KR20120094981A - 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법 - Google Patents

골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법 Download PDF

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이수만
박수정
임대석
이윤미
이선희
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Abstract

본 발명은 중간엽 줄기 세포; 및 푸코이단, 수라민, 및 화학식 2의 화합물(NF157)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 분화유도제를 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 분화유도제로서 수라민 또는 화학식 2의 화합물(NF157)을 사용하여 중간엽 줄기 세포를 골아세포(osteoblast)로 분화시키는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법을 제공한다.

Description

골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법{Pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases and method for the differentiation of mesenchymal stem cells to osteoblasts}
본 발명은 중간엽 줄기 세포 및 분화유도제를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 분화유도제를 사용한 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법에 관한 것이다.
중간엽 줄기 세포는 골수, 제대혈, 지방조직 등으로부터 분리할 수 있는 세포로서, 조직의 재생에 중요한 역할을 하는, 인체 조직세포로 분화되기 직전의 원시세포를 말한다. 상기 중간엽 줄기 세포는 뼈, 연골, 지방, 혈관, 간 등으로 분화가 가능한 세포이다. 중간엽 줄기 세포를 추출할 수 있는 많은 조직 중, 가장 대표적인 조직은 골수와 제대혈, 태아 조직, 지방조직 등이 있다. 이 중 특히, 지방유래 중간엽 줄기 세포는 골수유래 중간엽 줄기 세포와 같은 특성을 지니면서 지방 흡입술 시술 후 버려지는 조직으로부터 얻을 수 있고 비교적 분리가 용이하다는 장점을 가지고 있다.
현재 중간엽 줄기 세포를 조직공학적으로 적용하기 위한 방법에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나 중간엽 줄기 세포를 이용한 세포치료의 효과를 증대시키기 위하여 첨가되는 분화유도 물질들(즉, 분화유도제)은 이식 후, 또는 체내 투여시 인체에 영향에 관여하는 안전성과 효율성 면에서 여전히 문제점을 안고 있다. 예를 들어, 중간엽 줄기 세포의 골아 세포로의 분화를 유도하는 물질로는 덱사메타손, 골형성 단백질(Bone Morphogenetic Proteins: BMPs) 등이 알려져 있으나, 덱사메타손은 스텔이드 계통으로 체내에 투여될 경우에는 시상하부-뇌하수체-부신 축 억제가 일어날 수 있으며, 상대적으로 감염의 발생을 증가시키고, BMP의 경우 단백질로서 투여가 어렵고 국소적 또는 전신적으로 부작용을 초래할 가능성 때문에 임상적 적용에 한계를 갖고 있다(Wang EA : Bone morphogenetic proteins (BMPs) : Therapeutic potential in healing bony defects, Trends Biotechnol 11: 379-383, 1993). 특히 BMP 유전자를 줄기세포에 발현하여 뼈세포로 강력히 유도하여 골 치료에 이용을 시도한 바 있으나(국제특허공개 제WO2003/083079호; 및 Jai-Sun Lee, Electroporation-mediated transfer of Runx2 and Osterix genes to enhance osteogenesis of adipose stem cells 2010, Biomaterials), 유전자 도입으로 인한 안정성 문제로 인체에 임상으로 이용의 한계를 가지고 있다. 이러한 안정성의 문제를 회피하기 위해, 체외에서 중간엽 줄기세포에 분화 유도제를 사용하여 골아세포로 분화 시킨 후, 얻어진 골아세포를 생체에 적용하는 시도에 머물고 있는 실정이다 (Giorgio Burastero; The association of human mesenchymal stem cells with BMP-7 improves bone regeneration of critical-size segmental bone defects in athymic rats. Bone, Vol. 47, Issue 1, Pages 117-126).
본 발명자들은 중간엽 줄기 세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있는 분화유도제를 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였으며, 그 결과 수라민(suramin) 및 수라민의 유도체인 NF157이 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화를 효과적으로 촉진한다는 것을 발견하였다. 특히, 놀랍게도 푸코이단, 수라민, 또는 NF157을 중간엽 줄기 세포와 함께 생체에 투여하였을 때, 생체내에서 안전성 문제를 야기함 없이 골아 세포가 효과적으로 생성됨으로써 골질환의 세포 치료 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 중간엽 줄기 세포 및 분화유도제로서 푸코이단, 수라민, 또는 NF157을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 수라민, 또는 NF157을 사용하여 중간엽 줄기 세포를 골아세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 중간엽 줄기 세포; 및 푸코이단(fucoidan), 수라민(suramin), 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 분화유도제를 포함하는, 골다공증, 골암, 관절염, 구루병, 골절, 치주 질환, 분절성 골 결손, 골용해성 골질환, 원발성 및 속발성 부갑상선기능항진증, 파제트병, 골연화증, 및 과골증으로 이루어진 군으로부터 선택된 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다:
<화학식 2>
Figure pat00001
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 분화유도제는 수라민 또는 화학식 2의 화합물일 수 있으며, 상기 분화유도제는 106?109 cells/ml의 중간엽 줄기 세포와 함께 1 내지 10 uM의 농도로 바람직하게 존재할 수 있다. 또한, 상기 분화유도제는 푸코이단일 수 있으며, 상기 푸코이단은 106?109 cells/ml의 중간엽 줄기 세포와 함께 0.1 내지 1 mg/ml의 농도로 바람직하게 존재할 수 있다. 상기 중간엽 줄기 세포는 CD73 양성, CD90 양성, CD105 양성, 및 CD166 양성을 나타내는 인간의 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 중간엽 줄기 세포는 골수, 제대혈, 태반 또는 지방 유래의 중간엽 줄기 세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 지방 유래의 중간엽 줄기 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 분화유도제로서 수라민 또는 하기 화학식 2의 화합물의 존재하에서 중간엽 줄기 세포를 배양하여 중간엽 줄기 세포를 골아세포(osteoblast)로 분화시키는 것을 포함하는, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법이 제공된다:
<화학식 2>
Figure pat00002
본 발명의 분화방법은 1 내지 10 uM의 수라민 또는 화학식 2의 화합물, 5?20 중량%의 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS), 5?20 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.01?0.1 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈(low-glucose) DMEM 배지 중에서 중간엽 줄기 세포를 배양하여 중간엽 줄기 세포를 골아세포로 분화시킴으로써, 바람직하게 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 분화방법은 1 내지 10 uM의 수라민 또는 화학식 2의 화합물, 10 중량%의 우태혈청, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지 중에서 중간엽 줄기 세포를 배양하여 중간엽 줄기 세포를 골아세포로 분화시킴으로써 수행된다. 본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포는 CD73 양성, CD90 양성, CD105 양성, 및 CD166 양성을 나타내는 인간의 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 중간엽 줄기 세포는 골수, 제대혈, 태반 또는 지방 유래의 중간엽 줄기 세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 지방 유래의 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 또한, 상기 배양은 106?109 cells/ml의 중간엽 줄기 세포를 사용하여 바람직하게 수행될 수 있다.
본 발명에 의해, 수라민 및 그의 유도체인 NF157이 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화를 효과적으로 촉진한다는 것이 밝혀졌다. 특히, 푸코이단, 수라민, 또는 NF157을 각각 중간엽 줄기 세포와 함께 생체에 투여하였을 때, 생체내에서 안전성 문제를 야기함이 없이 골아세포가 효과적으로 생성되어 칼슘이 침착됨으로써 골질환의 예방 및 치료 활성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 기존 덱사메타손, BMP 단백질 등으로 인한 안전성 문제를 회피하면서 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 분화방법은 골아세포 이식을 통한 골질환 치료에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 덱사메타손, BMP, 수라민, NF157, 또는 푸코이단을 첨가하여 골아세포로 분화 유도시킨 지방유래 중간엽 줄기 세포로부터 골아세포의 특정 마커 유전자의 발현양을 실시간-PCR로 측정한 결과이다.
도 2는 덱사메타손, BMP, 수라민, NF157 또는 푸코이단을 지방유래 중간엽 줄기 세포와 혼합하여 5주령 생쥐의 생체내에 투여(피하 주입)하고, 회수한 분화유도된 조직을 나타낸다.
도 3은 덱사메타손, BMP, 수라민, NF157 또는 푸코이단을 지방유래 중간엽 줄기 세포와 혼합하여 5주령 생쥐의 생체내에 투여(피하 주입)하였을 때, 생체로부터 얻어진 지방유래 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화에 따른 칼슘 침착을 본 코사 염색(Von Kossa staining)을 통하여 측정한 결과이다.
본 발명은 중간엽 줄기 세포; 및 푸코이단, 수라민, 및 NF157로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 분화유도제를 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 "푸코이단(fucoidan)"은 식용으로 이용하고 있는 미역, 다시마 등의 갈조류에서 발견된 수용성 식이섬유의 일종으로 건조 갈조류당 약 4-5% 함유되어 있으며, 항혈전생성, 항암, 항염증, 항알러지, 항치매, 항바이러스, 항당뇨, 항비만 활성을 갖는 것으로 보고된 바 있다. 푸코이단은 황산화된 푸코우즈-함유 다당류(sulfated fucose-containing polysaccharides)를 총칭한다. 푸코이단은 이를 함유하는 갈조류로부터 종래의 방법(일본특허공개 평04-91027 등)에 따라 얻을 수 있다. 푸코이단은 글루쿠론산-함유 푸코이단(glucuronic acid-containing fucoidan, U-fucoidan) 및 글루쿠론산-비함유 푸코이단(glucuronic acid non-containing fucoidan, F-fucoidan)으로 나눌 수 있으며, 본 명세서에서 상기 "푸코이단(fucoidan)"은 이들 모두를 포함한다. 또한, 푸코이단은 갈락토오스, 우론산, 만노스, 자일로스 등과 결합된 형태로 존재할 수 있으며, 본 명세서에서 상기 "푸코이단(fucoidan)"은 상기 형태의 푸코이단을 모두 포함한다. 상기 푸코이단의 분자량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 분자량이 약 20만 정도일 수 있으나, 당쇄 등에 의해 다양한 분자량을 가질 수 있다.
상기 "수라민(Suramin)"은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물(C51H34N6O23S6)로서, 퓨린성 수용체(purinergic receptor)의 비특이적 길항제이다. 수라민은 수면병, 사상충에 의한 질환 등에 치료제로서 사용되며, 주 1회, 회당 1g의 농도로 6주간 정맥 주사로 투여하는 방법이 허가되어 있다.
Figure pat00003
상기 NF157은 하기 화학식 2의 구조를 갖는 화합물로서, 수라민 유도체이며, 퓨린성 수용체 중 P2Y11 특이적 길항제로 알려져 있다.
Figure pat00004
상기 골질환은 골손실(bone loss)로부터 야기되는 질환을 포함하며, 예를 들어, 골다공증(osteoporosis), 골암(bone cancer), 관절염(arthritis), 구루병(rickets), 골절(bone fracture), 치주 질환(periodontal disease), 분절성 골 결손(bone segmental defects), 골용해성 골질환(osteolytic bone disease), 원발성 및 속발성 부갑상선기능항진증(primary and secondary hyperparathyroidism), 파제트병(Paget's disease), 골연화증(osteomalacia), 과골증(hyperostosis) 등을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 분화유도제는 수라민 또는 화학식 2의 화합물일 수 있으며, 상기 분화유도제는 106?109 cells/ml의 중간엽 줄기 세포와 함께 1 내지 10 uM의 농도로 바람직하게 존재할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 분화유도제는 푸코이단일 수 있으며, 상기 푸코이단은 106?109 cells/ml의 중간엽 줄기 세포와 함께 0.1 내지 1 mg/ml의 농도로 바람직하게 존재할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 함유되는 상기 중간엽 줄기 세포는 인간의 성체 세포 유래의 중간엽 줄기 세포 모두를 포함하며, 면역학적 표현형이 CD73 양성, CD90 양성, CD105 양성, 및 CD166 양성인 특성을 갖는 중간엽 줄기 세포를 제한없이 포함한다. 상기 중간엽 줄기 세포는 골수, 제대혈, 또는 지방 유래의 중간엽 줄기 세포일 수 있으며, 바람직하게는 지방(지방세포 또는 조직) 유래의 중간엽 줄기 세포일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 상기한 바와 같이 중간엽 줄기 세포 및 푸코이단, 수라민, 및 NF157로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 분화유도제를 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 동결건조제 등의 비경구용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라 BD MatrigelTM Matrix (BD biosciences 사) 등과 같은 통상의 지지체를 가할 수 있으며, 기타 통상의 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포의 투여량은 골질환 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 투여형태, 투여경로 및 기간에 따라 상이하지만, 예를 들면, 상기 중간엽 줄기 세포는 1회 투여시 105 내지 108 cells/ml의 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기 세포와 함께, 수라민 또는 화학식 2의 화합물은 1 내지 10 uM의 용량으로 투여될 수 있으며, 푸코이단은 0.1 내지 1 mg/ml의 농도의 용량으로 투여될 수 있으나, 상기 용량 범위는 중간엽 줄기 세포의 세포수에 따라 상이할 수 있다. 또한, 액제, 현탁액, 에멀젼 등의 액상 단위 제제(liquid unit formulation)로 제제화할 수 있다 또한, 상기 단위 제제는 1 내지 10 uM의 수라민 또는 화학식 2의 화합물 또는 0.1 내지 1 mg/ml의 푸코이단을 함유할 수 있다. 상기 투여는 필요에 따라 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여될 수도 있으며, 또한 1 ml/kg 의 총용적으로 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 분화유도제로서 수라민 또는 NF157 (상기 화학식 2의 화합물)의 존재하에서 중간엽 줄기 세포를 배양하여 중간엽 줄기 세포를 골아세포(osteoblast)로 분화시키는 것을 포함하는, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법을 포함한다.
본 발명의 분화방법은 1 내지 10 uM의 수라민 또는 화학식 2의 화합물, 5?20 중량%의 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS), 5?20 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.01?0.1 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈(low-glucose) DMEM 배지 중에서 중간엽 줄기 세포를 배양하여 중간엽 줄기 세포를 골아세포로 분화시킴으로써, 바람직하게 수행될 수 있다. 즉, 상기 배지는 덱사메타손 및 골형성 단백질(BMPs)이 없는 즉, 덱사메타손-비함유(dexamethasone-free) 및 골형성 단백질-비함유(BMPs-free) 배지이다.
일 구현예에서, 본 발명의 분화방법은 1 내지 10 uM의 수라민 또는 화학식 2의 화합물, 10 중량%의 우태혈청, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지 중에서 중간엽 줄기 세포를 배양하여 중간엽 줄기 세포를 골아세포로 분화시킴으로써 수행된다.
본 발명의 분화방법에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포는 CD73 양성, CD90 양성, CD105 양성, 및 CD166 양성을 나타내는 인간의 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 중간엽 줄기 세포는 골수, 제대혈, 태반 또는 지방 유래의 중간엽 줄기 세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 지방 유래의 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 또한, 상기 배양은 106?109 cells/ml의 중간엽 줄기 세포를 사용하여 바람직하게 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명을 제한하는 것이 아니다.
실시예 1: 인간 지방조직에서 중간엽 줄기세포의 분리
피하지방 제거 시술을 받은 환자로부터 동의를 얻고, 해당 환자로부터 지방흡인(liposuction)방법을 통하여 제거되어 버려지는 지방조직을 수거하였다. 수거된 지방 조직을 칼슘과 포타슘이 포함되지 않은 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)로 3회 세척하였다. 0.075% 콜라게나아제를 처리하고 37℃ 배양기에서 1시간 동안 방치하여 지방조직을 와해시키고 세포를 분리하였다. 우태혈청이 포함된 DMEM 배지를 콜라게네이즈와 동량 첨가하여 250g의 속도로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 가라앉은 침전물에 0.16M NH4Cl 을 10분간 처리하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구를 제거한 조직에 250g의 속도로 10분간 원심분리하여 얻은 침전물에 DMEM을 넣어 현탁시킨 후, 지름 10cm의 조직배양 접시에 1 X 105씩 분주하여 3?4 일 동안 배양 후 섬유아세포 형태를 나타내는 세포를 선별하여 세포의 상태에 따라(즉, 세포가 70?80% 가량 조직배양 접시를 채웠을 때) 계대배양 하였다.
실시예 2: 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화유도 및 평가
실시예 1에서 얻어진 지방조직유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 확인하기 위해, 5?6회의 계대를 거친 중간엽 줄기세포가 70?80% 가량 채워진 배양 접시를 6군으로 나누고, 제1군은 콘트롤군, 제2군은 덱사메타손 처리군, 제3군은 BMP 처리군, 제4군은 수라민 처리군, 제5군은 NF157 처리군, 제6군은 푸코이단 처리군으로 하였다. 각 군의 배지 조성은 다음과 같으며, 주 2회 배지를 교체하며 2주간 배양하였다. 배지를 교환해 줄 때마다, 동일하게 처리된 배지를 사용하였다. 기본 골분화 배지는 10 %의 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS,(Gibco BRL사), 10 mM의 β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate, Sigma사), 및 0.05 mM의 아스코르브산(Sigma사)이 보충된 저-글루코오즈(low-glucose) DMEM 배지(Gibco BRL사)이다.
- 제1군: 기본 골분화 배지
- 제2군: 기본 골분화 배지와 0.1 μM의 덱사메타손(Sigma사)
- 제3군: 기본 골분화 배지와 50 ng의 골형성 단백질-2 (Bone Morphogenetic Protein-2: BMP-2 (Peprotech 사)
- 제4군: 기본 골분화 배지와 1 μM의 수라민(suramin)
- 제5군: 기본 골분화 배지와 1 μM의 NF157
- 제6군: 기본 골분화 배지와 0.1 mg/ml의 푸코이단
각각의 시험군에 있어서, 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 분화를 확인하기 위해 실시간-PCR을 통하여 유전자 발현을 확인하였다. 골아세포로의 분화 마커로 사용되는 유전자로서 RUNX2, 콜라겐 타입 I (collagen type I, Col I) 및 알카라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase, ALP)를 확인하였다. 각각의 프라이머 및 Tm(Melting temperature)등의 PCR 조건은 하기 표 1과 같고, 그 결과는 도 1과 같다.
유전자 프라이머 서열번호 Tm(℃)
Col I 정방향 5'-GGACACAATGGATTGCAAGG-3' 1 60
역방향 5'-TAACCACTGCTCCACTCTGG-3' 2
RUNX2 정방향 5'-TTACTTACACCCCGCCAGTC-3' 3 60
역방향 5'-TATGGAGTGCTGCTGGTCTG-3' 4
ALP 정방향 5'-ACCATTCCCACGTCTTCACATTTG-3' 5 57
역방향 5'-AGACATTCTCTCGTTCACCGCC-3' 6
도 1은 대조군의 유전자 마커 발현을 1로 하여, 각각의 발현량을 비교한 결과이다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 아무 처리도 하지 않은 중간엽 줄기세포 대조군(negative control)에 비해 수라민, NF157, 및 푸코이단을 처리한 군은 콜라겐 타입 I, 오테오칼신, 및 알카라인 포스파테이즈가 강하게 발현되었다. 특히 수라민을 처리하였을 때 덱사마타손 처리군(positive control)에 비하여 Col I이 강하게 발현되었다. 따라서 푸코이단의 첨가에 의해 골아세포로의 분화가 촉진되었음을 알 수 있다.
실시예 3: 분화유도제 및 중간엽 줄기 세포의 투여에 따른 세포치료제 활성 평가
5주령 누드 마우스 (체중: 20 ± 3 g)를 6군으로 나누고(n = 6), 제1군은 콘트롤군(중간엽 줄기 세포 투여군), 제2군은 덱사메타손 및 중간엽 줄기 세포 투여군, 제3군은 BMP 및 중간엽 줄기 세포 투여군, 제4군은 수라민 및 중간엽 줄기 세포 투여군, 제5군은 NF157 및 중간엽 줄기 세포 투여군, 제6군은 푸코이단 및 중간엽 줄기 세포 투여군으로 하였다.
실시예 1에서 얻어진 지방조직유래 중간엽 줄기세포 (5?6회의 계대를 거친 중간엽 줄기세포) 1 × 107 cells 및 각각의 분화유도제를 인산완충식염수 1 ml 중에 가하여 혼합한 후(분화 유도제의 농도: 덱사메타손 0.1 uM, BMP-2 50 ng , 수라민 1 uM, NF157 1 uM, 및 푸코이단 100 ng), 각각의 혼합물을 BD MatrigelTM Matrix (BD biosciences 사)와 1:3의 부피비로 혼합하여 최종 400 uL 의 주사용 액제를 얻었다. 얻어진 혼합물 300 uL을 1mL 주사기를 사용하여 누드 마우스의 피하에 주입하였다.
각 군의 누드 마우스를 4 주후에 치사시키고, 피하에 주입하여 분화를 유도한 조직을 회수하였다. 회수되 각각의 조직은 도 2와 같다. 각각의 조직은 1-2 cm 정도 크기의 부정형 모양을 구성하였으며 유사한 크기를 가지고 있다. 얻어진 조직 세포의 칼슘 침착 정도는 다음과 같이 측정하였다. 즉, 각각의 회수한 조직을 포르말린에 고정하고, 파라핀으로 포매하여 4 ㎛ 두께로 절단하였다. 절단된 조직을 슬라이드 글라스에 올려 슬라이드 워머에서 4시간 방치하여 파라핀 조직을 슬라이드 글라스 위에 고정 시키고, 100% 자일렌 (Xylene)에서 점차로 낮은 농도의 자일렌에 넣어 탈파라핀 과정을 수행한 다음, 100% 에탄올에서 75% 까지 점차 물의 비율을 높여 함수 과정을 수행하였다. silver-nitrate 염색을 이용한 본 코사 방법(von Kossa's method)에 따라 세포외 기질의 칼슘 침착 염색(mineralized matrix staining)을 수행하였다. 그 결과는 도 3과 같다.
도 2 및 도 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 수라민, NF157 또는 푸코이단을 중간엽 줄기 세포와 함께 투여한 경우에는, 일반적으로 골아세포로의 분화에 이용되는 덱사메타손과 BMP를 처리했을 경우와 마찬가지로 칼슘 침착을 확인 할 수 있었다. 중간엽 줄기세포와 혼합되어 누드마우스의 피하에 주입된 분화 유도제들은 이식 부위에 괴사 또는 이식한 세포의 사멸을 유도하지 않고 기존의 덱사메타손과 BMP 분화 유도제와 유사한 효율의 분화능을 나타냈다.
상기 결과로부터, 푸코이단, 수라민, 또는 NF157을 중간엽 줄기 세포와 함께 생체에 투여할 경우, 생체내에서 안전성 문제를 야기함이 없이 중간엽 줄기세포로부터 골아세포가 효과적으로 분화됨으로써 골질환의 예방 및 치료 활성을 나타낼 수 있는 신규 분화 유도물질로 유용할 것으로 기대된다.
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases and method for the differentiation of mesenchymal stem cells to osteoblasts <130> PN0437 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 ggacacaatg gattgcaagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 taaccactgc tccactctgg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ttacttacac cccgccagtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tatggagtgc tgctggtctg 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 accattccca cgtcttcaca tttg 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 agacattctc tcgttcaccg cc 22

Claims (15)

  1. 중간엽 줄기 세포; 및 푸코이단(fucoidan), 수라민(suramin), 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 분화유도제를 포함하는, 골다공증, 골암, 관절염, 구루병, 골절, 치주 질환, 분절성 골 결손, 골용해성 골질환, 원발성 및 속발성 부갑상선기능항진증, 파제트병, 골연화증, 및 과골증으로 이루어진 군으로부터 선택된 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    <화학식 2>
    Figure pat00005
  2. 제1항에 있어서, 상기 분화유도제가 수라민 또는 화학식 2의 화합물인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 106?109 cells/ml의 농도로 존재하고, 상기 분화유도제가 1 내지 10 uM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 분화유도제가 푸코이단인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 106?109 cells/ml의 농도로 존재하고, 상기 분화유도제가 0.1 내지 1 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 CD73 양성, CD90 양성, CD105 양성, 및 CD166 양성을 나타내는 인간의 중간엽 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
  7. 제6항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 골수, 제대혈, 태반 또는 지방 유래의 중간엽 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 지방 유래의 중간엽 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 분화유도제로서 수라민 또는 하기 화학식 2의 화합물의 존재하에서 중간엽 줄기 세포를 배양하여 중간엽 줄기 세포를 골아세포(osteoblast)로 분화시키는 것을 포함하는, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법:
    <화학식 2>
    Figure pat00006
  10. 제9항에 있어서, 1 내지 10 uM의 수라민 또는 화학식 2의 화합물, 5?20 중량%의 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS), 5?20 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.01?0.1 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈(low-glucose) DMEM 배지 중에서 중간엽 줄기 세포를 배양하여 중간엽 줄기 세포를 골아세포로 분화시키는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법.
  11. 제9항에 있어서, 1 내지 10 uM의 수라민 또는 화학식 2의 화합물, 10 중량%의 우태혈청, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 및 0.05 mM의 아스코르브산이 보충된 저-글루코오즈 DMEM 배지 중에서 중간엽 줄기 세포를 배양하여 중간엽 줄기 세포를 골아세포로 분화시키는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 CD73 양성, CD90 양성, CD105 양성, 및 CD166 양성을 나타내는 인간의 중간엽 줄기 세포인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 골수, 제대혈, 태반 또는 지방 유래의 중간엽 줄기 세포인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 지방 유래의 중간엽 줄기 세포인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법.
  15. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이 106?109 cells/ml의 중간엽 줄기 세포를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기 세포의 골아세포로의 분화방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104127688A (zh) * 2013-05-03 2014-11-05 吕刚 一种中药外用药膏组合物在制备用于预防、缓解和/或治疗骨关节疾病药物中的应用
CN104189749A (zh) * 2014-08-19 2014-12-10 张志红 一种治疗骨质增生的外用中药组合物
CN104415269A (zh) * 2013-09-09 2015-03-18 廖国建 一种治疗骨质增生的外用药物
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CN105012431A (zh) * 2015-07-30 2015-11-04 成都市飞龙水处理技术研究所 一种治疗骨质增生症的汤剂药物及其制备方法

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