KR20090090850A

KR20090090850A - 콩 단백질 가수분해물을 포함하는 제대혈 유래 중간엽줄기세포의 체외 증식에 필요한 배지 조성물

Info

Publication number: KR20090090850A
Application number: KR1020080016367A
Authority: KR
Inventors: 한훈; 김승열; 이용권; 김기헌; 전복환; 정남현
Original assignee: (주)히스토스템
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2009-08-26

Abstract

본 발명은 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 체외 증식에 일반적으로 사용되고 있는 우태혈청의 사용을 줄이기 위해 줄기세포 배양 배지의 구성분으로 콩 단백질 가수분해물을 사용함으로써 배지 중 우태혈청 농도를 감소시킨 배지 조성물에 관한 것으로, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 증식에서 고가의 우태혈청 사용을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 우태혈청 유래의 동물성 위해인자로 인한 위험요소를 줄일 수 있으며, 본 발명에 따른 콩 단백질 가수분해물이 첨가된 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양할 경우 자가 증식 상태와 분화력 또한 유지할 수 있으므로 세포 치료에 필요한 줄기세포 증식에 유용하게 활용될 수 있다.

제대혈, 중간엽 줄기세포, 콩 단백질 가수분해물, 우태혈청

Description

콩 단백질 가수분해물을 포함하는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 체외 증식에 필요한 배지 조성물{CULTURE MEDIUM COMPOSITION FOR IN VITRO PROLIFERATION OF MESENCHYMAL STEM CELL DERIVED FROM UMBILICAL CORD BLOOD COMPRISING SOY HYDROLISATE}

본 발명은 콩 단백질 가수분해물을 포함하는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 체외 증식에 필요한 배지 조성물에 관한 것으로, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 체외 증식에 일반적으로 사용되고 있는 우태혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)의 사용을 줄이기 위해 줄기세포 배양 배지의 구성분으로 콩 단백질 가수분해물을 사용하여 배지 중 우태혈청 농도를 감소시킨 배지 조성물에 관련된다.

중간엽 줄기세포는 자가증식능력(self-renewal)이 있고 조골세포, 연골세포, 지방세포 등 다방면의 세포로 분화할 수 있는 다분화능을 가진다. 연골, 뼈, 근육, 심장근육 등의 손상된 조직을 재건하기 위해 중간엽 줄기세포를 이용한 동물 실험의 결과를 보면, 인간에게 적용할 수 있을 가능성이 상당히 높다는 것을 알 수 있다(Kato S, Nishihira H, Hara H. (2000) Cord Blood transplantation and cord blood banking in Japan. Bone Marrow Transplant 25 Suppl. 2: S68-70; Lee OK, Kuo TK, Chen WM. (2004) Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Blood 103: 1669-1675). 또한, Kim 등의 논문에는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 인간 적용에 대한 성공적인 사례들이 발표되어 있다(Kim SW. (2006) Successful stem cell therapy using cord blood-derived multipotent stem cells for Buerger's disease and ischemic limb disease animal model. Stem Cells 24: 1620-1626). 이러한 점을 고려할 때, 중간엽 줄기세포를 인간에게 적용하기 위해 최적의 안정화 상태로 세포를 키우는 것이 세포치료에 절실히 필요하다.

골수는 중간엽 줄기세포의 가장 흔한 출처이며, 양수, 태아의 폐, 지방세포, 제대혈을 포함한 다양한 출처로부터 중간엽 줄기세포를 분리 배양할 수 있다(Erices A, Conget P, Minguell J. (2000) Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br Haematol 109: 235-42; Mareschi K, Biasin E, Piacibello W. (2001) Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica 86: 1099-1100). 그러나, 골수 및 지방세포 등은 조직적합성의 문제 때문에 타인을 위한 세포 출처보다는 자신의 세포를 자신이 이용하는 자가세포치료법에 주로 사용되고 있다. 이는, 타인과의 사이에서 조직적합성이 일치하기 위해서는 많은 수의 집단이 필요하기 때문이다. 그러나, 많은 제대혈을 확보한 풀이 있다면 이러한 한계를 극복할 수 있다.

제대혈 유래 줄기세포는 출생 후 탯줄에서 얻을 수 있다. 이 줄기세포는 흔히 신생아 줄기세포라고 언급되고, 성인이나 어린이의 골수에서 얻은 줄기세포보다 덜 성숙해 있다. 줄기세포의 출처로서 제대혈을 사용하는 장점은, 획득시 비침투적 확보가 가능하다는 것과, 수많은 아기의 출생으로 인한 출처의 풍부성이다. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 특징으로는, 초기 획득량에 대한 낮은 세포숫자와 낮은 세포증식능력을 들 수 있다. 최근까지 제대혈은 출생 후 태반과 함께 버려졌으나, 지금 세계의 몇몇 도시에서는 제대혈이 수집되어 대중의 사용을 위해 공적인 은행에 보관되거나 개인적인 사용을 위해 사적인 제대혈 은행에 보관되고 있다.

한편, 세포배양에서 무혈청 배지의 사용은 지난 30여 년간 지속적으로 증가하고 있으며, 조성 성분도 기존의 동물성 성분에서 비동물성, 비단백질성 성분으로 바뀌고 있지만, 아직도 혈청 사용의 장점으로 인해 세포배양용 배지에 많이 사용되고 있다. 혈청은 생물의약품의 생산에서 원하지 않는 오염원이 되는 것은 물론 안전에 위험을 줄 수 있는 존재이기도 하므로, 배지에 혈청을 사용하는 것은 적지 않은 문제를 야기한다(Mizrahi, A. (1977) Primatone RL in mammalian cell culture media. Biotechnol . Bioeng 19: 1577-15). 혈청은 주요 구성성분인 알부민과 트랜스페린을 포함하고, 세포의 성장에 상당한 영향을 미치는 광범위한 미량 구성성분들을 포함한다. 이 구성성분들은 영양분, 펩타이드 성장 인자, 호르몬, 미네랄, 지방을 포함하는데, 그 농도와 효과는 정확히 알려지지 않았다. 혈청은 롯트 마다 다르고, 각 롯트는 기껏해야 일 년간 보존되는데, 아마도 시간에 따라 구성성분들이 저하될 것이므로 대체되어야 한다. 그러나, 대체될 경우 다른 유사한 혈청 롯트가 선택된다 하더라도 처음의 롯트와 동일하지는 않을 것이다. 더욱이, 혈청은 균류, 세균, 바이러스, 프리온 같은 생물학적인 오염의 잠재적인 출처이기도 하다(Valk J, Mellor D, Brands R, Fischer R, Gruber F, Gstraunthaler G, Hellebrekers L, Hyllner J, Jonker F.H, Prieto P, Thalen M, Baumans V. (2004) The humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture. Toxicology in vitro 18: 1-1261).

혈청은 성장촉진 활성은 물론 성장억제 활성도 갖는다. 혈청 포함 배지는 단순한 화학물질로 구성된 배지보다 10배는 더 비싸다. 무혈청 배지는 동물 혈청을 포함하지 않지만 혈청 구성성분이나 그 대체물을 포함하고 있다. 비 동물성 배지는 그 구성물이 비 동물성 자원에서 왔다는 것만 제외하면 무혈청 배지와 비슷하다. 비 동물성 배지에서는 재조합 단백질이 원래의 단백질을 대체하고, 그것의 생산을 위한 영양분은 합성물, 식물, 미생물 자원으로부터 얻는다.

단백질 가수분해물과 같은 저분자량 펩타이드(펩톤, 단백질 분체, 가수분해된 단백질)들은 혈청을 대신할 수 있는 실용적인 선택으로 고려되고 있다. 단백질 가수분해물은 일반적으로 혈청을 부분적으로 또는 대부분 대체할 수 있는 농축되고 균형 잡힌 영양 혼합물로서의 역할을 하는 것으로 보고되어있다(Mizrahi, A. (1977) Primatone RL in mammalian cell culture media. Biotechnol . Bioeng 19: 1577-15; Schlaeger, E-J. (1996) The Protein Hydrolysate, Primatone RL, is a Cost-Effective Multiple Growth Promoter of Mammalian Cell Culture in Serum-Containig and Serum-Free Media and Displays Anti-Apoptotic Properties. J. Immunol. Methods 194: 191-199). 또한, 펩톤은 글루타민과 다른 아미노산의 안정된 공급처이기도 하다.

현재 중간엽 줄기세포를 생산하는 대부분의 방법에서는 우태혈청을 주요 구 성성분으로 사용하고 있는데, 위와 같은 혈청의 문제점 등을 고려할 때 중간엽 줄기세포 배양 배지의 구성 성분 중 혈청의 농도를 감소시키는 데 대한 요구가 있다.

본 발명의 목적은 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포의 체외 증식에 사용되는 배지 중 우태혈청의 양을 줄이기 위한 것으로, 식물 유래의 단백질 가수분해물을 사용한 배지 조성을 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 콩 단백질 가수분해물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포 증식용 배양 배지 조성물을 제공한다.

상기 배지에서 콩 단백질 가수분해물은 우태혈청의 양을 감소시키기 위해 첨가되는 것으로, 배지 조성물 중 콩 단백질 가수분해물의 농도는 0.5 내지 2.0 g/L인 것이 바람직하다.

본 발명에서는, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 증식시키기 위한 세포배양 배지에 콩 단백질 가수분해물을 첨가함으로써 우태혈청의 사용을 감소시키는 동시에 중간엽 줄기세포가 다른 세포로 분화되지 않도록 하고 있다.

본 발명의 배지에서 배양되는 중간엽 줄기세포는 증식능력이 통상의 혈청이 포함된 배지와 같거나 더 우수하게 된다. 또한, 배지에서 혈청을 감소시킴으로써 혈청으로 인한 오염의 가능성을 줄이는 한편, 고가의 혈청 사용량을 줄이는 것에 의해 배양 배지의 가격을 낮추어 경제적으로도 유리하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 콩 단백질 가수분해물이 우태혈청 포함 배지에서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 성장에 미치는 영향

(1) 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분리

영하 196 ℃에 냉동 보관된 제대혈에서 단핵구를 분리하기 위해, αMEM (alpha-minimum essential medium, Jeil Biotech Services, Korea)으로 제대혈을 2 배 용량으로 희석한 후 실온에서 10 분간 300xg로 원심분리하였다. 혈액으로부터 단핵구를 분리하는 데는 Ficoll(슈크로스의 중합체)과 Hypaque(디트리조에이트 나트륨; sodium ditrizoate)의 중합체인 Ficoll-Hypaque가 주로 이용된다. Ficoll-Hypaque의 비중은 1.077 g/㎖로, 단핵구는 이보다 가벼우나 적혈구는 이보다 무겁기 때문에 비중 차에 의한 분리가 가능하다. 즉, 혈액을 Ficoll-Hypaque 위에 올려서 원심분리하면 단핵구는 Ficoll-Hypaque 위에 모이게 된다.

이와 같은 밀도구배 원심분리 방법으로 얻어진 단핵구를 다시 첨가물이 섞이지 않은 세척용 αMEM으로 2 회 세척하였다.

이와 같은 밀도구배 원심분리 방법으로 얻어진 단핵구를 다시 첨가물이 섞이지 않은 세척용 αMEM에 넣어 10 분간 200xg로 원심분리한 후, 팔콘 튜브 바닥에 가라앉은 세포를 제외하고 αMEM을 버려 세척하였다. 한번 더 αMEM을 넣어 10 분간 200xg로 원심분리한 후, 팔콘 튜브 바닥에 가라앉은 세포를 제외하고 αMEM을 버려 1 회 더 세척하였다.

다음에, 항생제(1000 U/㎖ 페니실린 G, 1000 ㎍/㎖ 황산 스트렙토마이신, Gibco-BRL)와 항진균제(0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B), 그리고 2 mM의 글루타민 (Glutamine, Sigma)이 포함된 αMEM 배지에 20% 우태혈청(FBS; fetal bovine serum, Jeil Biotech Services)과 함께 세포수 1×10⁶/㎠의 농도로 부유시켰다.

5 일간 배양한 세포 군집에서 부유 세포를 제거하고, 부착 세포가 확보된 후에는 20% 우태혈청 및 항생제가 포함된 αMEM을 배양액으로 하여 2 일 간격으로 세척 과정 없이 완전 교환하여 25 일간 배양하였다.

중간엽 줄기세포 분리 후 D-PBS로 2회 세척하여 기존의 배지를 완전히 제거한 후, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포가 우태혈청이 10% 포함된 배지에서 성장하는 정도와, 우태혈청을 줄이고 여기에 콩 단백질 가수분해물을 첨가한 배지에서 성장하는 것을 비교하여 세포성장에 미치는 가수분해물의 효과를 조사하였다.

(2) 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양과 중간엽 줄기세포의 증식

본 발명의 실시예에서 사용된 중간엽 줄기세포는 아래와 같은 방법으로 증식하였다: 제대혈로부터 분리된 단핵구 세포를 10%의 우태혈청(JRH, USA)이 포함된 저포도당 DMEM(LG-DMEM, Gibco)에 접종하였다. 배양은 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 실시되었으며 5일마다 배지를 교환해 주었다. 세포 밀도가 70∼80%로 되었을 때 0.05% 트립신, 0.53 mM EDTA 용액에 37 ℃, 3분 동안 처리하여 수확하였다. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포가 배양 용기 바닥에 부착되었을 때, 우태혈청과 단백질 가수 분해물의 다양한 조합으로 조성된 배지로 교환해주었다. 중간엽 줄기세포가 부착된 후 12∼14일 동안 배양하였다.

(3) 세포배양 배지의 제조 방법과 단백질 가수분해물 농축액의 제조 방법

LG-DMEM은 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양의 기본 배지로 Gibco(USA)에서 구매하였다. 콩 유래의 단백질 가수분해물인 Bacto soytone(Beckton Dickinson, USA)과 Soy hydrolysates(Hyclone, USA)를 각각 구입하여, 200 g/L의 농도로 증류수에 녹인 다음 0.2 ㎛ Durapore filter(Millipore, USA)로 여과하여 사용하였다.

(4) 세포수 측정 방법

단백질 가수분해물 각 농도에 의한 중간엽 줄기세포의 성장촉진능력을 평가하기 위해, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 12-웰 플레이트(SPL사, 대한민국)에 웰 당 1x10⁴ 세포를 초기 세포농도로 하여 8 시간 배양하였고, 지정된 양의 우태혈청과 가수분해물로 조성된 배지를 첨가하여 계속 증식하였다. 세포 배양 동안 세포와 배양 배지에서의 세포농도를 주기적으로 측정하였다. 살아있는 세포의 농도는 트리판 블루(Trypan blue) 염료 배제(dye exclusion) 방법을 이용하였다. 모든 평가법은 세 번 반복으로 행하였으며, 그 결과는 모든 값의 평균으로 나타내었다.

(5) 우태혈청 포함 배지에서 자라는 중간엽 줄기세포의 성장에 미치는 단백질 가수분해물의 영향

본 발명에서는 Bacto soytone의 농도를 1.5 g/L로 하고 우태혈청의 농도를 2, 5, 및 8%로 변화시켜서 시험하였으며, 그 결과를 도 1에 나타낸다.

도 1은 Bacto soytone이 1.5 g/L의 농도로 포함된 배지에 우태혈청의 농도를 2, 5 및 8%로 변화시키면서 12일 동안 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 성장 정도를 비교한 그래프이다.

도 1에서 보면, 우태혈청의 농도가 2%일 경우에는 배양 12일째 세포의 농도가 10%의 우태혈청을 포함한 대조군의 60%였다. 하지만 5%의 우태혈청을 사용하였을 경우에는 배양 12일째 세포 농도가 대조군의 110%였고, 8%의 우태혈청을 사용하였을 경우 배양 12일째 세포 농도는 대조군의 95%였다. 즉, 적정량의 콩 단백질 가수분해물을 첨가한 배지를 사용한다면 절반 정도의 우태혈청을 사용한 것과 동등하거나 더 우수한 세포 증식 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

실시예 2: 혈청과 콩 단백질 가수분해물 종류별 비교

제대혈 유래 중간엽 줄기세포가 10% 우태혈청을 포함한 배지에서 자라는 정도와, 다양한 농도의 우태혈청과 함께 다른 종류의 콩 단백질 가수분해물이 포함된 배지에서 세포가 자라는 것을 비교함으로써, 세포성장에 미치는 가수분해물 종류별 효과를 조사하였다.

배지의 조성과 가수분해물의 조성 방법은 실시예 1에서와 동일하였다.

도 2는 도 2는 Soy hydrolysate가 0.5g/L의 농도로 포함된 배지에 우태혈청의 농도를 2, 5 및 8%로 변화시키면서 12일 동안 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 성장 정도를 비교한 그래프이다.

도 2에서 보면, 2% 우태혈청과 가수분해물을 포함한 경우에는 배양 12일째 세포의 성장 정도가 10% 우태혈청만을 포함한 대조군의 60%인 반면, 5% 및 8%의 우 태혈청에 가수분해물을 포함한 경우는 대조군에 비해 세포 성장 정도가 각각 73% 및 110%였다.

도 3은 Bacto soytone이 1.0 g/L의 농도로 포함된 배지에 우태혈청의 농도를 2, 5 및 8%로 변화시키면서 12일 동안 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 성장 정도를 비교한 그래프이다.

도 3에서 보면, 2% 우태혈청과 가수분해물을 포함한 경우에는 배양 12일째 세포 성장 정도가 대조군의 75% 정도인 반면, 5% 및 8%의 우태혈청에 가수분해물을 포함한 경우는 세포 성장 정도가 각각 90% 및 100%였다. 이러한 결과는 다른 종류의 가수분해물은 세포의 성장에 미치는 영향이 다르며, 성장에 적절한 농도도 다르다는 것을 보여준다.

실시예 3: 혈청과 콩 단백질 가수분해물의 농도별 비교

중간엽 줄기세포가 10% 우태혈청을 포함한 배지에서 자라는 정도를 일정한 농도의 우태혈청과 함께 다양한 농도의 콩 유래 단백질 가수분해물이 포함된 배지에서 세포가 자라는 것을 비교함으로써, 세포성장에 미치는 가수분해물 농도의 효과를 조사하였다.

배지의 조성과 가수분해물의 조성 방법은 실시예 1에서와 동일하게 하였다.

도 4는 우태혈청의 농도를 8%로 하고 콩 단백질 가수분해물로서 Soy hydrolysate(Hyclone)의 농도를 0.5, 1.0 및 1.5 g/L로 변화시키면서 12일 동안 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 성장 정도를 비교한 그래프이다.

도 4에서 보면, 배양 4일째에는 세포의 성장 정도가 가수분해물의 모든 농도 에서 거의 같은 수준으로 증가하였으나, 1.0 및 1.5 g/L의 가수분해물 농도에서는 이후 세포농도가 오히려 감소하였다. 하지만 배양 12일째에는 가수분해물 농도가 0.5 g/L일 때 10% 우태혈청만을 포함한 대조군에 비하여 세포 성장 정도가 110%로 증가하였다.

도 5는 우태혈청의 농도를 5%로 하고 콩 단백질 가수분해물로서 Bacto soytone(Beckton Dickinson)의 농도를 0.5, 1.0 및 1.5 g/L로 변화시키면서 12일 동안 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 성장 정도를 비교한 그래프이다.

도 5에서 보면, 배양 12일째 가수분해물의 농도가 0.5 g/L일 경우 10% 우태혈청만을 포함한 대조군에 비해 세포 성장 정도가 50%인 반면, 가수분해물의 농도가 1.0 및 1.5 g/L일 때에는 각각 90 및 110%였다. 이러한 결과는, 가수분해물의 종류마다 세포성장에 적절한 농도가 다르다는 사실과 함께, 세포성장에 적절한 조합의 우태혈청 농도도 달라짐을 보여준다.

실시예 4: 사진 비교

중간엽 줄기세포를 10% 우태혈청에서 증식시킬 경우와, 우태혈청과 가수분해물을 포함한 최적 조건에서 증식시킬 경우의 세포 성상을 육안으로 관찰함으로써, 가수분해물이 세포성장에 미치는 영향을 관찰하였다.

도 6의 A와 B는 10%의 우태혈청을 포함하는 대조군에서 7일 동안 배양한 경우의 중간엽 줄기세포 모양과 세포 농도를 보여주는 사진, C는 5% 우태혈청과 1.5 g/L의 Bacto soytone(Beckton Dickinson Co.)을 포함하는 배지에서, 그리고 D는 8% 우태혈청과 0.5 g/L의 Soy hydrolysate(Hyclone)를 포함하는 배지에서 7일 동안 배양한 경우의 중간엽 줄기세포 모양과 농도를 보여주는 사진이다.

도 6에서 보면, 우태혈청만을 포함하는 배지나, 콩 단백질 가수분해물을 포함하는 배지에서 세포를 성장시켰을 때 세포의 모양에서 큰 차이가 없다는 것을 알 수 있다.

실시예 5: 분화 비교

중간엽 줄기세포를 10% 우태혈청을 포함하는 배지에서 증식시킬 경우와, 적절한 농도의 우태혈청과 가수분해물을 포함하는 배지에서 증식시킬 경우, 분화에 차이가 있는지 여부를 확인하였다.

배지의 조성과 가수분해물의 조성 방법은 실시예 1에서와 동일하게 하였다. 배양된 중간엽 줄기세포에서 추출한 RNA는 대조군과 가수분해물이 포함된 배지에서 자란 세포의 분화 정도를 확인하는 데에 사용하였다. 대조군과 단백질 가수분해물이 포함된 배지에서 배양한 세포를 수확하여 차가운 PBS로 한번 세척하였다. 총 RNA는 RNEasy Mini isolation kit(Qiagen, USA)에서 제공한 방법에 따라 추출하였다. 첫 번째 상보적 DNA의 가닥은 역전사 시스템(Reverse Transcription System; Promega, USA)을 이용하여 합성하였다. 이 합성은 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 4 ㎕ MgCl₂(25 mM), 2 ㎕ 10X 완충액, 2 ㎕ dNTP 혼합물(10 mM), 0.75 ㎕ 역전사효소(reverse transcriptase, 15 unit), 0.5 ㎕ 올리고dT, 0.5 ㎕ 리보뉴클레아제 저해제(ribonuclease inhibitor)를 포함하여 42 ℃에서 45 분, 70 ℃에서 15 분 반응 시켜 실시하였다. 35 사이클로 행해진 PCR 반응은 아래와 같다: T1 Thermocycler(Biometra, Germany)를 이용하여 95 ℃에서 30 초 변성, 어닐링 온도에서 30 초, 72 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1분 동안 마지막 extension을 행하였다. 이 반응은 2 ㎕ cDNA, 2 ㎕ 프라이머(10 pM), 0.5 ㎕ Taq 중합효소(TaKaRa, Japan), 2.5 ㎕ 10X PCR 완충액을 포함하는 25 ㎕의 반응양을 가졌다. 센스 및 안티센스 프라이머, 어닐링 온도, 그리고 염기쌍은 다음 표 1에 나타낸다. 각각의 mRNA의 발현 수준은 housekeeping gene인 β-액틴으로 표준화하였다. 반응 후의 반응물은 2% 한천을 통해 전기 영동하였다. 밴드는 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 관찰하였다.

지방형성세포, 골수형성세포, 연골발생세포의 분화 정도를 확인하기 위하여 사용된 프라이머

목표 유전자	프라이머 염기서열	어닐링 온도(℃)	PCR 결과물크기(bp)
β-액틴	5’-CAGGCTGTGCTATCCCTGTAC-3’ 5’-CACGCACGATTTCCCGCTCGG-3’	55	223
알칼리 포스파타제	5’-TGGAGCTTCAGAAGCTCAACACCA-3’ 5’-ATCTCGTTGTCTGAGTACCAGTCC-3’	55	452
오스테오폰틴	5’-CTAGGCATCACCTGTGCCATACC-3’ 5’-CAGTGACCAGTTCATCAGATTCATC-3’	55	347
Sox-9	5’-GGTTGTTGGAGCTTTCCTCA-3’ 5’-TAGCCTCCCTCACTCCAAGA-3’	57	401
PPARγ	5’-TTCAGAAATGCCTTGCAGTG-3’ 5’-GGGCTCCATAAAGTCACCAA-3’	57	599

3 가지 최적화된 배지(8% 우태혈청 + 0.5 g/L Soy hydrolysate; 5% 우태혈청 + 1.0 g/L Bacto soytone; 및 5% 우태혈청 + 1.5 g/L Bacto soytone)에서 증식한 중간엽 줄기세포의 분화 정도는 14일 성장한 후에 관찰하였다.

도 7은 3가지 최적화된 배지에서 증식한 중간엽 줄기세포의 분화 정도를 14일 성장한 후에 조골발생세포 표지인자인 오스테오폰틴(osteopontin)과 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase)의 mRNA의 발현 정도로 살펴본 결과이다.

도 7에서 보듯이, 각각의 배지에서 자란 세포의 분화 정도를 평가하기 위해서 연골발생세포 표지인자인 오스테오폰틴과 알칼리포스파타제의 mRNA의 발현 정도를 살펴본 결과, 알칼리포스파타제의 양은 대조군보다 약간 높았지만 오스테오폰틴의 양은 대조군 보다 약간 낮았다. 이러한 결과는, 가수분해물이 포함된 배지에서 증식된 중간엽 줄기세포는 대조군에서 증식된 중간엽 줄기세포만큼 많이 분화되지 않았다는 것을 알려준다. 이 같은 결과는 지방형성세포 표지인자인 PPARγ(도 8)와 연골발생세포 표지인자인 sox-9(도 9)에서도 확인할 수 있다.

도 8은 3가지 최적화된 배지에서 증식한 중간엽 줄기세포의 분화 정도를 14일 성장한 후에 지방형성세포 표지인자인 PPARγ의 mRNA의 발현 정도로 살펴본 결과이고; 도 9는 3 가지 최적화된 배지에서 증식한 중간엽 줄기세포의 분화 정도를 14일 성장한 후에 연골발생세포 표지인자인 sox-9의 mRNA의 발현 정도로 살펴본 결과이다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 증식용 배양 배지에 특정 콩 단백질 가수분해물을 첨가할 경우의 세포 증식은, 우태혈청만을 10% 포함한 대조군 보다 동일하거나 높은 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 증식에서 고가의 우태혈청 사용을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 우태혈청 유래의 동물성 위해인자(바이러스, 광우병 위험물질)로 인한 위험요소를 줄일 수 있으며, 향후 완벽한 혈청 제거에 중요한 연구적 개발로 이어질 가능성이 높다. 세포 배양에서 혈청 사용량을 줄인다는 것은 그만큼 감염기회를 줄일 수 있다는 것으로, 실제로 생물 의약품 생산공정에서 사용되고 있는 혈청의 농도를 고려하여 가능성 있는 감염원의 농도를 줄이기 위하여 로그값 수준으로 저하되는 것을 검증하는 바이러스 밸리데이션이 수행되고 있다.

줄기세포의 특징은 자가증식(self-renewal)으로 자기 고유의 세포 상태를 유지시켜야 하는데, 본 발명에 따른 특정 콩 단백질 가수분해물이 첨가된 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양할 경우 자가 증식 상태를 유지할 수 있다. 또한 특정 분화배지를 사용하면 지방, 조골, 연골세포로 분화가 가능하여야 하는데, 본 발명에 따른 배지를 사용할 경우 그 분화력 또한 유지할 수 있다. 따라서, 콩 단백질을 사용한 본 발명에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배지 조성물은 세포 치료에 필요한 줄기세포 증식에 유용하게 활용될 수 있다.

도 2는 Soy hydrolysate가 0.5g/L의 농도로 포함된 배지에 우태혈청의 농도를 2, 5 및 8%로 변화시키면서 12일 동안 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 성장 정도를 비교한 그래프이다.

도 4는 우태혈청의 농도를 8%로 하고 콩 단백질 가수분해물로서 Soy hydrolysate의 농도를 0.5, 1.0 및 1.5 g/L로 변화시키면서 12일 동안 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 성장 정도를 비교한 그래프이다.

도 5는 우태혈청의 농도를 5%로 하고 콩 단백질 가수분해물로서 Bacto soytone의 농도를 0.5, 1.0 및 1.5 g/L로 변화시키면서 12일 동안 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 성장 정도를 비교한 그래프이다.

도 6의 A와 B는 10%의 우태혈청을 포함하는 대조군에서 7일 동안 배양한 경우의 중간엽 줄기세포 모양과 세포 농도를 보여주는 사진, C는 5% 우태혈청과 1.5 g/L의 Bacto soytone을 포함하는 배지에서, 그리고 D는 8% 우태혈청과 0.5 g/L의 Soy hydrolysate를 포함하는 배지에서 7일 동안 배양한 경우의 중간엽 줄기세포 모 양과 농도를 보여주는 사진이다.

도 7은 3가지 최적화된 배지(8% 우태혈청 + 0.5 g/L Soy hydrolysate; 5% 우태혈청 + 1.0 g/L Bacto soytone; 그리고 5% 우태혈청 + 1.5 g/L Bacto soytone)에서 증식한 중간엽 줄기세포의 분화 정도를 14일 성장한 후에 조골발생세포 표지인자인 오스테오폰틴(osteopontin)과 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase)의 mRNA의 발현 정도로 살펴본 결과이다.

도 8은 3가지 최적화된 배지(8% 우태혈청 + 0.5 g/L Soy hydrolysate; 5% 우태혈청 + 1.0 g/L Bacto soytone; 그리고 5% 우태혈청 + 1.5 g/L Bacto soytone)에서 증식한 중간엽 줄기세포의 분화 정도를 14일 성장한 후에 지방형성세포 표지인자인 PPARγ의 mRNA의 발현 정도로 살펴본 결과이다.

도 9는 3 가지 최적화된 배지(8% 우태혈청 + 0.5 g/L Soy hydrolysate; 5% 우태혈청 + 1.0 g/L Bacto soytone; 그리고 5% 우태혈청 + 1.5 g/L Bacto soytone)에서 증식한 중간엽 줄기세포의 분화 정도를 14일 성장한 후에 연골발생세포 표지인자인 sox-9의 mRNA의 발현 정도로 살펴본 결과이다.

Claims

콩 단백질 가수분해물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포 증식용 배양 배지 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 콩 단백질 가수분해물의 농도가 0.5 내지 2.0 g/L인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 콩 단백질 가수분해물은 우태혈청의 양을 감소시키기 위해 첨가되는 것임을 특징으로 하는 배지 조성물.