CN113382739A

CN113382739A - 包含克隆干细胞的用于治疗胰腺炎的药学组合物

Info

Publication number: CN113382739A
Application number: CN201980082815.XA
Authority: CN
Inventors: 宋淳旭; 金时那; 黄明奂
Original assignee: SCM Lifescience Co Ltd
Current assignee: SCM Lifescience Co Ltd
Priority date: 2018-12-13
Filing date: 2019-12-04
Publication date: 2021-09-10
Also published as: WO2020122498A1; TWI796536B; EP3909591A1; JP2022513222A; TW202034933A; KR102247136B9; KR20200073128A; JP7389505B2; KR102247136B1; US20220047640A1; EP3909591A4

Abstract

本发明涉及包含通过得以改善的干细胞的层分离培养获取的单克隆干细胞的用于预防、治疗或改善胰腺炎的组合物及其制备方法。根据本发明的得以改善的干细胞的层分离培养及增殖方法，可通过单克隆干细胞的快速增殖，在短时间内大量获取所需的单克隆干细胞，由此获取的单克隆间充质干细胞为胰腺炎治疗效果增加的干细胞，可有用地用作胰腺炎治疗剂。

Description

包含克隆干细胞的用于治疗胰腺炎的药学组合物

技术领域

本发明涉及包含通过得以改善的干细胞的层分离培养获取的单克隆干细胞的用于预防、治疗或改善胰腺炎的组合物及其制备方法。

背景技术

胰腺炎(pancreatitis)在胰腺(pancreas)发生炎症而引起的疾病，具有急性胰腺炎(acute pancreatitis)及慢性胰腺炎(chronic pancreatitis)。胰腺炎为因酗酒(alcohol abuse)、胆结石(gallstones)等而使胰液无法顺畅地流动，使得包含在胰液的酶诱发胰腺的自我分解而发生。胰腺炎大致分为两种类型：轻症型(mild type)胰腺炎，发现间质性水肿(interstitial edema)和胰周脂肪坏死(peripancreatic fat necrosis)；重症型(evere type)胰腺炎，伴随胰周的(peripancreatic)及胰内的(intrapancreatic)的广泛脂肪坏死、胰腺实质坏死(pancreatic parenchymal necrosis)、出血。

胰腺炎的准确的病理生理机制尚不明确，代表性的症状为蛋白酶前体在胰腺中早期活性来发生的自消化的过程。即，若消化酶在胰腺腺泡细胞(pancreas acinar cell)中异常的早期活性，则消化胰腺的腺泡本身，由此发生炎症来导致组织的脱落、坏死。近来，发现胰腺腺泡细胞受损后，作为对于组织损伤的反应，向胰腺内流入的活化的巨噬细胞分泌促炎症性细胞因子白细胞介素(interleukin)-1β来对于炎症细胞的循环、胰腺水肿及胰腺实质破坏中起到重要作用。

已提出了减轻胰腺炎的严重程度、抑制各种脏器并发症的发生的多个实验疗法，但在将实验疗法适用于人的情况下，示出非常微弱的效果，因此，目前为止尚无与胰腺炎的预防及治疗相关的有效且广泛使用的治疗剂。

近来，尝试在各种炎症性疾病的治疗利用干细胞。干细胞具有可生长为我们身体的210多个所有器官组织的潜在能力，可无限分裂，并通过适当的操作可分化成所需的器官。由于这种干细胞的特性，干细胞作为新型治疗剂而备受瞩目，并且利用干细胞治疗难治性疾病的可能性非常高，预计可治疗许多疾病，如白血病、骨质疏松症、肝炎、帕金森病、老年性痴呆、烧伤等。

然而，在干细胞的情况下，在很难大量获取其的一点上仍然具有很多限制。作为获取干细胞的方法，可以说从冷冻胚芽细胞获取的方法为有效，但在伦理方面还存在许多争议。为了解决这种问题，还研究了利用体细胞核移植方法或成体干细胞来获取干细胞的方法。比胚芽干细胞研究更加活跃进行的领域为成体干细胞的研究。作为存在于中枢神经系统或骨髓等各种器官中而参与生长器官发育及损伤时的再生的细胞，成体干细胞存在于各种器官中，因此可在包括骨髓、脾脏、脂肪细胞等的各种部位获取，但从骨髓获取的方法为最常见的。但是，在从许多各种骨髓细胞中分离并培养多个间充质干细胞的方面上，难以获取始终呈均匀形态的细胞，因此正在进行用于完善这种问题的研究。

本发明人发明了新式的命名为层分离培养法的干细胞的分离方法，通过韩国专利申请KR 10-2006-0075676号申请了专利，并取得了授权。与其他方法相比，上述层分离培养法不仅能够以低成本进行，并且不存在污染问题，可不用顾虑混入其他干细胞而有效地获取克隆间充质干细胞(cMSC)的这一点上，与其他干细胞获取方法相比，具有极好的优秀性。但是，尽管上述方法具有优秀性，但为了大量生产间充质干细胞来用作最终产物，层分离培养法需要制造工作细胞库，并通过它来获取最终产物的工序才可取得充分量的间充质干细胞，并且需要约10次传代(Passage)以上的传代培养，因此从这一方面上，难以快速取得单克隆间充质干细胞集团。

另一方面，为了治疗炎症性疾病，尤其胰腺炎，利用干细胞仍然具有许多限制，并且尚没有用于有效治疗胰腺炎的干细胞制备方法及利用其的胰腺炎治疗方法。

发明内容

技术问题

在通过如上所述的层分离培养法的改善来研究用于诱导干细胞的快速增殖的研究当中，本发明人发现利用将培养细胞密度调低，并添加抗氧化剂来进行培养的得以改善的层分离培养法的情况下，可仅通过少的传代诱导出有效的细胞增殖率的增加，由此获取的单克隆干细胞与现有的层分离培养方法的干细胞相比示出非常显著的胰腺炎治疗效果，并且完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供包含通过改善现有的层分离培养法的干细胞的层分离培养及增殖方法获取的单克隆干细胞的用于预防、治疗及改善胰腺炎的组合物及其制备方法。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供用于预防或治疗胰腺炎的药学组合物，其包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm²至1000细胞/cm²的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。

并且，本发明提供用于预防、改善或治疗胰腺炎的组合物的制备方法，包括通过下述步骤获取单克隆干细胞的步骤：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，通过以50细胞/cm²至1000细胞/cm²的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养的步骤，来获取单克隆干细胞。

并且，本发明提供用于预防、改善或治疗胰腺炎的干细胞，通过下述步骤获取：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm²至1000细胞/cm²的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。

发明的效果

根据本发明的得以改善的干细胞的层分离培养及增殖方法，可通过单克隆干细胞的快速增殖，在短时间内大量获取所需的单克隆干细胞，由此获取的单克隆间充质干细胞为胰腺炎治疗效果得以增加的干细胞，可有用地用作胰腺炎治疗剂。

附图说明

图1为示出从骨髓分离单克隆间充质干细胞的现有的层分离培养法。

图2为示出通过显微镜观察并确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的形态学变化的结果的图。

图3为示出通过流式细胞荧光分选技术(FACS，Flowcytometry)分析来将根据细胞培养密度及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的细胞大小及粒度(granularity)的变化的以前向散射(FSCforward scatter)(A部分)及侧向散射(SSC，side scatter)(B部分)光的平均值来进行确认的结果的图(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。

图4为示出通过β-半乳糖苷酶(β-gal)的活性染色来对细胞培养密度及细胞培养传代不同的单克隆间充质干细胞进行染色之后确认细胞是否老化的结果的图。

图5为示出以不同的细胞培养密度来培养传代15次(P15，Passage 15)的单克隆间充质干细胞之后利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)来确认作为老化相关基因的的传代15次(p15)、传代16次(p16)及作为增殖标记的增殖细胞核抗原(PCNA)的结果的图。

图6为示出通过群体倍增时间(PDT，Population Doubling Time)及群体倍增水平(PDL，population Doubling Level)来确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的增殖能力的结果的图(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。

图7为示出确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的分化能力的结果的图(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。图7的A部分为通过油红(Oil red)O组织学染色法来确认分化为根据细胞培养及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的脂肪细胞的分化能力的结果，图7的B部分示出对图7的A部分的组织学染色程度进行定量化的图。图7的C部分为通过茜素红S(Alizarin red S)组织学染色来确认分化为根据细胞培养及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的固化细胞的分化能力的结果，图7的D部分为示出对图7的C部分的组织学染色程度进行定量化的图。

图8为示出由根据细胞培养密度及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞生产的总活性氧(ROS，reactive oxygen species)生产(A部分)及通过彗星试验(comet assay)来确认由根据细胞培养密度及细胞培养传代的总活性氧生产引起的脱氧核糖核酸(DNA)损伤的结果(B部分)的图(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。

图9为示出为了确认由根据细胞培养密度及细胞培养传代生产的活性氧引起的脱氧核糖核酸损伤程度而测定8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG，8-hydroxy-2'-deoxyguanosine)浓度的结果的图(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。

图10为示出利用高密度条件单独(HD)或高密度条件+抗坏血酸(抗氧化剂的一种)追加(HD+AA)来培养传代11次(P11)至传代15次(P15)的单克隆间充质干细胞之后确认细胞增殖能力的变化的结果的图。

图11为示出利用高密度条件单独(HD)或高密度条件+抗坏血酸追加(HD+AA)来培养传代15次(P15)的单克隆间充质干细胞之后对所生产的活性氧水平进行比较的结果的图(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。

图12a为比较示出现有的层分离培养法及得以改善的层分离培养法实验方法的图。

图12b为得以改善的层分离培养法的示意图，为示出与不同于现有的层分离培养法的传代2次之后相对应的低密度培养的示意图。

图13至图20为示出确认以1000细胞/cm²或4000细胞/cm²的密度接种通过层分离培养法取得的SCM01至SCM08单克隆间充质干细胞，并利用添加有或未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基(LG-DMEM，Dulbecco's Modified Eagle Medium，lowglucose)、α-伊格尔极限必需培养基(α-MEM，Minimum Essential Mediumα)培养基来培养的细胞的增殖率的结果的图。各个图的A部分为示出根据各个实验组的传代1次(P1)至传代5次(P5)的细胞数的变化的图，各个图的B部分为示出各个实验组的群体倍增时间及群体倍增水平结果的图。

图21为示出利用未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基且仅改变以1000细胞/cm²或4000细胞/cm²的密度的细胞密度的实验组中的细胞增殖率的结果的图。

图22为示出利用未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基且仅改变以1000细胞/cm²或4000细胞/cm²的密度的细胞密度的实验组中的群体倍增时间及群体倍增水平的结果的图。

图23为示出确认利用添加有抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基且仅改变以1000细胞/cm²或4000细胞/cm²的密度细胞密度的实验组中的细胞增殖率的结果的图。

图24为示出确认利用添加有抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基且仅改变以1000细胞/cm²或4000细胞/cm²的密度的细胞密度的实验组中的群体倍增时间及群体倍增水平的结果的图。

图25为示出确认将细胞密度固定为1000细胞/cm²的密度并将培养基变更为LG-达尔伯克改良伊格尔培养基或α-伊格尔极限必需培养基的实验组中的细胞增殖率的结果的图。

图26为示出确认将细胞密度固定为1000细胞/cm²的密度并将培养基变更为LG-达尔伯克改良伊格尔培养基或α-伊格尔极限必需培养基的实验组中的群体倍增时间及群体倍增水平的结果的图。

图27为示出急性胰腺炎动物模型构建及本发明的cMSC1、cMSC2处理方案的示意图。

图28为示出确认根据在急性胰腺炎动物模型中处理本发明的cMSC1、cMSC2的α-淀粉酶(a-amylase)及脂肪酶(lipase)的活性变化的结果的图(通过均值的标准误差(SEM)p值表示所有值的均值(All values are presented as means with standard error ofmean(SEM)P value)＝*，<0.05；**，<0.01；***，<0.001vs.SAP组(SAP group)和###，<0.001vs.对照组(control group))。

图29为示出确认根据在急性胰腺炎动物模型中处理cMSC1、cMSC2的髓过氧化物酶(MPO，myeloperoxidase)活性变化的结果的图(通过均值的标准误差(SEM)p值表示所有值的均值(All values are presented as means with standard error of mean(SEM)Pvalue)＝*，<0.05；**，<0.01；***，<0.001vs.SAP组(SAP group)和###，<0.001vs.对照组(control group))。

图30为示出确认根据在急性胰腺炎动物模型中处理cMSC1、cMSC2的炎症性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)变化及抗炎症性细胞因子白细胞介素-10(IL-10)变化的结果的图(通过均值的标准误差(SEM)p值表示所有值的均值(All values are presented as means with standard error of mean(SEM)Pvalue)＝*，<0.05；**，<0.01；***，<0.001vs.SAP组(SAP group)和###，<0.001vs.对照组(control group))。

图31为示出根据在急性胰腺炎动物模型中处理cMSC1、cMSC2的组织病理学分析结果的图。

图32为示出确认根据在急性胰腺炎动物模型中处理cMSC1、cMSC2的组织病理学评分(histopathologic score)、水肿、坏死、出血、炎症浸润评分的结果的图(通过均值的标准误差(SEM)p值表示所有值的均值(All values are presented as means withstandard error of mean(SEM)P value)＝*，<0.05；**，<0.01；***，<0.001vs.SAP组(SAPgroup)和###，<0.001vs.对照组(control group))。

图33为示出通过Nucleo Counter NC-250设备确认利用得以改善的方法培养的cMSC1及通过现有的方法培养的cMSC2的细胞大小的结果的图。

图34为利用流式细胞荧光分选技术确认cMSC1及cMSC2的细胞大小分布的结果的图。

图35为示出通过混合淋巴细胞反应(MLR，mixed lymphocyte reaction)方法确认cMSC1及cMSC2的免疫细胞抑制能力的结果的图(外周血单个核细胞(PBMC，peripheralblood mononuclear cell))。

图36为示出确认cMSC1及cMSC2的培养液的人转化生长因子-β1(hTGF-β1)和人可溶性肿瘤坏死因子受体1(hsTNF-R1，Soluble tumor necrosis factor receptor 1)的分泌量的结果的图。

图37为示出以WI38细胞为基准比较在cMSC1及cMSC2中表达的免疫相关标记吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO，Indoleamine 2,3-dioxygenase)、T-细胞可诱导共刺激分子配体(ICOSL，Induced T cell co-stimulator ligand)的表达变化的结果的表。

图38为示出在共培养免疫细胞和cMSC1、cMSC2的培养液中分泌的干扰素-γ、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-10的结果的图。

具体实施方式

本发明涉及胰腺炎的预防或治疗方法，其包括向需要的个体给药包含通过间充质干细胞的得以改善的层分离培养及增殖方法获取的单克隆干细胞的用于预防或治疗胰腺炎的药学组合物或上述单克隆干细胞的步骤。

并且，本发明涉及用于预防、改善或治疗胰腺炎的组合物的制备方法，其包括通过间充质干细胞的得以改善的层分离培养及增殖方法获取单克隆干细胞的步骤。

本发明的作为有效成分的单克隆干细胞为通过如下的得以改善的层分离培养方法获取的干细胞，即，除了可快速无污染地获取干细胞的层分离培养法的优点之外，通过单克隆干细胞的快速增殖，优选地，可通过单克隆间充质干细胞的快速增殖来在无需进行工作细胞库(WCB，Working Cell Bank)制备步骤也可在短时间内大量或所需的单克隆干细胞。与通过现有的层分离培养方法获取的干细胞相比，通过如上所述的方法获取的单克隆干细胞为胰腺炎治疗效果得以增加的干细胞。

以下，详细说明本发明。

本发明提供用于预防或治疗胰腺炎的药学组合物，包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm²至1000细胞/cm²的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。

上述步骤2)及步骤3)的培养是在30℃至40℃的温度条件下，培养4小时以下，优选地，培养1小时至3小时，更优选地，培养1小时30分钟至2小时30分钟，重复培养是在30℃至40℃的温度条件下培养4小时以下，优选地，培养1小时至3小时，更优选地，培养1小时30分钟至2小时30分钟，之后，重复2次至3次在30℃至40℃的温度条件下培养12小时至36小时，优选地，培养18小时至30小时，接着，在30℃至40℃的温度条件下培养24小时至72小时，培养36小时至60小时，优选地，培养36小时至60小时，每次将上清液移入新的培养容器。

简单综述本发明的实施例中所分离的方法为如下。

经培养的多个细胞形成单克隆细胞组，分离该多个单克隆细胞组之后可进行传代培养，本发明的特征在于，除了现有的层分离培养方法，包括步骤5)的传代培养步骤。

本发明的“层分离培养”是指根据比重分离干细胞的方法，首先，提取人的骨髓来在细胞培养液中进行培养之后，仅获取上清液，并将其移入经涂层剂的处理或未经涂层剂的处理的培养容器中进行培养之后，重复数次相同过程的工序。像这种层分离培养的特征在于，重复不经离心分离过程且反复取得上清液来进行培养的工序，并且具有最后可无其他细胞的污染而取得单克隆干细胞，优选地，可取得单克隆间充质干细胞的优点。

本发明的上述步骤1)至步骤5)中的步骤1)至步骤4)可与韩国KR 10-2006-0075676号、美国US 12/982738号或韩国KR10-2013-7020033号中所记载的层分离培养方法相同或等同地进行，韩国KR 10-2006-0075676号可全文并入本发明中。

并且，在现有的韩国KR10-2013-7020033号及美国US12/982738号中，公开了与胰腺炎治疗关联来获取细胞的方法，其包括：步骤(i)，取得骨髓、外周血、脐带血、脂肪组织样品或细胞因子-活化的外周血的生物样品；步骤(ii)，将上述骨髓、外周血、脐带血、脂肪组织样品或细胞因子-活化的外周血的生物样品在容器中沉淀；步骤(iii)，通过2次以上的连续的方式将与其他细胞相比细胞密度低的上清液从上述容器移入其他容器；步骤(iv)，从上述上清液分离密度较小的细胞；步骤(v)，向患有胰腺炎的对象给药在步骤(iv)中取得的细胞，其中，上述骨髓、外周血、脐带血、脂肪组织样品或细胞因子-活化的外周血在步骤(i)至步骤(iii)中未经大于1000rpm的离心分离的步骤。上述方法为不进行离心分离且仅通过密度差异获取单克隆干细胞的方法，从而利用韩国KR 10-2006-0075676号的现有的层分离培养方法。

但是，上述美国US 12/982738号、韩国KR 10-2006-0075676号及韩国KR 10-2013-7020033号的层分离培养方法未公开在少的传代中有效获取单克隆干细胞，由此获取胰腺炎治疗效果显著改善的单克隆干细胞的方法。

如图1所示，在现有的层分离培养方法中，将从单菌落获取的所有细胞移动至6孔板，以80％～90％的克隆率(confluency)增殖后，为了将处于增殖的状态的传代1次(P1)细胞作为种子细胞(seed cell)且没有对于密度调节的意识地获取大量的细胞，以4000细胞/cm²进行高密度培养。

相反，本发明涉及基于在通过调节传代2次之后的培养中调节细胞密度来有效获取具有优秀的胰腺炎的预防、治疗、改善效果的干细胞的“得以改善的层分离培养方法”，其特征在于，现有的层分离培养方法与种子细胞之后的培养步骤不同。例如，具体地，包括“步骤5)，以50细胞/cm²至1000细胞/cm²的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养”。与现有的层分离培养方法相比，得以改善的层分离培养方法可诱导快速的单克隆干细胞的增殖，因此可快速取得最终产物，优选地，仅可通过如传代2次(P2)至传代8次(P8)的少于传代10次的培养来制备原始细胞库(MCB，Master Cell Bank)，可获取示出优秀的胰腺炎的预防或治疗效果的单克隆干细胞。

如现有的工序，当本发明的单克隆干细胞以4000细胞/cm²的高密度来进行培养时，细胞增殖能力显著降低，间充质干细胞的标记产生变化，并且，丧失干细胞的分化能力。因此，通过得以改善的层分离培养法取得的单克隆干细胞是指能够以低密度至中等程度的密度，即，以小于4000细胞/cm²的低细胞密度，例如，以3000细胞/cm²以下的细胞密度，优选地，以2000细胞/cm²以下的细胞密度，更优选地，以50细胞/cm²至1000细胞/cm²的细胞密度培养的单克隆干细胞。

与以如4000细胞/cm²的高密度培养的间充质干细胞相比，当1000细胞/cm²以下的细胞密度培养单克隆间充质干细胞时存在如下的优点，即，细胞的增殖能力在整个长时间的培养期间保持显著的高水平，因此无需重复多次传代也可快速取得单克隆细胞。因此，本发明的得以改善的层分离培养方法的特征在于，将种子细胞之后的传代培养步骤进行少于传代10次，优选地，仅进行传代8次，与现有的层分离培养方法为了确保充足数量的细胞而最多进行传代25次相比，具有仅可通过少的传代培养大量生产单克隆干细胞的优点。

并且，当以上述细胞密度培养单克隆间充质干细胞时，该细胞存在脱氧核糖核酸损伤少，老化受到抑制，可有效保持干细胞的分化能力的优点，并且可快速获取具有优秀的干细胞特性的单克隆间充质干细胞。

并且，与以如4000细胞/cm²的高密度培养的单克隆干细胞相比，根据本发明的方法获取的单克隆干细胞示出优秀的胰腺炎的预防、改善或治疗效果。

用于本发明的培养基均可包含不包含抗氧化剂的培养基、上述培养基中添加有抗氧化剂的培养基或包含抗氧化剂的培养基。

作为不包含抗氧化剂的培养基，并不限于此，但可使用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，根据需要，可向上述培养基额外地添加抗氧化剂来进行培养。并且，根据需要，可利用包含抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基进行培养。

本发明的抗氧化剂可无限制地包含可用于细胞培养中的抗氧化剂，并且可以为选自由谷胱甘肽(Glutathione)、半胱氨酸(Cysteine)、半胱胺(Cysteamine)、泛醇(Ubiquinol)、β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)及抗坏血酸(Ascorbicacid；AA)组成的组中的一种以上。当培养基中添加有抗氧化剂时，上述抗氧化剂能够以10μg/ml至50μg/ml的浓度，优选地，以10μg/ml至30μg/ml的浓度，更优选地，以25μg/ml的浓度添加。

在本发明的一例中，作为不包含抗氧化剂的培养基，使用达尔伯克改良伊格尔培养基，更优选地，使用LG-达尔伯克改良伊格尔培养基，作为包含抗坏血酸来作为抗氧化剂的培养基，使用α-伊格尔极限必需培养基。

另一方面，可根据本发明的方法，非常有效地增殖单克隆干细胞，因此可省略利用原始细胞库来制备工作细胞库(WCB，Working Cell Bank)的工序。与现有的层分离培养法的制备原始细胞库之后需要伴随制备工作细胞库的方法相比，该方法使工序单纯化。

当利用包含抗氧化剂的培养基来作为本发明的培养基时，上述培养基中还可添加庆大霉素来作为抗生素。

通过本发明的方法取得的间充质干细胞可以为最终优选地，以传代2次(P2)至传代10次(P10)的间充质干细胞，更优选地，可以为传代2次(P2)至传代8次(P8)的间充质干细胞，更加优选地，可以为传代2次(P2)至传代6次(P6)的间充质干细胞。这表示，与现有的最少传代10次(P10)至传代12次(P12)的间充质干细胞以最终产物来被取得的工序相比，本发明的干细胞为通过更少的传代数取得的干细胞，并且可通过细胞接种密度的调节来容易且大量取得在低的传代中快速得以增殖的间充质干细胞。

在本发明中，与现有的层分离培养法取得的单克隆干细胞(以下，由“cMSC2”表示)相比，如上所述的得以改善的层分离培养法，优选地，通过2000细胞/cm²以下的低密度，更优选地，通过1000细胞/cm²以下的低密度及抗氧条件的得以改善的层分离培养法取得的单克隆干细胞(以下，由“cMSC1”表示)形成更小且均质的细胞，提供包括轻症在内的重症急性胰腺炎的生存率，缓解水肿引起的胰腺的重量的增加，有效减少因急性胰腺炎而增加的消化酶的增加和与炎症相关的酶的增加。

在本发明中，“胰腺炎”是指因胰腺酶而破坏胰腺分泌腺及胰腺的整体炎症，包括慢性胰腺炎及急性胰腺炎，但可以为急性胰腺炎，可无限制地包括轻症及重症急性胰腺炎。

通过本发明的得以改善的层分离培养方法获取的单克隆干细胞不仅可有效地预防、治疗或改善胰腺炎，还可有效地预防、治疗或改善胰腺炎引起的疾病，例如选自由肺损伤、败血症、肾衰竭、胸腔积液、多发性器官衰竭及多发性器官损伤组成的组中的一种以上的疾病。

通过本发明的方法获取的单克隆干细胞的特征在于，示出选自由可增强胰腺细胞的存活率、α-淀粉酶或脂肪酶活性的减少、髓过氧化物酶(Myeloperoxidase；MPO)活性的减少、中性粒细胞浸润及炎症的改善、炎症性细胞因子分泌的减少及抗炎症性细胞因子分泌的增加组成的组中的一种以上的活性。

并且，通过本发明的方法获取的单克隆干细胞可改善选自由水肿、坏死、出血及炎症浸润组成的组中的一种以上的胰腺炎病理学状态。

并且，通过本发明的方法获取的单克隆干细胞可以为选自由转化生长因子-β1(TGF-β1)的分泌能力、可溶性肿瘤坏死因子受体1(sTNF-R1，Soluble tumor necrosisfactor receptor 1)的分泌能力、吲哚胺2，3-双加氧酶的表达能力、T-细胞可诱导共刺激分子配体的表达能力组成的组中的一种以上的能力得以增加的单克隆干细胞。

因此，与通过现有的层分离培养法取得的cMSC2相比，作为通过本发明的得以改善的层分离方法获取的单克隆干细胞的cMSC1的胰腺细胞的存活率增强、α-淀粉酶或脂肪酶活性的减少、髓过氧化物酶活性的减少、中性粒细胞浸润及炎症的改善、炎症性细胞因子分泌的减少、抗炎症性细胞因子分泌的增加等活性均显著优秀，改善选自由水肿、坏死、出血及炎症浸润组成的组中的一种以上的胰腺炎病理学状态的效果突出。这种胰腺炎治疗效果的差异仅为通过得以改善的层分离培养法取得的本发明的单克隆干细胞的显著效果，原因在于，与通过现有的方法取得的cMSC2相比，选自由转化生长因子-β1的分泌能力、可溶性肿瘤坏死因子受体1的分泌能力、吲哚胺2，3-双加氧酶的表达能力、T-细胞可诱导共刺激分子配体的表达能力组成的组中的一种以上的能力得以增加。

为了给药，除上述有效成分之外，本发明的药学组合物还可包含一种以上的药学上可接受的载体来制备。本发明的药学组合物中包含的药学上可接收的载体可在制剂时通常利用，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。除上述成分之外，本发明的药学组合物还可包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。

本发明的药学组合物的剂量可根据上述药学组合物的制剂化方法、给药方式、给药时间和/或给药途径不同，可根据包括通过上述药学组合物的给药实现的反应的种类和程度、成为给药对象的个体的种类、年龄、体重、常规健康状态、疾病的症状或程度、性别、饮食、排泄、在相应个体同时使用或与移植一同使用的药物其他组合物的成分等在内的各种因子及医药领域中周知的类似因子不同，本技术领域的普通技术人员可容易确定并处方对于所目的的治疗有效的剂量。

本发明的药学组合物的剂量可以为如1日1mg/kg至1000mg/kg，上述剂量决不以任何方式限定本发明的范围。

本发明的药学组合物的给药途径及给药方式可各自独立，并不特别限制其方式，只要上述药学组合物可到达所目的的相应部位，可利用任意给药途径及给药方式。

上述药学组合物可通过口服给药或非口服给药方式给药。例如，上述非口服方式包括静脉内给药、腹腔内给药、肌内给药、经皮给药或皮下给药等，还可利用将上述药学组合物涂敷在患病部位或者向患病部位喷雾、被患病部位吸入的方法，但并不局限于此。

并且，本发明提供胰腺炎的预防或治疗方法，其包括：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；步骤5)，以50细胞/cm²至1000细胞/cm²的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养，来获取单克隆干细胞数；以及步骤6)，向个体给药上述单克隆干细胞。

在本发明中，上述“个体”包括需要预防或治疗胰腺炎的个体，可以为哺乳动物或除人之外的哺乳动物。

并且，本发明提供用于预防、改善或治疗胰腺炎的组合物的制备方法，包括通过下述步骤获取单克隆干细胞的步骤：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm²至1000细胞/cm²的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。

根据本发明，与通过现有的层分离培养法取得的单克隆干细胞相比，无需制备细胞工作库也可容易取得示出突出的胰腺炎的预防、改善或治疗效果的单克隆干细胞，上述组合物可无限制地包含药学组合物、食品组合物、准药品组合物及化妆品组合物。

本发明的制备方法的特征在于，上述步骤5)的培养以1000细胞/cm²的细胞密度接种于培养基中并进行培养。

并且，本发明的制备方法的特征在于，上述步骤5)的培养基可以为添加有抗氧化剂的培养基。

在本发明的治疗方法及制备方法中，可相同地使用在上述说明中的组合物中记述的内容，为了避免说明书记载的复杂性，将省略所重复的内容

以下，通过实施例详细说明本发明。

下述实施例用于例示本发明，本发明的内容并不限定于下述实施例。

本发明实施方式

实施例1：确立得以改善的层分离培养法

为了制备对于胰腺炎具有优秀的效果的单克隆间充质干细胞，利用了得以改善的间充质干细胞层分离培养法及增殖方法。得以改善的间充质干细胞层分离培养法及增殖方法的特征在于，在韩国专利申请10-2006-0075676号中所记载的层分离培养法的培养条件中改变了细胞密度及培养基。在以下实验中，使通过层分离培养法取得的单克隆间充质干细胞(cMSC)的细胞培养密度分别为50细胞/cm²(低密度)、1000细胞/cm²(中等密度)、4000细胞/cm²(高密度)，并分析了由此所具有的细胞的特性。

1.1根据细胞密度的间充质干细胞的形态学变化的确认

首先，进行了用于确认长期培养中的根据细胞密度的间充质干细胞的形态学变化的实验。为了赋予培养条件的变化，利用了传代5次(P5)、传代10次(P10)、传代15次(P15)的间充质干细胞，分别以低密度、中等密度、高密度的条件接种于LG-达尔伯克改良伊格尔培养基中。接着，通过显微镜观察细胞的形态学变化，并判断了干细胞的老化与否，将其结果在图2中示出。

如图2所示，在传代5次(P5)及传代10次(P10)中，根据细胞密度，在细胞大小与形态学图案中呈现出差异，尤其，在传代15次(P15)的情况下，高密度培养条件中观察到了平坦且放大形态的间充质干细胞。像这种形态呈现典型的间充质干细胞的老化，并且确认了在长期培养中细胞的密度调节可调节间充质干细胞的老化。

1.2根据细胞密度的间充质干细胞细胞大小及粒度的确认

为了额外地确认根据细胞密度的干细胞的变化，通过流式细胞荧光分选技术分析来对周知为在经老化的细胞中增加的细胞大小及细胞的粒度进行了定量分析，并将其结果在图3中示出。

如图3所示，确认了虽然在传代5次(P5)中细胞的大小未呈现出显著差异，但在传代10次(P10)及传代15次(P15)的情况下，根据细胞密度而呈现出显著的差异。尤其，在传代10次(P10)及传代15次(P15)中可确认到在高细胞密度的培养条件下，细胞的大小显著增加，并且细胞老化进一步得以促进。与此相同地，在所有传代(Passage)中呈现出了细胞的粒度也随着细胞的密度增加而显著增加的结果。因此，可确认到在间充质干细胞的长期培养中，细胞的密度的调节可成为调节细胞老化的因素，可通过降低细胞培养密度，来改善在后期传代中呈现的形态学变化。

1.3根据培养细胞密度的间充质干细胞的老化确认

为了确认实施例1.1及1.2中确认的形态学变化是否实际上为间充质干细胞的年龄依赖性(age-dependent)现象，进行可选择性地染色老化细胞的利用β-半乳糖苷酶的染色分析法，并且通过逆转录-聚合酶链反应来比较了作为老化相关基因的传代15次(p15)、传代16次(p16)及作为增殖标记的增殖细胞核抗原基因的表达。并将其结果分别在图4及图5中示出。

如图4所示，确认了在传代5次(P5)及传代10次(P10)中，在所有细胞密度中均未能确认老化的细胞的染色，但在传代15次(P15)中，随着细胞密度增大，老化的细胞的染色明显增加。并且，如图5所示，在传代15次(P15)中，随着细胞的培养密度增大，作为老化相关基因的CDK抑制剂，传代15次(p15)及传代16次(p16)的基因表达增加，并且作为增殖标记的增殖细胞核抗原减少。

这种结果为表示间充质干细胞的形态学变化与间充质干细胞的老化存在关联的结果，并且为表示当进行传代培养时，细胞培养密度的调节可调节间充质干细胞的老化的结果。

1.4根据培养细胞密度的间充质干细胞的增殖能力变化的确认

众所周知，间充质干细胞的增殖能力随着传代、细胞的老化而逐渐减少。因此，增殖能力可用于确认间充质干细胞的老化的标准，并且进行了长期细胞培养时的根据细胞培养密度的间充质干细胞的增殖能力比较。各个细胞的增殖能力通过初始接种细胞数与培养结束后取得的细胞的数量来计算各个传代的增殖率，并进行了确认，将其结果在表1及图6中示出。

表1

如表1中所示，确认了在以低密度培养的间充质干细胞的情况下，传代5次(P5)、传代10次(P10)、传代15次(P15)中倍增(fold increase)88.4、34.3、16.4，反之，以中等密度培养的间充质干细胞为8.5、4.9、3.1，以高密度培养的间充质干细胞为3.0、1.9、1.1。并且，如图6所示，确认了群体倍增时间与群体倍增水平也呈现出了类似于倍增的图案。这种结果为表示在长期的间充质干细胞培养中可通过降低细胞密度来使间充质干细胞的增殖能力保持的结果，并且表示即使进行相同的传代培养，也可使间充质干细胞的老化受到抑制，可使间充质干细胞的寿命延长。

1.5根据培养细胞密度的间充质干细胞的分化能力变化的确认

为了确认细胞培养密度是否影响干细胞功能，比较了根据传代5次(P5)至传代15次(P15)培养的分化能力。作为干细胞功能，确认了脂肪细胞分化能力及骨细胞分化能力，在各个传代及密度中进行了定性及定量分析。具体地，脂肪细胞分化培养液通过向高糖(High Glusose)达尔伯克改良伊格尔培养基培养液中添加新生小牛血清(NCS，NewbornCalf Serum，美国吉布科(Gibco)公司产品)、10^-7mol的地塞米松(dexamethasone)(美国西格玛(Sigma)公司产品)、0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，美国西格玛(Sigma)公司产品)、10μg/ml的胰岛素(insulin，美国西格玛(Sigma)公司产品)、100μM的吲哚美辛(indomethacin，美国西格玛(Sigma)公司产品)来制备的培养基并进行了实验，7天分化之后，通过油红O组织学染色来进行了确认。并且，油红O组织学染色之后，利用异丙醇进行洗脱，并在500nm测定之后，通过定量分析来进行了确认。

骨细胞分化培养液使用了向α-伊格尔极限必需培养基培养液中添加有胎牛血清(FBS，美国吉布科(Gibco)公司产品)、50μg/ml的抗坏血酸-2-磷酸酯(ascorbic 2-phosphate，美国西格玛(Sigma)公司产品)、10^-8mol的地塞米松(美国西格玛(Sigma)公司产品)、10mM的β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate，美国西格玛(Sigma)公司产品)的培养基，21天分化之后，通过茜素红S组织学染色进行了确认。并且，茜素红S组织学染色之后，利用10％的乙酸进行了洗脱，并在405nm测定之后，通过定量分析来进行了确认。将通过如上所述的方法来确认脂肪细胞分化能力及骨细胞分化能力的结果在图7中示出。

如图7所示，确认了脂肪细胞分化能力随着传代整体上减少，但因密度导致的差异未明显呈现，反之，在骨细胞分化能力的情况下，确认了高密度条件的传代15次(P15)培养组中显著减少的现象。通过这种结果，确认了间充质干细胞的骨细胞分化能力在以低细胞密度培养的情况下，能够更好保持。

1.6根据培养细胞密度的间充质干细胞的抗原谱分析

进行了用于确认细胞培养密度是否还影响干细胞的抗原表达的实验，利用流式细胞荧光分选技术来确认根据各个传代及培养密度的阳性及阴性抗原表达的变化，并将其结果在表2中示出。

表2

如表2所示，确认了阴性标记表达的变化未明显地确认出，但一部分阳性标记的情况在传代中也根据细胞培养密度呈现出表达量的变化。

尤其，在传代15次(P15)中，以高密度培养细胞的情况下，大部分的阳性标记的表达量显著减少了，不仅如此，CD73、CD105呈现出阴性表达，因此确认到了保持低细胞密度来进行细胞培养可成为非常重要的因素。

1.7根据培养细胞密度的活性氧生产及脱氧核糖核酸损伤的比较

据悉，间充质干细胞的功能的减少及脱氧核糖核酸损伤存在关联，尤其，由作为活性氧的活性氧诱导的脱氧核糖核酸损伤促进间充质干细胞的老化。因此，为了确认根据培养密度总活性氧生产及根据其的脱氧核糖核酸损伤是否不同，通过荧光强度分析来比较根据传代及细胞培养密度的总细胞性活性氧量，并通过彗星试验分析来确认脱氧核糖核酸损伤程度，将其结果在图8中示出。

如图8所示，确认了总活性氧生产在所有传代中随着细胞培养密度增加而增加的倾向，尤其，确认了在传代10次(P10)、传代15次(P15)中活性氧生产显著增加(A)。彗星试验分析中分类为从脱氧核糖核酸损伤最弱的CC1至损伤最严重的CC5来进行了数据分析，确认了在损伤最严重的的CC5的情况下，随着细胞培养密度增大而显著增加的情况。反之，CC1呈现出了随着细胞密度增大而显著降低的倾向(B)。

额外地，为了确认脱氧核糖核酸损伤是否为由活性氧诱发的，进行了用于确认因活性氧的脱氧核糖核酸损伤的8-羟基脱氧鸟苷的浓度的实验。8-羟基脱氧鸟苷分析方法如下。将从各个细胞取得的脱氧核糖核酸试样50μl放入8-羟基脱氧鸟苷共轭涂层板(8-OHdGconjugate coated plate)之后，在常温下培养了10分钟。之后，额外地放入抗-8-羟基脱氧鸟苷抗体(anti-8-OHdG antibody)来在常温下培养了1小时，清洗3次之后，将二级抗体酶偶联物(secondary antibody enzyme conjugate)放入各个孔板(well)之后，重新在常温下培养了1小时。接着，重新清洗3次之后，放入基质溶液(substrate solution)，在常温下培养了30分钟。最后，放入停止液(Stop solution)之后，在450nm下测定吸光度来进行了确认，将其结果在图9中示出。

如图9所示，确认了在脱氧核糖核酸损伤出现最严重的传代15次(P15)组中，随着细胞培养密度增大，8-羟基脱氧鸟苷的浓度显著增加。通过这种结果，因在高密度培养条件下所生产的活性氧而使脱氧核糖核酸损伤增加，由此促进了间充质干细胞的老化。

这种结果为表示将细胞培养密度调低可起到从因间充质干细胞的活性氧生产增加所导致的脱氧核糖核酸损伤保护间充质干细胞的作用的结果。

1.8根据抗氧化剂处理的间充质干细胞增殖及活性氧生产能力的确认

为了确认间充质干细胞的增殖是否受到因在高密度培养条件所生产的活性氧而带来的影响，进行了活性氧消除实验。在传代11次(P11)至传代15次(P15)中，高密度培养条件及在高密度培养条件下添加作为抗氧化剂的抗坏血酸25μg/ml至培养基中进行培养之后，比较两组之间的增殖率的倍增(Fold)，将其结果在图10中示出。

如图10所示，确认了在高密度培养条件下，倍增在传代11次(P11)至传代15次(P15)中分别为2.6、1.9、1.6，随着传代数增加而增殖能力减少，并开始呈现老化，但经抗氧化剂处理的情况下，在所有传代中增殖能力保持50％左右的高水平。并且，在抗氧化剂处理组中，增值倍数(growth fold increase)在传代11次(P11)至传代15次(P15)中分别为3.8、2.9、2.5，直到传代15次(P15)增殖能力也保持高水平。

将确认了在作为端点(Endpoint)的传代15次(P15)中，高密度培养条件单独及高密度培养条件+抗氧化剂处理两组之间的活性氧水平结果在图11中示出。

如图11所示，确认了通过处理作为抗氧化剂的抗坏血酸，增殖增加的条件中活性氧的水平也减少。因此，优选地，间充质干细胞培养在低细胞密度下进行，而不是高密度，当从高密度细胞培养诱导的活性氧生产利用抗氧化剂来进行消除的情况下，可使间充质干细胞的增殖能力增加。即，因高密度条件的活性氧而抑制间充质干细胞的增殖能力，随着细胞密度降低而活性氧减少，因此间充质干细胞增殖能力可得以促进。

综上所述，确认了为了保持通过层分离培养来获取的单克隆间充质干细胞的增殖、培养及干细胞功能，在培养条件中将细胞密度调节为1000细胞/cm²以下的密度为重要，在添加抗氧化剂来进行培养的情况下，抑制可从细胞培养诱发的氧化应激，从而可有效地促进间充质干细胞增殖。并且，若比较相同的低细胞密度条件培养，则当如传代15次(P15)的传代10次以上的干细胞与如传代5次的小于传代10次的干细胞比较时，确认到如细胞的形态学变化突出、干细胞的老化促进、分化能力减少的结果，因此，以1000细胞/cm²以下的密度且少于传代10次的低传代数进行培养最为有效。

实施例2：得以改善的层分离培养法的鉴定

通过上述实施例1，在以层分离培养法取得的间充质干细胞培养中，细胞密度的调节、传代调节及抗氧化剂的添加可成为重要的因素，因此，通过韩国专利申请10-2006-0075676号中所记载的层分离培养法的现有工序获取的单克隆间充质干细胞以不同的细胞培养密度且改变添加有作为抗氧化剂的抗坏血酸的培养基，由此来比较了通过进行传代培养来获取单菌落间充质干细胞的增殖能力及由此的细胞获取效果。

在之前韩国专利申请10-2006-0075676号的实施例1中，公开了通过如图1的层分离培养方法从骨髓分离出间充质干细胞及培养的方法，将经层分离步骤获取的作为单一性细胞组的多个菌落以每孔100至600的细胞数移入至培养容器。

并且，在韩国专利申请10-2013-0106432号及美国专利申请2012-0171168号公开了利用层分离培养法分离来源于骨髓的间充质干细胞及培养的方法，还公开了将菌落以50细胞/cm²至100细胞/cm²涂抹。

但是，在韩国专利申请10-2006-0075676号、韩国专利申请10-2013-0106432号及美国专利申请US2012-0171168号仅公开通过层分离培养法取得的单一性细胞组菌落进行计数来移动至6孔板后来培养的结构，即，与传代1次相对应的菌落培养的条件，未公开并不是传代2次之后的菌落的对于个别细胞的反复培养密度调节的结构及根据其的效果。根据在上述申请中记载的现有的层分离培养法，为了获取充足量的具有胰腺炎的预防、治疗、改善效果的单克隆干细胞，需进行至少传代10次以上的培养。相反，在本发明的得以改善的层分离培养方法中，可通过传代2次之后的低细胞密度条件，最多传代8次以下的少的传代培养数有效获取大量的具有胰腺炎治疗效果的所目的的单克隆干细胞。

具体地，在本改善方法中，培养通过层分离培养方法获取的传代1次(P1)的菌落后，传代2次(P2)之后，在传代培养中，分注作为低密度的1000细胞/cm²以下的细胞，并将其与4000细胞/cm²细胞培养的效果进行了比较。并且，将细胞培养基以不同的两种包含由抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基及未包含抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基来比较了由此带来的细胞增殖效果。

将用于确认得以改善的层分离培养法的效果的实验组在表3中示出，经相对于现有的层分离培养法得以改善的层分离培养方法的工序改善部分在图12示意性地示出。

如图12所示，到获取传代1次的工序为止，将现有的层分离培养法和得以改善的层分离培养法以相同方式进行工序，但是，得以改善的层分离培养法与现有的层分离培养法的不同之处在于，将所扩张的传代1次细胞用作种子细胞来进行培养的步骤之后的传代培养工序。在现有的层分离培养法中，以4000细胞/cm²以上的高密度进行传代培养，来在没有对于密度条件的认知下获取大量的细胞，在得以改善的层分离培养法中，将传代培养的密度调节成作为低密度的1000细胞/cm²以下，由此，仅可传代2次之后的最多传代8次以下的培养获取最终产物。将传代2次之后的培养工序在图12中详细示出。

表3

上述表3的细胞系为由层分离培养方法分离的细胞系，分别以SCM01至SCM08命名。

2.1根据细胞系密度及培养基的增殖效果确认

利用上述SCM01至SCM08细胞系来进行培养，分别利用细胞数、群体倍增时间、群体倍增水平来比较根据直至小于传代10次的传代5次的传代培养的细胞增殖效果，并在图13至图20示出。

如图13至图20中所确认，在以每cm² 1000个的细胞密度接种并进行培养的所有实验组中呈现出比以每cm² 4000个的细胞密度接种并培养的实验组更优秀的细胞增殖效果。并且，尽管为相同的1000个细胞密度组，但在包含有作为抗氧化剂的抗坏血酸的α-伊格尔极限必需培养基中所培养的1000α实验组中确认到了更为显著的细胞增殖效果。

2.2根据细胞系密度的增殖效果比较

为了进一步准确的根据培养细胞数的增殖率的比较，将培养基分别固定为LG达尔伯克改良伊格尔培养基或α-伊格尔极限必需培养基，并比较了根据每cm² 1000个或4000个的细胞接种密度的根据传代培养的细胞增殖效果，并将其结果在图21至图24中示出。

如图21所示，确认了当在LG达尔伯克改良伊格尔培养基中所培养的SCM01至SCM08细胞系均以每cm² 1000个细胞数接种并培养时，确认到传代2次(P2)至传代5次(P5)的增殖率显著高于每cm² 4000个的细胞数接种组，确认了与由传代5次(P5)中所确认的每cm² 4000个细胞接种相比，每cm² 1000个细胞接种组的增殖率为最小3.08倍至最大48.50倍。

并且，如图22所示，确认了在所有细胞系中，每cm² 1000个的细胞接种组的群体倍增时间值也低于或接近每cm² 4000个细胞系接种，在所有细胞系中，群体倍增水平值也与每cm² 4000个细胞接种相比高。

并且，如图23所示，确认了当在α-伊格尔极限必需培养基中所培养的SCM01至SCM08细胞系均以1000个细胞数接种并培养时，呈现出与达尔伯克改良伊格尔培养基实验组相同的倾向，与传代5次(P5)中所确认的每cm² 4000个细胞系接种相比，每cm² 1000个细胞接种组的增殖率为最小6.32倍至最大85.63倍。并且，如图24所示，确认了在所有细胞系中，每cm² 1000个细胞接种组的群体倍增时间值也低于或接近于每cm² 4000个细胞接种，在所有细胞系中，群体倍增水平值也与每cm² 4000个细胞接种相比高。

这种结果为表示与每cm² 4000个的高密度细胞接种培养相比，可通过每cm² 1000个以下的细胞接种来诱导快速单克隆间充质干细胞的增殖的结果。

2.3根据培养基的增殖效果比较

在上文中，通过实施例2.2确认到了与4000细胞/cm²培养相比，1000细胞/cm²培养可呈现优秀的增殖效果，因此将细胞数固定为1000个，随着将培养基以变数进行改变来比较细胞增殖效果，从而额外地鉴定了根据培养基条件的增殖效果，并将其结果在图25及图26中示出。

如图25所示，将培养基改变为α-伊格尔极限必需培养基及达尔伯克改良伊格尔培养基来比较细胞增殖率的结果，与LG-达尔伯克改良伊格尔培养基相比，在利用α-伊格尔极限必需培养基的实验组中确认到了最小1.77倍至6.39倍的高细胞增殖率。并且，如图26所示，确认了群体倍增时间在所有α-伊格尔极限必需培养基实验组中较低，而群体倍增水平增加。

像这种实验结果表示，利用每cm² 1000个以下的细胞来调节细胞接种密度，除了以如传代2次(P2)至传代5次(P5)的低于传代10次的少的传代进行培养之外，在利用添加有抗氧化剂的培养基来培养的情况下，细胞增殖效率极大化。

实施例3：改善工序的建立

通过上述实施例确认到，就间充质干细胞培养而言，细胞密度的调节及抗氧化剂的添加成为重要的因素，除了韩国专利申请10-2006-0075676号及韩国专利申请10-2013-7020033号中所记载的层分离培养法的现有的工序之外，建立了当进行传代培养时，利用不同的细胞培养密度及培养基条件来在低于传代10次的少的传代中有效地获取单菌落的间充质干细胞的得以改善的工序，综上所述，在下列表4(利用达尔伯克改良伊格尔培养基的培养条件)及表5(利用α-伊格尔极限必需培养基的培养条件)。

表4

表5

更具体地，如下进行了本发明的来源于骨髓的间充质干细胞的层分离培养工序及增殖培养。

利用局部麻醉剂麻醉骨髓提供人的臀部之后，向坐骨扎入注射针来提取了骨髓。100mm的培养容器中放入20％的胎牛血清、1％的包含青霉素/链霉素的14ml的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbecco`s modified Eagle`s Medium，美国吉布科(GIBCO-BRL)产品，美国生命技术公司(Life-technologies)，马里兰州(MD)，美国(USA))、1ml的人的骨髓，在37℃的温度条件下，5％的CO₂细胞培养仪中培养了2小时。培养之后，将培养容器稍微向一侧倾斜，以尽量使附着于底部的细胞不脱落方式仅将培养容器的上层培养液最大限度的移入新的容器。

再重复一次相同的过程之后，将所取得的培养液移入底部涂敷有胶原蛋白(collagen)的培养容器(Becton Dickinson)中之后，在37℃的温度条件下培养了2小时。将培养液重新移入新的涂敷有胶原蛋白的容器中，24小时之后再移入新的容器中，24小时之后再移入新的容器中。最终，48小时之后用肉眼确认到了移入新的容器之后残留的细胞附着于培养容器底部的情况。可推测出能够经过前部分的多个层分离步骤直至该步骤的细胞为细胞的比重显著小于其他细胞的小细胞。

当经过约10日至14日的时间时，多细胞形成单菌落(single colony)，将该单克隆细胞组用胰蛋白酶进行处理并分离之后，移入6-孔培养容器中。在37℃的温度条件下，5％的CO₂细胞培养仪中培养了4日至5日之后，生长了约80％时，将多个细胞用0.05％的胰蛋白酶/1mM的乙二胺四乙酸(EDTA，美国吉布科(GIBCO-BRL)公司产品)进行处理之后，移入T175培养容器并以低细胞密度进行了传代培养。

像这样，当将小于传代10次，优选地，传代8次以下的传代2次(P2)至传代5次(P5)中的细胞密度降低为1000细胞/cm²水平来进行培养时，尽管其他工序也均以相同的方式进行了调节，但间充质干细胞的增殖能力及干细胞特性优秀地保持，从而在相同的传代中也有效地诱导增殖。尤其，当降低细胞密度来进行培养时，可省略正在现有工序中所需的在间充质干细胞中制备工作细胞库的过程，并且可有效地缩短细胞制备期间。尤其，减少传代，可取得大量的未完成老化的细胞，并且当将这种细胞用作治疗剂时，有待其治疗效果优秀。

并且，当利用添加有抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基来作为培养基时，由高密度的细胞培养所诱导的氧化应激因抗氧化剂处理而得以有效改善，并且可恢复间充质干细胞的细胞增殖能力，因此与现有的工序相比，显著缩短细胞的传代，可快速稳定地取得保持间充质干细胞的特性的且未进行老化的新鲜状态的单菌落间充质干细胞。

综上所述可知，低密度细胞培养可短时间内取得大量细胞，因此，可简化制备工序，不仅如此，在长期培养(long-term culture)当中也可取得完整保持着间充质干细胞的特性的且未进行老化的状态的细胞，因此可实现优质的干细胞生产。

由此，在以下用于治疗的胰腺炎的实验中利用了通过上述实施例构建的改善方法获取的干细胞。

实施例4：通过得以改善的层分离培养法取得的干细胞的胰腺炎治疗效果的确认

4.1准备cMSC1、cMSC2

根据实施例3的得以改善的层分离培养法，当进行传代培养时，将细胞培养密度设定为1000细胞/cm²以下，利用包含抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基传代3次，由此取得单克隆间充质干细胞。添加庆大霉素作为抗生素，利用α-伊格尔极限必需培养基培养液进行(参照表5)。以下，将通过1000细胞/cm²以下的低密度及抗氧化条件的得以改善的层分离培养法取得的干细胞命名为“cMSC1”。并且，为了与通过得以改善的层分离培养法取得的干细胞比较效果，当传代培养时，将以4000细胞/cm²以上的密度及未添加抗氧化剂的条件的培养方法进行培养的通过现有的层分离培养法取得并传代3次来培养的干细胞命名为“cMSC2”。

4.2根据cMSC1给药的急性胰腺炎治疗效果的确认

4.2.1急性胰腺炎动物模型构建及实验方法

为了确认根据cMSC1给药的急性胰腺炎的治疗效果，将急性胰腺炎动物模型设置得如下述表6。用于实验的小鼠从无特定病原体的(SPF，Specific Pathogen Free)小鼠((株)KOATECH)购入并使用，每组使用15只5周龄的雄性雄鼠，将共60只小鼠用于以下实验。

表6

组	实验组
		1	正常对照组(Control)
2	载体(Vehicle)(SAP)
		3	cMSC1(急性胰腺炎诱发+cMSC1给药组)
4	cMSC2(急性胰腺炎诱发+cMSC2给药组)

为了构建急性胰腺炎动物模型，手术之前，利用电动剪毛机(clipper)去除动物腹部的毛。利用Zoletil 50(法国维克(VIRBAC)公司，法国))及甲苯噻嗪(xylazine)(德国拜耳(

Bayer AG)公司，德国(Germany))实施麻醉，需要时，进行追加麻醉。利用聚维酮及70％的酒精对所要切开的部位进行广泛消毒后，实施腹部正中切开。暴露十二指肠后，将作为急性胰腺炎诱发物质的3％的牛胆酸钠(sodium taurocholate)以1mL/kg的剂量向胰腺内给药来诱导急性胰腺炎。

在动物模型中，诱导胰腺炎，并4小时后，将cMSC1及cMSC2以2×10⁶个细胞通过尾静脉单次给药200ul，72小时后，摘取血液及器官来进行分析。图27示出构建本发明的急性胰腺炎动物模型的示意图。

4.2.2根据cMSC1及cMSC2处理的胰腺细胞存活率的确认

确认了向在实施例4.2.1中制备的急性胰腺炎动物模型注入的细胞存活率。将cMSC1及cMSC2与在下述表7示出的细胞稳定剂一同以相同剂量通过尾静脉给药。

表7

如在上述表7中所确认，当注入作为试验物质的cMSC1和cMSC2时，测定存活率的结果，分别为91％、87.7％，均具有85％以上的存活率，尤其，cMSC1给药组示出90％以上的存活率，由此确认了胰腺细胞保护效果更突出。

4.2.3根据cMSC1处理的血液生化的效果

为了在诱发急性胰腺炎的实施例4.2.1的大鼠中确认根据cMSC处理的血液生化的效果，确认了胰腺炎标记物水平。具体地，在作为试验结束时间点的cMSC1或cMSC2给药72小时后，利用血液生化分析仪(日立7180型(7180Hitachi)，日本(Japan))测定两种酶，即，α-淀粉酶(α-amylase)及脂肪酶(lipase)，将结果在图28中示出。

如图28所示，确认了在给药cMSC1、cMSC2后的72小时的急性胰腺炎(SAP)模型中，α-淀粉酶及脂肪酶水平与对照组相比显著高。确认了与SAP模型相比，cMSC2给药组在α-淀粉酶水平中未示出效果，但抑制了约13％的脂肪酶增加。另一方面，在通过得以改善的层分离培养法取得的cMSC1给药组中，与SAP对照组相比，确认了51％的淀粉酶水平的减少，脂肪酶也示出64％的显著的水平减少。

即，若注入cMSC1，则作为胰腺炎标记物的α-淀粉酶和脂肪酶均显著减少约51％至64％，这种结果表示cMSC1非常显著地减少血清内总的α-淀粉酶和脂肪酶活性。

4.2.4根据cMSC1处理的髓过氧化物酶(MPO，Myeloperoxidase)的确认

髓过氧化物酶为在中性粒细胞(neutrophil granulocytes)中大量表达的酶，用作心肌梗死(myocardial infarction)或急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)的预测因子，是表示炎症程度的标记。为了确认胰腺组织中的中性粒细胞的浸润程度及炎症程度是否根据本发明的cMSC1处理而得以改善，利用髓过氧化物酶活性测定试剂盒(Myeloperoxidase activity assay kit)(STA-803，Cell biolabs公司)根据制备公司的方法测定髓过氧化物酶(150kDa)，将其结果在图29中示出。

如图29所示，经确认在诱导急性胰腺炎的组中，与对照组相比，髓过氧化物酶活性约增加12倍，在通过得以改善的层分离培养法取得的cMSC1处理组中，显著减少65％以上。这种结果表示，与现有的工序的细胞系组cMSC2的8％减少效果相比，cMSC1示出统计学上显著减少中性粒细胞的效果。

4.2.5根据cMSC1处理的炎症性细胞因子及抗炎症性细胞因子的分析

为了在作为急性胰腺炎动物模型的实施例4.2.1的大鼠中确认炎症性因子是否根据cMS C处理来诱导其的改变，利用下述表8的分析工具根据制造商的方法测定作为炎症性细胞因子的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、干扰素-γ、白细胞介素-10的表达变化，将其结果在图30中示出。

表8

如图30所示，经确认，在急性胰腺炎动物模型(SAP)中，与对照组相比，肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、干扰素-γ的水平显著增加，在cMSC1及cMSC2处理组中，与对照组相比，表达水平明显减少。尤其，在cMSC1处理组中，相对于对照组在肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、干扰素-γ红分别示出49％、42％、61％的减少效果，示出显著优秀的炎症性细胞因子抑制效果。并且，与对照组相比，抗炎症性细胞因子的白细胞介素-10在cMSC1及cMSC2处理组中均增加，尤其，与对照组相比，cMCS1的白细胞介素-10水平增加69％，确认了通过cMSC处理可诱导抗炎症性细胞因子的表达的增加。

4.2.5根据cMSC1处理的组织病理学的分析

摘除实施例4.2.1的急性胰腺炎动物模型的器官，为了确认根据cMSC1处理的水肿病变的变化，进行组织病理学分析。具体地，给药试验物质后，在72小时后采集血液后将动物安乐死后，摘除胰腺并利用10％的中性缓冲福尔马林固定。利用所固定的组织进行修剪、脱水、石蜡包埋及薄切等常规组织处理过程，并制备用于组织病理学检查的标本。实施苏木精-伊红(H&E，Hematoxylin&Eosin)染色，利用光学显微镜(Olympus BX53，日本(Japan))观察组织病理学变化。组织病理学评价利用施密特评分(Schmidt’s score)(A better modelof acute pancreatitis for evaluating therapy,Schmidt J et al,1992)评分化。将其结果在图31及图32中示出。

如图31所示，确认到在显微镜下，与对照组相比，在SAP中发现炎症，在cMSC1处理组中的炎症程度最大程度的得以改善。

如图32所示，确认了在急性胰腺炎动物模型中，组织病理学评分、水肿、坏死、出血、炎症浸润评分均与对照组相比急速增加，这种急速增加均通过cMSC1及cMSC2的处理得以缓解的倾向。尤其，与对照组相比，cMSC1处理组在所有评价指标中示出约27％至35％的减少效果，确认了与cMSC2处理组相比示出约2倍的效果。

综上所述，在通过得以改善的层分离培养法取得的cMSC1的情况下，可在急性胰腺炎中，增加胰腺细胞存活率，将血液生化、组织病理学病变均有效地改善，因此，确认了当治疗急性胰腺炎时示出优秀的效果。并且，即使与通过现有的层分离培养法取得且高密度传代培养的cMSC2相比，这种对于cMSC1的急性胰腺炎治疗的效果明显优秀。

实施例5：通过得以改善的层分离培养法取得的干细胞特性比较

5.1 cMSC1及cMSC2细胞特性的比较

与通过现有的层分离培养法取得的cMSC2相比，确认了在实施例4中通过得以改善的层分离培养法取得的干细胞cMSC1示出显著优秀的急性胰腺炎治疗效果，进行了用于比较这些细胞的特性的实验。

通过与实施例4.1的方法相同的方法取得了cMSC1及cMSC2，将其培养并确认细胞大小。

将用于实验的细胞及方法在下述表9中示出。

表9

为了鉴定cMSC1与cMSC2的细胞大小差异，利用Nucleo Counter NC-250仪器确认了细胞大小，将其结果在图33及表10中示出。

表10

如表10及图33所示，确认了两种细胞的大小不同，通过仪器确认细胞直径的标准偏差的结果，确认了通过得以改善的层分离培养法取得的cMSC1与cMSC2相比偏差更少。

追加地，确认了当利用流式细胞荧光分选技术相同地指定前向散射/侧向散射光(FSC/SSC)值时，流式细胞分析中是否也示出细胞的大小差异，并将其结果在图34中示出。

如图34所示，确认了cMSC2的细胞大小大，细胞整体上广泛地分布，相反，cMSC1的细胞的大小小，由此，分布在侧向散射光(SSC)50K内。

如上所述，随着cMSC1的细胞大小更小且均值的形成，培养间充质干细胞时所分泌的细胞因子量改变，由此确认了cMSC1的急性胰腺炎治疗效果进一步加强。

5.2 cMSC1及cMSC2的体外效果的确认

培养对于急性胰腺炎示出不同效果的cMSC1及cMSC2后，进行体外(in vitro)实验来比较了各个细胞的活性。首先，在混合淋巴细胞反应(MLR，Mixed lymphocyte reaction)条件下确认了活化的T细胞的抑制率。实验方法如下。将两名互不相同的供体(donor)的外周血单个核细胞相互混合来诱导借助抗原的T细胞的活性(allogeneic MLR)后，分别添加cMSC1或cMSC2来确认了是否抑制T细胞的活性。将利用各自的染料(Dye)(CFSE和eFluor670)染色的人的外周血单个核细胞与cMSC1或cMSC2分别以4∶1比例共培养后，培养8日，分析通过利用流式细胞荧光分选技术(FACS verse)(BD Biosciences)仪器的流细胞分析法测定。将其结果在图35中示出。

如图35所示，在混合淋巴细胞反应条件下确认活化的T细胞的抑制率的结果，两种细胞均在T细胞∶cMSC＝1∶4条件下示出50％以上的抑制率，但得以改善的工序的细胞系(cMSC1)示出79％的抑制率，现有工序的细胞系(MSC2)示出53％的抑制率，由此确认了约26％的差异。

在体外培养cMSC1及cMSC2，在各个细胞系的培养液中比较了转化生长因子-β1、可溶性肿瘤坏死因子受体1及免疫相关标记吲哚胺2，3-双加氧酶、T-细胞可诱导共刺激分子配体的表达量，将其结果在图36及图37中示出。

如图36所示，在培养两种细胞系的培养液中确认转化生长因子-β1和可溶性肿瘤坏死因子受体1的分泌量的结果，确认了在两种细胞系之间的转化生长因子-β1为示出大的差异，但可溶性肿瘤坏死因子受体1在作为得以改善的工序的细胞系的cMSC1中的分泌量为高28pg/ml。

并且，如图37所示，以未进行任何刺激的状态的WI38(人成纤维细胞(HumanFibroblast))为基准，比较吲哚胺2，3-双加氧酶、T-细胞可诱导共刺激分子配体的表达量的结果，确认了在作为得以改善的工序的细胞系的cMSC1中的两种基因表达量约高2倍。

追加地，在植物凝集素(PHA，phytohemagglutinin)刺激条件下共培养后，利用培养液确认了炎症性细胞因子(干扰素-γ、白细胞介素-17)及抗炎症性(白细胞介素-10)细胞因子的变化。为了确认干扰素-γ、白细胞介素-17、白细胞介素-10的分泌量，将1×10⁶cells/well浓度的外周血单个核细胞涂抹在24孔板，并利用1ug/ml的植物凝集素诱导炎症反应，具体地，将是否处理上述植物凝集素及是否处理cMSC设置得不同来测定各个实验组中的干扰素-γ、白细胞介素-17、白细胞介素-10的浓度，将其结果在图38中示出。

如图38所示，确认了与得以改善的工序的细胞系cMSC1共培养的结果，与植物凝集素刺激条件相比，干扰素-γ抑制74.3％、白细胞介素-17抑制82.2％，在通过现有的工序取得的细胞系cMSC2中，确认了干扰素-γ抑制55.4％、白细胞介素-17抑制65.8％。即，确认了两种细胞系之间的炎症性细胞因子的抑制率差异约为20％，在相同条件下，确认抗炎症性细胞因子白细胞介素-10的分泌量的结果，在得以改善的工序的细胞系cMSC1中的白细胞介素-10约增加25％，反之，确认了在现有工序的细胞系cMSC2中增加7％，由此确认了cMSC1与cMSC2相比还将抗炎症性细胞因子分泌增加约3倍以上。

综上所述，若利用通过得以改善的工序取得的cMSC1，可确认有效减少因急性胰腺炎而增加的消化酶的增加和炎症相关酶的增加。并且，确认了减少炎症性细胞因子的分泌，并更显著地增加抗炎症细胞因子的分泌，通过胰腺的组织学分析也确认了显著的结果。尤其，将本发明的cMSC1的增殖能力及干细胞特性保持的优秀，由此不仅有效地保持增殖，还与通过现有的工序取得的cMSC2相比时，cMSC1的免疫调节能力、免疫相关基因的表达、炎症及抗炎症性细胞因子的分泌更为优秀。因此，与通过现有的工序获取的细胞相比，通过得以改善的工序获取的细胞可更加优秀地预防、治疗胰腺炎。

Claims

1.一种用于预防或治疗胰腺炎的药学组合物，其特征在于，包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：

步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；

步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；

步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；

步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及

步骤5)，以50细胞/cm²至1000细胞/cm²的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。

2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗胰腺炎的药学组合物，其特征在于，上述步骤5)的培养通过以1000细胞/cm²的细胞密度接种于培养基中来进行。

3.根据权利要求1所述的用于预防或治疗胰腺炎的药学组合物，其特征在于，上述步骤5)的培养通过以传代2次至传代8次来培养。

4.根据权利要求1所述的用于预防或治疗胰腺炎的药学组合物，其特征在于，上述步骤5)的培养基为添加有抗氧化剂的培养基。

5.根据权利要求1所述的用于预防或治疗胰腺炎的药学组合物，其特征在于，上述胰腺炎为慢性胰腺炎或急性胰腺炎。

6.根据权利要求1所述的用于预防或治疗胰腺炎的药学组合物，其特征在于，上述单克隆干细胞用于增加胰腺细胞的存活率。

7.根据权利要求1所述的用于预防或治疗胰腺炎的药学组合物，其特征在于，上述单克隆干细胞示出选自由α-淀粉酶或脂肪酶活性的减少、髓过氧化物酶的活性减少、中性粒细胞浸润及炎症改善、炎症性细胞因子的分泌减少及抗炎症性细胞因子的分泌增加组成的组中的一种以上的活性。

8.根据权利要求1所述的用于预防或治疗胰腺炎的药学组合物，其特征在于，上述单克隆干细胞用于改善选自由水肿、坏死、出血及炎症浸润组成的组中的一种以上的胰腺炎病理学状态。

9.根据权利要求1所述的用于预防或治疗胰腺炎的药学组合物，其特征在于，上述单克隆干细胞为将选自由转化生长因子-β1分泌能力、可溶性肿瘤坏死因子受体1分泌能力、吲哚胺2，3-双加氧酶表达能力及T-细胞可诱导共刺激分子配体表达能力组成的组中的一种以上的能力增强的单克隆干细胞。

10.一种用于预防、改善或治疗胰腺炎的组合物的制备方法，其特征在于，包括通过下述步骤获取单克隆干细胞的步骤：

步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；

步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；

11.根据权利要求10所述的用于预防、改善或治疗胰腺炎的组合物的制备方法，其特征在于，上述步骤5)的培养通过以1000细胞/cm²的细胞密度接种于培养基中来进行。

12.根据权利要求10所述的用于预防、改善或治疗胰腺炎的组合物的制备方法，其特征在于，上述步骤5)的培养为传代2次至传代8次的培养。

13.根据权利要求10所述的用于预防、改善或治疗胰腺炎的组合物的制备方法，其特征在于，上述步骤5)的培养基为添加有抗氧化剂的培养基。

14.一种用于预防、改善或治疗胰腺炎的干细胞，其特征在于，通过下述步骤获取：

步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；

步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；

15.一种胰腺炎的预防或治疗方法，其特征在于，包括：

步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；

步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；

步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；

步骤5)，通过以50细胞/cm²至1000细胞/cm²的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养的步骤，来获取单克隆干细胞；以及

步骤6)，向个体给药上述单克隆干细胞。