KR101581703B1 - 탈분화된 연골세포의 정상 연골세포로의 전환 방법 - Google Patents

탈분화된 연골세포의 정상 연골세포로의 전환 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정 siRNA(small interfering RNA) 즉, 서열번호 1 및/또는 2의 siRNA로로 탈분화된 연골세포를 형질전환시키고, TGFβ를 포함하는 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는 탈분화된 연골세포의 정상 연골세포로의 전환 방법; 및 서열번호 1 및/또는 2의 siRNA로 연골세포를 형질전환시키고, TGFβ를 포함하는 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는 연골세포의 탈분화 억제 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1 및/또는 2의 siRNA로 형질전환된, 탈분화가 억제된 연골세포를 제공한다.

Description

탈분화된 연골세포의 정상 연골세포로의 전환 방법{Method for converting dedifferentiated chondrocytes to normal chondrocytes}
본 발명은 특정 siRNA(small interfering RNA)로 탈분화된 연골세포를 형질전환시키고, TGFβ를 포함하는 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는 탈분화된 연골세포의 정상 연골세포로의 전환 방법; 및 특정 siRNA로 연골세포를 형질전환시키고, TGFβ를 포함하는 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는 연골세포의 탈분화 억제 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정 siRNA로 형질전환된, 탈분화가 억제된 연골세포에 관한 것이다.
관절 연골은 관절면으로부터 깊이에 따라 구조와 구성요소가 다양하며, 천층, 중간층, 심층, 석회층으로 구성되어 있는 결합조직의 특수한 형태로 세포외 기질이 단단하여 물리적인 힘에 의해 손상을 받지 않도록 하는데 중요한 역할을 한다. 관절연골 조직은 퇴행성 변화에 따라 연골 두께와 연골세포 수의 감소 이외에 기질의 구성변화가 초래되며, 또한 연골세포의 기능에도 변화가 유발된다. 사람에게 가장 빈번하게 유발되는 퇴행성 질환 중 하나인 골관절염의 유발요인으로 연골의 탈분화 현상이 중요하게 생각되고 있다(Bobacz K et al, Ann Rheum Dis, 63(12), pp.1618-1622, 2004). 또한, 특이하게 관절 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직이다(Brittberg M et al, New England Journal of Medicine, 331, pp. 889-895, 1994). 현재 다양한 의공학적 접근방법으로 퇴행관절 연골질환을 치료하려는 노력이 진행되고 있으나, 정상적인 연골조직재생에는 아직까지 많은 한계점이 있다. 따라서 현재까지 자가 연골세포 이식법에 의한 연골조직의 재생이 임상적으로 매우 안정적이고 효과적인 수술법으로 알려져 있다. 그러나, 이러한 자가연골세포 치료법에 있어 정상 연골세포원을 대량으로 확보하기가 매우 곤란하여, 연골조직의 광범위한 손상 부위에는 사용할 수 없으며, 또한 관절 연골의 손상 위치, 환자의 나이 등에 따라 제한점을 가지고 있다.
연골세포는 이미 분화된 세포로서 조직 내에서 세포 분열이 왕성하지 않지만, 분리 후 체외에서 단층배양시 증식이 촉진되어 충분한 수의 연골세포를 얻을 수 있다. 그러나 필요로 하는 충분한 세포수를 얻기 위해 단층배양을 오랫동안 하게 되면 연골세포의 표현형이 감소하는 탈분화 현상이 일어날 뿐 아니라, 생체 내 이식시 섬유화 연골조직 및 석회화(Calcification)된 조직이 형성되는 문제점이 있다(Fischer J et al. Arthritis & Rheumatism, 62(9), pp. 2696-2706, 2010). 퇴행성관절염의 경우, 연골조직에서 얻어지는 세포가 이미 탈분화되어 있고, 또한 정상 연골조직에서 정상 연골세포를 회수할 경우에도 체외 단층배양에 의해 정상 연골세포의 탈분화가 급속히 이루어져 정상 연골세포를 대량으로 확보하는 것은 기술적으로 매우 어려운 실정이다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 다양한 세포성장인자[예를 들어, transforming growth factor beta(TGFβ)] 첨가, 펠렛 형태의 3차원 배양, 줄기세포에 연골분화 관련 유전자 도입 등의 기술을 이용한 배양법이 제안되고 있다. TGFβ(예를 들어, TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3)는 세포내의 TGFβ 수용체 타입 I과 II에 결합하여 신호전달을 유발하며, 세포내의 SMAD2/3의 인산화를 통한 핵내의 연골관련 유전자의 발현 촉진을 유발한다(Patil et al., Journal of Cellular Physiology, 226(12), pp. 3094-3103, 2011). 하지만, 지금까지 만족할 만한 재분화 유도 및 탈분화 억제효과를 보이지 못하고 있으며, 충분한 수의 정상 연골세포의 확보가 매우 어려운 실정이다.
본 발명자들은 연골세포 이식에 의한 연골조직의 재생에 사용될 수 있는 정상적 표현형을 갖는 연골세포를 얻기 위해서, 탈분화가 이미 진행된 연골세포를 정상세포로 되돌리는 방법 즉, 탈분화가 억제된 연골세포를 제공할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 특히, 본 발명자들은 탈분화된 세포를 다양한 siRNA로 형질전환시켜 정상 연골세포로의 전환을 평가하였으며, 특정 siRNA를 사용하여 탈분화된 세포를 형질전환하고, 이를 특정 성장인자(즉, TGFβ) 존재하에서 배양할 경우, 세포내의 SMAD2/3의 인산화가 효과적으로 증가하고, 또한 정상 연골세포의 지표 마커인 collagen type II의 발현이 증가하는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 탈분화된 연골세포를 특정 siRNA를 사용하여 형질전환시키고, 이를 TGFβ 존재하에서 배양하는 것을 포함하는, 탈분화된 연골세포의 정상 연골세포로의 전환 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 연골세포를 특정 siRNA를 사용하여 형질전환시키고, 이를 TGFβ 존재하에서 배양하는 것을 포함하는, 연골세포의 탈분화 억제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 특정 siRNA로 형질전환된, 탈분화가 억제된 연골세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA; 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA; 또는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA의 혼합물로 탈분화된 연골세포를 형질전환시키는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 형질전환된 연골세포를 TGFβ를 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 탈분화된 연골세포의 정상 연골세포로의 전환 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, (a') 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA; 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA; 또는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA의 혼합물로 연골세포를 형질전환시키는 단계; 및 (b') 단계(a')로부터 얻어진 형질전환된 연골세포를 TGFβ를 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 연골세포의 탈분화 억제 방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA; 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA; 또는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA의 혼합물로 형질전환된, 탈분화가 억제된 연골세포가 제공된다.
서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및/또는 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA로 탈분화된 연골세포를 형질전환시키고, 이를 TGFβ 존재하에서 배양할 경우, 탈분화된 연골세포를 정상 연골세포로 전환할 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 또한, 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및/또는 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA로 연골세포를 형질전환시키고, 이를 TGFβ 존재하에서 배양할 경우, 형질전환된 연골세포의 탈분화가 효과적으로 억제된다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 방법, 즉 탈분화된 연골세포의 정상 연골세포로의 전환 방법 및 연골세포의 탈분화 억제 방법은 연골세포의 단층배양에서 나타나는 탈분화를 억제함과 동시에, 정상적 표현형을 갖는 연골세포로 재분화시킴으로써 정상 연골세포를 대량으로 배양하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 자가 연골 조직에서의 연골세포의 낮은 회수율을 개선할 수 있어, 세포치료용 연골세포의 제조에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 제6계대의 탈분화된 연골세포를 siRNA를 농도별로 처리하여 형질전환하였을 때, 정상 연골세포 관련 신호전달 마커인 SMAD2의 인산화 양상을 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 50nM의 siRNA로 형질전환하여 얻어진 세포를 TGFβ1을 농도별로 처리하였을 때, 정상 연골세포 관련 신호전달 마커인 SMAD2의 인산화 양상을 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 제6계대의 탈분화된 연골세포를 본 발명에 따라 형질전환 또는 비-형질전환시킨 세포에 대하여, 각각의 처리조건에 따른 정상 연골세포 관련 신호전달 마커인 SMAD2의 인산화[도 3의 (a)] 양상을 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과, 및 정상 연골세포의 지표 마커인 collagen type II의 발현이 단백질 수준[도 3의 (b), 웨스턴 블롯팅] 및 mRNA 수준[도 3의 (c), 실시간 PCR]을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 제6계대의 탈분화된 연골세포를 본 발명에 따라 형질전환 또는 비-형질전환시킨 세포에 대하여, TGFβ1을 처리 또는 미처리하였을 때, SMAD2/3과 SMAD4 단백질의 핵내 이동을 공초점 현미경을 이용하여 관찰한 결과[도 4의 (a)] 및 이를 정량분석한 결과[도 4의 (b) 및 (c)]이다.
도 5는 제6계대의 탈분화된 연골세포를 본 발명에 따라 형질전환 또는 비-형질전환시킨 세포에 대하여, TGFβ1을 처리 또는 미처리하여 얻어진 각각의 세포를 누드 마우스에 피하이식한 후 연골재생능을 평가한 결과를 나타낸다. 도 5의 (a)는 누드 마우스로부터 얻어진 조직을 알시안 블루(Alcian blue) 및 뉴클이어 패스트 레드(Nuclear fast red)로 염색하여 연골세포에서 관찰되는 글라이코스아미노글리칸 매트릭스(Glycosaminoglycan(GAG) matrix)를 관찰한 결과이다. 도 5의 (b) 및 (c)는 aggrecan과 collagen type II의 RNA 발현정도를 qPCR로 측정한 결과이다.
본 명세서에서, "연골세포(chondrocytes)"이라 함은 인간을 포함한 포유동물의 연골조직으로부터 체외로 분리되어 배출된 연골세포; 또는 줄기세포[예를 들어, 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs] 등으로부터 공지의 방법으로 분화시켜 얻어진 연골세포를 말한다. 상기 연골세포는 바람직하게는 인간의 연골조직으로부터 체외로 분리되어 배출된 연골세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인간의 정상 유리화 연골(결합조직)로부터 체외로 분리되어 배출된 연골세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 연골세포는 예를 들어, 인간의 슬관절, 척관절, 고관절, 비연골로부터 체외로 분리되어 배출된 연골세포일 수 있다. 상기 연골세포는, 진단, 치료 등의 목적으로 인체로부터 분리된 연골조직으로부터, 공지의 방법에 따라 효소처리(예를 들어, 타입 II 콜라게나아제 처리) 및 원심분리 등의 방법을 통하여 분리할 수 있다. 분리된 연골세포는 통상의 연골세포 배양용 배지, 예를 들어, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10%의 우태아혈청(FBS)이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지[Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), Gibco BRL, Gaithersburg, MD)] 중에서 배양될 수 있다. 연골세포의 표현형 즉 바이오 마커는 Col II 및/또는 Aggrecan(Agg)을 포함하며, 따라서, 본 명세서에서 "정상 연골세포(normal chondrocytes)"라 함은 Col II 및/또는 Aggrecan(Agg)의 바이오마커를 정상적으로 발현하는 연골세포를 의미한다.
또한, 본 명세서에서 "연골세포의 탈분화(dedifferentiation)"라 함은 연속되는 단층 계대 배양 및 기타 원인에 의해 연골세포의 합성 프로파일(synthetic profile)의 포괄적 변화로 인한 연골세포의 유전적 혹은 형태학적 표현형이 변화되어 연골세포로서의 특징을 잃어버리는 변화를 의미한다. 여기서 합성 프로파일이라 함은 유전자 발현 및 관련 단백질의 합성을 의미한다. 탈분화된 연골세포의 표현형 즉 바이오마커는 Col X 및 Col I을 포함하며, 따라서, "연골세포의 탈분화"는 또한 Col II 및/또는 Agg 등의 정상 연골세포 바이오 마커의 발현이 유의성 있게 감소하고, Col X 및/또는 Col I 등의 탈분화 바이오 마커의 발현이 유의성 있게 증가하는 것으로 정의될 수 있다.
서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및/또는 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA로 탈분화된 연골세포를 형질전환시키고, 이를 TGFβ 존재하에서 배양할 경우, 탈분화된 연골세포를 정상 연골세포로 전환할 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 또한, 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및/또는 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA로 연골세포를 형질전환시키고, 이를 TGFβ 존재하에서 배양할 경우, 형질전환된 연골세포의 탈분화가 효과적으로 억제된다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA; 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA; 또는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA의 혼합물로 탈분화된 연골세포를 형질전환시키는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 형질전환된 연골세포를 TGFβ를 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 탈분화된 연골세포의 정상 연골세포로의 전환 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a') 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA; 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA; 또는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA의 혼합물로 연골세포를 형질전환시키는 단계; 및 (b') 단계(a')로부터 얻어진 형질전환된 연골세포를 TGFβ를 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 연골세포의 탈분화 억제 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 구성된 siRNA는 해당 서열을 근거로 통상의 생명공학적 방법에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 상기 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 구성된 siRNA는 이중 가닥 RNA 절단효소(RNAseIII 혹은 Dicer)를 이용하여 시험관내(in vitro)에서 제작된 주형 DNA를 절단함으로써, 합성될 수 있다.
본 발명에 따른 탈분화된 연골세포의 정상 연골세포로의 전환 방법 및 연골세포의 탈분화 억제 방법에 있어서, 상기 형질전환은 통상의 유전공학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 즉, 상기 형질전환은 siRNA 도입 시약, 예를 들어 X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent, Roche, USA)을 이용하여 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 형질전환은 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA의 1:1 중량비의 혼합물을 포함하는 용액을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 용액은 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA의 1:1 중량비의 혼합물을 10 ∼ 50 nM의 농도, 예를 들어 약 50 nM의 농도로 포함할 수 있다.
상기 형질전환은 또한 다른 물리화학적 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 비-바이러스 감염 방법인 마이크로포레이터(Micoroporator) 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 마이크로포레이터 방법은 고압의 전압으로 세포(즉, 연골세포)를 자극하여 세포막의 조성을 순간적으로 변화시켜 유전자 전달체를 세포 내로 유입되도록 하는 방법이다. 또한, 상기 형질전환은 상기 siRNA에 대응하는 DNA 단편을 클로닝하여 siRNA 발현벡터를 제조함으로써 비-바이러스성 도입 또는 바이러스 감염 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 바이러스 감염 방법의 경우, 예를 들어 레트로바이러스 벡터(retroviral vector) 또는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)에 상기 siRNA 발현 벡터를 삽입시켜, 숙주 세포에 감염시킴으로써 바이러스를 생산하게 한 후, 상기 바이러스로 연골세포를 감염시켜 수행될 수도 있다.
상기 단계(b) 및 단계(b')의 형질전환된 연골세포의 배양은 TGFβ(transforming growth factor β)를 포함하는, 연골세포 배양용 배지를 사용하여 수행될 수 있다. TGFβ는 "형질전환성장인자-β" 혹은 "전환성장인자-β" 혹은 "변환성장인자-β" 등으로 지칭되며, TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3의 3가지 동형체(isoforms)가 알려져 있다. 본 명세서에서, TGFβ라 함은 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, 또는 이들의 혼합물을 모두 지칭한다. 바람직하게는, 상기 TGFβ는 TGFβ1일 수 있다. 상기 연골세포 배양용 배지로는, 공지된 연골세포 배양용 배지, 예를 들어, 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)과 우태아혈청(FBS)이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), Gibco BRL, Gaithersburg, MD)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 연골세포 배양용 배지 중 TGFβ1의 농도는 1 ∼ 10 ng/ml의 범위일 수 있으며, 예를 들어 5 ∼ 10 ng/ml 일 수 있다.
본 발명에 따른 탈분화된 연골세포의 정상 연골세포로의 전환 방법 및 연골세포의 탈분화 억제 방법은 계대배양되는 연골세포에 효과적으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 연골세포의 탈분화 억제 방법은 정상 연골조직으로부터 얻어진 정상 연골세포(예를 들어, 제1계대 내지 제5계대로 배양된 연골세포)를 탈분화 없이 안정적으로 배양하는데 효과적으로 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 탈분화된 연골세포의 정상 연골세포로의 전환 방법은 정상 연골세포의 계대배양 과정, 예를 들어, 통상 제6계대 이상의 계대배양 과정에서 발생하는 탈분화가 진행된 연골세포를 정상 연골세포 형태로 배양하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 정상 연골세포 및 탈분화된 연골세포를 체외에서 계대배양하는데 효과적으로 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기에서 기술된 방법에 따라 얻어진 형질전환된 세포를 제공한다. 즉, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA; 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA; 또는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA의 혼합물로 형질전환된, 탈분화가 억제된 연골세포를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 연골세포의 배양
차의과학대학 부속병원의 윤리위원회의 허가 아래, 환자로부터 동의를 받고, 수술시 제거된 관절 연골조직을 수거하였다. 오염된 혈액을 제거하기 위해, 얻어진 연골 조직을 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)(Sigma, St. Louis, MO)를 이용하여 3회 세척하고, 수술칼을 이용하여 효소처리가 용이하도록 세절하였다. 이어서 연골조직을 0.05 w/v% 소혈청알부민 함유 PBS와 2 mg/mL 타입 II 콜라게나아제(Sigma)로 15시간 동안 37℃에서 소화시켰다. 70 ㎛ 필터로 여과하고, 여액을 원심분리하여 부유하는 지방세포를 제거하였다. 분리된 연골세포는 1X104 cells/cm2의 밀도로 파종하고, 4∼5일 동안 배지[1 % 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)과 10%의 우태아혈청(FBS)(Invitrogen, USA)이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), Gibco BRL, Gaithersburg, MD)]에서 37℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 배양하고, 동일한 배지로 교체하면서 계대배양하였다. 각 계대배양의 배양기간은 4∼5일로 동일하게 하였다.
실시예 2. siRNA 도입 및 SMAD2 인산화 확인
서열번호 1의 siRNA 및 서열번호 2의 siRNA는 (주)서린바이오사이언스(경기도, 한국)에 의뢰하여 제작하였다. 서열번호 1의 siRNA 및 서열번호 2의 siRNA의 혼합물(1:1 중량비)을 인산완충식염수에 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 또는 50 nM의 농도로 용해시켰다. 상기 siRNA를 사용하여, siRNA 도입 시약(X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent, Roche, USA)을 이용하여, 제조자 지침에 따라, 제6계대의 탈분화 연골세포에 주입하여 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 1 % 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin) 및 1 % 우태아혈청(FBS)(Invitrogen, USA)이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), Gibco BRL, Gaithersburg, MD)에서 48시간 동안 배양한 후, 48시간 후, 세포로부터 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯팅 및 실시간 PCR(Real time PCR)을 수행하였다. 또한, TGFβ1 신호전달의 영향을 평가하기 위하여 TGFβ1을 상기 배지에 0 ng/ml, 1 ng/ml, 3 ng/ml, 또는 5 ng/ml로 처리하였다.
상기 웨스턴 블롯팅은 다음과 같이 수행하였다. 즉, 각각의 세포를 배양 접시에 50 ㎕ 라이시스 버퍼(Lysis buffer, RIPA buffer, Sigma)에 첨가하고, 얼음상태에서 30분간 용해하고, 세포 용해물(Lysate)을 30 분간 13000 rpm에서 초원심분리(Micro 17R, Hanil Science Industrial, Seoul, Korea)하였다. 단백질을 포함하는 상층액을 SDS-PAGE 샘플 완충액(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) sample buffer)에 넣고 95℃에서 5 분간 변성시켰다. 겔에 있는 단백질을 다시 PVDF(Polyvinylidene difluoride membranes)(Millipore, Billerica, MS)에 옮기고, 1차 항체인 항-P-smad2 (cell signaling, USA), 항-smad2 (cell signaling, USA), 항-Collagen II (Millipore, Germany), 항-β-엑틴 항체(sigma, USA)와 에이치알피 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 2차 항체를 통해 결합시킨 후, Enhanced chemiluminescence(ECL)로 측정하였다. 상기 웨스턴 블롯팅 결과는 각각 도 1 내지 3과 같다. 도 1 내지 3에서 콘트롤 siRNA는 무-기능(non-functional) siRNA로서, Thermo scientific (USA)사의 Non-Targeting siRNA(D-001810-01-05)을 사용하였다.
상기 실시간 PCR(Real time PCR)은 연골세포 관련 마커 유전자로서 Col II, 그리고 GAPDH를 하우스키핑 유전자로 사용하여 함께 분석하였다. 구체적으로는, 각각의 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 트립신-이디티에이(Trypsin-EDTA)로 세포를 회수하고, 트리졸(TRIzol, Life Technologies, Inc. Grand Island, NY) 방법을 통하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 1 ㎍으로 cDNA를 만들고, Real-time PCR kit(Bioneer, Seoul, Korea)를 이용하여 유전자 발현의 변화를 측정하였다. 상기 Real Time-PCR에 사용된 프라이머 세트 및 각각의 분화 마커는 다음 표 1과 같다.
마커 서열
Col II 서열번호 3 센스 5'-CAC GTA CAC TGC CCT GAA GGA- 3'
서열번호 4 안티센스 5'-CGA TAA CAG TCT TGC CCC ACT T-3'
Aggrecan 서열번호 5 센스 5'-GCC TGC GCT CCA ATG ACT-3'
서열번호 6 안티센스 5'-ATG GAA CAC GAT GCC TTT CAC-3'
GAPDH 서열번호 7 센스 5'-ACA TCG CTC AGA CAC CAT G-3'
서열번호 8 안티센스 5'-TGT AGT TGA GGT CAA TGA AGG G-3'
도 1은 제6계대의 탈분화된 연골세포를 siRNA를 농도별로 처리하여 형질전환하였을 때, 정상 연골세포 관련 신호전달 마커인 SMAD2의 인산화 양상을 나타낸다. 도 1의 결과로부터 siRNA의 농도 의존적으로 SMAD2의 인산화가 증가함을 알 수 있다. 도 2는 50nM의 siRNA로 형질전환하여 얻어진 세포를 TGFβ1을 농도별로 처리하였을 때, 정상 연골세포 관련 신호전달 마커인 SMAD2의 인산화 양상을 나타낸다. 도 2의 결과로부터 TGFβ1의 처리에 의해 SMAD2의 인산화가 효과적으로 증가함을 알 수 있다. 도 3은 제6계대의 탈분화된 연골세포를 상기한 바와 같이 형질전환 또는 비-형질전환시킨 세포에 대하여, 각각의 처리조건에 따른 정상 연골세포 관련 신호전달 마커인 SMAD2의 인산화[도 3의 (a)] 및 정상 연골세포의 지표 마커인 collagen type II의 발현이 단백질 수준[도 3의 (b)]을 측정한 결과를 나타낸다. 본 발명에 따라 siRNA로 형질전환시키고, TGFβ1 존재하에서 배양된 세포는 연골세포의 신호전달 마커인 SMAD2의 인산화가 유의성 있게 증가하였고, 연골 세포 지표 마커인 collagen type II 또한 유의성 있게 증가하였다. 또한, siRNA를 도입한 세포에 TGFβ1을 처리하였을 때, 연골 분화 지표 마커인 collagen type II의 발현이 높은 수준으로 유의성 있게 증가하였다[도 3의 (c)]. 따라서, 본 발명에 따라 siRNA의 도입을 통하여 연골세포의 탈분화를 억제함으로써, 우수한 연골 조직 재생능이 나타냄을 알 수 있다.
실시예 3. 인산화된 SMAD2 /3 및 SMAD4 단백질의 핵내 이동
실시예 2에서와 같이 siRNA로 형질전환된 세포를 TGFβ1이 함유된 배지에서 배양한 세포를 4% 포름알데하이드를 이용하여 고정하였다. 인산화된 SMAD2/3의 핵내 관찰을 위해서, 면역염색법을 수행하였으며, 2차 항체로는 alexa-488과 alexa-568을 이용하였고, 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과는 도 4의 (a)와 같으며, 이를 정량분석한 결과는 각각 도 4의 (b) 및 (c)와 같다. 도 4에서 콘트롤 siRNA는 무-기능(non-functional) siRNA로서, Thermo scientific (USA)사의 Non-Targeting siRNA(D-001810-01-05)을 사용하였다. 도 4의 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, p43 siRNA와 TGFβ1으로 처리한 그룹에서 세포의 표면적과 핵 사이즈가 작아졌으며, SMAD2/3와 SMAD4 단백질의 핵내 이동이 유의성 있게 증가하였다.
실시예 4. 생체내 ( In vivo ) 연골조직 재생 평가
실시예 2에서와 같이 siRNA 혹은 콘트롤 siRNA로 형질전환된 세포를 TGFβ1(10 ng/ml)이 함유된 배지에서 배양한 세포(각각 1x106 cells) 및 각각의 미처리 세포(각각 1x106 cells)를 피브린 젤(Fibrin gel)(Greenplast, 녹십자, KOREA) 100 ㎕에 혼합하여, 누드 마우스(Bal b/c nude mouse) (Orient Bio, KOREA)의 등(flank)에 피하 이식하여 연골재생능을 평가하였다. 각 군은 4마리씩 사용하였다(n=4). 연골세포 이식을 수행한 후 5주 후에, 누드 마우스를 CO2 챔버에서 치사하였고, 얻어진 조직은 4 % 포르말린(Formalin, DUKSAN, KOREA)으로 24시간 동안 고정하였다. 고정된 조직으로부터 에탄올을 이용하여 조직 내 수분을 제거하고, 자일렌(Xylene, JUNSEI, JAPAN)을 이용해 에탄올을 치환하여 파라핀(Paraffin)으로 포매하고, 조직 블록(Block)을 제조하였다. 얻어진 파라핀 블록을 박절기(Microtome)을 이용하여 4 ㎛의 두께로 박절하였다. 얻어진 각 조직의 절편을 PBS로 2 회 세척하고, 4 % 알시안 블루(Alcian blue) 용액에 넣고 실온에서 30분 동안 처리하여 염색하였다. 염색액을 제거하고 뉴클이어 패스트 레드(Nuclear fast red)를 이용하여 대비 염색하였다. 그 결과는 도 5의 a)와 같다. 적색은 세포의 핵 부위이고, 청색은 연골세포에서 관찰되는 글라이코스아미노글리칸 매트릭스(Glycosaminoglycan(GAG) matrix)를 나타낸다(Scale bar=500 ㎛). 또한, 형성된 조직을 상기와 동일한 방법으로 조직을 박절하고 Col II의 발현을 면역형광염색(Immunofluorescence staining)으로 확인하였다. 즉, 박절된 조직을 4 w/v% 파라포름알데하이드에 10분간 고정시킨 다음, 0.1 % Triton X-100(Sigma) 용액에 1 분간 두어 세포막을 투과시키고 3 % BSA가 포함된 PBS에서 1 시간 동안 상온에서 방치함으로써 블록킹(Blocking)시켰다. 이렇게 준비된 샘플은 DAPI로 핵을 염색하고, 프라이머리 Col II 항체 및 세컨드 FITC-conjugate 단백질을 이용하여 염색 후 형광현미경으로 관찰하였다. 또한, 형성된 조직으로부터 연골세포 관련 마커 유전자인 Col II, Agg의 발현 양상을 qPCR로 측정하였다. 그 결과는 도 5의 b, c)와 같다. 도 5에서 콘트롤 siRNA는 무-기능(non-functional) siRNA로서, Thermo scientific (USA)사의 Non-Targeting siRNA(D-001810-01-05)을 사용하였다.
도 5의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 마우스 피하조직내로 이식된 탈분화된 세포 그룹 중, p43 siRNA와 TGFβ1을 동시에 처리한 그룹에서 연골조직재생의 마커인 GAG 매트릭스 형성과 collagen type II 및 aggrecan의 발현이 유의성 있게 증가하였으며, 따라서 연골조직재생효과가 현저하게 우수함을 알 수 있다.
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for converting dedifferentiated chondrocytes to normal chondrocytes <130> PN0677 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic siRNA <400> 1 aaucuucuuc uuaggauuca gcucc 25 <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic siRNA <400> 2 ggagcugaau ccuaagaaga agauu 25 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 3 cacgtacact gccctgaagg a 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 4 cgataacagt cttgccccac tt 22 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 5 gcctgcgctc caatgact 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 6 atggaacacg atgcctttca c 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 7 acatcgctca gacaccatg 19 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 8 tgtagttgag gtcaatgaag gg 22

Claims (7)

  1. (a) 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA의 혼합물로 탈분화된 연골세포를 함유하는 계대배양된 연골세포를 형질전환시키는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 형질전환된 연골세포를 TGFβ를 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 탈분화가 억제된 연골세포의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 형질전환이 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA의 1:1 중량비의 혼합물을 포함하는 용액을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 용액이 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA의 1:1 중량비의 혼합물을 10 ∼ 50 nM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 TGFβ가 TGFβ1인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 배지가 TGFβ1을 1 ∼ 10 ng/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 서열번호 1의 염기서열로 구성된 siRNA 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 siRNA의 혼합물로 탈분화된 연골세포를 함유하는 계대배양된 연골세포를 형질전환시켜 얻어진, 탈분화가 억제된 연골세포.
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JP5175036B2 (ja) 2006-05-22 2013-04-03 独立行政法人国立病院機構 ヒト軟骨細胞形質維持因子
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