KR101322430B1

KR101322430B1 - 연골세포의 탈분화 억제 방법

Info

Publication number: KR101322430B1
Application number: KR1020120050387A
Authority: KR
Inventors: 이수홍; 차병현; 안종찬; 차혁진
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2012-05-11
Publication date: 2013-10-28

Abstract

본 발명은 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자로 연골세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 연골세포의 탈분화 억제 방법; 및 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된 탈분화가 억제된 연골세포를 제공한다. 본 발명에 따른 탈분화 억제 방법은 연골세포의 단층배양에서 나타나는 탈분화를 억제함으로써, 정상적 표현형을 갖는 연골세포를 대량으로 배양할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 자가 연골 조직에서의 연골세포의 낮은 회수율을 개선할 수 있어, 세포치료용 연골세포 제조에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

연골세포의 탈분화 억제 방법{Methods for inhibiting dedifferentiation of chondrocytes}

본 발명은 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자로 연골세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 연골세포의 탈분화 억제 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된, 탈분화가 억제된 연골세포에 관한 것이다.

관절 연골은 관절면으로부터 깊이에 따라 구조와 구성요소가 다양하며, 천층, 중간층, 심층, 석회층으로 구성되어 있는 결합조직의 특수한 형태로 세포외 기질이 단단하여 물리적인 힘에 의해 손상을 받지 않도록 하는데 중요한 역할을 한다. 관절연골 조직은 노화에 따라 연골 두께와 연골세포 수의 감소 이외에 기질의 구성변화가 초래되며, 또한 연골세포의 기능에도 변화가 유발된다. 사람에게 가장 빈번하게 유발되는 퇴행성 질환 중 하나인 골관절염의 유발요인으로 노화 현상이 중요하게 생각되고 있다(Bobacz K et al, Ann Rheum Dis, 63(12), pp.1618-1622, 2004). 또한, 특이하게 관절 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직이다(Brittberg M et al, New England Journal of Medicine, 331, pp. 889-895, 1994). 현재 다양한 의공학적 접근방법으로 퇴행관절 연골질환을 치료하려는 노력이 진행되고 있으나, 정상적인 연골조직재생에는 아직까지 많은 한계점이 있다. 따라서 현재까지 자가 연골세포 이식법에 의한 연골조직의 재생이 임상적으로 매우 안정적이고 효과적인 수술법으로 알려져 있다. 그러나, 이러한 자가연골세포 치료법에 있어 정상 연골세포원을 다량으로 확보하기가 불가능하여, 연골조직의 광범위한 손상 부위에는 사용할 수 없으며, 또한 관절 연골의 손상 위치, 환자의 나이 등에 따라 제한점을 가지고 있다.

연골세포는 이미 분화된 세포로서 조직 내에서 세포 분열이 왕성하지 않지만, 분리 후 체외에서 단층배양 시 증식이 촉진되어 충분한 수의 연골세포를 얻을 수 있다. 그러나 필요로 하는 충분한 세포수를 얻기 위해 단층배양을 오랫동안 하게 되면 연골세포의 표현형이 감소하는 탈분화 현상이 일어날 뿐 아니라, 생체 내 이식시 섬유화 연골조직 및 석회화(Calcification)된 조직이 형성되는 문제점이 있다(Fischer J et al. Arthritis & Rheumatism, 62(9), pp. 2696-2706, 2010). 퇴행성관절염의 경우, 연골조직에서 얻어지는 세포가 이미 노화되어 있고, 또한 정상 연골조직에서 정상 연골세포를 회수할 경우에도 체외 단층배양에 의해 정상 연골세포의 탈분화가 급속히 이루어져 정상 연골세포를 대량으로 확보하는 것은 기술적으로 매우 어려운 실정이다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 다양한 세포성장인자 (예를 들어, TGF-b) 첨가, 펠렛 형태의 3차원 배양, 줄기세포에 연골분화 관련 유전자 도입 등의 기술을 이용한 배양법이 제안되고 있으나, 아직까지 만족할 만한 탈분화 억제효과를 보이지 못하고 있으며, 충분한 수의 정상 연골세포의 확보가 매우 어려운 실정이다.

본 발명자들은 연골세포 이식에 의한 연골조직의 재생에 사용될 수 있는 정상적 표현형을 갖는 연골세포, 즉 탈분화가 억제된 연골세포를 제공할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 노화억제 유전자로 알려져 있는 Wip1 유전자로 연골세포를 형질전환시켰을 때, 지속적인 계대배양 시에도 연골세포의 표현형이 그대로 유지되면서 탈분화가 효과적으로 억제된다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자로 연골세포를 형질전환 시키는 단계를 포함하는, 연골세포의 탈분화(dedifferentiation) 억제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된, 탈분화가 억제된 연골세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자, 바람직하게는 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 유전자로 연골세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 연골세포의 탈분화(dedifferentiation) 억제 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자, 바람직하게는 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 유전자로 형질전환된, 탈분화가 억제된 연골세포가 제공된다.

Wip1 유전자로 형질전환시켜 얻어진 연골세포가 지속적인 계대배양 시에도 연골세포의 표현형이 그대로 유지되면서 탈분화가 효과적으로 억제된다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 기존의 연골세포의 단층배양에서 나타나는 탈분화를 억제함으로써, 정상적 표현형을 갖는 연골세포를 대량으로 배양할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 자가 연골 조직에서의 연골세포의 낮은 회수율을 개선할 수 있어, 세포치료용 연골세포 제조에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 제2계대의 연골세포 및 제5계대의 연골세포에 대하여 연골세포 관련 마커 유전자 발현 양상을 RT-PCR로 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 Wip1 플라스미드 DNA 벡터의 클로닝시 사용된 TOPO 벡터의 개열지도이다.
도 3은 빈(Empty) 벡터를 도입한 제2계대의 연골세포(p2-Mock) 및 Wip1 플라스미드 DNA 벡터로 형질전환된 제2계대의 연골세포(p2-Wip1)를 각각 7일 동안 배양한 후 RT-PCR 분석(A) 및 웨스턴 블롯팅 분석(B)을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 빈(Empty) 벡터를 도입한 제5계대의 연골세포(p5-Mock) 및 Wip1 플라스미드 DNA 벡터로 형질전환된 제5계대의 연골세포(p5-Wip1)를 누드 마우스에 피하 이식하여 연골재생능을 평가한 결과이다. 도 4의 a)는 두 그룹의 세포를 이식하여 6 주 동안 형성된 조직을 박절하여 알시안 블루(Alcian blue) 염색법으로 글라이코스아미노글리칸 매트릭스(Glycosaminoglycan(GAG) matrix)를 염색하고 정량한 결과이다. 도 4의 b)는 두 그룹의 형성된 조직을 Col II의 면역형광염색(Immunofluorescence staining)으로 확인한 결과이다(Scale bar=500 ㎛). 도 4의c)는 두 그룹의 형성된 조직으로부터 연골세포 관련 마커 유전자의 발현 양상을 RT-PCR로 측정한 결과를 나타낸다.

본 명세서에서, "연골세포(chondrocytes)"이라 함은 인간을 포함한 동물의 연골조직으로부터 체외로 배출된 연골세포; 또는 줄기세포[예를 들어, 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs] 등으로부터 공지의 방법으로 분화시켜 얻어진 연골세포를 말한다. 상기 연골세포는 바람직하게는 인간의 연골조직으로부터 체외로 배출된 연골세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인간의 정상 유리화 연골(결합조직)로부터 체외로 배출된 연골세포일 수 있다. 구체적으로는 상기 연골세포는 예를 들어, 인간의 슬관절, 척관절, 비연골로부터 체외로 배출된 연골세포일 수 있다. 상기 연골세포는, 치료 등의 목적으로 인체로부터 분리된 연골조직으로부터, 공지의 방법에 따라 효소처리(예를 들어, 타입 II 콜라게나아제 처리) 및 원심분리 등의 방법을 통하여 분리할 수 있다. 분리된 연골세포는 통상의 연골세포 배양용 배지, 예를 들어, 1 % 페니실린-스트렙토마이신 및 10%의 우태아혈청(FBS)이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), Gibco BRL, Gaithersburg, MD)] 중에서 배양될 수 있다.

또한, 본 명세서에서 "연골세포의 탈분화(dedifferentiation)"라 함은 연속되는 단층 계대 배양 및 기타 원인에 의해 연골세포의 합성 프로파일(synthetic profile)의 포괄적 변화로 인한 연골세포의 유전적 혹은 형태학적 표현형이 변화되어 연골세포로서의 특징을 잃어버리는 변화를 의미한다. 여기서 합성 프로파일이라함은 유전자 발현 및 관련 단백질의 합성을 의미한다. 연골세포의 표현형 즉 바이오 마커는 Col II 및 Aggrecan(Agg)를 포함하며, 탈분화된 연골세포의 표현형 즉 바이오마커는 Col X를 포함한다. 따라서, 연골세포의 탈분화는 또한 Col II 및 Agg 등의 정상 연골세포 바이오 마커의 발현이 유의성 있게 감소하고, Col X 등의 탈분화 바이오 마커의 발현이 유의성 있게 증가하는 것으로 정의될 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자로 연골세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 연골세포의 탈분화 억제 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된, 탈분화가 억제된 연골세포를 제공한다.

본 발명에 의해, Wip1 유전자로 형질전환시켜 얻어진 연골세포가 지속적인 계대배양 시에도 연골세포의 표현형이 그대로 유지되면서 탈분화가 효과적으로 억제된다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 기존의 연골세포의 단층배양에서 나타나는 탈분화를 억제함으로써, 정상적 표현형을 갖는 연골세포를 대량으로 배양할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 자가 연골 조직에서의 연골세포의 낮은 회수율을 개선할 수 있어, 세포치료용 연골세포 제조에 유용하게 활용될 수 있다.

상기 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 구성될 수 있다. 본 발명에 따른 탈분화 억제 방법은 바람직하게는 제1계대 내지 제5계대로 계대배양된 연골세포, 더욱 바람직하게는 제2계대로 계대배양된 연골세포에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 탈분화가 억제된 연골세포는 바람직하게는 제1계대 내지 제5계대로 계대배양된 연골세포, 더욱 바람직하게는 제2계대로 계대배양된 연골세포를 상기 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환시켜 얻어진 연골세포일 수 있다.

상기 연골세포의 형질전환은 통상의 유전공학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 형질전환은 비-바이러스 감염 방법인 마이크로포레이터(Micoroporator) 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 마이크로포레이터 방법은 고압의 전압으로 세포(즉, 연골세포)를 자극하여 세포막의 조성을 순간적으로 변화시켜 유전자(즉, Wip1 단백질을 코딩하는 유전자)가 세포 내로 유입되도록 하는 방법으로서, 유전공학분야에서 통상적으로 사용되는 방법이다. 예를 들어, 상기 형질전환은 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자를 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA 벡터[예를 들어, TOPO 벡터(Promega, Madison, WI) 등]에 클로닝하여 재조합 Wip1 플라스미드 DNA 벡터를 얻은 다음, 마이크로포레이터 방법으로 연골세포에 도입함으로써 수행될 수 있다. 상기 마이크로포레이터 방법은 Resuspension 용액(Invitrogen, USA)에 상기 Wip1 플라스미드 DNA 벡터 및 연골세포를 혼합한 후, 약 1400 voltage, 약 20 ms, 약 2 pulse로 반응시킴으로써 수행될 수 있으며, 얻어진 세포는 통상의 배양용 배지(예를 들어, 항생제가 없는 DMEM 배양액)에 파종하여 배양될 수 있다.

또한, 상기 형질전환은 바이러스 감염 방법(Virus infection method)을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 형질전환은 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터(retroviral vector) 또는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)에 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 얻어진 벡터를 숙주 세포에 감염시켜 바이러스를 생산하게 한 후, 상기 바이러스로 연골세포를 감염시켜 수행될 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인간 연골세포의 배양 및 탈분화 평가

(1) 인간 연골세포의 분리

차의과학대학 부속병원의 윤리위원회의 허가 아래, 환자로부터 동의를 받고, 정형외과에서의 무릎 수술 시 제거되어 버려지는 연골조직을 수거하였다. 오염된 혈액을 제거하기 위해, 얻어진 연골 조직을 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)(Sigma, St. Louis, MO)를 이용하여 3회 세척하고, 수술칼을 이용하여 효소처리가 용이하도록 세절하였다. 이어서 연골조직을 0.05 w/v% 소혈청알부민 함유 PBS와 2 mg/mL 타입 II 콜라게나아제(Sigma)로 15시간 동안 37℃에서 소화시켰다. 70 ㎛ 필터로 여과하고, 여액을 원심분리한 후 부유하는 지방세포를 제거하였다. 분리된 연골세포을 배지[1 % 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)과 10%의 우태아혈청(FBS)(Invitrogen, USA)이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), Gibco BRL, Gaithersburg, MD)]에서 37℃, 5 % CO₂ 인큐베이터에서 배양하여 인간 연골세포를 분리하였다. 1회 계대 배양된 세포를 다음 시험에서 사용하였다.

(2) 제2계대의 연골세포 및 제5계대의 연골세포의 표현형 분석

상기 (1)에서 얻어진 연골세포를 1X10⁴ cells/cm²의 밀도로 파종하고, 4∼5 일 동안 배지[1 % 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)과 10 %의 우태아혈청(FBS)(Invitrogen)이 첨가된 DMEM(Gibco)]에서 배양하고, 동일한 배지로 교체하면서 제5계대(passage 5)까지 계대배양하였다. 각 계대배양의 배양기간은 4∼5일로 동일하게 하였다. 제2계대(passage 2) 및 제5계대(passage 5)에서 각각 얻어진 연골세포에 대하여 마커 유전자의 발현을 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)으로 평가하였다. 연골세포 관련 마커 유전자로서 Col II 및 Aggrecan(Agg)의 발현을 측정하였으며, 탈분화 마커 유전자로서 Col X의 발현을 측정하였다. GAPDH를 하우스키핑 유전자로 사용하여 함께 분석하였다.

상기 RT-PCR은 다음과 같이 수행하였다. 즉, 각 계대(passage 2 및 passage 5)에서 얻어진 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 트립신-이디티에이(Trysin-EDTA)로 세포를 회수하고, 트리졸(TRIzol, Life Technologies, Inc. Grand Island, NY) 방법을 통하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 2 ㎍를 RT-PCR kit(Bioneer, Seoul, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 수행한 뒤, 1.2 % 아가로즈젤(Agarose gel)을 이용한 전기영동을 통해 유전자 발현의 변화를 측정하였다. 상기 RT-PCR에 사용된 프라이머 세트 및 각각의 분화 마커는 다음 표 1과 같다.

마커	서열			기 원^*
Col II	서열번호 3	센스	5'-TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3'	NM_001844
Col II	서열번호 4	안티센스	5'-AGA GTC CTA GAG TGA CTG AG-3'	NM_001844
Aggrecan (Agg)	서열번호 5	센스	5'-GAA TCT AGC AGT GAG ACG TC-3'	NM_013227
Aggrecan (Agg)	서열번호 6	안티센스	5'-CTG CAG CAG TTG ATT CTG AT-3'	NM_013227
Col X	서열번호 7	센스	5'-AGG GTT ACC AGG TCC AAA AG-3'	NM_00493.3
Col X	서열번호 8	안티센스	5'-TTC CAG TCC TTG GGT CAT AA-3'	NM_00493.3
GAPDH	서열번호 9	센스	5'-CGG ATT TGG TCG TAT TGG GC-3'	NM_002046
GAPDH	서열번호 10	안티센스	5'-CAG GGA TGA TGT TCT GGA GA-3'	NM_002046

*기원: NCBI 접근 번호(NCBI accession number)

상기와 같이 RT-PCR을 수행한 결과는 도 1과 같다. 도 1의 결과로부터, 제5계대의 연골세포에 비하여 제2계대의 연골세포에서의 연골세포 관련 마커인 Col II와 Agg의 발현이 높은 것을 확인할 수 있다. 반면, 연골세포 탈분화 마커인 Col X는 제2계대의 연골세포에서 낮은 수준의 발현을 보였으나, 제5계대의 연골세포에서는 높은 발현을 나타내었다. 따라서, 계대가 증가할수록, 연골세포의 탈분화가 유의성 있게 증가함을 알 수 있다.

실시예 2. Wip1 유전자 도입 및 확인

공지의 방법(Bulavin, D.V. et al. Nature genetics 31, 210-215 (2002); 및 Bulavin, D.V. et al. Nature genetics 36, 343-350 (2004)에 따라, 제한효소로서 BamH1 및 Sal1를 사용하여 서열번호 2의 Wip1 유전자를 TOPO TA cloning kit(Promega, Madison, WI)를 이용하여 TOPO 벡터에 삽입하여, Wip1 플라스미드 DNA 벡터를 제작하였다. 상기 TOPO 벡터의 개열지도는 도 2와 같다.

Wip1 플라스미드 DNA 벡터를 사용하여, 비-바이러스성 유전자 도입 시스템인 마이크로포레이터(Micoroporator, Invitrogen)을 이용하여 유전자 도입을 수행하였다. 즉, 제조사 지침에 따라 100 ㎕의 Resuspension 용액(Invitrogen, USA)에 상기 Wip1 플라스미드 DNA 벡터 5 ㎍과 연골세포 1X10⁶ cells를 혼합한 후, 약 1400 voltage, 약 20 ms, 약 2 pulse로 반응시킴으로써 유전자 도입을 수행하였다. 얻어진 세포는 통상의 배양용 배지(예를 들어, 항생제가 없는 DMEM 배양액)에 파종하여 배양하여 제2계대의 연골세포를 형질전환시켰다. 비교를 위하여, Wip1 유전자가 없는 빈(Empty) 벡터 즉, TOPO 벡터(Promega사)를 사용하여 동일한 방법으로 제2계대의 연골세포를 형질전환시켰다.

유전자 도입을 수행하여 얻어진 연골세포를 7일 동안 배지[1 % 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)과 10 %의 우태아혈청(FBS)(Invitrogen)이 첨가된 DMEM(Gibco)]에서 배양하고, 실시예 1의 (2)와 동일한 방법으로 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. Wip1 유전자 발현을 측정하기 위한 프라이머로서, 센스 및 안티센스 프라이머는 각각 5'-CAG ACA CAA GTG TCC AGA CT-3'(서열번호 11) 및 5'-TGG CAC AAG ATT GTC CAT GC-3'(서열번호 12)을 사용하였다.

또한, 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯팅(Westhern blotting)을 수행하여 도입된 Wip1 유전자 발현과 단백질 발현을 확인하였다. 상기 웨스턴 블롯팅은 다음과 같이 수행하였다. 즉, 각각의 배양 접시에 100 ㎕ 라이시스 버퍼(Lysis buffer, RIPA buffer, Sigma)에 첨가하고, 세포 용해물(Lysate)을 10 분간 13000 rpm에서 초원심분리(Micro 17R, Hanil Science Industrial, Seoul, Korea)하였다. 단백질을 포함하는 상층액을 SDS-PAGE 샘플 완충액(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) sample buffer)에 넣고 95℃에서 5 분간 변성시켰다. 겔에 있는 단백질을 다시 PVDF(Polyvinylidene difluoride membranes)(Millipore, Billerica, MS)에 옮기고, 1차 항체인 항-α-튜블린 항체(ABM, Canada), 항-V5-Tag 항체(ABM), 항-Wip1 항체(Santa Cruz Biotechnology, CA)와 에이치알피 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 2차 항체를 통해 결합시킨 후, Enhanced chemiluminescence(ECL)로 측정하였다. 또한, 세포내부의 내재된 유전자가 아닌 외부에서 도입된 유전자임을 확인하기 위해 벡터 내의 Tagged 단백질인 V5를 함께 확인하였다.

상기 RT-PCR 및 웨스턴 블롯팅 결과는 각각 도 3의 (A) 및 (B)와 같다. 도 3의 (A) 및 (B)로부터 알 수 있는 바와 같이, 빈(Empty) 벡터를 도입한 제2계대의 연골세포(p2-Mock)에서는 Wip1 유전자가 발현되지 않았으나, Wip1 플라스미드 DNA 벡터로 형질전환된 제2계대의 연골세포(p2-Wip1)는 Wip1 유전자를 효과적으로 발현하였다.

실시예 3. 생체내 ( In vivo ) 연골조직 재생 평가 및 마커 유전자 발현 분석

실시예 1에서 얻어진 제5계대의 연골세포를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 방법으로 빈(Empty) 벡터를 도입한 제5계대의 연골세포(p5-Mock) 및 Wip1 플라스미드 DNA 벡터로 형질전환된 제5계대의 연골세포(p5-Wip1)를 각각 얻었다. 각각의 연골세포 1x10⁶ cells를 피브린 젤(Fibrin gel)(Greenplast, 녹십자, KOREA) 100 ㎕에 혼합하여, 누드 마우스(Bal b/c nude mouse) (Orient Bio, KOREA)의 등(flank)에 피하 이식하여 연골재생능을 평가하였다. 각 군은 4마리씩 사용하였다(n=4).

연골세포 이식을 수행한 후 6주 후에, 누드 마우스를 CO₂ 챔버에서 희생하였고, 얻어진 조직은 4 % 포르말린(Formalin, DUKSAN, KOREA)으로 24시간 동안 고정하였다. 고정된 조직으로부터 에탄올을 이용하여 조직 내 수분을 제거하고, 투영제인 자일렌(Xylene, JUNSEI, JAPAN)을 이용해 에탄올을 치환하여 파라핀(Paraffin)으로 포매하고, 조직 블록(Block)을 제조하였다. 얻어진 파라핀 블록을 박절기(Microtome)을 이용하여 4 ㎛의 두께로 박절하였다. 얻어진 각 조직의 절편을 PBS로 2 회 세척하고, 4 % 알시안 블루(Alcian blue) 용액에 넣고 실온에서 30분 동안 처리하여 염색하였다. 염색액을 제거하고 뉴클이어 패스트 레드(Nuclear fast red)를 이용하여 대비 염색하였다. 그 결과는 도 4의 a)와 같다. 도 4의 a)의 좌측 패널에서 적색은 세포의 핵 부위이고, 청색은 연골세포에서 관찰되는 글라이코스아미노글리칸 매트릭스(Glycosaminoglycan(GAG) matrix)를 나타낸다(Scale bar=500 ㎛). 도 4의 a)의 우측 패널은 상기 방법으로 염색된 조직에서부터 청색의 GAG matrix를 영상 분석기(Image analyzer)로 정량한 결과이다. 도 4의 a)의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, Wip1-p5 연골세포를 이식한 그룹(Wip1-p5)에서 연골조직으로부터 관찰되는 연골소강(Cartilage lacuna)과 함께 많은 부분에서 청색의 GAG matrix가 관찰되었다. 반면 빈(Empty) 벡터를 도입한 제5계대의 연골세포를 이식한 그룹(Mock-p5)에서는 GAG matrix가 거의 관찰되지 못했다. 또한, Wip1-p5 연골세포를 이식한 그룹에서 청색의 GAG matrix가 염색된 연골조직이 생성된 조직 면적대비 56.97±2.58 %로 측정된 반면, Mock-p5 연골세포를 이식한 그룹에서는 3.24±0.52 %로 측정되었다(n=4, **, p<0.01). 따라서 통계학적으로 유의성 있게 Mock-p5 연골조직보다 Wip1-p5 연골조직에서 높은 연골재생능을 나타냄을 알 수 있다.

또한, 두 그룹의 형성된 조직을 상기와 동일한 방법으로 조직을 박절하고 Col II의 발현을 면역형광염색(Immunofluorescence staining)으로 확인하였다. 즉, 박절된 조직을 4 w/v % 파라포름알데하이드에 10분간 고정시킨 다음, 0.1 % Triton X-100(Sigma) 용액에 1 분간 두어 세포막을 투과시키고 3 % BSA가 포함된 PBS에서 1 시간 동안 상온에서 방치함으로써 블록킹(Blocking)시켰다. 이렇게 준비된 샘플은 DAPI로 핵을 염색하고, 프라이머리 Col II 항체 및 세컨드 FITC-conjugate 단백질을 이용하여 염색 후 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과는 도 4의 b)와 같다(Scale bar=500 ㎛). 도 4의 b)에서 좌측 패널은 광학이미지이고, 중간 패널은 DAPI를 통해서 핵을 염색한 결과이고, 우측 패널은 Col II의 면역형광염색 이미지이다. 도 4의 b)의 결과로부터, Wip1-p5 연골세포를 이식한 그룹에서 연골조직으로부터 관찰되는 Col II(Green)가 많은 부분에서 높게 발현되는 것을 알 수 있다. 반면, Mock-p5 연골세포를 이식한 그룹에서는 Col II의 발현이 거의 관찰 되지 못했다(Scale bar=500 ㎛).

또한, 두 그룹의 형성된 조직으로부터 연골세포 관련 마커 유전자인 Col II, Agg의 발현 양상을 RT-PCR로 측정하였다. 상기 RT-PCR에 사용된 Col II, Agg, 및 GAPDH의 프라이머 세트는 상기 표 1과 동일하다. 그 결과는 도 4의 c)와 같다. 도 4의 c)로부터 알 수 있는 바와 같이, Wip1-p5 연골세포를 이식한 그룹의 연골조직으로부터 높은 Col II 및 Agg의 발현을 확인할 수 있는 반면, Mock-p5 연골세포를 이식한 그룹에서는 Col II 및 Agg의 발현이 거의 관찰되지 못하였다.

따라서, 상기 도 4의 a) 내지 c)의 결과, 즉, Alcian blue 염색, Col II의 면역형광염색 및 RT-PCR 결과로부터, Wip1 유전자의 도입에 의해 연골세포의 탈분화가 효과적으로 억제됨으로써, 우수한 연골조직 재생능을 나타냄을 알 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자로 연골세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 연골세포의 탈분화(dedifferentiation) 억제 방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자가 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 연골세포가 제1계대 내지 제5계대로 계대배양된 연골세포인 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된, 탈분화가 억제된 연골세포.
제4항에 있어서, 상기 유전자가 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 탈분화가 억제된 연골세포.
제4항 또는 제5항에 있어서, 제1계대 내지 제5계대로 계대배양된 연골세포를 형질전환시켜 얻어진 것임을 특징으로 하는 탈분화가 억제된 연골세포.