캡쳐하였다. 통계학적분석

모든 데이터값은 평균 및 표준편차로 표현하였다. 차이유의성은 독립 t_검정 및 일원변량분성을 이용하여 판단하였다. 사후 분석에서 던넷 검정 (Dunnett test)은 대조군 비교를 위해 사용되었으며， 터키 검정 (Tukey's test)는 PRP 및 10분 및 30분간 PRP 전처리에 대한 비교를 위해 사용되었 다. P < 0.05는 통계적 유의성을 갖는 것으로 판단하였다. 실험결과

인 비트로 귀소 및생착분석법

세포 종류에 상관없이 PRP의 사용은 시간-의존적 방식으로 세포 부 착을 증가시켰다 (도 4-7). 30분간 PRP를 전처리 하였을 경우， 세포 부착이 가장 증가하였고 그 다음으로 10분간 PRP 전처리， PRP 처리 및 대조군 순 으로 세포 부착이 증가하였다.

골수 간엽즐기세포 부착은 배양 시간에 의존적으로 증가하였으며, PRP사용에 의해 보다 증가되었다. 60분간 배양한 대조군의 세포수는 20분 간 배양한 PRP 처리군과 비슷한 수준을 나타냈으며， 10분 및 30분간 PRP 를 전처리한 군을 10분간 배양하였을 때보다 조금 많았다. 대조군에서 60분 동안 배양 접시에 부착된 세포는 57.11%였다. 반면， PRP를 10분 또는 30분 간 전처리한 군에서 부착 세포의 수는 큰 차이를 나타내지 않았으며 배양 15분 및 20분 후에 각각 정체기 (plateau)에 도달하였다 (도 4).

연골세포 부착은 배양 시간에 의존적으로 증가하였으며， PRP 사용에 의해 보다 증가되었다. 60분간 배양한 대조군의 세포수는 30분간 배양한 PRP 처리군과 비슷한 수준을 나타냈으며, 10분 및 30분간 PRP를 전처리한 군을 각각 10분 및 20분간 배양하였을 때와 비슷한 수준을 나타냈다. 대조 군에서 60분 동안 배양 접시에 부착된 세포는 76.56%였다. 반면， PRP 처리 군 및 10분간 PRP를 전처리한 군은 배양 60분 후에 정체기에 도달했으며， PRP를 30분간 전처리한 군을 배양 30분 만에 정체기에 도달하였다 (도 5). 골수유래간엽줄기세포

각 시간 포인트에서 처리군 사이의 세포 부착 정도를 비교한 결과는 표 1， 도 4 및 5와 같다. 2.5분 및 5분에서는 처리군 사이에 유의한 차이는 없었으나 10, 15， 20， 30 및 60분에서는 처리군 사이에 유의한 차이가 있었 다.

[표 1]

골수유래 간엽줄기세포의 배양조건별부착비율비교

10분 배양 시， 30분간 PRP 전처리한 군이 다른 3군에 비해 유의하게 세포 부착이 증가되었다 (모든 P < 0.001). 대조군， PRP 처리 및 10분간 PRP 전처리군 사이에는 유의한 차이가 없었다. 15분 배양 시， 10분 및 30분 간 PRP를 전처리한 군은 대조군과 유의한 차이를 보였다 (P = 0.001 및 < 0.001, 각각). PRP 및 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었으며 (P = 0.204), 30분간 PRP를 전처리한 군은 PRP 및 10분간 PRP를 전처리한 군과 유의한 차이를 보였다 (P < 0.001 및 0.012， 각각). 20분 배양 시， 10분 및 30분간 PRP를 전처리한 군은 대조군과 유의한 차이를 보였으나 (모든 P < 0.001)， PRP 및 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었다 (P =0.734). 30분간 PRP를 전처리한 군은 PRP와 유의한 차이를 보였다 (P < 0.001). 30분 배양 시， 10 분 및 30분간 PRP를 전처리한 군은 대조군과 유의한 차이를 보였으나 (모든 P < 0.001), PRP 및 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었다 (P = 0.193).

30분간 PRP를 전처리한 군은 PRP와 유의한 차이를 보였다 (P < 0.001). 60분 배양 시， PRP 처리， 10분 및 30분간 PRP를 전처리한 군이 대 조군과 유의한 차이를 보였으나 (P = 0.041, = 0.381, 및 < αοοι, 각각)， 서 로간에는 유의한 차이를 보이지 않았다. 연골세포

각 시간 포인트에서 처리군 사이의 세포 부착 정도를 비교한 결과는 표 2， 도 6 및 7과 같다. 2.5분 및 5분에서는 처리군 사이에 유의한 차이는 없었다.10 15 20 30 및 60분에서는 처리군 사이에 유의한 차이가 있었다.

연골세포의 배양조건별 부착비율비교

10분 배양 시， 30분간 PRP를 전처리한 군이 대조군 및 10분간 PRP 를 전처리한 군에 비해 유의하게 세포 부착이 증가되었다 (P = 0.005 및 0.029， 각각). PRP ^'처리군 및 10분간 PRP를 전처리한 군 사이에는 유의한 차이가 없었다. 15분 배양 시， 30분간 PRP를 전처리한 군은 대조군 및 PRP 처리군과 유의한 차이를 보였으나 (P < 0.001 및 = 0.002), 10분간 PRP를 전 처리한 군과는 유의한 차이가 없었다 (P = 0.088). 20분 배양 시, 10분 및 30분간 PRP를 전처리한 군은 대조군과 유의한 차이를 보였으나 (P < 0.001 & = 0.001)， PRP 및 대조군 사이에는 유의한 차이가없었다 (P = 0.513). 10 분 및 30분간 PRP를 전처리한 군은 PRP와 유의한 차이를 보였다 (P = 0.032 및 < 0.001， 각각). 30분 배양 시， 10분 및 30분간 PRP를 전처리한 군은 대조군과 유의한 차이를 보였으나 (P < 0.001 및 = 0.015), PRP 및 대 조군 사이에는 유의한 차이가 없었다 (P = 0.142). 30분간 PRP를 전처리한 군은 PRP처리군 및 10분간 PRP를 전처리한 군과 유의한 차이를 보였다 (P < 0.001 및 =0.005, 각각).60분 배양 시， PRP 처리군 및 30분간 PRP를 전 처리한 군이 대조군과 유의한 차이를 보였다 (P = 0.001 및 < 0.001， 각각). 30분간 PRP를 전처리한 군은 PRP 처리군 및 10분간 PRP를 전처리한 군과 유의한 차이를 보였다 (P = 0.001 및 < 0.001， 각각). 액스 비보 귀소 및생착분석법

이식된 골수 유래 간엽줄기세포는 골연골 조각으로 이동 및 부착되었 다 (도 8-9). 세포 귀소 및 생착은 골연골 조각의 병변 정도 및 PRP의 치료 에 따라 증가하였다. 인 비트로 결과와 일관되게 30분간 PRP를 전처리 한 경우， 세포 부착이 가장 증가하였고 그 다음으로 10분간 PRP를 전처리한 군， PRP를 처리한 군 및 대조군 순으로 세포 부착이 증가하였다. 세포 귀소 및 생착은 연골의 손상 정도에 의존적으로 증가하였으며， PRP를 사용한 경 우 더욱 증가하였다ᅳ 등급 G1-G3의 손상된 연골은 PRP를 처리하였을 때 (PRP 전처리 여부와 상관없이)， 세포 귀소 및 생착능이 증가하였다 (도 9).

참고문헌

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21. Jo, C.H., Kim, E.M., Ahn, H.J., Kim, H.J., Seong, S.C., and Lee, M.C. 2006. Degree of degeneration and chondroitinase ABC treatment of human articular cartilage affect adhesion of chondrocytes. Tissue Eng 12: 167-176.

22. Brittberg, M., and Peterson, L. 1998. Introduction of an articular cartilage classifiction. ICRS News letter 1:5一 8. 이상으로 본 발명의 특정 한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업 계의 통상의 지식을 가진 자에 게 있어서 이 러 한 구체적 인 기술은 단지 바람직 한 구현예 일 뿐이 며， 이 에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명 백하 다. 따라서， 본 발명 의 실질적 인 범위는 첨부된 청구항과 그의 둥가물에 의 하여 정의된다고 할 것 이다.

Claims

【청구범위】

【청구항 1】

PRP(Platelet-Rich Plasma)를 유효성분으로 포함하는 세포 부착능 및 귀소 (homing)능 증진용 조성물.

【청구항 2】

제 1 항에 있어서， 상기 PRP는 혈장 1 마이크로리터 당 2 X 10⁵ - 3 X 10⁸ 개의 혈소판을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

【청구항 3】

제 1 항에 있어서， 상기 세포는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성 물

【청구항 4】

제 3 항에 있어서， 상기 줄기세포는 다능성 줄기세포 (multipotent stem cells)인 것올 특징으로 하는 조성물.

【청구항 5】

제 4 항에 있어서， 상기 다능성 줄기세포는 다능성 중간엽줄기 세포， 다능성 조혈모줄기세포， 다능성 신경줄기세포, 다능성 내피줄기세포, 다능성 상피줄기세포， 다능성 표피줄기세포， 역분화 줄기세포， 다능성 근육줄기세포， 다능성 성 체 줄기세포, 다능성 췌장줄기세포， 다능성 심근줄기세포， 다능성 혈관줄기세포， 다능성 모낭줄기세포， 다능성 각막줄기 세포， 다능성 지방줄기 세포, 다능성 제대 /제대혈 줄기세포， 다능성 치아줄기세포， 다능성 간줄기세 포 및 다능성 암줄기세포로 구성 된 군으로부터 선택되 는 것을 특징으로 하 는 조성물.

【청구항 6】

제 1 항에 있어서， 상기 조성물은 세포의 부착능 및 귀소능을 개선하 기 위하여 생체외 (in vitro) 분리 된 세포를 전처 리하는 데 이용되는 것을 특 징으로 하는 조성물.

【청구항 7】

제 1 항에 있어서， 상기 조성물은 상기 세포를 이식하고자 하는 생체 내 부위에 적용되는 것을 특징으로 하는 조성물.

【청구항 8】

제 1 항에 있어서， 상기 조성물은 이식하고자 하는 상기 세포와 흔합 하여 생체내 부위 에 적용되는 것을 특징으로 하는 조성물.

【청구항 9】

제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 세포는 손상된 조직으로의 증가된 귀소능을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물. 【청구항 10】

제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 조성물을 분리된 세포 및 /또 는 상기 세포가 이식 될 생체내 부위에 처 리 하는 단계를 포함하는 세포의 부 착능 및 귀소능을 증진하는 방법 . 【청구항 11】

세포 부착능 및 귀소 (homing)능 증진용의 PRP (Platelet-Rich Plasma).