KR101287861B1

KR101287861B1 - 지방-유래 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화방법 및 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능의 분석방법

Info

Publication number: KR101287861B1
Application number: KR1020110015369A
Authority: KR
Inventors: 이수홍; 강선웅; 김재환; 한인보; 신동아
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2011-02-22
Filing date: 2011-02-22
Publication date: 2013-07-18
Also published as: KR20120096150A

Abstract

본 발명은 (a) TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자로 지방-유래 중간엽 줄기세포를 형질전환하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 형질전환된 중간엽 줄기세포를 TGF-β를 포함하는 연골세포 분화용 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 지방-유래 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포의 TGF-β 수용체의 발현량을 측정하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능의 분석방법을 제공한다.

Description

지방-유래 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화방법 및 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능의 분석방법{Process for the differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells to chondrocytes and method for analyzing chondrogenic differentiation efficacy of mesenchymal stem cells}

본 발명은 지방-유래 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화방법 및 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능의 분석방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자로 지방-유래 중간엽 줄기세포를 형질전환시켜, TGF-β 수용체의 과발현을 유도함으로써 연골세포로의 분화를 향상시키는 방법; 및 중간엽 줄기세포의 TGF-β 수용체의 발현량을 측정하는 것을 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능의 분석방법에 관한 것이다.

관절 연골은 관절면으로부터 깊이에 따라 구조와 구성요소가 다양하며 천층, 중간층, 심층, 석회층으로 구성되어 있는 결합조직의 특수한 형태로 세포외 기질이 단단하여 물리적인 힘에 의해 손상을 받지 않도록 하는데 중요한 역할을 한다. 관절연골 조직은 노화에 따라 연골 두께와 연골세포 수의 감소 이외에 기질의 구성변화가 초래되며, 또한 연골세포의 기능에도 변화가 유발된다. 사람에게 가장 빈번하게 유발되는 퇴행성 질환 중 하나인 골관절염의 유발요인으로 노화 현상이 중요하게 생각되고 있다(Bobacz K et al, Ann Rheum Dis, 63(12), pp.1618-1622, 2004). 또한, 특이하게 관절 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직이다(Brittberg M et al, New England Journal of Medicine, 331, pp. 889-895, 1994). 현재 다양한 의공학적 접근방법으로 퇴행관절 연골질환을 치료하려는 노력이 진행되고 있으나, 정상적인 연골조직재생에는 아직까지 많은 한계점이 있다.

자가 연골세포 이식법에 의한 연골조직의 재생이 최근 시도되어 임상적으로 매우 효과적인 수술법으로 알려지고 있으나, 연골의 광범위한 손상 부위에는 사용할 수 없으며, 또한 관절 연골의 손상 위치, 환자의 나이 등에 따라 제한점을 가지고 있다. 연골세포는 이미 분화된 세포로서 조직 내에서 세포 분열이 왕성하지 않지만, 분리 후 체외에서 단층배양시 증식이 촉진되어 충분한 수의 연골세포를 얻을 수 있다. 그러나 필요로 하는 충분한 세포수를 얻기 위해 단층배양을 오랫동안 하게 되면 연골세포의 표현형이 감소하는 탈분화 현상이 일어날 뿐아니라, 연골세포의 비대화 현상(Hypertrophy)에 의해 생체내 이식시 석회화(calcification)된 조직이 형성되는 문제점이 있다(Fischer J et al. Arthritis & Rheumatism, 62(9), pp. 2696-2706, 2010). 또한, 퇴행성 관절염의 경우, 연골조직에서 얻어지는 세포가 노화되어 있어 연골세포의 대량 배양이 아주 어렵다. 이에 반해 줄기세포는 연골세포에 비해 단층배양에서 증식 속도가 빠르고, 나이가 많은 사람으로부터 얻어진 줄기세포도 유사분열 능력과 생합성 활성이 뛰어나 줄기세포를 이용한 연골 재생에 관한 연구가 활발하게 수행되고 있다.

인간 중간엽 줄기세포는 성체줄기세포로서, 배아줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 암화나 윤리적인 문제를 극복할 수 있으며, 지방세포, 골아세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등 다양한 세포로의 분화가 가능하여 세포치료의 세포원으로서 주목을 받고 있다(Park JS et al. Biomaterials, 32(1), pp. 28-38, 2011, Shetty P et al. Asian J Transfus Sci, 4(1), pp. 14-24, 2010, 및 Kume S et al. J Bone Miner Res, 20(9), pp. 1647-58, 2005). 또한, 중간엽 줄기세포는 이식시에도 면역반응을 유발시키지 않기 때문에 세포치료의 효과적인 수단으로써 각광받고 있는 세포원이다. 하지만, 중간엽 줄기세포의 효율적인 대량 분화 기술이 아직 확립되어 있지 않아, 실제 임상 및 산업적 이용에 커다란 한계점으로 인식되고 있다. 예들 들어, 관절연골 손상 치유를 위해서는 생체 내 및 실험실 내에서 줄기세포를 다량의 연골세포주로 분화시킬 수 있는 효율적 분화유도기술 개발은 필수적이다.

중간엽 줄기세포로는 윤활막, 제대혈, 골수 또는 지방조직 유래의 줄기세포 등을 포함한 다양한 중간엽 줄기세포가 알려져 있으나, 연골세포로의 분화를 위해서는 주로 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 이용하여 왔다. 그러나 지방조직 유래의 줄기세포(통상 '지방-유래 중간엽 줄기세포' 또는 '지방-유래 줄기세포'로 칭해진다)는 지방흡입술 등을 통하여 쉽게 또한 많은 양을 한번에 얻을 수 있다는 점에서 유리하기 때문에, 많은 연구자들이 지방-유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키기 위한 연구를 수행하고 있다. 그러나 2006년 Kern 등은 지방-유래 중간엽 줄기세포가 연골이나 골조직보다 지방조직을 형성하려는 경향이 강하다는 것을 보고한 바 있고(Kern S et al. Stem Cells, 24(5), pp. 1294-1301, 2005 및 Im GI et al. Osteoarthritis Cartilage, 13(10), pp. 845-853, 2005), 골수에 비하여 지방-유래 중간엽 줄기세포는 연골세포로의 분화능이 떨어지는 것이 문제점으로 지적되고 있다(Im GI et al. Osteoarthritis Cartilage, 13(10), pp. 845-853, 2005; Rebelatto CK et al. Exp Biol Med, 233(7), pp. 901-913, 2008; 및 Bioback K et al. Biomed Mater Eng, 18(1) pp. 71-76, 2008). 또한, 지방-유래 중간엽 줄기세포는 이를 채취한 개체에 따라 연골세포로의 분화효율이 크게 차이가 남으로써, 이러한 편차를 극복할 수 있는 효과적인 분화방법을 개발하는 것이 당업계에 요구되고 있다.

본 발명자들은 인간의 지방에서 분리한 중간엽 줄기세포 즉, 지방-유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있는 효율적인 방법 특히, 지방-유래 중간엽 줄기세포의 개체 편차를 줄이면서 효과적으로 연골세포로 분화시킬 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 연골세포로의 분화과정에 관여하는 분화유도 신호전달 기작(mechanism)을 분석하였으며, 그 결과 TGF-β로부터 유도되는 전달 체계의 활성화가 연골세포로의 분화에 있어서 매우 중요한 역할을 한다는 것을 발견하였다. 특히, 놀랍게도, TGF-β와 결합할 수 있는 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자로 지방-유래 중간엽 줄기세포를 형질전환시켜 연골세포로의 분화를 유도하였을 때, 연골세포로의 분화능을 현저하게 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 TGF-β 수용체를 과발현하도록 지방-유래 중간엽 줄기세포를 형질전환하는 것을 포함하는, 지방-유래 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포의 TGF-β 수용체의 발현량을 측정하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능의 분석방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, (a) TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자로 지방-유래 중간엽 줄기세포를 형질전환하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 형질전환된 중간엽 줄기세포를 TGF-β를 포함하는 연골세포 분화용 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 지방-유래 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화방법이 제공된다.

본 발명의 분화방법에 있어서, 단계(a)의 상기 형질전환은 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 바람직하게 수행될 수 있으며, 상기 연골세포 분화용 배지는 TGF-β, 덱사메타손, 아스코르브산, 인슐린, 트랜스페린, 및 셀레늄염을 포함하는 DMEM 배지, 더욱 바람직하게는 TGF-β 1∼100 ng/ml, 덱사메타손 10∼1,000 nM, 아스코르브산 10∼500 nM, 인슐린 1∼1,000 ng/ml, 트랜스페린 50∼5,000 μg/ml, 및 셀레늄염 100∼3,000 ng/ml을 포함하는 DMEM 배지일 수 있다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 중간엽 줄기세포의 TGF-β 수용체의 발현량을 측정하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능의 분석방법이 제공된다.

본 발명의 분석방법에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 지방-유래 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 상기 발현량 측정은 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction), 또는 웨스턴 블롯팅에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 의해, TGF-β로부터 유도되는 전달 체계의 활성화가 연골세포로의 분화에 있어서 매우 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 특히, 본 발명에 따라 지방-유래 중간엽 줄기세포를 형질전환시켜 TGF-β 수용체를 과발현시키고, 이로부터 연골세포로의 분화를 유도할 경우, 개체의 편차 없이 연골세포로의 분화능을 현저하게 증가시킬 수 있다. 또한, TGF-β 수용체는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 조절하는 마커로서 기능할 수 있으므로, 중간엽 줄기세포의 TGF-β 수용체의 발현량을 측정함으로써, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 효과적으로 분석할 수 있다.

도 1은 10명의 개체로부터 얻어진 지방-유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킨 후, 얻어진 세포에 대하여 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)(A), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR)(B), 및 조직학적 분석(C)을 수행한 결과를 각각 나타낸다.
도 2는 10명의 개체로부터 얻어진 지방-유래 중간엽 줄기세포에 대한 TGF-β 신호 전달과 관련된 마커인 ALK1, 제I형 TGF-β 수용체(Type I TGF-β receptor), 제II형 TGF-β 수용체(Type II TGF-β receptor)의 발현양을 실시간 중합효소연쇄반응(A)과 웨스턴 블럿(B)으로 분석한 결과를 각각 나타낸다.
도 3은 제I형 TGF-β 수용체, 제II형 TGF-β 수용체, 또는 제I형 TGF-β 수용체와 제II형 TGF-β 수용체를 각각 코딩하는 유전자(A)를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 지방-유래 중간엽 줄기세포를 형질전환시킨 후, 웨스턴 블럿 방법을 통하여 HA와 FLAG로 유전자의 발현을 측정한 결과(B)를 나타낸다. 도 3의 C는 형질전환된 각각의 지방-유래 중간엽 줄기세포에 TGF-β 10 ng/ml의 농도로 4시간 동안 처리한 후, 하위 신호 전달 마커인 Smad 1/5/8과 Smad 2의 인산화 양을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 제I형 TGF-β 수용체, 제II형 TGF-β 수용체, 또는 제I형 TGF-β 수용체와 제II형 TGF-β 수용체를 각각 코딩하는 유전자로 형질전환된 지방-유래 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킨 후, 얻어진 세포에 대하여 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)(A), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR)(B), 및 조직학적 분석(C)을 수행한 결과를 각각 나타낸다.

본 발명은 (a) TGF-β 수용체로 지방-유래 중간엽 줄기세포를 형질전환하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 형질전환된 중간엽 줄기세포를 TGF-β를 포함하는 연골세포 분화용 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 지방-유래 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화방법을 제공한다.

본 발명에 의해, TGF-β로부터 유도되는 전달 체계의 활성화가 연골세포로의 분화에 있어서 매우 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 특히, 본 발명에 따라 지방-유래 중간엽 줄기세포를 형질전환시켜 TGF-β 수용체를 과발현시키고, 이로부터 연골세포로의 분화를 유도할 경우, 개체의 편차 없이 연골세포로의 분화능을 현저하게 증가시킬 수 있다. TGF-β 단백질은 액티빈(activin), 골 형성 단백질, 성장분화인자 등과 같은 단백질과 구조적으로 유사한 펩타이드로서, 발생과정, 세포분화 및 증식, 생존 등을 조절하는 인자로 알려져 있다. 특히 TGF-β는 중간엽 줄기세포의 연골형성세포로 분화 및 연골 형성에 중요한 역할을 수행한다. 이러한 TGF-β의 신호 전달은 type 1 과 2로 알려진 두가지 세린/쓰레오닌 키나아제(serine/threonine kinase)인 수용체 즉, 제I형 TGF-β 수용체(Type I TGF-β receptor), 제II형 TGF-β 수용체(Type II TGF-β receptor)를 통해 이루어진다. 이들 수용체는 인산화에 의하여 세포내 Smad 전사인자를 활성화시킴으로서 그 신호를 전달하는 것으로 알려져 있다. 특히, 제I형 TGF-β 수용체는 Smad 2와 3의 인산화를 통하여 신호를 전달하는 것으로 알려져 있다(Roberts AB et al. Mirobes Infect, 1, pp. 1265-1273, 1999; Forguson CM et al. Endocrinology, 141, pp. 4728-4735, 2000; 및 Yang Z et al. J Cell Biol, 153, pp. 35-46, 2001).

본 발명의 분화방법은 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자로 지방-유래 중간엽 줄기세포를 형질전환하는 단계[즉, 단계(a)]를 포함한다.

상기 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자는 제I형 TGF-β 수용체(Type I TGF-β receptor)를 코딩하는 유전자; 또는 제II형 TGF-β 수용체(Type II TGF-β receptor)를 코딩하는 유전자; 또는 제I형 TGF-β 수용체 및 제II형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 유전자들은 모두 공지된 서열로서, 통상의 유전공학적 방법에 의해 제조할 수 있으며, 또한 상기 유전자들은 상업적으로 구입할 수도 있다(예를 들어, SIGMA, Cosmo4, Bioneer, Takara, Invitrogen 사 등).

본 발명의 분화방법에 있어서, 지방-유래 중간엽 줄기세포는 제I형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자 혹은 제II형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자 각각으로 형질전환시킬 수 있으며, 제I형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자 및 제II형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자로 동시에 형질전환시키는 것이 높은 분화 효율을 달성할 수 있으므로 더욱 바람직하다.

상기 지방-유래 중간엽 줄기세포의 형질전환은 공지되어 있는 제I형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자 및/또는 제II형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자를 통상의 유전공학적 방법, 예를 들어 바이러스성 벡터를 이용하는 방법, 일렉트로포레이션 방법 등을 포함한 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 형질전환은 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 바람직하게 수행될 수 있다. 상기 일렉트로포레이션은 통상적으로 사용되는 일렉트로포레이션 기기를 사용하여, 완충액 중에 제I형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자 및/또는 제II형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자를 코딩하는 유전자를 현탁시킨 후, 전기를 가하여 수행될 수 있다. 필요할 경우, 유전자의 효과적인 도입을 확인하기 위하여, 제I형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자 및/또는 제II형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자에 FLAG 또는 HA를 코딩하는 유전자를 도입시킨 유전자 융합체를 사용하여 일렉트로포레이션을 수행할 수도 있다. 상기 유전자 융합체 또한 상업적으로 구입가능하다(예를 들어, SIGMA, Cosmo4, Bioneer, Takara, Invitrogen 사 등).

본 발명의 분화방법은 단계(a)에서 얻어진 형질전환된 중간엽 줄기세포를 TGF-β를 포함하는 연골세포 분화용 배지 중에서 배양하는 단계[즉, 단계(b)]를 포함한다.

상기 연골세포 분화용 배지는 분화유도인자로서 TGF-β를 포함하는 한, 특별히 제한되지 않으며, 종래에 알려져 있는 연골세포 분화용 배지를 사용할 수 있다(예를 들어, Rebelatto CK et al. Exp Biol Med, 233(7), pp. 901-913, 2008 등). 일 구현예에서, 본 발명의 분화방법에 사용되는 연골세포 분화용 배지는 TGF-β, 덱사메타손, 아스코르브산, 인슐린, 트랜스페린, 및 셀레늄염을 포함하는 DMEM 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 TGF-β 1∼100 ng/ml, 덱사메타손 10∼1,000 nM, 아스코르브산 10∼500 nM, 인슐린 1∼1,000 ng/ml, 트랜스페린 50∼5,000 μg/ml, 및 셀레늄염 100∼3,000 ng/ml을 포함하는 DMEM 배지일 수 있다. 단계(b)의 상기 배양은 펠렛 배양 형태로 통상의 배양 플레이트 상에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양될 수 있다. 배양기간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 약 3주간 동안 수행될 수 있다. 배양 완료 후, 연골세포는 펠렛 형태로 얻어지게 되며, 배지를 제거함으로써 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 분화방법에 의해 얻어진 연골세포는 연골손상 질환을 치료하기 위한 세포대체요법용 약학 조성물의 유효성분으로서 이용될 수 있다. 상기 연골 손상 질환으로는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 외상에 의한 관절 손상 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 중간엽 줄기세포의 TGF-β 수용체의 발현량을 측정하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능의 분석방법을 제공한다.

상기한 바와 같이, 제I형 TGF-β 수용체 및/또는 제II형 TGF-β 수용체는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 조절하는 마커로서 기능할 수 있으므로, 중간엽 줄기세포의 TGF-β 수용체의 발현량을 측정함으로써, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능을 효과적으로 분석할 수 있다.

상기 분석방법에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 윤활막, 제대혈, 골수, 지방(지방조직) 등 다양한 기원을 가진 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 지방-유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 발현량 측정은 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction), 또는 웨스턴 블롯팅에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 지방-유래 중간엽 줄기세포의 분리

23세에서 73세 사이의 환자 10명으로부터 지방흡입(liposuction) 방법을 통하여 제거되어 버려지는 지방조직을 수거하였다. 각각의 지방조직을 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척한 후, 1.5 mg/ml의 콜라게나제로 처리한 다음, 눈금 70 ㎛의 나일론 망으로 걸러냈다. 그 걸러낸 액을 용혈 완충액(0.15M NH₄Cl, 10mM KHCO₃, 0.1mM EDTA)으로 적혈구를 제거하고, PBS로 세포를 2회 세척하여 지방-유래 중간엽 줄기세포를 얻었다.

얻어진 지방-유래 중간엽 줄기세포를 다시 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1% 항균제를 함유한 DMEM 배양액에 1 X 10⁴/cm²농도로 접종하여, 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양접시에 배양하였다. 세포들이 바닥면적의 80%를 차지할 때, 트립신/EDTA를 이용하여 바닥에 부착된 세포를 분리하였다. 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 수득한 세포를, 다시 상기 배지로 현탁하여 동일하게 3회 계대 배양한 후 다음 실험에 사용하였다.

실시예 2. 개체별 지방-유래 중간엽 줄기세포의 연골 분화도 평가

실시예 1에서 얻어진 3회 계대 배양된 2 X 10⁵개의 지방-유래 중간엽 줄기세포를, 50 nM의 아스코르빈산, 1% ITS(인슐린 1g/L, 소듐 셀레나이트 0.67 mg/L, 트랜스페린 0.5 g/L), 1 X 10^-7M의 덱사메타손, 및 10 ㎍/L의 TGF-β로 보충된 DMEM 배지에 접종하여, 펠렛 배양 형태로 37℃, 5% CO₂의 조건에서 3주간 배양하였다. 3주간 배양 후, 배지를 제거하고, 얻어진 세포의 정성분석을 위하여 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행하여 연골세포 분화마커인 제2형 콜라겐(Collagen type 2, Col II) 및 아그레칸(Aggrecan, Agg) 유전자의 RNA 발현을 측정하였다. 즉, 얻어진 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 트립신-이디티에이(Trysin-EDTA)로 세포를 회수하고, 트리졸(TRIzol, Life Technologies, Inc. Grand Island, NY) 방법을 통하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 5 ㎍를 RT-PCR kit(Bioneer, Seoul, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 수행한 뒤, 1.2% 아가로즈젤(Agarose gel)을 이용한 전기영동을 통해 유전자 발현의 변화를 측정하였다. RT-PCR에 사용된 프라이머 세트 및 각각의 분화마커는 다음 표 1과 같다.

마커	서열		기원^*
Col II	센스	5'-TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3'	NM_001844
	안티센스	5'-AGA GTC CTA GAG TGA CTG AG-3'
Aggrecan (Agg)	센스	5'-GAA TCT AGC AGT GAG ACG TC-3'	NM_013227
	안티센스	5'-CTG CAG CAG TTG ATT CTG AT-3'
α-튜블린	센스	5'-CTC CGC CAT CAG CTC GGC AG-3'	NM_006009
	안티센스	5'-AGG GTG GAA GAG CTG GCG GT-3'

*기원: NCBI 접근 번호(NCBI accession number)

또한 얻어진 세포의 정성분석을 위하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction, Real-Time PCR)을 수행하여 상기 마커의 발현량을 측정하였다. 구체적으로는, 1.2% 아가로즈젤(Agarose gel)에서 전기영동하여 Etbr (ethidium bromide) 염색을 통해 가시화하고 젤 다큐멘테이션 시스템 (Gel Doc 1000, Bio-Red Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 분석하였다.

또한, 얻어진 세포를 파라핀으로 포매하고, 미세 절단한 다음 알시안 블루(alcian blue) 염색한 후, 조직학적 분석을 수행하였다.

상기 RT-PCR 분석, Real-Time PCR 분석, 및 조직학적 분석 결과는 도 1의 A, B, 및 C와 같다. 도 1의 A 및 B의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 동일한 조건에서 연골세포로의 분화를 유도하였음에도 불구하고, 지방-유래 중간엽 줄기세포는 개체별로 연골세포 분화에 대한 큰 차이를 보였다. 1번, 3번, 5번, 7번의 개체에서 얻은 지방-유래 중간엽 줄기세포는 연골세포로의 분화가 잘 이루어지지 않은 반면, 2번, 8번, 9번, 10번 개체에서 분리한 중간엽 줄기세포는 연골세포로의 분화가 잘 이루어졌다. 상기 결과는 조직학적 분석에서도 동일하게 나타났다(도 1의 C).

실시예 3. 개체별 지방-유래 중간엽 줄기세포의 특성 분석

실시예 2에서 개체별로 지방-유래 중간엽 줄기세포의 연골분화가 다르게 나타나는 원인을 분석하기 위해, TGF-β 신호 전달과 관련된 마커로 알려져 있는 ALK1, 제I형 TGF-β 수용체, 제II형 TGF-β 수용체의 발현양을 실시간 PCR과 웨스턴 블럿으로 분석하였으며, 그 결과는 도 2의 A와 같다. 또한 ALK1, 제I형 TGF-β 수용체, 및 제II형 TGF-β 수용체의 하위 신호 전달 마커인 Smad 1/5/8과 Smad 2의 인산화 양을 TGF-β 10 ng/ml의 농도로 4시간 동안 처리한 후 웨스턴 블럿으로 분석하여, TGF-β에 의한 지방-유래 중간엽 줄기세포의 연골세포 분화 특성을 분석하였으며, 그 결과는 도 2의 B와 같다.

도 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, ALK1과 제I형 TGF-β 수용체의 양은 연골 분화와 밀접한 관계가 있었다. ALK1이 적게 발현하고, 제I형 TGF-β 수용체의 양이 많이 발현할수록 연골세포로의 분화가 잘 이루어졌으며, ALK1이 많이 발현하는 세포는 SMAD 1/5/8의 인산화가 강하게 이루어졌고, 제I형 TGF-β 수용체가 많이 발현하는 세포는 SMAD2의 인산화가 많이 이루어졌다. 하지만, 제II형 TGF-β 수용체의 발현과는 통계학적으로 유의성 있는 값을 얻지 못했으나, 제II형 TGF-β 수용체가 많이 발현할수록 연골 분화가 잘 이루어졌다.

실시예 4. TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자 전달 및 유전자 발현 확인

실시예 2에서 지방-유래 중간엽 줄기세포 중 연골 분화가 잘 이루어지지 않았던 개체 5번과 7번을 이용해 실험을 진행하였다. 유전자 전달은 일렉트로포레이션 기기(MP-100, DIGITAL BIO TECHNOLOGY, Korea)를 방법을 이용하였다. 먼저, 각각의 세포를 트립신-EDTA 용액으로 처리하여 떼어내어 PBS 용액에 3번 세척한 후, 1 X 10⁶ 개의 세포를 1.5ml의 튜브에 옮겨 1200 rpm으로 3분간 원심분리하여 세포를 침전시켰다.

제I형 TGF-β 수용체 및 FLAG (DYKDDDDK)를 코딩하는 유전자 발현벡터는 human embryonal carcinoma cell line인 NCCIT 세포주에서 total RNA를 추출하여 Oligo dT 프라이머(Invitrogen)를 이용하여 역전사 반응을 유도한 후, type I TGF-β open reading frame을 지정하는 5'-프라이머(5'-CATAAGCTTGCCACCATGGAGGCGGCGGTCGCTG-3')와, FLAG 코딩 염기서열이 포함된 3'-프라이머(5'-CATGCGGCCGCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCACCGGTGATATCCATTTTGATGCCTTCCTGTTG-3')를 이용한 PCR을 수행하여 pcDNA3.0 (Invitrogen) 벡터에 클로닝하여 제작하였다. 제II형 TGF-β 수용체 및 HA (YPYDVPDYA)를 코딩하는 유전자 발현벡터는 human cervical cancer cell line인 HeLa 세포주에서 total RNA를 추출하여 Oligo dT 프라이머(Invitrogen)를 이용하여 역전사 반응을 유도한 후, type II TGF-β open reading frame을 지정하는 5'-프라이머(5'-CTGGATCCGCCACCATGGGTCGGGGGCTGCTCAG-3')와, HA 코딩 염기서열이 포함된 3'-프라이머(5'-AATAGGGCCCTCTAGCTAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATCTAGATGCATGCTCGAGTTTGGTAGTGTTTAGGGAGC-3')를 이용한 PCR을 수행하여 pcDNA3.0 (Invitrogen) 벡터에 클로닝하여 제작하였다. 제I형 TGF-β 수용체 및 FLAG를 코딩하는 유전자 8㎍; 또는 제II형 TGF-β 수용체 및 HA를 코딩하는 유전자 8㎍; 또는 제I형 TGF-β 수용체 및 FLAG를 코딩하는 유전자와 제II형 TGF-β 수용체 및 HA를 코딩하는 유전자 8㎍을 각각 Solution R 완충액(DIGITAL BIO TECHNOLOGY, Korea) 100 ㎕로 현탁하고, 상기에서 얻어진 침전된 세포를 1 X 10⁶ 개씩 첨가하였다. Microporator pipette과 Gold-tip을 틈새없이 밀착시켜 연결 한 후, microporation tube에 E2 완충액(DIGITAL BIO TECHNOLOGY, Korea) 3ml을 넣어주고 pipette station에 결합하였다. Gold-tip과 밀착시킨 microporator pipette으로 DNA와 섞은 Solution R 완충액을 흡입시켰다. Solution R 완충액을 흡입시킨 picroporatior pipette과 E2 완충액이 들어있는 pipette station를 결합한 후, Microporator의 전원을 켜고 설정 전기조건(Pulse voltage: 1200V, Pulse width: 30 ms, Pulse number: 2회)을 입력하고 전기를 가하였다. 얻어진 각각의 세포를 배양 플레이트에 골고루 뿌려주고, 37℃ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 유전자 도입 효율과 생존율을 분석하였으며, 유전자 도입율 65% 이상 생존율 80% 이상인 조건에서 실험을 진행하였다.

세포에 도입된 유전자의 발현은 유전자 도입 후 72시간 동안 배양한 후 웨스턴 블럿 방법을 통하여 HA와 FLAG로 확인하였다. 그 결과는 도 3의 B와 같다. 도 3의 B의 결과로부터, 제I형 TGF-β 수용체와 제II형 TGF-β 수용체의 발현량이 향상되었으며, HA와 FLAG가 유전자가 도입된 세포에서 발현하는 것으로 보아 제I형 TGF-β 수용체 및 제II형 TGF-β 수용체는 넣어준 유전자에 의해 발현하고 있음을 알 수 있다. 또한 형질전환된 각각의 지방-유래 중간엽 줄기세포에 TGF-β를 10 ng/ml의 농도로 4시간 동안 처리한 후, 하위 신호 전달 마커인 Smad 1/5/8과 Smad 2의 인산화 양을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과, 제I형 TGF-β 수용체 또는 제I형 TGF-β 수용체와 제II형 TGF-β 수용체를 동시에 발현하는 중간엽 줄기세포 SMAD2의 인산화가 크게 증가하였다(도 3의 C)

실시예 5. 유전자가 도입된 지방유래 중간엽 줄기세포의 연골 분화

실시예 4에서 제I형 TGF-β 수용체, 제II형 TGF-β 수용체, 또는 제I형 TGF-β 수용체 및 제II형 TGF-β 수용체로 형질전환된 지방-유래 중간엽 줄기세포에 대하여 실시예 2와 동일한 방법으로 연골세포로 분화시켰다. 즉, 각각 2 X 10⁵개의 형질전환된 지방-유래 중간엽 줄기세포를, 50 nM의 아스코르빈산, 1% ITS(인슐린 1g/L, 소듐 셀레나이트 0.67 mg/L, 트랜스페린 0.5 g/L), 1 X 10^-7M의 덱사메타손, 및 10 ㎍/L의 TGF-β로 보충된 DMEM 배지에 접종하여, 펠렛 배양 형태로 37℃, 5% CO₂의 조건에서 3주간 배양하였다. 3주간 배양 후, 실시예 2와 동일한 방법으로 RT-PCR, Real-Time PCR, 및 조직학적 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 4와 같다.

도 4의 결과로부터, 5번 개체와 7번 개체 모두 제I형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자 또는 제I형 및 제II형 TGF-β 수용체를 동시에 코딩하는 유전자를 전달한 그룹에서 연골세포로의 분화가 향상되었고, 제I형 TGF-β 수용체 및 제II형 TGF-β 수용체를 동시에 코딩하는 유전자를 전달한 그룹에서 가장 높은 효율의 연골 분화가 이루어졌다.

Claims

(a) 제I형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자로 지방-유래 중간엽 줄기세포를 형질전환하거나 혹은 제I형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자 및 제II형 TGF-β 수용체를 코딩하는 유전자로 지방-유래 중간엽 줄기세포를 형질전환하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 형질전환된 중간엽 줄기세포를 TGF-β를 포함하는 연골세포 분화용 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 지방-유래 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화방법.
제1항에 있어서, 단계(a)의 상기 형질전환이 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 분화방법.
제1항에 있어서, 상기 연골세포 분화용 배지가 TGF-β, 덱사메타손, 아스코르브산, 인슐린, 트랜스페린, 및 셀레늄염을 포함하는 DMEM 배지인 것을 특징으로 하는 분화방법.
제3항에 있어서, 상기 연골 분화용 배지가 TGF-β 1∼100 ng/ml, 덱사메타손 10∼1,000 nM, 아스코르브산 10∼500 nM, 인슐린 1∼1,000 ng/ml, 트랜스페린 50∼5,000 μg/ml, 및 셀레늄염 100∼3,000 ng/ml을 포함하는 DMEM 배지인 것을 특징으로 하는 분화방법.
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