KR20190128315A

KR20190128315A - 항염증 성분을 분비하는 줄기세포 배양방법 및 그 줄기세포 배양액을 포함하는 항염증 조성물

Info

Publication number: KR20190128315A
Application number: KR1020180052331A
Authority: KR
Inventors: 김준홍; 윤성지; ?쇼웬; 최정혜
Original assignee: 주식회사 휴코드
Priority date: 2018-05-08
Filing date: 2018-05-08
Publication date: 2019-11-18
Also published as: WO2019216450A1; KR102082745B1; JP2021526360A; JP7072292B2

Abstract

본 발명의 일실시예는 염증질환 개선 및 치료를 위한 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법 및 그 줄비세포 배양액을 포함하는 항염증조성물을 제공한다. 구체적으로 항염증 성분은 염증 유발 물질 NO(Nitric Oxide) 및 PGE₂ (Prostaglandin E₂)의 생성량을 억제할 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 염증 유발 물질와 관려된 iNOS 및 COX2의 유전자 및 단백질 발현을 억제시킴으로써 염증 유발물질의 생성을 억제시킬 수 있다.

Description

항염증 성분을 분비하는 줄기세포 배양방법 및 그 줄기세포 배양액을 포함하는 항염증 조성물 {A METHOD FOR PREPARING A STEM CELL SECRETING ANTI-INFLAMMATORY SUBSTANCES AND ANTI-INFLAMMATORY COMPOSITIONS COMPRISING CULTURE MEDIUM OF THE STEM CELL}

본 발명은 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 배양하는 방법 및 그 줄기세포 배양액을 포함하는 항염증 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 iNOS및 COX2를 억제함으로써 NO(Nitric Oxide) 및 PGE₂ (Prostaglandin E₂)를 생성량을 억제하는 효과를 지닌 성분을 분비하는, 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 배양하는 방법 및 그 줄기세포 배양액을 포함하는 항염증 조성물에 관한 것이다.

줄기세포란 우리 몸을 구성하는 모든 세포로 분화될 수 있는 만능세포와 자가재생능이 있으며, 세포 및 조직의 손상이 있을 때 재생작용을 할 수 있는 세포를 말한다. 이러한 줄기세포는 배아줄기세포와 성체줄기세포로 크게 구분하며, 배아줄기세포는 착상 전 단계의 수정란에서 유래 가능하며 성체줄기세포는 특정 세포형태들로 분화가 가능한 다능성을 가진 세포로써, 제대혈, 양막, 태반, 골수, 신경, 근육, 지방조직, 피부 조직 (피부, 간 또는 위 점막세포, 음경포피), 모낭, 췌장, 방광, 고환, 각막, 치아 (젖니, 사랑니), 월경혈 등 매우 다양한 조직에서 유래될 수 있다. 줄기세포는 또 다른 분류방법으로, 자가 (autologous)와 타가 (allogenic)줄기세포로도 구분되며, 그 이유는 줄기세포를 환자의 몸에 이식할 경우 가장 큰 부작용 중 하나가 이식거부반응이기 때문이다. 따라서, 자가 또는 타가줄기세포로 구분하는 경우가 많다. 성체줄기세포의 경우 현재 많은 임상시험연구가 진행되고 있기 때문에 특히 성체줄기세포 이식의 경우 자가 줄기세포인가 또는 타가 줄기세포인가에 따라 연구단계와 방향이 결정된다.

현재, 줄기세포를 골수에서 분리 및 배양하는 것은 쉬운 일이지만, 골수의 획득이 용이하지 않고, 타인의 줄기세포를 이식할 경우 면역 거부 반응 문제를 해결하는 것이 현실적으로 어려운 것으로 알려져 있다. 이에 비해, 제대(탯줄)혈은 골수에 비해 획득이 용이할 뿐 아니라, 많은 제대혈을 확보할 경우에는 환자의 조직적합성 유전자와 일치하거나 가장 유사한 제대혈 줄기세포를 사용할 수 있으므로 면역거부 반응을 해결할 수 있다는 장점이 있다. 즉, 제대혈은 줄기세포의 공급원으로서 현실적으로 사용이 불가능한 배아 줄기세포보다 상업적으로 유리하며, 성체 줄기세포처럼 인위적으로 성인의 몸 안에 있는 골수, 지방 등을 채취하는 작업 등이 필요 없다는 점에서도 상업적 이용이 보다 수월하다고 할 수 있다.

염증성 질환과 관련하여, 대표적인 피부질환인 알레르기 접촉피부염, 건선, 아토피피부염 등은 면역세포인 T세포가 매개하는 염증성 질환으로, 이러한 염증성 질환을 치료하기 위해 스테로이드성 항염증제제가 사용되고 있으나 여러 가지 많은 부작용을 나타내고 있다. 따라서, 독성이 낮고 부작용이 없는 새로운 물질 개발이 필요한 실정이며, 본 발명자들은 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 이용해 항염증 효과가 있는 물질을 개발하였다.

한국공개특허 제10-2009-0090850호 한국공개특허 제10-2013-0104924호

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 많은 부작용을 가지고 있는 종래의 항염증 제제를 대체하는 물질을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법 및 그 줄기세포 배양액을 포함하는 항염증 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면에 따른 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법은,

제대혈로부터 단핵구를 분리하는 단계;

상기 단핵구를 배양하여 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 수득하는 단계;

상기 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 줄기세포 항염증맞춤형 배지에서 자극하는 단계;

상기 자극된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 세척하는 단계; 및

상기 세척된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 배양배지에서 배양하는 단계;

를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 줄기세포 항염증맞춤형 배지는,

αMEM 또는 IMDM; 및

TGF-β,TNF-α, IL-3, IL-6 및 MEM 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분;을 포함할 수 있다.

αMEM 또는 IMDM은 10 내지 30 중량부; 및

TGF-β,TNF-α, IL-3, IL-6 및 MEM 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분은 1x10^-8 내지 17x10^-6 중량부;

를 포함할 수 있다.

IMDM은 10 내지 30 중량부; 및

TGF-β는 1 x10^-8 내지 1x10^-7 중량부, TNF-α는 1 x10^-8 내지 5x10^-8 중량부, IL-3은 1x10^-8 내지 5x10^-8 중량부, IL-6은 1x10^-8 내지 5x10^-8 중량부 및 MEM 비타민은 8 x10^-6 내지 17x10^-6 중량부;

를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 자극하는 단계는 20 내지 28시간동안 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 자극하는 단계는 35 내지 38 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양배지는,

αMEM, IMDM, DMEM/F12 및 Medium199으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 배양액; 및

인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, MEM 비타민 및 인간 알부민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분;을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

αMEM, IMDM, DMEM/F12 및 Medium199으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 배양액은 10 내지 30 중량부; 및

인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, MEM 비타민 및 인간 알부민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분은 1 x10^-6 내지 5x10^-2 중량부;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

Medium199은 10 내지 30 중량부; 및

인슐린은 1 x10^-3 내지 5x10^-2 중량부, 트랜스페린은 1 x10^-3 내지 5x10^-2 중량부, 아셀렌산나트륨은 1 x10^-6 내지 5x10^-5 중량부, MEM 비타민은 8 x10^-6 내지 17x10^-6 중량부 및 인간 알부민은 5 x10^-3 내지 15x10^-3 중량부;

를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 항염증 성분은 NO(Nitric oxide) 생성을 억제시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 NO 생성이 억제되는 것은 i-NOS(inducible Nitric oxide synthase)의 발현수준이 억제됨으로써 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 항염증 성분은 PGE₂ (Prostaglandin E₂) 생성을 억제시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 PGE₂ 생성이 억제되는 것은 COX2(Cyclooxygenase 2)의 발현수준이 억제됨으로써 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 항염증 조성물은, 본 발명에 따른 방법으로 배양된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 분비하는 배양액을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 항염증 조성물은 IL-8, IL-10, IL-18, GM-CSF 및 MIP-1α로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 항염증 조성물은 IL-8은 40 내지 50 중량부, IL-10 은 0.05 내지 0.07 중량부, IL-18 은 1 내지 2 중량부, GM-CSF 은 0.4 내지 0.6 중량부 및 MIP-1α는 20 내지 30 중량부를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 분비하는 배양액을 포함하는 항염증 조성물은 염증질환의 개선 또는 치료를 위한 의약품 또는 기능성 화장품에 이용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도1은 본 발명에 따른 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 분비하는 항염증 성분(HSCM)의 세포독성(MTT Assay)에 대한 결과값이다.
도2는 항염증 성분(HSCM)의 농도에 따른 니트릭옥사이드(NO; Nitric Oxide) 생성량을 측정한 결과값이다.
도3은 항염증 성분(HSCM)의 농도에 따른 프로스타글란딘 E₂(PGE₂; Prostaglandin E₂) 생성량을 측정한 결과값이다.
도4는 항염증 성분(HSCM)의 농도에 따른 염증인자 iNOS, COX2, IL-1β, IL-6 그리고 TNF-α 의 유전자 발현을 측정한 결과값이다.
도5는 항염증 성분(HSCM)의 농도에 따른 염증인자 iNOS 및 COX2의 단백질 발현을 측정한 결과값이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 일측면에 따른 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법은 1) 제대혈로부터 단핵구를 분리하는 단계; 2) 상기 단핵구를 배양하여 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 수득하는 단계; 3) 상기 수득한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 줄기세포 항염증맞춤형 배지에서 자극하는 단계; 4) 상기 자극된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 세척하는 단계; 및 5) 상기 세척된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 배양배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 제대혈이란, 출산 때 탯줄에서 나오는 탯줄혈액을 의미하는 것으로서, 백혈구와 적혈구·혈소판 등을 만드는 hematopoietic stem cell(조혈모세포)를 함유할 수 있고, 연골과 뼈·근육·신경 등을 만드는 mesenchymal stem cell(간엽줄기세포)도 포함할 수 있다.

상기 다분화능 줄기세포는 어떤 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 분화능력을 가지고 있는 줄기세포를 의미하며, 예를 들어, 다분화능을 갖는 세포로는 HSC, MSC, NSC와 같은 성체줄기세포를 포함할 수 있다. 이러한 다분화능을 갖는 성체줄기세포는 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상시 재생을 유도하는 기능에 관여할 수 있다.

상기 다분화능 줄기세포는 여러 성분들을 분비할 수 있고 이러한 성분들이 생체내의 손상된 세포나 조직에 작용하여 손상된 부위를 호전시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르며, 상기 다분화능 줄기세포는 손상된 세포나 조직을 직접 복구할 수도 있지만, 손상된 세포가 자멸하지 않도록 지켜주고, 혈관을 새로 만들며, 딱딱하게 굳은 단백질을 분해해 조직의 기능을 되살릴 수 있을 뿐만 아니라 이에 필요한 다양한 생리인자를 분비할 수도 있다(이를 파라크린 효과라고 부름). 구체적으로 보면, 상기 다분화능 줄기세포는 피부의 성장·재생에 도움되는 세포성장인자와 피부를 유해활성산소 등으로부터 보호하는 항산화물질 분비를 촉진하고 염증을 줄여주는 물질 또는 항암성 물질 등을 분비할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 수득한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 줄기세포 항염증맞춤형 배지에서 자극하는 단계는, 줄기세포의 항염증 관련 신호전달 기전을 활성화시킬 수 있고, 그 결과 IL-8, IL-10, IL-18, GM-CSF, MCP-1α와 같은 항염증 성분의 분비를 유도하게 할 수 있다. 즉, 상기 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 여러 가지 신호전달 기전 중에서 특이적으로 항염증 관련 신호전달 기전을 일반적인 상태보다 더 활성화시킬 수 있으며 그 결과 항염증 성분을 분비하기에 적합하도록 상기 줄기세포의 상태를 변화시킬 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 줄기세포 항염증맞춤형 배지는 αMEM 또는 IMDM; 및 TGF-β, TNF-α, IL-3, IL-6 및 MEM 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 줄기세포 항염증맞춤형 배지는 αMEM 또는 IMDM은 10 내지 30 중량부; 및 TGF-β, TNF-α, IL-3, IL-6 및 MEM 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분은 1x10^-8 내지 17x10^-7;를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 MEM비타민은 Choline chloride, D-Calcium pantothenate, Folic Acid, Nicotinamide, Pyridoxal hydrochloride, Riboflavin, Thiamine hydrochloride 및 i-Inositol로 구성될 수 있다. 바람직하게, 상기 MEM비타민은 전체 1ml당 80 내지 120ug의 Choline chloride, 80 내지 120ug의 D-Calcium pantothenate, 80 내지 120ug의 Folic Acid, 80 내지 120ug의 Nicotinamide, 80 내지 120ug의 Pyridoxal hydrochloride, 8 내지 12ug의 Riboflavin, 80 내지 120ug의 Thiamine hydrochloride 및 180 내지 220ug의 i-Inositol로 구성될 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 줄기세포 항염증맞춤형 배지는, αMEM 또는 IMDM은 10 내지 30 중량부; 및 TGF-β는 1x10^-8 내지 17x10^-7 중량부, TNF-α은 1 x10^-8 내지 17x10^-7 중량부, IL-3은 1x10^-8 내지 17x10^-7 중량부, IL-6은 1x10^-8 내지 17x10^-7 중량부 및 MEM 비타민은 1x10^-8 내지 17x10^-7 중량부;일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 줄기세포 항염증맞춤형 배지는, IMDM 15 내지 25 중량부; 및 TGF-β는 1x10^-8 내지 1x10^-7 중량부, TNF-α는 1x10^-8 내지 5x10^-8 중량부, IL-3은 1x10^-8 내지 5x10^-8 중량부, IL-6은 1x10^-8 내지 5x10^-8 중량부 및 MEM 비타민은 8x10^-6 내지 17x10^-6 중량부일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, αMEM 또는 IMDM은 400 내지 600ml; 및 TGF-β, TNF-α, IL-3, IL-6 및 MEM 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분은 1 내지 100pg/ml가 포함될 수 있다.

본 발명의 또다른 실시예에 따르면, IMDM은 450 내지 550ml; 및 TGF-β는 1 내지 100pg/ml, TNF-α는 1 내지 100pg/ml, IL-3은 1 내지 100pg/ml, IL-6은 1 내지 100pg/ml 및 MEM 비타민은 1 내지 100pg/ml;를 포함할 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 TGF-β는 10 내지 100pg/ml, 상기 TNF-α는 10 내지 50pg/ml, 상기 IL-3는 10 내지 50pg/ml, 상기 IL-6는 10 내지 50pg/ml 및 상기 MEM 비타민은 8000 내지 17000pg/ml 일 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 자극하는 단계는 20 내지 28시간동안 이루어질 수 있다. 바람직하게는 23 내지 25시간일 수 있다. 20시간보다 적은 시간동안 자극을 하게 되면 본 발명의 실시예에 따른 줄기세포가 항염증 성분을 분비하기 위해 충분히 자극이 되지 않고, 또한, 28시간 초과로 자극하게되면 상기 줄기세포가 과도하게 자극을 받게 되어 항염증 성분이외에 다른 성분이 더 나오게 되어 항염증 순도를 낮출 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 자극하는 단계는 35 내지 38 ℃에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는 36 내지 37.5℃에서 이루어질 수 있다. 35 ℃보다 낮은 온도에서 줄기세포를 자극하게 되면 세포의 전반적인 활동이 감소하게 되어 충분한 자극이 일어나지 못할 수 있고, 38 ℃보다 높은 온도에서 줄기세포를 자극하게 되면 세포내 효소 등의 활성이 저해를 받게 되어 결과적으로 세포가 사멸할 수 있기 때문에 본 발명의 실시예에 따른 항염증 물질의 분비가 제대로 일어나지 못할 수 있다.

상기 자극된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 세척하는 단계는 상기 줄기세포 항염증맞춤형 배지에서 자극하는 단계이후 및 배양배지에서 배양하는 단계 이전에 줄기세포 항염증맞춤형 배지를 제거함과 동시에, 상기 자극하는 단계동안에 상기 제대혈 유래 다분화능 줄기세포에서 분비되는 성분도 함께 제거하는 단계이다. 상기 자극하는 단계에서 제대혈 유래 다분화능 줄기세포에서 분비되는 성분은 본 발명의 목적인 항염증 작용에 부합하는 성분이 아니므로 세척 과정을 통해 제거되어야만 한다.

상기 세척된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 배양배지에서 배양하는 단계는, 상기 자극이 완료된 후 세척 단계를 거친 제대혈 유래 줄기세포에서 항염증 성분을 생산하여 분비하게 하기 위해 배양하는 단계이다. 즉, 상기 배양하는 단계에서 배양된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 분비하는 성분은 항염증 작용을 할 수 있는 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 항염증 성분은 NO(Nitric oxide)생성을 억제시킬 수 있다. 상기 NO는 혈압조절, 신경전달, 혈소판 응집억제, 면역기능 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 여러 조직과 세포에서 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase(NOS)에 의해 합성될 수 있다. 상기 NOS는 크게 nNOS(neuronal NOS), eNOS(endothelial NOS)와 i-NOS(inducible NOS)로 나눌 수 있다. 특히 상기 i-NOS는 세포내 칼슘 농도에 비의존성이며 대식세포, 혈관평활근세포, 내피세포, 간세포와 심근세포 등 여러 세포에서 LPS, IFN-γ, IL-1과 TNF-α 등의 자극에 의해 활성화되어 장시간동안 다량의 NO를 생성할 수 있다. 그러나 NO가 필요이상으로 생성되면 shock에 의한 혈관확장, 염증반응으로 유발되는 조직손상, 신경조직의 손상등을 일으켜 생체에 유해한 작용을 나타낼 수 있다.

도2를 참조해서 보면, 본 발명의 실시예에 따른 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법을 통해 줄기세포로부터 분비된 항염증 성분(HSCM)이 NO생성량을 억제시킬 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 항염증 성분은 i-NOS(inducible Nitric oxide synthase)의 발현수준을 억제함으로써 NO 생성을 억제시킬 수 있다. 이는 도4 및 5를 참조해서 보면, 상기 항염증 성분이 i-NOS의 유전자 발현을 억제할 뿐만 아니라 그로 인한 단백질 발현까지 억제할 수 있다는 것을 보여준다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 항염증 성분은 PGE₂(Prostaglandin E2) 생성을 억제시킬 수 있다. 상기 PGE₂는 상기NO와 같이 염증 매개물질 중의 하나로서, 혈관 확장, 부종, 발열, 동통 등을 매개할 수 있다. 또한, 염증질환에서 matrix metalloproteinases(MMPs)의 생성을 유도하여 조직 손상에 관여할 수 있으며, 류마티스 관절염환자에서 얻은 대식세포에서 다량의 PGE₂가 생성되고, 생성된 PGE₂는 류마티스 관절염에서의 염증반응과 조직 파괴 기전에 중요한 역할을 할 수 있다. 상기 PGE₂의 합성은 phospholipase A2의 효소작용에 의해 막 인지질(membrane phospholipid)로부터 arachidonic acid가 만들어지는 것으로 시작된다. Arachidonic acid는 효소작용에 의해 prostaglandin G2가 되고 다시 불안정한 대사산물인 prostaglandin H2가 되는데 이 두 과정은 cyclooxygenase (COX)에 의해 촉진된다. COX는 두 종류 이상의 isoenzyme이 존재하는데 이들 중 COX1은 지속적으로 발현하여 혈소판 응집, 위 점막 보호, 신기능 조절 등의 생리적 기능을 담당하고 COX2는 염증 등의 자극에 의해 발현되며 따라서 COX2에 의해 생성된 prostaglandin이 염증반응과 세포증식에 관여할 수 있다.

도2를 참조해서 보면, 본 발명의 실시예에 따른 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법을 통해 줄기세포로부터 분비된 항염증 성분(HSCM)이 PGE₂생성량을 억제시킬 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 항염증 성분은 COX2(Cyclooxygenase 2)의 발현수준을 억제함으로써 상기 PGE₂를 억제시킬 수 있다. 이는 도4 및 5를 참조해서 보면, 상기 항염증 성분이 COX2의 유전자 발현을 억제할 뿐만 아니라 그로 인한 단백질 발현까지 억제할 수 있다는 것을 보여준다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 배양배지는, αMEM, IMDM, DMEM/F12 및 Medium199으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 배양액; 및 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, MEM 비타민 및 인간 알부민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분;을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 배양배지는, αMEM, IMDM, DMEM/F12 및 Medium199으로 이루어진 군에서 선택되는 하나는 10 내지 30 중량부; 및 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, MEM 비타민 및 인간 알부민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분은 1 x10^-6 내지 5x10^-2 중량부;를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 배양배지는, Medium199은 10 내지 30 중량부; 및 인슐린은 1x10^-6 내지 5x10^-2 중량부, 트랜스페린은 1x10^-6 내지 5x10^-2 중량부, 아셀렌산나트륨은 1x10^-6 내지 5x10^-2 중량부, MEM 비타민은 1x10^-6 내지 5x10^-2 중량부 및 인간 알부민은 1x10^-6 내지 5x10^-2 중량부;를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 배양배지는, Medium199은 15 내지 25 중량부; 및 인슐린은 1x10^-3 내지 5x10^-2 중량부, 트랜스페린은 1x10^-3 내지 5x10^-2 중량부, 아셀렌산나트륨은 1x10^-6 내지 5x10^-5 중량부, MEM 비타민은 8x10^-6 내지 17x10^-6 중량부 및 인간 알부민은 5x10^-3 내지 15x10^-3 중량부;를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 배양배지는, αMEM, IMDM, DMEM/F12 및 Medium199으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 배양액은 400 내지 600 ml; 및 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, MEM 비타민 및 인간 알부민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분은 0.001 내지 50 ug/ml;을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, Medium199은 450 내지 550ml; 및 인슐린은 1 내지 50ug/ml, 트랜스페린은 1 내지 50ug/ml, 아셀렌산나트륨은 0.001 내지 0.05ug/ml, MEM 비타민은 0.008 내지 0.017ug/ml 및 인간 알부민은 5 내지 15ug/ml;을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 항염증 조성물은 상기 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법으로 배양된 줄기세포가 분비하는 배양액을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 항염증 조성물은 IL-8, IL-10, IL-18, GM-CSF 및 MIP-1α으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항염증 조성물은, IL-8은 40 내지 50 중량부, IL-10 은 0.05 내지 0.07 중량부, IL-18 은 1 내지 2 중량부, GM-CSF 은 0.4 내지 0.6 중량부 및 MIP-1α는 20 내지 30 중량부를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 항염증 조성물은 IL-8은 40 내지 50ng/ml, IL-10 은 0.05 내지 0.07ng/ml, IL-18 은 1 내지 2ng/ml, GM-CSF 은 0.4 내지 0.6 ng/ml 및 MIP-1α는 20 내지 30 ng/ml를 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명에 따른, 항염증 성분(HSCM)을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 제조방법 및 이의 효과에 대하여 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 제대혈의 선별

동의서를 받은 산모로부터 24시간 이내에 이송된 제대혈을 사용하거나, 이미 유핵세포층만 회수하여 영하 196 ℃ 초저온 냉동고에 보관 중인 냉동보관 제대혈을 선별하였다.

실시예 2 : 제대혈로부터 다분화능 줄기세포의 분리 및 배양

영하 196 ℃에서 냉동 보관 중이던 제대혈은 37 ℃의 수욕(water bath)에 넣어서 바로 해동하여 사용하고, 산모로부터 24시간 이내에 이송된 제대혈은 그대로 사용하였다. 제대혈로부터 단핵구를 분리하기 위해, αMEM(alpha-minimum essential medium, Jeil Biotech Services, Korea)이나 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 제대혈을 2배 용량으로 희석한 후 실온에서 10 분간 300 x g로 원심분리 하였다. 분리된 buffy coat 층을 수확하여 다시 2 배 용량의 αMEM으로 희석한 후 Ficoll-Hypaque에 중첩하고 실온에서 30 분간 300xg로 원심분리를 시행하였다.

혈액으로부터 단핵구를 분리하는 데는 Ficoll(슈크로스의 중합체)과 Hypaque (디트리조에이트 나트륨; sodium ditrizoate)의 중합체인 Ficoll-Hypaque가 주로 이용된다. Ficoll-Hypaque의 비중은 1.077g/ml로, 단핵구는 이보다 가벼우나 적혈구는 이보다 무겁기 때문에 비중 차에 의한 분리가 가능하다. 즉, 혈액을 Ficoll-Hypaque 위에 올려서 원심분리하면 단핵구는 Ficoll-Hypaque 위에 모이게 된다.

이와 같은 밀도구배 원심분리 방법으로 얻어진 단핵구를 다시 첨가물이 섞이지 않은 세척용 αMEM으로 2회 세척 하였다. 얻어진 단핵구를 항생제(1000 U/ml 페니실린 G, 1000 ug/ml 황산 스트렙토마이신, Gibco-BRL)와 항진균 제(0.25 ug/ml 암포테리신 B), 그리고 2 mM의 글루타민(Glutamine, Sigma)이 포함된 αMEM 배지에 10∼우태혈청(FBS; fetal bovine serum, Jeil Biotech Services)과 함께 세포성장인자로서 Stem Cell Factor(50 ng/ml), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; 10 ng/ml), G-CSF(granulocyte colonystimulating factor; 10 ng/ml), IL-3(interleukin-3; 10 ng/ml) 및 IL-6(interleukin-6; 10 ng/ml)을 첨가하고, 세포수 1××10⁶/㎠의 농도로 부유시켰다. 선택된 세포들을 5일간 배양시킨 후 다분화능 줄기세포를 수득하였다.

제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 얻고 PBS로 3회 세척 후 줄기세포 항염증맞춤형 배지(IMDM 500ml, TGF-β(Prosepc, Israel) 10~100pg/ml, TNF-α(Prospec, Istrael) 10~50pg/ml, IL-3(Prospec, Istrael) 10~50pg/ml, IL-6(Prospec, Istrael) 10~50pg/ml 및 MEM 비타민(Gibco, USA) 1~2%(8,000~17,000pg/ml)) 에 24시간 동안 37℃ 배양기(incubator)에 배양하여 자극시켰다. 줄기세포 자극이 끝난 뒤 PBS로 3회 세척 하고 배양배지(Medium199 500ml, 인슐린(Sigma, USA) 1~50ug/ml, 트랜스페린(Sigma, USA) 1~50ug/ml, 아셀렌산나트륨(Sigma, USA) 0.001~0.05ug/ml, MEM 비타민(Gibco, USA) 1~2%(0.008~0.017ug/ml), 인간 알부민(Sigma, USA) 0.5~1.5%(5~15ug/ml)) 를 넣고 37℃ 배양기(incubator)에 배양하였다. 2일에 한번씩 배지를 교체하여 배양액을 수거하며, 수거한 배양액은 각각 필터(Top Filter system, Corning) 한 후 냉장 및 냉동 보관하여 사용하였다.

시험예 1 : 세포독성 실험(MTT Assay)

본 발명에 따른 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 분비하는 항염증 물질인 HSCM의 세포독성 유무를 확인하기 위해 MTT assay를 시행하였다. Raw 264.7 cells를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 96 well plate에 3Ⅹ10³cells/well로 100ul씩 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 실험군 (HSCM 0, 10, 20, 30, 40, 50%)을 준비하여 각 그룹 당 triplicate로 처리한 뒤 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 배양 후 시험액이 포함된 배지에 5mg/ml의 MTT 시약을 well 당 10ul씩 분주한 다음 96 well plate의 빛을 차단하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 4시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 MTT 시약이 포함된 배지를 제거하고, DMSO (dimethyl sulfoxide) 100ul를 가하여 MTT-formazan crystal을 용해시키고 570nm 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.

결과값은 도1에 나타내었으며, 이를 살펴보면 항염증 성분(HSCM)의 농도가 올라가도 세포 생존에는 유의미하게 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.

시험예 2 : 항염증 성분(HSCM) 함유 배지에서 배양된 세포에서 Nitric Oxide 생성량 측정

Raw 264.7 macrophage cells를 이용한 Griess 법으로 nitric oxide (NO) 생성량 실험을 수행하였다. 10% FBS가 함유된 DMEM으로 48 well plate에 1Ⅹ10⁵cells/well로 250ul씩 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 실험군 (HSCM 0, 10, 30, 50%)을 10% FBS 함유 DMEM 배양액에 넣고 여기에 염증 유발원인 1ug/ml의 LPS(lipopolysaccharide)를 첨가하였으며 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 배양액을 모두 취하여 1.5ml tube에 옮기고, 14,000rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 획득하였다. 획득한 상층액을 100ul씩 96 well plate에 옮기고, Griess reagent(cayman, USA)를 100ul 씩 첨가하여 상온에서 20분간 반응시켜 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NaNO₂ 표준물질을 이용하여 standard curve를 작성하고, 이와 비교하여 NO 생성량을 정량하였다.

결과값은 도2에 나타내었으며, 이를 살펴보면, HSCM의 농도가 증가할수록 Nitric Oxide의 농도가 줄어들고 있음을 알 수 있다.

시험예 3 : 항염증 성분(HSCM) 함유 배지에서 배양된 세포에서 Prostaglandin E ₂ 생성량 측정

PGE₂ (Prostaglandin E₂)를 측정하기 위하여 10% FBS가 함유된 DMEM으로 48 well plate에 1Ⅹ10⁵cells/well로 250ul씩 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 실험군 (HSCM 0, 10, 30, 50%)을 10% FBS 함유 DMEM 배양액에 넣고 여기에 염증 유발원인 1ug/ml의 LPS(lipopoliysaccharide)를 첨가하였으며 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 배양액을 모두 수거하여 1.5ml tube에 옮기고, 14,000rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 획득하였다. 획득한 상층액은 PGE₂ EIA kit(cayman, USA)를 사용하여 측정하였다. Goat anti-mouse로 coating된 96 well plate에 각각 standard과 시료(EIA buffer를 이용하여 5배 dilution)를 50ul씩 첨가하고 Tracer solution과 monoclonal antibody solution을 각각 50ul씩 well에 넣은 후 4℃에서 18시간 동안 반응하였다. 반응 후 Washing buffer로 5회 세척하고 200ul의 Ellman reagent 60~90분간 반응시켜 ELISA reader로 405~420nm에서 흡광도를 측정하였다. standard curve를 작성하고 이와 비교하여 PGE₂ 생성량을 정량하였다.

결과값은 도3에 나타내었으며, 이를 살펴보면 항염증 성분(HSCM)의 농도가 증가할수록 PGE₂의 농도가 줄어들고 있음을 알 수 있다.

시험예 4 : 항염증 성분(HSCM) 함유 배지에서 배양된 세포에서 항염증 관련 유전자 발현 분석 (RT-PCR법)

HSCM이 염증반응 유발시 생성이 증가되는 염증인자 iNOS, COX2, IL-1βIL-6 그리고 TNF-α 의 유전자 발현에 대한 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다. Raw 264.7 macrophage cells를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 24 well plate에 1Ⅹ10⁵cells/well의 농도로 분주하고 37℃, 5% CO₂incubator에서 배양한다. 배양 후 배지를 제거하고 실험군 (HSCM 0, 10, 30, 50%)을 10% FBS 함유 DMEM 배양액에 넣고 여기에 염증 유발원인 1ug/ml의 LPS를 첨가하였으며 37℃, 5% CO₂조건으로 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 배지를 제거하고 PBS로 1회 세척한 다음 배양된 세포로부터 유전자 발현 분석을 위하여 RNAzol B reagent를 이용 세포 내 total RNA를 추출하였다. RNAzol B reagent을 1ml 첨가해 cell을 녹여 조직을 변성시킨 후, 1.5ml tube에 각각 옮기고 chloroform 200ul를 첨가한 후 20초간 vortexing 하여 완전히 혼합되도록 하였다. 실온에서 15분간 반응 후 14,000rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 획득하였고 동량의 isopropyl alcohol을 첨가하여 inverting 한 후 10분간 실온에 정치하였다. 시료를 14,000rpm에서 15분간 원심 분리하여 RNA pellet을 얻고, 70% RNA용 ethanol로 14,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 세척한 후 아스피레이터를 이용해 5분간 건조하였다. 건조된 RNA 시료는 0.1% DEPC (diethyl pyrocarbonate)로 처리된 증류수 25ul을 첨가하고 55℃에서 10분간 반응시켜 pellet을 녹인 후 cDNA 합성을 위한 시료로 사용하였으며, 그 중 5㎕를 20배 희석하여 spectrophotometer를 이용 O.D. 260/280nm에서 RNA의 농도 및 순도를 측정하였다.

(1) cDNA 합성

단일가닥 cDNA 합성은 추출한 총 RNA 1ug에 oligo-d(T) primer (100pmol) 1ul를 혼합하여 65℃에서 10분간 반응 시킨 후 급속 냉각시켰다. 이 template에 10mM dNTP (TaKaRa Bio Inc., Japan), 0.1M DTT와 5x RT buffer (10mM Tris-Cl, 50mM KCl, 2.5mM MgCl₂) 각 2ul를 첨가하고 M-MLV RTase (BioNeer, Korea) 100unit을 첨가한 후 DEPC로 처리된 증류수를 이용하여 전체 양이 20ul가 되도록 보정하였다. 시료는 25℃에서 5분, 42℃에서 1시간동안 합성 반응 후 72℃에서 15분간 반응을 통하여 reverse transcriptase를 불활성화 시켜 종결하였다.

(2) RT-PCR

합성한 cDNA와 각 유전자의 primer를 이용하여 RT-PCR반응을 수행하였다. 반응조건은 template 1ul와 primer 각 0.5ul (10pmol), 2.5mM dNTP 0.5ul, 10X PCR buffer [10mM Tris-Cl (pH8.3), 50mM KCl, 2.5mM MgCl2] 2.5ul, Taq polymerase 2 unit/ul 을 첨가한 후 멸균증류수를 이용하여 전체 양을 25ul로 보정하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응으로부터 획득한 증폭산물은 1.5% agarose gel을 이용하여 전기영동을 수행하였고, 각 PCR 산물의 검출강도는 image analysis system (Kodak EDAS290)를 이용하여 분석하였다. 밴드 검출강도의 상대적 정량치는 house keeping 유전자인 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)와 actin의 검출강도를 기준으로 보정하였다.

결과값은 도4에 나타내었으며, 각 밴드를 비교해보면 HSCM의 농도가 증가할수록 염증을 일으키는 물질과 관련된 iNOS, COX2, IL-1βIL-6 그리고 TNF-α의 유전자 발현이 점차 억제되는 것을 알 수 있다.

시험예 5 : 항염증 성분(HSCM) 함유 배지에서 배양된 세포에서 항염증 관련 유전자 단백질 발현 분석 (Western blot법)

염증반응시 생성되는 NO 및 PGE₂에 직접적으로 관여하는 iNOS와 COX2의 단백질 발현정도를 확인하여 HSCM의 항염증 효과를 알아보고자 실시하였다. Raw 264.7 macrophage cells에 실험군 (HSCM 0, 10, 30, 50%)을 1ug/ml의 LPS와 함께 24시간 동안 처리한 후, 배양된 배지를 제거하고 1ml의 PBS를 첨가하여 스크래퍼(scraper)로 수거하여 14,000rpm에서 20분 동안 원심분리 하여 세척하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 500ul lysis buffer (150mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH7.5, 1% NP40, 0.1% SDS, 1mM PMSF)를 첨가하여 초음파 분쇄기로 lysis 시켰으며, 14,000rpm에서 10분간 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 배양세포로부터 얻어진 단백질시료는 BCA 방법을 이용하여 정량하였고 20ug의 lysate를 12% SDS-PAGE로 전기영동으로 분리하였으며, 전이용액을 사용하여 단백질을 PVDF membrane에 90V로 50분 동안 전이시켰다. 그리고 membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TBST (50mM Tris-HCl pH7.6, 150mM NaCl, 0.2% Tween 20)용액에 상온에서 1시간 동안 실시하였다. iNOS의 항체로는 rabbit polyclonal anti iNOS (Millipore), COX2의 항체로는 rabbit polyclonal anti COX2 (Millipore), Actin의 항체로는 goat polyclonal anti actin (Santa-Curz)을 5% skim milk가 함유된 TBST용액에 희석하여 상온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. TBST 용액으로 3회 세척한 후, 2차 항체로는 HRP (Horse Radish peroxidase)가 결합된 anti-goat, anti-rabbit IgG를 5% skim milk가 함유된 TBST용액에 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, membrane을 TBST로 3회 세척 후 immobilon western kit. (Millipore Cat. No. WBKLS0100)을 사용하여 1분간 반응시켜 LAS-3000 분석장비로 발색된 밴드의 강도를 확인하였다.

결과값은 도5에 나타내었으며, 이를 살펴보면, HSCM의 농도가 증가할수록 염증을 일으키는 NO 및 PGE₂와 관련된 iNOS 단백질 및 COX2단백질의 발현이 점차 억제되고 있음을 알 수 있다.

비교예 1 : 항염증 성분(HSCM) 함유 배지에서 배양된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포에서 분비된 항염증 성분 및 콩단백질 가수분해물 함유 배지에서 배양된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포에서 분비된 항염증 성분 비교

국내공개특허 10-2009-0090850 또는 국내공개특허10-2013-0104924에서 공개된 콩가수분해물 함유 배지에서 배양된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 분비하는 성분 중에서 항염증과 관련된 주요성분인 IL-8, IL-10, IL-18, GM-CSF 및 MIP-1α의 함량을 본 발명에 따라 자극 및 배양된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포에서 분비하는 상기 성분 함량과 비교하였고 그 결과는 표1로 나타내었다.

(단위: pg)

항염증 성분	국내공개특허(10-2009-0090850 또는 10-2013-0104924)의 콩가수분해물 함유 배지에서 배양된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포	본 발명에 따라 자극 및 배양된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포
IL-8	4790.71±1267.38	42458.46±4279.86
IL-10	1.18±0.02	60.12±1.06
IL-18	0	1135.79±22.01
GM-CSF	20.15±8.58	484.37±11.14
MIP-1a	8.78±0.66	25704.68±742.22

[표1]에 나타난 결과값을 살펴보면, 본 발명에 따라 자극 및 배양된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포는 주요 항염증 성분인 IL-8, IL-10, IL-18, GM-CSF 및 MIP-1α의 함량이 상기 공개된 특허들에 나와있는 배양기술로 배양된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포보다 IL-8은 8.8배, IL-10은 50배, GM-CSF는 24배 및 MIP-1α은 2927배가 더 많이 분비되는 것을 알 수 있다. 또한, IL-18은 상기 특허들에 따른 제대혈 다분화능 줄기세포에서는 분비되지 않았으나 본 발명에 따른 제대혈 다분화능 줄기세포에서는 상기 표1에서 같이 분비되었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

제대혈로부터 단핵구를 분리하는 단계;
상기 단핵구를 배양하여 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 수득하는 단계;
상기 수득한 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 줄기세포 항염증맞춤형 배지에서 자극하는 단계;
상기 자극된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 세척하는 단계; 및
상기 세척된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포를 배양배지에서 배양하는 단계;
를 포함하는, 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포 항염증맞춤형 배지는,
αMEM 또는 IMDM; 및
TGF-β, TNF-α, IL-3, IL-6 및 MEM 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분;
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 자극하는 단계는 20 내지 28시간동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 자극하는 단계는 35 내지 38 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 배양배지는,
αMEM, IMDM, DMEM/F12 및 Medium199으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 배양액; 및
인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, MEM 비타민 및 인간 알부민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분;
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 항염증 성분은 NO(Nitric oxide) 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법.
제6항에 있어서,
상기 NO 생성이 억제되는 것은 i-NOS(inducible Nitric oxide synthase)의 발현수준이 억제됨으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 항염증 성분은 PGE₂(Prostaglandin E2) 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법.
제8항에 있어서,
상기 PGE₂ 생성이 억제되는 것은 COX2(Cyclooxygenase 2)의 발현수준이 억제됨으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는, 항염증 성분을 분비하는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 배양방법.
제1항에 따른 방법으로 배양된 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 분비하는 배양액을 포함하는 항염증 조성물.
제10항에 있어서,
상기 항염증 조성물은 IL-8, IL-10, IL-18, GM-CSF 및 MIP-1α로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항염증 조성물.