JP2021526360A - 抗炎症成分を分泌する幹細胞の培養方法およびその幹細胞培養液を含む抗炎症組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
同意書を受けた産母から24時間以内に搬送された臍帯血を用いるか、あるいは、既に有核細胞層のみを回収して零下196℃の超低温冷凍庫に保管中の冷凍保管臍帯血を選別した。
零下196℃で冷凍保管中であった臍帯血は37℃の水浴(water bath)に入れて直ちに解凍して用い、産母から24時間以内に搬送された臍帯血はそのまま用いた。臍帯血から単球を分離するために、アルファ最小必須培地(αMEM:alpha−minimum essential medium, Jeil Biotech Services, Korea)やダルベッコ変法イーグル培地(DMEM:Dulbecco’s modified Eagle’s medium)で臍帯血を2倍の容量に希釈した後、室温で10分間300xgで遠心分離した。分離されたバフィーコート層を収穫して再び2倍容量のαMEMで希釈した後、フィコール・ハイパック(Ficoll−Hypaque)に重ね、室温で30分間300xgで遠心分離を行った。
本発明に係る臍帯血由来多分化能幹細胞が分泌する抗炎症物質であるHSCM(ヒト臍帯血細胞順化培養液)の細胞毒性の有無を確認するためにMTT試験を行った。Raw 264.7細胞を10%のウシ胎児血清(FBS)含有DMEMで96ウェルプレートに3×103cells/wellにて100μlずつ入れ、37℃、5% CO2の培養器において24時間培養した。培養後に培地を取り除き、実験群(HSCM 0、10、20、30、40、50%)を用意して各グループあたりにトリプリケートで処理した後、37℃、5% CO2培養器において24時間培養した。培養後に試験液が含まれている培地に5mg/mlのMTT試薬を1ウェルあたりに10μlずつ分注した後、96ウェルプレートの光を遮って37℃、5% CO2の培養器において4時間培養した。培養が完了すると、MTT試薬が含まれている培地を取り除き、ジメチルスルホキシド(DMSO:dimethyl sulfoxide)100μlを加えてMTTホルマザン結晶を溶解させ、570nmにおける吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
Raw 264.7マクロファージ細胞を用いたグリース(Griess)法にて一酸化窒素(NO:Nitric oxide)の生成量の測定実験を行った。10% FBS含有DMEMで48ウェルプレートに1×105cells/wellにて250μlずつ入れ、37℃、5% CO2の培養器において24時間培養した。培養後に培地を取り除き、実験群(HSCM 0、10、30、50%)を10% FBS含有DMEM培養液に入れ、ここに炎症誘発源である1μg/mlのリポ多糖(LPS:lipopolysaccharide)を添加し、37℃、5% CO2の培養器において24時間培養した。次いで、培養液をすべて取って1.5mlのチューブに移し、14,000rpmにて20分間遠心分離して上澄み液を得た。得られた上澄み液を100μlずつ96ウェルプレートに移し、グリース試薬(cayman,USA)を100μlずつ添加して常温で20分間反応させてELISAリーダーで540nmにおける吸光度を測定した。亜硝酸ナトリウム(NaNO2)標準物質を用いて標準曲線を作成し、これと比較してNOの生成量を定量した。
PGE2(Prostaglandin E2)を測定するために、10% FBS含有DMEMで48ウェルプレートに1×105cells/wellにて250μlずつ入れ、37℃、5% CO2の培養器において24時間培養した。培養後に培地を取り除き、実験群(HSCM 0、10、30、50%)を10% FBS含有DMEM培養液に入れ、ここに炎症誘発源である1μg/mlのリポ多糖(LPS:lipopoliysaccharide)を添加し、37℃、5% CO2の培養器において24時間培養した。次いで、培養液をすべて回収して1.5mlのチューブに移し、14,000rpmにて20分間遠心分離して上澄み液を得た。得られた上澄み液はPGE2 EIAキット(cayman,USA)を用いて測定した。ヤギ抗マウスによりコーティングされた96ウェルプレートにそれぞれスタンダードと試料(EIA緩衝液を用いて5倍に希釈する)を50μlずつ添加し、トレーサー溶液とモノクローナル抗体溶液をそれぞれ50μlずつウェルに入れた後、4℃で18時間反応させた。反応後に洗浄緩衝液で5回洗浄し、200μlのエルマン試薬に60〜90分間反応させてELISAリーダーで405〜420nmにおける吸光度を測定した。標準曲線を作成し、これと比較してPGE2の生成量を定量した。
HSCMが炎症反応を引き起こすときに生成が増加する炎症因子iNOS、COX2、IL−1β、IL−6及びTNF−αの遺伝子発現への影響を調べるために、RT−PCRを行った。Raw 264.7マクロファージ細胞を10% FBS含有DMEMで24ウェルプレートに1×105cells/wellの濃度にて分注し、37℃、5% CO2の培養器において培養した。培養後に培地を取り除き、実験群(HSCM 0、10、30、50%)を10% FBS含有DMEM培養液に入れ、ここに炎症誘発源である1μg/mlのLPSを添加し、37℃、5% CO2の条件下で24時間培養した。次いで、培地を取り除き、PBSで1回洗浄した後、培養された細胞からの遺伝子発現の分析のためにRNAzol B試薬を用いて細胞内の総RNAを抽出した。RNAzol B試薬を1ml添加して細胞を溶かして組織を変性させた後、1.5mlのチューブにそれぞれ移し、クロロホルム200μlを添加した後、20秒間ボルデックスして完全に混合されるようにした。室温で15分間反応させた後、14,000rpmにて20分間遠心分離して上澄み液を得、同量のイソプロピルアルコールを添加してインバーティングした後、10分間室温に静置した。試料を14,000rpmにて15分間遠心分離してRNAペレットを得、70%RNA用エタノールで14,000rpmにて10分間遠心分離して洗浄した後、アスピレーターを用いて5分間乾燥した。乾燥されたRNA試料は、0.1% ジエチルピロカーボネート(DEPC;diethyl pyrocarbonate)により処理された蒸留水25μlを添加し、55℃で10分間反応させてペレットを溶かした後、cDNAの合成のための試料として用い、これらのうちの5μlを20倍に希釈して分光光度計を用いてO.D.260/280nmにおけるRNAの濃度および純度を測定した。
一本鎖cDNAの合成は、抽出した総RNA 1μgにオリゴ−d(T)プライマー(100pmol)1μlを混合して65℃で10分間反応させた後に急速冷却させることにより行われた。このテンプレートに10mM dNTP(TaKaRa Bio Inc.,Japan)、0.1M DTTと5×逆転写(RT)緩衝液(10mM Tris−Cl, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2)各2μlを添加し、M−MLV RTase(BioNeer,Korea)100unitを添加した後、ジエチルピロカーボネート(DEPC)により処理された蒸留水を用いて全体の量が20μlになるように補正した。試料は、25℃で5分間、42℃で1時間合成反応させた後、72℃で15分間反応させることにより逆転写酵素を不活性化させて終結した。
合成したcDNAと各遺伝子のプライマーを用いてRT−PCR反応を行った。反応条件は、テンプレート1μlとプライマー各0.5μl(10pmol)、2.5mM dNTP 0.5μl、10×PCR緩衝液[10mM Tris−Cl(pH 8.3),50mM KCl, 2.5mM MgCl2]2.5μl、Taqポリメラーゼ2unit/μlを添加した後、滅菌蒸留水を用いて全体の量を25μlに補正してPCR反応を行った。PCR反応から得られた増幅産物は1.5%アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、各PCR産物の検出強度は、画像分析システム(Kodak EDAS290)を用いて分析した。バンドの検出強度の相対的な定量値は、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH:glyceraldehyde−3−phosphatedehydrogenase)とアクチンの検出強度を基準として補正した。
炎症反応の際に生成されるNOおよびPGE2に直接的に関与するiNOSとCOX2のタンパク質の発現の度合いを確認してHSCMの抗炎症効果について調べるために行った。Raw 264.7マクロファージ細胞に実験群(HSCM 0、10、30、50%)を1μg/mlのLPSと一緒に24時間の間に処理した後、培養された培地を取り除き、1mlのPBSを添加してスクラッパー(scraper)で回収して14,000rpmにて20分間遠心分離して洗浄した。遠心分離後に上澄み液を取り除き、500μl 溶解緩衝液(150mM NaCl、50mM Tris−HCl pH 7.5、1% NP40、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM フッ化フェニルメタンスルホニル(PMSF))を添加して超音波粉砕器で溶解させ、14,000rpmにて10分間遠心分離して細胞膜成分などを取り除いた。培養細胞から得られたタンパク質試料は、ビシンコニン酸(BCA)法を用いて定量し、20μgの溶解物を12%ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により分離し、転移溶液を用いてタンパク質をPVDFメンブレインに90Vにて50分間転移させた。そして、メンブレインのブロッキングは、5%脱脂乳含有TBST(50mM Tris−HCl pH 7.6,150mM NaCl,0.2% Tween 20)溶液で常温で1時間行った。iNOSの抗体としてのウサギポリクローナル抗iNOS(Millipore)、COX2の抗体としてのウサギポリクローナル抗COX2(Millipore)、アクチン(Actin)の抗体としてのヤギポリクローナル抗アクチン(Santa−Curz)を5%脱脂乳含有TBST(TWEEN(登録商標)20含有トリス緩衝生理食塩水)溶液に希釈して常温で1時間30分間反応させた。TBST溶液で3回洗浄した後、2次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP:Horse Radish peroxidase)結合抗ヤギ、抗ウサギIgGを5%脱脂乳含有TBST溶液に希釈して常温で1時間反応させた。次いで、メンブレインをTBSTで3回洗浄した後、イモビロンウェスターンキット(Millipore Cat.No.WBKLS0100)を用いて1分間反応させてLAS−3000分析装備で発色されたバンドの強度を確認した。
Claims (11)
- 臍帯血から単球を分離するステップと、
前記単球を培養して臍帯血由来多分化能幹細胞を得るステップと、
前記得た臍帯血由来多分化能幹細胞を幹細胞抗炎症カスタムメイド培地において刺激するステップと、
前記刺激された臍帯血由来多分化能幹細胞を洗浄するステップと、
前記洗浄された臍帯血由来多分化能幹細胞を培養培地において培養するステップと、を含む
ことを特徴とする抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。 - 前記幹細胞抗炎症カスタムメイド培地は、
αMEMまたはIMDMと、
TGF−β、TNF−α、IL−3、IL−6およびMEMビタミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分と、を含む
請求項1に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。 - 前記刺激するステップは、20〜28時間の間に行われる
請求項1に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。 - 前記刺激するステップは、35〜38℃で行われる
請求項1に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。 - 前記培養培地は、
αMEM、IMDM、DMEM/F12およびMedium 199よりなる群から選ばれる一つの培養液と、
インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、MEMビタミンおよびヒトアルブミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分と、を含む
請求項1に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。 - 前記抗炎症成分は、一酸化窒素(NO:Nitric oxide)の生成を抑える
請求項1に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。 - 前記一酸化窒素(NO)の生成が抑えられることは、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS:inducible Nitric oxide synthase)の発現レベルが抑えられることにより行われる
請求項6に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。 - 前記抗炎症成分は、プロスタグランジンE2(PGE2:Prostaglandin E2)の生成を抑える
請求項1に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。 - 前記プロスタグランジンE2(PGE2)の生成が抑えられることは、シクロオキシゲナーゼ2(COX2:Cyclooxygenase 2)の発現レベルが抑えられることにより行われる
請求項8に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。 - 請求項1に記載の方法により培養された臍帯血由来多分化能幹細胞が分泌する培養液を含む
ことを特徴とする抗炎症組成物。 - 前記抗炎症組成物は、IL−8、IL−10、IL−18、GM−CSFおよびMIP−1αよりなる群から選ばれる少なくとも一つを含む
請求項10に記載の抗炎症組成物。
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