CN113226338A - 包含克隆干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物 - Google Patents

包含克隆干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物 Download PDF

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CN113226338A CN201980086599.6A CN201980086599A CN113226338A CN 113226338 A CN113226338 A CN 113226338A CN 201980086599 A CN201980086599 A CN 201980086599A CN 113226338 A CN113226338 A CN 113226338A
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Abstract

本发明涉及包含通过得以改善的干细胞的层分离培养获取的单克隆干细胞的用于预防、治疗或改善特应性皮炎的组合物及其制备方法、利用其的特应性皮炎治疗方法。根据本发明的得以改善的干细胞的层分离培养及增殖方法，可通过单克隆干细胞的快速增殖，在短时间内大量获取所需的单克隆干细胞，由此获取的单克隆间充质干细胞为特应性皮炎治疗效果增加的干细胞，可有用地用作特应性皮炎治疗剂。

Description

包含克隆干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物
技术领域
本发明涉及包含通过得以改善的干细胞的层分离培养获取的单克隆干细胞的用于预防、治疗或改善特应性皮炎的组合物及其制备方法、利用其的特应性皮炎治疗方法。
背景技术
还以特应性湿疹而周知的特应性皮炎(Atopic dermatitis，AD)为非常常见的炎症性皮肤疾病，据报告急性特应性皮炎的发病机制与以CD4+T细胞及嗜酸粒细胞的皮肤渗透、免疫球蛋白E及Th2细胞因子的分泌增加为介导的Th2炎症反应有关。特应性皮炎伴随严重的瘙痒和皮肤干燥等的症状，特应性皮炎的特征在于，在血液中表现高免疫球蛋白E(IgE)的表达量且使嗜酸粒细胞增加。近来，据估计，特应性皮炎约占总人口的10％至20％，没有可根治的明确的治疗法，尤其，大部分诊断在5岁以下的稚龄，其中，50％的诊断在6个月至24个月之间。在韩国幼儿过敏呼吸系统学会中进行的全韩国流行病毒调查中，最近10年间的特应性皮炎的患病率逐渐增加，对其的社会关注也不断增加。特应性皮炎患儿的50％至75％表现出发展为哮喘、鼻炎的过敏性疾病的经过，因此，在早期诊断且管理作为发展为过敏的起点的特应性皮炎，对于预防发展为成人过敏非常重要。
特应性皮炎由如T淋巴细胞的活化、细胞因子系统的异常、细胞介导的免疫力降低、免疫球蛋白E的增加的免疫学异常和生理学因素以及皮肤的生化缺陷等诸多因素引起。为了治疗这种特应性皮炎，除了干燥的皮肤保湿，通常还需要利用如类固醇的药物的治疗。作为特应性皮炎的治疗剂，在症状轻的情况下，使用保湿剂、局部类固醇剂、抗组胺剂、抗生素及局部免疫反应调节剂等。在严重的特应性皮炎的情况下，使用全身性类固醇剂或免疫抑制剂，但长期服用会有副作用，若停止服用该药物，则病变复发的可能性高，因此，需要长期使用也安全且有效的治疗法。
近来，尝试在各种炎症性疾病的治疗利用干细胞。干细胞具有可生长为我们身体的210多个所有器官的组织的潜在能力，可且可无限分裂，并通过适当的操作而分化成所需的器官。由于这种干细胞的特性，干细胞作为新型治疗剂而备受瞩目，并且利用干细胞治疗难治性疾病的可能性非常高，预计可治疗许多疾病，如白血病、骨质疏松症、肝炎、帕金森病、老年性痴呆、烧伤等。
然而，在干细胞的情况下，在很难大量获取其的层面上仍然具有很多限制。作为获取干细胞的方法，可以说从冷冻胚芽细胞获取的方法为有效，但在伦理方面还存在许多争议。为了解决这种问题，还研究了利用体细胞核移植方法或成体干细胞来获取干细胞的方法。比胚芽干细胞研究更加活跃进行的领域为成体干细胞的研究。作为存在于中枢神经系统或骨髓等各种器官中而参与生长期的器官发育及损伤时的再生的细胞，成体肝细胞存在于各种器官中，因此可在包括骨髓、脾脏、脂肪细胞等的各种部位获取，但从骨髓获取的方法为最常见的方法。但是，在从许多各种骨髓细胞中分离并培养多个间充质干细胞的方面上，难以获取始终呈均匀形态的细胞，因此正在进行用于完善这种问题的研究。
本发明人发明了新式的命名为层分离培养法的干细胞的分离方法，通过韩国专利申请KR 10-2006-0075676号申请了专利，并取得了授权。与其他方法相比，上述层分离培养法不仅能够以低成本进行，并且不存在污染问题，可不用顾虑混入其他干细胞而有效地获取克隆间充质干细胞(cMSC)的这一点上，与其他干细胞获取方法相比，具有极好的优秀性。但是，尽管上述方法具有优秀性，但为了大量生产间充质干细胞来用作最终产物，层分离培养法需要制造工作细胞库，并通过它来获取最终产物的工序才可取得充分量的间充质干细胞，并且需要约10次传代(Passage)以上的传代培养，因此从这一方面上，难以快速取得单克隆间充质干细胞集团。
因此，为了治疗炎症性疾病，尤其特应性皮炎，利用干细胞仍然具有许多限制，并且尚没有用于有效治疗特应性皮炎的干细胞制备方法及利用其的特应性皮炎治疗方法。
发明内容
技术问题
在通过改善如上所述的层分离培养法来进行用于诱导干细胞的快速增殖的研究当中，本发明人发现利用将培养细胞密度调低，并添加抗氧化剂来进行培养的得以改善的层分离培养法的情况下，可仅通过少的传代诱导出有效的细胞增殖率的增加，由此获取的单克隆干细胞与现有的层分离培养方法的干细胞相比，示出非常显著的特应性皮炎治疗效果，并且完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供包含通过改善现有的层分离培养法的干细胞的层分离培养及增殖方法获取的单克隆干细胞的用于预防、治疗及改善特应性皮炎的组合物及其制备方法、利用其的特应性皮炎的预防、治疗及改善方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物，其包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2(cells/cm2)至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
并且，本发明提供用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物，其包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
并且，本发明提供用于预防或改善特应性皮炎的准药品组合物，其包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
并且，本发明提供用于预防、改善或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法，包括通过下述步骤获取单克隆干细胞的步骤：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
并且，本发明提供特应性皮炎的预防、改善或治疗方法，其包括：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养，来获取单克隆干细胞；以及步骤6)，向个体给药上述单克隆干细胞。
并且，本发明提供用于预防、改善或治疗特应性皮炎的干细胞，其通过下述步骤获取：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
发明的效果
根据本发明的得以改善的干细胞的层分离培养及增殖方法，可通过单克隆干细胞的快速增殖，在短时间内大量获取所需的单克隆干细胞，由此获取的单克隆间充质干细胞为特应性皮炎治疗效果得以增加的干细胞，可有用地用作特应性皮炎治疗剂。
附图说明
图1为示出从骨髓分离单克隆间充质干细胞的现有的层分离培养法。
图2为示出通过显微镜观察并确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的形态学变化的结果的图。
图3为示出通过流式细胞荧光分选技术(FACS，Flow cytometry)分析来将根据细胞培养密度及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的细胞大小及粒度(granularity)的变化以前向散射(FSC，forward scatter)(A部分)及侧向散射(SSC，side scatter)(B部分)光的平均值来进行确认的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图4为示出通过β-半乳糖苷酶(β-gal)的活性染色来对细胞培养密度及细胞培养传代不同的单克隆间充质干细胞进行染色之后确认细胞是否老化的结果的图。
图5为示出以不同的细胞培养密度来培养传代15次(P15，Passage 15)的单克隆间充质干细胞之后利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)来确认作为老化相关基因的p15、p16及作为增殖标记的增殖细胞核抗原(PCNA)的结果的图。
图6为示出通过群体倍增时间(PDT，Population Doubling Time)及群体倍增水平(PDL，population Doubling Level)来确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的增殖能力的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图7为示出确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的分化能力的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。图7的A部分为通过油红(Oil red)O组织学染色法来确认分化为根据细胞培养及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的脂肪细胞的分化能力的结果。图7的B部分示出对图7的A部分的组织学染色程度进行定量化的图。图7的C部分为通过茜素红S(Alizarin red S)组织学染色来确认分化为根据细胞培养及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞的骨化细胞的分化能力的结果，图7的D部分为示出对图7的C部分的组织学染色程度进行定量化的图。
图8为示出由根据细胞培养密度及细胞培养传代的单克隆间充质干细胞生产的总活性氧(ROS，reactive oxygen species)生产(A部分)及通过彗星试验(comet assay)来确认由根据细胞培养密度及细胞培养传代的总活性氧生产引起的脱氧核糖核酸(DNA)损伤的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图9为示出为了确认由根据细胞培养密度及细胞培养传代生产的活性氧引起的脱氧核糖核酸损伤程度而测定8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG，8-hydroxy-2'-deoxyguanosine)浓度的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图10为示出利用高密度条件单独(HD)或高密度条件+抗坏血酸(抗氧化剂的一种)追加(HD+AA)来培养传代11次(P11)至传代15次(P15)的单克隆间充质干细胞之后确认细胞增殖能力的变化的结果图。
图11为示出利用高密度条件单独(HD)或高密度条件+抗坏血酸追加(HD+AA)来培养传代15次(P15)的单克隆间充质干细胞之后对所生产的活性氧水平进行比较的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。
图12a为比较示出现有的层分离培养法及得以改善的层分离培养法实验方法的图。
图12b为得以改善的层分离培养法的示意图，为示出与不同于现有的层分离培养法的传代2次之后相对应的低密度培养的示意图。
图13至图20为示出确认以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的的密度接种通过层分离培养法取得的SCM01至SCM08单克隆间充质干细胞，并利用添加有或未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基(LG-DMEM，Dulbecc o's Modified Eagle Medium，lowglucose)、α-伊格尔极限必需培养基(α-MEM，Minimum Essential Mediumα)培养基来培养的细胞的增殖率的结果的图。各个图的A部分为示出根据各个实验组的传代1次(P1)至传代5次(P5)的细胞数的变化的图，各个图的B部分为示出各个实验组的群体倍增时间及群体倍增水平结果的图。
图21为示出利用未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基且仅改变以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度的细胞密度的实验组中的细胞增殖率的结果的图。
图22为示出确认利用未添加有抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基且仅改变以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度的细胞密度的实验组中的群体倍增时间及群体倍增水平的结果的图。
图23为示出确认利用添加有抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基且仅改变以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度的细胞密度的实验组中的细胞增殖率的结果的图。
图24为示出确认利用添加有抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基且仅改变以1000细胞/cm2或4000细胞/cm2的密度的细胞密度的实验组中的群体倍增时间及群体倍增水平的结果的图。
图25为示出确认将细胞密度固定为1000细胞/cm2的密度并将培养基变更为LG-达尔伯克改良伊格尔培养基或α-伊格尔极限必需培养基的实验组中的细胞增殖率的结果的图。
图26为示出确认将细胞密度固定为1000细胞/cm2的密度并将培养基变更为LG-达尔伯克改良伊格尔培养基或α-伊格尔极限必需培养基的实验组中的群体倍增时间及群体倍增水平的结果的图。
图27为示出确认特应性皮炎动物模型中的对照组(细胞载体(Cell Vehicle)，veh)、根据给药GCM-MSC、SCM-cMSC的皮肤病变的变化的结果的图。
图28为示出通过苏木精-伊红(H&E)及甲苯胺蓝染色确认特应性皮炎动物模型中的对照组(细胞载体，veh)、根据给药GCM-MSC、SCM-cMSC的皮肤病变的变化的结果的图。
图29为示出确认特应性皮炎动物模型中的对照组(细胞载体，veh)、根据处理GCM-MSC、SCM-cMSC的表皮厚度变化的结果的图(*P＝0.0152，**P＝0.0016)。
图30为示出确认特应性皮炎动物模型中的对照组(细胞载体，veh)、根据处理GCM-MSC、SCM-cMSC的真皮厚度变化的结果的图(***P＝0.0003)。
图31为示出确认对照组(细胞载体，veh)、根据处理GCM-MSC、SCM-cMSC的免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1(IgG1)生产量变化的结果的图(免疫球蛋白E-P**＝0.009，免疫球蛋白G1-P*＝0.0432)。
图32为示出确认对照组(细胞载体，veh)、根据处理GCM-MSC、SCM-cMSC的免疫球蛋白G2a(IgG2a)生产量变化的结果的图(P****＜0.0001)。
图33为示出对照组(细胞载体，veh)、根据处理GCM-MSC、SCM-cMSC的腋淋巴结中的白细胞介素-4(IL-4)、γ-干扰素(IFN-γ)生产量变化的结果的图(***P＝0.0008，P*＝0.0338)。
图34为示出确认对照组(细胞载体，veh)、根据处理GCM-MSC、SCM-cMSC的肥大细胞数变化的结果的图(P**＝0.0026，0.0036)。
图35为示出确认特应性皮炎动物模型中的对照组(细胞载体，veh)、根据给药cMSC1(100细胞/cm2，1000细胞/cm2)、cMSC2(4000细胞/cm2)的体重变化的结果的图。
图36为示出确认特应性皮炎动物模型中的根据给药cMSC1(100细胞/cm2，1000细胞/cm2)、cMSC2(4000细胞/cm2)的细胞存活率变化的结果的图。
图37为通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分析确认特应性皮炎动物模型中的正常对照组(naive)、对照组(细胞载体，veh)、根据给药cMSC1(100细胞/cm2，1000细胞/cm2)、cMSC2(4000细胞/cm2)的总免疫球蛋白E生产量变化的结果的图(1way ANOVA-Tukey’s multiplecomparisons test，****P＜0.0001，***P＝0.0001，*P＝0.0238，compared toVeh.Unpaired t test-#P＝0.0336compared to100细胞/cm2group)。
图38为示出确认特应性皮炎动物模型中的正常对照组(-)、对照组(磷酸盐缓冲液(PBS)，veh)、根据涂敷cMSC1(100细胞/cm2，1000细胞/cm2)、cMSC2(4000细胞/cm2)的皮肤病变的变化的结果的图。
图39为示出确认特应性皮炎动物模型中的正常对照组(-)、对照组(磷酸盐缓冲液，veh)、根据涂敷cMSC1(100细胞/cm2，1000细胞/cm2)、cMSC2(4000细胞/cm2)的表皮增厚缓解效果的结果的图。
具体实施方式
本发明涉及特应性皮炎的预防或治疗方法，其包括向需要的个体给药包含通过间充质干细胞的得以改善的层分离培养及增殖方法获取的单克隆干细胞的用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物或上述单克隆干细胞的步骤。
并且，本发明涉及用于预防、改善或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法，其包括通过间充质干细胞的得以改善的层分离培养及增殖方法获取单克隆干细胞的步骤。
本发明的作为有效成分的单克隆干细胞为通过如下的得以改善的层分离培养方法获取的干细胞，即，除了可快速无污染地获取干细胞的层分离培养法的优点之外，通过单克隆干细胞的快速增殖，优选地，可通过单克隆间充质干细胞的快速增殖来在无需进行工作细胞库(WCB，Working Cell Bank)制备步骤也可在短时间内大量获取所需的单克隆干细胞。本发明的特征在于，相比于通过现有的层分离培养方法获取的干细胞，通过如上所述的方法获取的单克隆干细胞为特应性皮炎治疗效果得以增加的干细胞。
以下，详细说明本发明。
本发明提供用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物，其包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
上述步骤2)及步骤3)的培养是在30℃至40℃的温度条件下，培养4小时以下，优选地，培养1小时至3小时，更优选地，培养1小时30分钟至2小时30分钟，重复培养是在30℃至40℃的温度条件下培养4小时以下，优选地，培养1小时至3小时，更优选地，培养1小时30分钟至2小时30分钟，之后，重复2次至3次在30℃至40℃的温度条件下培养12小时至36小时，优选地，培养18小时至30小时，接着，在30℃至40℃的温度条件下培养24小时至72小时，培养36小时至60小时，优选地，培养36小时至60小时，每次将上清液移入新的培养容器。
简单综述本发明的实施例中所分离的方法为如下。
Figure BDA0003133767560000091
经培养的多个细胞形成单克隆细胞组，分离该多个单克隆细胞组之后可进行传代培养，本发明的特征在于，除了现有的层分离培养方法，包括步骤5)的传代培养步骤。
本发明的“层分离培养(Subfractionation Culturing Method，SCM)”是指根据比重分离干细胞的方法，首先，提取人的骨髓来在细胞培养液中进行培养之后，仅获取上清液，并将其移入经涂层剂的处理或未经涂层剂的处理的培养容器中进行培养之后，重复数次相同过程的工序。像这种层分离培养的特征在于，重复不经离心分离过程且反复取得上清液来进行培养的工序，并且具有最后可无其他细胞的污染而取得单克隆干细胞，优选地，可取得单克隆间充质干细胞的优点。
本发明的上述步骤1)至步骤5)中的步骤1)至步骤4)可与韩国KR10-2006-0075676号或KR10-2014-0170045号汇总所记载的层分离培养方法相同或等同地进行，韩国KR 10-2006-0075676号可全文并入本发明中作为参考。
并且，在现有的韩国KR10-2014-0170045号中，作为与特应性皮炎的治疗关联来获取细胞的方法，公开获取通过层分离培养法获取的克隆干细胞并利用其的特应性皮炎的预防或治疗方法，其包括：步骤(i)，在第一容器培养包含来源于骨髓的间充质干细胞的样品来获取上清液；步骤(ii)，将第一容器的上清液移入第二容器；步骤(iii)，培养在上述第二容器中存在的细胞并获取上清液；步骤(iv)，将步骤(ii)及步骤(iii)重复3次以上；步骤(v)，分离来源于单细胞的菌落；以及步骤(vi)，将细胞从上述菌落移入生长培养基并培养细胞，这为不进行离心分离且仅通过密度差异获取单克隆干细胞的方法，从而利用韩国KR10-2006-0075676号的现有的层分离培养方法。
但是，上述韩国KR 10-2006-0075676号及韩国KR10-2014-0170045号的层分离培养方法未公开在少的传代中有效获取单克隆干细胞，由此获取特应性皮炎治疗效果显著改善的单克隆干细胞的方法。
如图1所示，在现有的层分离培养方法中，将从单菌落获取的所有细胞移动至6孔板，以80％～90％的克隆率(confluency)增殖后，为了将处于增殖状态的传代1次(P1)细胞作为种子细胞(seed cell)且没有对于密度调节的意识地获取大量的细胞，以4000细胞/cm2进行高密度培养。
相反，本发明涉及基于在通过调节传代2次之后的培养中调节细胞密度来有效获取具有优秀的特应性皮炎的预防、治疗、改善效果的干细胞的“得以改善的层分离培养方法”，其特征在于，现有的层分离培养方法与种子细胞之后的培养步骤不同。例如，具体地，包括“步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养”。相比于现有的层分离培养方法，得以改善的层分离培养方法可诱导单克隆干细胞的快速增殖，因此可快速取得最终产物，优选地，仅可通过如传代2次(P2)至传代8次(P8)的低于传代10次的培养来制备原始细胞库(MCB，Master Cell Bank)，可获取示出优秀的特应性皮炎的预防或治疗效果的单克隆干细胞。
如现有的工序，当本发明的单克隆干细胞以4000细胞/cm2的高密度来进行培养时，细胞增殖能力显著降低，间充质干细胞的标记产生变化，并且，丧失干细胞的分化能力。因此，通过得以改善的层分离培养法取得的单克隆干细胞是指能够以低密度至中等程度的密度，即，以小于4000细胞/cm2的低细胞密度，例如，以3000细胞/cm2以下的细胞密度，优选地，以2000细胞/cm2以下的细胞密度，更优选地，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度培养的单克隆干细胞。
与以如4000细胞/cm2的高密度培养的间充质干细胞相比，当1000细胞/cm2以下的细胞密度培养单克隆间充质干细胞时存在如下的优点，即，细胞的增殖能力在整个长时间的培养期间保持显著的高水平，因此无需重复多次传代也可快速取得所期望量的单克隆细胞。因此，本发明的得以改善的层分离培养方法的特征在于，将种子细胞之后的传代培养步骤进低于传代10次，优选地，仅进行传代8次，与以往的层分离培养方法为了确保充足数量的细胞而最多进行传代25次相比，具有仅可通过少的传代培养大量生产单克隆干细胞的优点。
并且，当以上述细胞密度培养单克隆间充质干细胞时，该细胞存在脱氧核糖核酸损伤少、老化受到抑制、可有效保持干细胞的分化能力的优点，并且可快速获取具有优秀的干细胞特性的单克隆间充质干细胞。
并且，与以如4000细胞/cm2的高密度培养的单克隆干细胞相比，根据本发明的方法获取的单克隆干细胞示出优秀的特应性皮炎地预防、改善或治疗效果。
用于本发明的培养基均可包含不包含抗氧化剂的培养基、上述培养基中添加有抗氧化剂的培养基或包含抗氧化剂的培养基。
作为不包含抗氧化剂的培养基，并不限于此，还可使用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)根据需要，可向上述培养基额外地添加抗氧化剂来进行培养。并且，根据需要，可利用包含抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基进行培养。
本发明的抗氧化剂可无限制地包含可用于细胞培养中的抗氧化剂，并且可以为选自由谷胱甘肽(Glutathione)、半胱氨酸(Cysteine)、半胱胺(Cysteami ne)、泛醇(Ubiquinol)、β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)及抗坏血酸(Ascor bic acid；AA)组成的组中的一种以上。当培养基中添加有抗氧化剂时，上述抗氧化剂能够以10μg/ml至50μg/ml的浓度，优选地，以10μg/ml至30μg/ml的浓度，更优选地，以25μg/ml的浓度添加。
在本发明的一例中，作为不包含抗氧化剂的培养基，使用达尔伯克改良伊格尔培养基，更优选地，使用LG-达尔伯克改良伊格尔培养基，作为包含抗坏血酸来作为抗氧化剂的培养基，使用α-伊格尔极限必需培养基。
另一方面，可根据本发明的方法，非常有效地增殖单克隆干细胞，因此可省略利用原始细胞库来制备工作细胞库(WCB，Working Cell Bank)。与现有的层分离培养法的制备原始细胞库之后需要伴随制备工作细胞库的方法相比，该方法使工序单纯化。
当利用包含抗氧化剂的培养基来作为本发明的培养基时，上述培养基中还可添加庆大霉素来作为抗生素。
通过本发明的方法取得的间充质干细胞可以为最终优选地，以传代2次(P2)至传代10次(P10)的间充质干细胞，更优选地，可以为传代2次(P2)至传代8次(P8)的间充质干细胞，更加优选地，可以为传代2次(P2)至传代6次(P6)的间充质干细胞。
这表示，与现有的最少传代10次(P10)至传代12次(P12)的间充质干细胞以最终产物来被取得的工序相比，本发明的干细胞为通过更少的传代数取得的干细胞，并且可通过细胞接种密度的调节来容易且大量取得在低的传代中快速得以增殖的间充质干细胞。
在本发明中，与现有的层分离培养法取得的单克隆干细胞(以下，由“cMSC2”表示)相比，如上所述的得以改善的层分离培养法，优选地，通过2000细胞/cm2以下的低密度，更优选地，通过1000细胞/cm2以下的低密度及抗氧条件的得以改善的层分离培养法取得的单克隆干细胞(以下，由“cMSC1”或“SCM-cMSC”表示)具有如下的优秀效果，即，可形成更小且均质的细胞，缓解诱发特应性皮炎的皮肤真皮或表皮的增厚，抑制选自由免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1及白细胞介素-4组成的组中的一种以上的生成，促进干扰素-γ(INF-γ)的生成，抑制肥大细胞。
在本发明中，“特应性皮炎”可包括胎热，可无限制地包括以皮肤干燥症及瘙痒症为主要症状的皮肤的过敏疾病。
通过本发明的方法取得的单克隆干细胞的特征在于，可有效缓解在诱发特应性皮炎的皮肤中表现出的硬皮、真皮的增厚及角质症状，尤其，缓解真皮或表皮的增厚。
并且，通过本发明的方法获取的单克隆干细胞可改善在特应性皮炎中诱发的各种免疫、炎症因子，优选地，抑制选自由免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1及白细胞介素-4组成的组中的一种以上的生产，促进干扰素-γ的生成。
并且，通过本发明的方法获取的单克隆干细胞的特征在于，可抑制诱发过敏反应的细胞，优选地，抑制肥大细胞。
与通过现有的密度梯度离心分离方法取得的干细胞(GCM-MSC)和通过现有的层分离培养法取得的cMSC2相比，通过本发明的方法获取的作为单克隆干细胞的cMSC1或SCM-cMSC的特征在于，具有优秀的与特应性皮炎相关的组织学因子、生理学因子的改善效果。
为了给药，除上述有效成分之外，本发明的药学组合物还可包含一种以上的药学上可接受的载体来制备。本发明的药学组合物中包含的药学上可接收的载体可在制剂时通常利用，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。除上述成分之外，本发明的药学组合物还可包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。
本发明的药学组合物的剂量可根据上述药学组合物的制剂化方法、给药方式、给药时间和/或给药途径不同，可根据包括通过上述药学组合物的给药实现的反应的种类和程度、成为给药对象的个体的种类、年龄、体重、常规健康状态、疾病的症状或程度、性别、饮食、排泄、在相应个体同时使用或与移植一同使用的药物其他组合物的成分等在内的各种因子及医药领域中周知的类似因子不同，本技术领域的普通技术人员可容易确定并处方对于所目的的治疗有效的剂量。
本发明的药学组合物的剂量可以为如1日1mg/kg至1000mg/kg，上述剂量绝不以任何方式限定本发明的范围。
本发明的药学组合物的给药途径及给药方式可各自独立，并不特别限制其方式，只要上述药学组合物可到达所目的的相应部位，可利用任意给药途径及给药方式。
上述药学组合物可通过口服给药或非口服给药方式给药。例如，上述非口服方式包括静脉内给药、腹腔内给药、肌内给药、经皮给药或皮下给药等，还可利用将上述药学组合物涂敷在患病部位或者向患病部位喷雾、被患病部位吸入的方法，但并不局限于此。
并且，本发明提供特应性皮炎的预防或治疗方法，其包括：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养，来获取单克隆干细胞；以及步骤6)，向个体给药上述单克隆干细胞。
在本发明中，上述“个体”包括需要预防或治疗特应性皮炎的个体，可以为哺乳动物或除人之外的哺乳动物。
在将本发明的单克隆干细胞向个体给药的情况下，可与本领域公知的特应性皮炎的预防或治疗药物结合给药，能够以与允许或确认对人体无害的本领域公知的干细胞治疗剂赋形剂一同剂型化的形态给药。
并且，本发明提供用于预防、改善或治疗特应性皮炎的干细胞，其通过下述步骤获取：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
并且，本发明提供用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物，包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
除本发明的上述干细胞之外，上述化妆品组合物还可包含如脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂及胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定化剂、发泡剂(foaming agent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、金属离子掩蔽剂及螯合剂、保存剂、维生素、阻断剂、湿润化剂、精油、颜料、燃料、亲水或亲油活性剂、脂质卵泡或在化妆品中通常使用的任意其他成分的在化妆品领域通常使用的辅助剂。
在上述化妆品组合物中，可向通常包含的化妆品组合物添加0.01重量百分比至15重量百分比的本发明的干细胞，优选地，可添加1重量百分比至10重量百分比的本发明的干细胞。
并且，上述成分能够以在皮肤科学领域中通常使用的量引入。为了治疗特应性皮炎，可适当稀释上述干细胞或其的培养液来直接涂敷在皮肤，能够以软膏剂制备来使本发明的用于治疗皮肤疾病的药学组合物有效地适用于患病部位。上述软膏剂通过将本发明的用于治疗特应性皮炎的药学组合物与无机物质配合后，利用脂溶性基剂涂敷其来制备。优选地，上述无机物质使用抗菌性、消炎效果、表皮再生效果等优秀的材质，作为它们的具体例，有氧化锌、碳酸锌、氧化铁等。并且，优选地，还需使用作为水溶性物质的可安全地浸渍本发明的用于治疗特应性皮炎的药学组合物的陶瓷载体。优选地，使用沸石、滑石、石膏、牡蛎粉及它们的混合物作为上述陶瓷载体。这种陶瓷载体具有优秀的水溶性成分的浸渍性，可顺畅地向皮肤供给水溶性成分。
并且，本发明提供用于预防或改善特应性皮炎的准药品组合物，包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
在本发明中，术语“准药品”是指与用于治疗、减轻、处理或预防人或动物的疾病的纤维、橡胶产品或与此类似的物品，对于人体的作用弱或并不直接作用于人体，与机构或并不是机械的物品相似，为了预防感染而用于杀菌、杀虫及与其类似的用途的制剂中的一种相对应的物品，指用于诊断、治疗、减轻、处理或预防人或动物的疾病的物品中的并不是机构、机械或装置的物品以及用于对人或动物的结构和功能起到药理学影响的物品中的除并不是机构、机械或装置之外的物品，还包括皮肤外部用剂及个人卫生用品。
在以预防或改善、治疗特应性皮炎的目的在准药品包含本发明的组合物的情况下，可直接包含上述组合物来使用或与其他准药品成分一同使用，可根据常规方法释放使用。可根据使用目的适当确定有效成分的混合量。本发明的准药品能够以如霜剂、乳业剂、气雾剂、香波剂、凝胶剂或片剂的形态制备来使用，但并不特别局限于此。在霜剂、软膏剂、香波剂、凝胶剂或片剂的情况下，具有白色凡士林、黄色凡士林、羊毛脂、漂白蜜蜡、十六醇、十八烷醇、硬脂酸、固化油、胶凝碳氢化合物、聚乙二醇、液体石蜡、角鲨烷等的基剂；油酸、异丙基肉豆蔻酸、三异辛酸甘油酯、克罗米通、癸二酸二乙酯、己二酸二异丙酯、己基月桂酸、脂肪酸、脂肪酸酯、脂族醇、植物油等的溶剂及溶解辅助剂；生育酚衍生物、L-抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚等的抗氧化剂；对羟基苯甲酸酯等的防腐剂；甘油、丙二醇、透明质酸钠等的保湿剂；聚氧乙烯衍生物、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、卵磷脂等的表面活性剂；聚羧乙烯、黄原胶、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐类、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等的增稠剂等。
在气雾剂的情况下，可适当配合用于配置软膏剂、霜剂、凝胶剂、悬浮剂、乳剂、液剂及乳业剂等的白色凡士林、黄色凡士林、羊毛脂、漂白蜜蜡、十六醇、十八烷醇、硬脂酸、固化油、胶凝碳氢化合物、聚乙二醇、液体石蜡、角鲨烷等的基剂；油酸、异丙基肉豆蔻酸、己二酸二异丙酯、癸二酸二异丙酯、三异辛酸甘油酯、克罗米通、癸二酸二乙酯、己基月桂酸、脂肪酸、脂肪酸酯、脂族醇、植物油等的溶剂及溶解辅助剂；生育酚衍生物、L-抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚等的抗氧化剂；对羟基苯甲酸酯等的防腐剂；甘油、丙二醇、透明质酸钠等的保湿剂；聚氧乙烯衍生物、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、卵磷脂等的表面活性剂；聚羧乙烯、黄原胶、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐类、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等的增稠剂，还可包含各种稳定剂、缓冲剂、苦味剂、悬浮剂，、乳化剂、芳香剂、保存剂、溶解辅助剂、除此之外的适当的添加剂。并且，可根据需求配合稳定剂、保存剂、吸收促进剂、pH值调整剂、除此之外的适当的添加剂。
并且，本发明提供用于预防、改善或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法，包括通过下述步骤获取单克隆干细胞的步骤：步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
根据本发明，与通过现有的层分离培养法取得的单克隆干细胞相比，无需制备细胞工作库也可容易取得示出突出的特应性皮炎的预防、改善或治疗效果的单克隆干细胞，上述组合物可无限制地包含药学组合物、食品组合物、准药品组合物及化妆品组合物。
本发明的制备方法的特征在于，上述步骤5)的培养以1000细胞/cm2的细胞密度接种于培养基中并进行培养。
并且，本发明的制备方法的特征在于，上述步骤5)的培养基可以为添加有抗氧化剂的培养基。
在本发明的治疗方法及制备方法中，可相同地使用在上述说明中的组合物中记述的内容，为了避免说明书记载的复杂性，将省略所重复的内容。
以下，通过实施例详细说明本发明。
下述实施例用于例示本发明，本发明的内容并不限定于下述实施例。
本发明实施方式
实施例1：确立得以改善的层分离培养法
为了制备对于特应性皮炎具有优秀的效果的单克隆间充质干细胞，利用了得以改善的间充质干细胞层分离培养法及增殖方法。得以改善的间充质干细胞层分离培养法及增殖方法的特征在于，在韩国专利申请10-2006-0075676号中所记载的层分离培养法的培养条件中改变了细胞密度及培养基。在以下实验中，使通过层分离培养法取得的单克隆间充质干细胞(cMSC)的细胞培养密度分别为50细胞/cm2(低密度)、1000细胞/cm2(中等密度)、4000细胞/cm2(高密度)，并分析了由此所具有的细胞的特性。
1.1根据细胞密度的间充质干细胞的形态学变化的确认
首先，进行了用于确认长期培养中的根据细胞密度的间充质干细胞的形态学变化的实验。为了赋予长期培养条件，利用传代5次(P5)、传代10次(P10)、传代15次(P15)的间充质干细胞，分别以低密度、中等密度、高密度的条件接种于LG-达尔伯克改良伊格尔培养基中。接着，通过显微镜观察细胞的形态学变化，并判断了干细胞的老化与否，将其结果在图2中示出。
如图2所示，在传代5次(P5)及传代10次(P10)中，根据细胞密度，在细胞大小与形态学图案中呈现出差异，尤其，在传代15次(P15)的的情况下，高密度培养条件中观察到了平坦且放大形态的间充质干细胞。像这种形态呈现典型的间充质干细胞的老化，并且确认了在长期培养中细胞的密度调节可调节间充质干细胞的老化。
1.2根据细胞密度的间充质干细胞细胞大小及粒度的确认
为了额外地确认根据细胞密度的干细胞的变化，通过流式细胞荧光分选技术分析来对周知为在经老化的细胞中增加的细胞大小及细胞的粒度进行了定量分析，并将其结果在图3中示出。
如图3所示，确认了虽然在传代5次(P5)中细胞的大小未呈现出显著差异，但在传代10次(P10)及传代15次(P15)的情况下，根据细胞密度而呈现出显著的差异。尤其，在传代10次(P10)及传代15次(P15)中可确认到在高细胞密度的培养条件下，细胞的大小显著增加，并且细胞老化进一步得以促进。与此相同地，在所有传代(Passage)中呈现出了细胞的粒度也随着细胞的密度增加而显著增加的结果。
因此，可确认到在间充质干细胞的长期培养中，细胞的密度的调节可成为调节细胞老化的因素，可通过降低细胞培养密度，来改善在后期传代中呈现的形态学变化。
1.3根据培养细胞密度的间充质干细胞的老化确认
为了确认实施例1.1及1.2中确认的形态学变化实际上是否为间充质干细胞的年龄依赖性(age-dependent)现象，进行可选择性地染色老化细胞的利用β-半乳糖苷酶的染色分析法，并且通过逆转录-聚合酶链反应来比较了作为老化相关基因的传代15次(p15)、传代16次(p16)及作为增殖标记的增殖细胞核抗原基因的表达。并将其结果分别在图4及图5中示出。
如图4所示，确认了在传代5次(P5)及传代10次(P10)中，在所有细胞密度中均未能确认老化的细胞的染色，但在传代15次(P15)中，随着细胞密度增大，老化的细胞的染色明显增加。并且，如图5所示，在传代15次(P15)中，随着细胞的培养密度增大，作为老化相关基因的CDK抑制剂，传代15次(p15)及传代16次(p16)的基因表达增加，并且作为增殖标记的增殖细胞核抗原减少。
这种结果为表示间充质干细胞的形态学变化与间充质干细胞的老化存在关联的结果，并且为表示当进行传代培养时，细胞培养密度的调节可调节间充质干细胞的老化的结果。
1.4根据培养细胞密度的间充质干细胞的增殖能力变化的确认
众所周知，间充质干细胞的增殖能力随着传代、细胞的老化而逐渐减少。因此，增殖能力可用于确认间充质干细胞的老化的标准，并且进行行了长期细胞培养时的根据细胞培养密度的间充质干细胞的增殖能力比较。各个细胞的增殖能力通过初试接种细胞数与培养结束后取得的细胞的数量来计算各个传代的增殖率，并进行了确认，将其结果在表1及图6中示出。
表1
Figure BDA0003133767560000191
如表1中所示，确认了在以低密度培养的间充质干细胞的情况下，传代5次(P5)、传代10次(P10)、传代15次(P15)中倍增(fold increase)88.4、34.3、16.4，反之，以中等密度培养的间充质干细胞为8.5、4.9、3.1，以高密度培养的间充质干细胞为3.0、1.9、1.1。并且，如图6所示，确认了群体倍增时间与群体倍增水平也呈现出了类似于倍增的图案。这种结果为表示在长期的间充质干细胞培养中可通过降低细胞密度来使间充质干细胞的增殖能力保持的结果，并且表示即使进行相同的传代培养，也可使间充质干细胞的老化受到抑制，可使间充质干细胞的寿命延长。
1.5根据培养细胞密度的间充质干细胞的分化能力变化的确认
为了确认细胞培养密度是否影响干细胞功能，比较了根据传代5次(P5)至传代15次(P15)培养的分化能力。作为干细胞功能，确认了脂肪细胞分化能力及骨细胞分化能力，在各个传代及密度中进行了定性及定量分析。具体地，脂肪细胞分化培养液通过向高糖(High Glusose)达尔伯克改良伊格尔培养基培养液中添加新生小牛血清(NCS，NewbornCalf Serum，美国吉布科(Gibco)公司产品)、10-7mol的地塞米松(dexamethasone)(美国西格玛(Sigma)公司产品)、0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，美国西格玛(Sigma)公司产品)、10μg/ml的胰岛素(insulin，美国西格玛(Sigma)公司产品)、100μM的吲哚美辛(indomethacin，美国西格玛(Sigma)公司产品)来制备的培养基并进行了实验，7天分化之后，通过油红O组织学染色来进行了确认。并且，油红O组织学染色之后，利用异丙醇进行洗脱，并在500nm测定之后，通过定量分析来进行了确认。
骨细胞分化培养液使用了向α-伊格尔极限必需培养基培养液中添加有胎牛血清(FBS，美国吉布科(Gibco)公司产品)、50μg/ml的抗坏血酸-2-磷酸酯(ascorbic2-phosphate，美国西格玛(Sigma)公司产品)、10-8mol的地塞米松(美国西格玛(Sigma)公司产品)、10mM的β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate，美国西格玛(Sigma)公司产品)的培养基，21天分化之后，通过茜素红S组织学染色进行了确认。并且，茜素红S组织学染色之后，利用10％的乙酸进行了洗脱，并在405nm测定之后，通过定量分析来进行了确认。将通过如上所述的方法来确认脂肪细胞分化能力及骨细胞分化能力的结果在图7中示出。
如图7所示，确认了脂肪细胞分化能力随着传代整体上减少，但因密度导致的差异未明显呈现，反之，在骨细胞分化能力的情况下，确认了高密度条件的传代15次(P15)培养组中显著减少的现象。通过这种结果，确认了间充质干细胞的骨细胞分化能力在以低细胞密度培养的情况下，能够更好保持。
1.6根据培养细胞密度的间充质干细胞的抗原谱分析
进行了用于确认细胞培养密度是否还影响干细胞的抗原表达的实验，利用流式细胞荧光分选技术来确认根据各个传代及培养密度的阳性及阴性抗原表达的变化，并将其结果在表2中示出。
表2
Figure BDA0003133767560000211
如表2所示，确认了阴性标记表达的变化未明显地确认出，但一部分阳性标记的情况在传代中也根据细胞培养密度呈现出表达量的变化。
尤其，在传代15次(P15)中，以高密度培养细胞的情况下，大部分的阳性标记的表达量显著减少了，不仅如此，CD73、CD105呈现出阴性表达，因此确认到了保持细胞密度来进行细胞培养可成为非常重要的因素。
1.7根据培养细胞密度的活性氧生产及脱氧核糖核酸损伤的比较
据悉，间充质干细胞的功能的减少及脱氧核糖核酸损伤存在关联，尤其，由作为活性氧的活性氧诱导的脱氧核糖核酸损伤促进间充质干细胞的老化。因此，为了确认根据培养密度总活性氧生产及根据其的脱氧核糖核酸损伤是否不同，通过荧光强度分析来比较根据传代及细胞培养密度的总细胞性活性氧量，并通过彗星试验分析来确认脱氧核糖核酸损伤程度，将其结果在图8中示出。
如图8所示，确认了总活性氧生产在所有传代中随着细胞培养密度增加而增加的倾向，确认了尤其，在传代10次(P10)、传代15次(P15)中活性氧生产显著增加(A)。彗星试验分析中分类为从脱氧核糖核酸损伤最弱的CC1至损伤最严重的CC5来进行了数据分析，确认了在损伤最严重的的CC5的情况下，随着细胞培养密度增大而显著增加的情况。反之，CC1呈现出了随着细胞密度增大而显著降低的倾向(B)。
额外地，为了确认脱氧核糖核酸损伤是否为由活性氧诱发的，进行了用于确认因活性氧的脱氧核糖核酸损伤的8-羟基脱氧鸟苷的浓度的实验。8-羟基脱氧鸟苷分析方法如下。将从各个细胞取得的脱氧核糖核酸试样50μl放入8-羟基脱氧鸟苷共轭涂层板(8-OHdGconjugate coated plate)之后，在常温下培养了10分钟。之后，额外地放入抗-8-羟基脱氧鸟苷抗体(anti-8-OHdG antibody)来在常温下培养了1小时，清洗3次之后，将二级抗体酶偶联物(sec ondary antibody enzyme conjugate)放入各个孔板(well)之后，重新在常温下培养了1小时。接着，重新清洗3次之后，放入基质溶液(substrate solution)，在常温下培养了30分钟。最后，放入停止液(Stop solution)之后，在450nm下测定吸光度来进行了确认，将其结果在图9中示出。
如图9所示，确认了在脱氧核糖核酸损伤出现最严重的传代15次(P15)组中，随着细胞培养密度增大，8-羟基脱氧鸟苷的浓度显著增加。通过这种结果，因在高密度培养条件下所生产的活性氧而使脱氧核糖核酸损伤增加，由此促进了间充质干细胞的老化。
这种结果为表示将细胞培养密度调低可起到从因间充质干细胞的活性氧生产增加所导致的脱氧核糖核酸损伤保护间充质干细胞的作用的结果。
1.8根据抗氧化剂处理的间充质干细胞增殖及活性氧生产能力的确认
为了确认间充质干细胞的增殖是否受到因在高密度培养条件所生产的活性氧而带来的影响，进行了活性氧消除实验。在传代11次(P11)至传代15次(P15)中，高密度培养条件及在高密度培养条件下添加作为抗氧化剂的抗坏血酸25μg/ml至培养基中进行培养之后，比较两组之间的增殖率的增殖倍数(Fold)增加，将其结果在图10中示出。
如图10所示，确认了在高密度培养条件下，倍增在传代11次(P11)至传代15次(P15)中分别为2.6、1.9、1.6，随着传代数增加而增殖能力减少，并开始呈现老化，但经抗氧化剂处理的情况下，在所有传代中增殖能力保持50％左右的高水平。并且，在抗氧化剂处理组中，增值倍数(growth fold increase)在传代11次(P11)至传代15次(P15)中分别为3.8、2.9、2.5，直到传代15次(P15)增殖能力也保持高水平。
将确认了在作为端点(Endpoint)的传代15次(P15)中，高密度培养条件单独及高密度培养条件+抗氧化剂处理两组之间的活性氧水平结在图11中示出。
如图11所示，确认了通过处理作为抗氧化剂的抗坏血酸，增殖增加的条件下活性氧的水平也减少。因此，优选地，在低细胞密度下培养间充质干细胞，而不是高密度，当从高密度细胞培养诱导的活性氧生产利用抗氧化剂来进行消除的情况下，可使间充质干细胞的增殖能力增加。即，因高密度条件的活性氧而抑制间充质干细胞的增殖能力，随着细胞密度降低而活性氧减少，因此间充质干细胞增殖能力可得以促进。
综上所述，确认了为了保持通过层分离培养来获取的单克隆间充质干细胞的增殖、培养及干细胞功能，在培养条件中将细胞密度调节为1000细胞/cm2以下的密度为重要，在添加抗氧化剂来进行培养的情况下，抑制可从细胞培养诱发的氧化应激，从而可有效地促进间充质干细胞增殖。并且，若比较相同的低细胞密度条件培养，则当如传代15次(P15)的传代10次以上的干细胞与如传代5次的小于传代10次的干细胞比较时，确认到如细胞的形态学变化突出、干细胞的老化促进、分化能力减少的结果，因此，以1000细胞/cm2以下的密度且小于传代10次的低传代数进行培养最为有效。
实施例2：得以改善的层分离培养法的鉴定
通过上述实施例1，在以层分离培养法取得的间充质干细胞培养中，细胞密度的调节、传代调节及抗氧化剂的添加可成为重要的因素，因此，通过韩国专利申请10-2006-0075676号中所记载的层分离培养法的现有工序获取的单克隆间充质干细胞以不同的细胞培养密度且改变添加有作为抗氧化剂的抗坏血酸的培养基，由此来比较了通过进行传代培养来获取单菌落间充质干细胞的增殖能力及由此的细胞获取效果。
在之前韩国专利申请10-2006-0075676号的实施例1中，公开了通过如图1的层分离培养方法从骨髓分离出间充质干细胞及培养的方法，将经层分离步骤获取的作为单一性细胞组的多个菌落以每孔100至600的细胞数移入至培养容器。
并且，在韩国专利申请10-2014-0170045中公开了利用层分离培养法分离及来源于骨髓的间充质干细胞及培养的方法，还公开了将菌落以50细胞/cm2至100细胞/cm2涂抹。
但是，在韩国专利申请10-2006-0075676号及10-2014-0170045号仅公开对通过层分离培养法取得的单一性细胞组菌落进行计数来移动至6孔板后，为了制备用于以低浓度进行传代培养的种子细胞而扩张的结构，即，与传代1次相对应的菌落培养的条件，未公开并不是传代2次之后的菌落的对于个别细胞的反复培养细胞密度调节的结构及根据其的效果。根据在上述申请中记载的现有的层分离培养法，为了获取充足量的具有特应性皮炎的预防、治疗、改善效果的单克隆干细胞，需进行至少传代10次以上的培养。相反，在本发明的得以改善的层分离培养方法中，可通过传代2次之后的低细胞密度条件，最多传代8次以下的少的传代培养数有效获取大量的所目的的单克隆干细胞。
具体地，在本改善方法中，培养通过层分离培养方法获取的传代1次(P1)的菌落后，传代2次(P2)之后，在传代培养中，分注作为低密度的1000细胞/cm2以下的细胞，并将其与4000细胞/cm2细胞培养的效果进行了比较。并且，将细胞培养基以不同的两种包含由抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基及未包含抗氧化剂的LG-达尔伯克改良伊格尔培养基来比较了由此带来的细胞增殖效果。
将用于确认得以改善的层分离培养法的效果的实验组在表3中示出，将相对于现有的层分离培养法得以改善的层分离培养方法的工序改善部分在图12a及图12b示意性地示出。
如图12a所示，到获取传代1次的工序为止，将以往的层分离培养法和得以改善的层分离培养法以相同方式进行工序，但是，得以改善的层分离培养法与现有的层分离培养法的不同之处在于，将所扩张的传代1次细胞用作种子细胞来进行培养的步骤之后的传代培养工序。在现有的层分离培养法中，以4000细胞/cm2以上的高密度进行传代培养，在没有对于密度调节的认知下获取大量的细胞，在得以改善的层分离培养法中，将传代培养的密度调节成作为低密度的1000细胞/cm2以下，由此，仅可传代2次之后的最多传代8次以下的培养获取最终产物。将传代2次之后的培养工序在图12b中详细示出。
表3
Figure BDA0003133767560000251
上述表3的细胞系为由层分离培养方法分离的细胞系，分别以SCM01至SCM08命名。
2.1基于细胞系密度及培养基的增殖效果确认
利用上述SCM01至08细胞系来进行培养，分别利用细胞数、群体倍增时间、群体倍增水平来比较根据直至小于传代10次的传代5次的传代培养的细胞增殖效果，并在图13至图20示出。
如图13至图20中所确认，在以每cm21000个的细胞密度接种并进行培养的所有实验组中呈现出比以每cm24000个的细胞密度接种并培养的实验组更优秀的细胞增殖效果。并且，尽管为相同的1000个细胞密度组，但在包含有作为抗氧化剂的抗坏血酸的α-伊格尔极限必需培养基中所培养的1000α实验组中确认到了更为显著的细胞增殖效果。
2.2根据细胞系密度的增殖效果比较
为了进一步准确地比较根据培养细胞数的增殖率的比较，将培养基分别固定为LG达尔伯克改良伊格尔培养基或α-伊格尔极限必需培养基，并比较了根据每cm21000个或4000个的细胞接种密度的根据传代培养的细胞增殖效果，并将其结果在图21至图24中示出。
如图21所示，确认了当在LG达尔伯克改良伊格尔培养基中所培养的SCM01至SCM08细胞系均以每cm21000个细胞数接种并培养时，确认到传代2次(P2)至传代5次(P5)的增殖率显著高于每cm24000个的细胞数接种组，确认了与由传代5次(P5)中所确认的每cm24000个细胞接种相比，每cm21000个细胞接种组的增殖率为最小3.08倍至最大48.50倍。
并且，如图22所示，确认了在所有细胞系中，每cm21000个的细胞接种组的群体倍增时间值也低于或接近每cm24000个细胞系接种，在所有细胞系中，群体倍增水平值也与每cm24000个细胞接种相比高。
并且，如图23所示，确认了当在α-伊格尔极限必需培养基中所培养的SCM01至SCM08细胞系均以1000个细胞数接种并培养时，呈现出与达尔伯克改良伊格尔培养基实验组相同的倾向，与传代5次(P5)中所确认的每cm24000个细胞系接种相比，每cm21000个细胞接种组的增殖率为最小6.32倍至最大85.63倍。并且，如图24所示，确认了在所有细胞系中，每cm21000个细胞接种组的群体倍增时间值也低于或接近于每cm24000个细胞接种，在所有细胞系中，群体倍增水平值也与每cm24000个细胞接种相比高。
这种结果为表示与每cm24000个的高密度细胞接种培养相比，可通过每cm21000个以下的细胞接种来诱导单克隆间充质干细胞快速增殖的结果。
2.3根据培养基的增殖效果比较
在上文中，通过实施例2.2确认到了与4000细胞/cm2培养相比，1000细胞/cm2培养可呈现优秀的增殖效果，因此将细胞数固定为1000个，随着将培养基以变数进行改变来比较细胞增殖效果，从而额外地鉴定了根据培养基条件的增殖效果，并将其结果在图25及图26中示出。
如图25所示，将培养基改变为α-伊格尔极限必需培养基及达尔伯克改良伊格尔培养基来比较细胞增殖率的结果，与LG-达尔伯克改良伊格尔培养基相比，在利用α-伊格尔极限必需培养基的实验组中确认到了最小1.77倍至6.39倍的高细胞增殖率。并且，如图26所示，确认了群体倍增时间在所有α-伊格尔极限必需培养基实验组中较低，而群体倍增水平增加。
像这种实验结果表示，利用每cm21000个以下的细胞来调节细胞接种密度，除了以如传代2次(P2)至传代5次(P5)的低于传代10次的少的传代进行培养之外，在利用添加有抗氧化剂的培养基来培养的情况下，细胞增殖效率极大化。
实施例3：改善工序的建立
通过上述实施例确认到，就间充质干细胞培养而言，细胞密度的调节及抗氧化剂的添加成为重要的因素，除了韩国专利申请10-2006-0075676号及10-2014-0170045号中所记载的层分离培养法的现有工序之外，建立了当进行传代培养时，利用不同的细胞培养密度及培养基条件来在低于传代10次的少的传代中有效地获取单菌落的间充质干细胞的得以改善的工序，综上所述，在下列表4(利用达尔伯克改良伊格尔培养基的培养条件)及表5(利用α-伊格尔极限必需培养基的培养条件)中示出。
表4
Figure BDA0003133767560000271
Figure BDA0003133767560000281
表5
Figure BDA0003133767560000282
Figure BDA0003133767560000291
更具体地，如下进行了本发明的来源于骨髓的间充质干细胞的层分离培养工序及增殖培养。
利用局部麻醉剂麻醉骨髓提供人的臀部之后，向坐骨扎入注射针来提取了骨髓。100mm的培养容器中放入20％的胎牛血清、1％的包含青霉素/链霉素的14ml的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbecco`s modified Eagle`s Medium，美国吉布科(GIBCO-BRL)产品，美国生命技术公司(Life-technologies)，马里兰州(MD)，美国(USA))、1ml的人的骨髓，在37℃的温度条件下，5％的CO2细胞培养仪中培养了2小时。培养之后，将培养容器稍微向一侧倾斜，以尽量使附着于底部的细胞不脱落方式仅将培养容器的上层培养液最大限度的移入新的容器。
再重复一次相同的过程之后，将所取得的培养液移入底部涂敷有胶原蛋白(collagen)的培养容器(BectonDickinson)中之后，在37℃的温度条件下培养了2小时。将培养液重新移入新的涂敷有胶原蛋白的容器中，24小时之后再移入新的容器中，24小时之后再移入新的容器中。最终，48小时之后用肉眼确认到了移入新的容器之后残留的细胞附着于培养容器底部的情况。可推测出能够经过前部分的多个层分离步骤直至该步骤的细胞为细胞的比重显著小于其他细胞的小细胞。
当经过约10日至14日的时间时，多细胞形成单菌落(single colony)，将该单克隆细胞组用胰蛋白酶进行处理并分离之后，移入6-孔培养容器中。在37℃的温度条件下，5％的CO2细胞培养仪中培养了4日至5日之后，成长了约80％时，将多个细胞用0.05％的胰蛋白酶/1mM的乙二胺四乙酸(EDTA，美国吉布科(GIBCO-BRL)公司产品)进行处理之后，移入T175培养容器并以低细胞密度进行了传代培养。
像这样，当将小于传代10次，优选地，传代8次以下的传代2次(P2)至传代5次(P5)中的细胞密度降低为1000细胞/cm2水平来进行培养时，尽管其他工序也均以相同的方式进行了调节，但间充质干细胞的增殖能力及干细胞特性优秀地保持，从而在相同的传代中也有效地诱导增殖。尤其，当降低细胞密度来进行培养时，可省略现有工序中所需的在间充质干细胞中制备工作细胞库的过程，并且可有效地缩短细胞制备期间。尤其，减少传代，可取得大量的未完成老化的细胞，并且当将这种细胞用作治疗剂时，有待其治疗效果优秀。
并且，当利用添加有抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基来培养基时，由高密度的细胞培养所诱导的氧化应激因抗氧化剂处理而得以有效改善，并且可恢复间充质干细胞的细胞增殖能力，因此与现有的工序相比，显著缩短细胞的传代，可快速稳定地取得保持间充质干细胞的特性的且未进行老化的新鲜状态的单菌落间充质干细胞。
综上所述可知，低密度细胞培养可短时间内取得大量细胞，因此，可简化制备工序，不仅如此，在长期培养(long-term culture)当中也可取得完整保持着间充质干细胞的特性的且未进行老化的状态的细胞，因此可实现优质的干细胞生产。
由此，在以下用于治疗的特应性皮炎的实验中利用了通过上述实施例构建的改善方法获取的干细胞。
实施例4：通过得以改善的层分离培养法取得的干细胞的特应性皮炎治疗效果的确认
4.1试样及方法
进行了用于确认通过现有的利用为了获取干细胞而使用的泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)的密度梯度离心分离方法(gradient centrifugation method，GCM)取得的干细胞(以下，称为GCM-MSC)与通过得以改善的层分离培养法取得的单克隆干细胞(以下，称为SCM-cMSC)是否在特应性皮炎治疗效果示出差异的比较实验。
将用于实验的试样在下述表6中示出。来源于蛋清的白蛋白及氢氧化铝用于诱导特应性皮炎，将3M Tegaderm透明敷料(Tegaderm Film)用于敷料。
表6
Figure BDA0003133767560000311
Figure BDA0003133767560000321
为了制备特应性皮炎动物模型，从SLC公司(SLC,Inc)(静冈，日本)购入6周龄的无特定病原体的(SPF，specific pathogen-free)BALB/c小鼠(mice)(15g～20g)并使用。在适应1周后开始实验。为了诱发特应性皮炎，向6周龄的BALB/c小鼠每周一次腹腔内及皮下给药50μg的卵白蛋白(OVA)及40mg的明矾佐剂(Alum Adjuvant)，持续给药3周。给药诱导物后，将包含60μg的卵白蛋白的1.2cm×1.2cm贴剂附着在脱毛区域两次，持续附着2周，由此在BALB/c小鼠诱导特应性皮炎。致敏20日后，通过如下述表7的剂量通过尾静脉(caudalvein)向诱发特应性皮炎的上述小鼠给药细胞载体(Cell vehicle)、GCM-MSC、SCM-cMSC，上述给药以2日的间隔给药3次。使用未诱发特应性皮炎的5只小鼠作为正常对照组。
表7
Figure BDA0003133767560000322
给药后，确认了小鼠皮肤、腋淋巴结(axillary lymph node，aLN)及血液中的与特应性皮炎相关的标记的表达变化及相关指标，从而确认对于特应性皮炎的效果。
4.2根据SCM-cMSC给药的皮肤病变变化的确认
通过如上所述的方案向在实施例4.1中制备的特应性皮炎诱发动物模型给药SCM-cMSC、GCM-MSC，59日后，确认了皮肤病变的变化，将其结果在图27中示出。
如图27所示，确认到在通过得以改善的层分离培养法取得的SCM-cMSC给药组中有效改善特应性皮肤病变。
利用10％的福尔马林处理特应性皮炎模型的背部皮肤组织，在4℃的温度下固定24小时，将其切开并进行脱水处理来固定在石蜡。将厚度为4μm的切割面位于载玻片上，利用苏木精-伊红溶液对其染色8分钟，利用酒精清洗后，确认表皮和真皮的厚度变化及炎症性浸润。利用200倍率的CaseViewer 1.4software(3DHISTECH公司，布达佩斯(BU)，匈牙利(Hungary))确认了表皮和真皮的厚度。之后，通过与苏木精-伊红相同的方法处理皮肤组织后，进行甲苯胺蓝染色，在工作溶液(workingsolution)中染色2分钟～3分钟，并进行清洗及脱水。将如上所述的肉眼发现及组织染色的结果在表8、图28至图30中示出。
表8
Figure BDA0003133767560000331
如表8所示，经确认，与细胞载体相比，在SCM-cMSC处理组中，将诱发特应性皮炎而增加的表皮及真皮厚度的增加抑制了1.5倍为止，这种效果与GCM-MSC处理组相比，示出1.4倍、1.3倍的抑制效果，与GCM-MSC处理组相比，示出显著的改善效果。
并且，如图28至图30所示，通过分析皮肤病变部位的组织学的结果确认，SCM-cMSC处理组中特应性皮炎的严重程度明显降低。
4.3根据SCM-cMSC给药的免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1抑制效果及免疫球蛋白G2(IgG2)生产效果的确认
在4个实验组中，通过酶联免疫吸附试验测定、比较免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1的生产，由此确认了特应性皮炎治疗效果。为了分析免疫球蛋白E，以100μl/孔将稀释在涂敷缓冲液的捕获抗原涂敷在微孔板，将板密封并在4℃的温度下培养一夜。抽吸孔并利用清洗缓冲液清洗后，将板翻转，并去除清洗后残留的缓冲液。利用200μl/孔的检测稀释液(AssayDiluent)封闭板，在室温条件下培养1小时。清洗后，将各个实验组移动至适当的板。在室温条件下将所密封的板培养2小时，再次清洗后，通过添加100ul的工作检测器(WorkingDetector)(检测抗体(Detection Antibody)和Sav HRP试剂(Sav HRP reagent))并在室温条件下再培养1小时。向各个孔添加100μl的底物溶液后，将板在不密封的状态下，在暗的环境中室温培养培养30分钟，并添加50ul的终止溶液。在结束反应的30分钟以内，在450nm中确认了吸光度，在450nm的吸光度值中减去570nm的吸光度值。将确认根据免疫球蛋白E及免疫球蛋白G1生产的效果的结果在图31中示出。
如图31所示，通过给药SCM-cMSC来显著降低由特应性皮炎诱发的免疫球蛋白E及免疫球蛋白G1的生产。与GCM-MSC相比，这种减少效果也显著优秀。
另外，利用酶联免疫吸附试验方法确认了免疫球蛋白G2a生产变化，将其结果在图32中示出。
如图32所示，免疫球蛋白G2a的生产在SCM-cMSC中显著优于GCM-MSC处理组，经确认，与特应性皮炎模型组(载体(vehicle))相比，增加约3倍以上。
4.4
根据SCM-cMSC给药的腋窝淋巴结中的白细胞介素-4、γ-干扰素表达效果的确认
在特应性皮炎动物模型中，分离腋淋巴结，通过实时聚合酶链反应(PCR)确认了根据给药SCM-cMSC、GCM-MSC的腋淋巴结中的白细胞介素-4及γ-干扰素的表达变化。利用TRIzol试剂(TRIzol Reagent)(美国生命技术公司(Life technologies))从腋淋巴结获取总核糖核酸(RNA)，根据制造商的说明书利用primeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser(TAKARA公司)准备互补脱氧核糖核酸(cDNA)。利用SYBR Green定量聚合酶链反应预混液(SYBR Green Quantitative PCR Master Mix)(KAPA Biosystems公司)扩增互补脱氧核糖核酸产物，引物均从Qiagen公司购入并使用。在StepOnePlus RealTime PCR System(Applied Biosystems公司)中进行反应，对于共20ml，聚合酶链反应通过如下的条件进行：变性；在94.1℃的温度下，扩增5分钟；对于磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)循环25个周期，在94.1℃的温度下间为30秒钟，在58.1℃的温度下时间为30s秒钟，在72.1℃的温度下时间为30秒钟，延伸；在72℃的温度下10分钟。之后，将1μl的各个试样置于琼脂糖凝胶，利用溴化乙锭染色后，通过紫外线进行视觉化。相对于磷酸甘油醛脱氢酶，将各个靶基因的表达标准化，将其结果在图33中示出。用于实验的引物的信息如下。
-GAPDH Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay Cat#QT01658692
-IL-4Mm_Il4_va.1_SG QuantiTect Primer Assay Cat#QT02418311
-IFNγMm_Ifng_1_SG QuantiTect Primer Assay Cat#QT0103882115
如图33所示，通过GCM-MSC及SCM-cMSC的处理，在特应性皮炎模型的腋淋巴结中增加的白细胞介素-4减少，通过SCM-cMSC处理，确认了最为优秀的减少效果。并且，确认了通过SCM-cMSC处理，特应性皮炎模型中减少的γ-干扰素的水平显著增加。
4.5根据SCM-cMSC给药的肥大细胞数的测定
为了对肥大细胞进行计数，还利用姬姆萨染色(Giemsa)进行皮肤组织染色，利用100倍率的paint.NET对所浸润的肥大细胞的数进行计数。
如图34所示，与正常对照组相比，在特应性皮炎模型中，由于炎症的诱发，肥大细胞显著增加(平均86)，如上所述的增加，通过SCM-cMSC的给药，显著减少至平均49的水平。与GCM-MSC给药组几乎不示出肥大细胞减少活性相比，这是为仅在SCM-cMSC给药组中明确确认的效果。
实施例5：根据培养密度的特应性皮炎治疗效果的比较
5.1准备cMSC1、cMSC2
通过实施例4确认，经通过实施例2、实施例3得以改善的层分离培养法取得的cMSC在长期培养中以保持间充质干细胞的特性的未老化的细胞状态获取，与作为通过现有的密度梯度离心分离取得的干细胞的GCM-MSC相比，通过这种得以改善的层分离培养法取得的cMSC示出显著优秀的特应性皮炎治疗效果。由此还进行了如下的实验，即，与通过包括高密度培养步骤的现有的层分离培养法取得的cMSC相比，通过包括低密度培养步骤的得以改善的层分离培养法取得的cMSC是否在特应性皮炎治疗效果中呈现出差异。
根据实施例3的得以改善的层分离培养法，当进行传代培养时，将细胞培养密度设置为100细胞/cm2、1000细胞/cm2，利用包含抗氧化剂的α-伊格尔极限必需培养基取得单克隆间充质干细胞。添加庆大霉素作为抗生素，利用α-伊格尔极限必需培养基培养液进行(参照表5)。以下，将通过100细胞/cm2、1000细胞/cm2以下的低密度及抗氧化条件的得以改善的层分离培养法取得的干细胞命名为“cMSC1”。
并且，为了与通过得以改善的层分离培养法取得的干细胞进行比较，当进行传代培养时，将通过以4000细胞/cm2以上的密度及未添加有抗氧化剂的条件的培养方法进行培养的现有的层分离培养法取得的干细胞命名为“cMSC2”。
5.2实验材料及方法
用于特应性皮炎试验的动物为雌性6周龄的无特定病原体的BALB/c小鼠(15g～20g)，从SLC公司(静冈(Shizuoka)，日本(Japan))购入，在动物室内驯化1周后，进行实验。在仁荷大学医学院生命科学研究所中，在22℃～25℃的温度、40％～60％的湿度条件下，以12个小时昼夜交替，在150Lux～300Lux的照明条件下饲养，在每个小鼠用笼(cage)饲养5只，保持饲养环境来使得小鼠自由摄入杀菌蒸馏水和固体饲料，从而进行实验。混合50μg/50μl(磷酸盐缓冲液)的卵白蛋白(OVA，Ovalbumin)与4mg/100μl的明矾佐剂并向7周龄的雌性BALB/c小鼠给药，以每周1次的方式给药3周，共给药3次，通过腹腔给药、皮下给药诱导特应性皮炎的致敏。当3次均向相同部位给药时，可诱发与相应疾病无关的炎症，因此，分别向不同部位给药。在给药卵白蛋白3周后，将利用60μg/60μl(磷酸盐缓冲液)的卵白蛋白浸湿的1.2×1.2cm大小的无菌纱布附着在脱毛的背部皮肤，以每周2次～3次的频率共附着2周，由此在局部部位诱导特应性皮炎。通过卵白蛋白贴剂(patch)诱导特应性皮炎后，在传代2次之后的步骤中，将通过磷酸盐缓冲液、层分离培养方法取得的单克隆干细胞的细胞密度设置得不同来取得，如100细胞/cm2、1000细胞/cm2、4000细胞/cm2，以2日为间隔通过尾静脉共注入3次。注入量为每次3.3×105/200μl，3次，通过静脉给药共1.0×106/600μl。结束给药后的两日后，对病变部位再次进行脱毛，将利用60μg/60μl(磷酸盐缓冲液)的卵白蛋白浸湿1.2×1.2cm大小的无菌纱布附着在脱毛的背部皮肤，以每周3次～4次的频率共附着2周，由此在局部部位再次诱导特应性皮炎。在诱导特应性皮炎后的13日～14日的时间点，利用抑制剂(restrainer)修饰实验动物后，利用安装有26 1/2号针头(gauge needle)的BD公司制造的1ml的注射器(syringe)且通过尾静脉给药。在Veh.组的动物中，代替试验物质，通过相同的方法静脉内给药磷酸盐缓冲液，除Naive、Veh.组之外，将试验物质悬浮在磷酸盐缓冲液后，静脉给药。磷酸盐缓冲液及试验物质均以200μl/头的相同量给药。
通过如下的方式取得了用于确认对于特应性皮炎的效果的血液样品。在给药细胞稳定化剂或试验物质后的第13天，利用异氟烷(isoflurane)麻醉所有实验动物后切开腹部来露出后腔静脉后，利用1ml的注射器采集约700μl的血液。将所采集的血液装入血清分离管(Serum separate tube)，在3000rpm/15分钟、4℃的条件下，进行离心分离后分离血清(serum)，将所分离的血清放入1.5ml的e-管(e-tube)并保存在温度为-70℃的深冷柜(deepfreezer)中。
为了分析对于特应性皮炎的效果，利用酶联免疫吸附试验试剂盒(ELISA kit)测定所有实验动物的血清样品(serum sample)的总免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1、免疫球蛋白G2a的浓度，测定方法根据试剂盒内的说明书进行。具体地，首先，将通过后腔静脉采集的血液放入乙二胺四乙酸管(EDTA tube)，在3000rpm的条件下离心分离15分钟，仅分离上清液，在实验前为止，保存在-70℃的温度下并进行血液中的免疫球蛋白E水平(level)的测定。在4℃的温度下，将可识别免疫球蛋白E的捕获抗体(capture antibody)与涂敷缓冲液(coating buffer)一同在酶联免疫吸附试验板(ELISA plate)保存一夜(overnight)，第二天，经过1小时的阻断(blocking)过程后，将血清稀释100倍，并在室温条件下以50μl的量反应2小时。之后，放入识别免疫球蛋白E的二次抗体后，放入作为底物缓冲液(substratebuffer)的四甲基联苯胺溶液(TMB solution)并反应约15分钟左右后，放入50μl的终止液(stop solution)。当进行测定时，利用酶联免疫吸附试验读取器在450nm的滤波器中测定该值。
将在实验结束时摘除的皮肤组织固定在4％的福尔马林溶液后，制备组织切片，并进行苏木精-伊红(H&E，Hematoxylin&Eosin)染色及对浸润到真皮内的肥大细胞进行染色的甲苯胺蓝(toluidine blue)染色。在所染色的组织中，通过光学显微镜的200倍率下，测定真皮及表皮的厚度，在100倍率下，测定炎症细胞浸润及肥大细胞的敏化。皮肤厚度及肥大细胞测定利用PAINT.NET程序进行。
在从所要实验动物汇总采样的皮肤(skin)和腋淋巴结中，利用实时荧光定量聚合酶链反应预混液(qPCR master mix)测定白细胞介素-4、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-31(IL-31)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TGF-β)、γ-干扰素、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)等的表达量。测定方法根据实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)中的方案进行，具体地，为了进行实时聚合酶链反应(Real-time PCR)，从实验动物的皮肤组织中分离信使核糖核酸(mRNA)。向皮肤图组织添加1ml的trizol溶液并通过研钵研磨后分离来获取核糖核酸。为了将1μg的所分离的核糖核酸制备为互补脱氧核糖核酸，进行基因组脱氧核糖核酸消除反应(genomic DNAelimination reaction)后，添加反转录酶(reverse-transcription enzyme)来反应20分钟。在实时聚合酶链反应中，通过使用与其中的脱氧核糖核酸特异性结合的SYBR FAST实时荧光定量聚合酶链反应预混液(SYBR FAST qPCR master mix)来进行实验。试样为5μl的互补脱氧核糖核酸、10μl的实时荧光定量聚合酶链反应预混液(2X)、1μl的特定靶引物(specific target primer)、4μl的DW，均以成为20μl的体积的方式准备。聚合酶链反应以共45循环进行，将利用磷酸甘油醛脱氢酶修饰靶基因(target gene)的比例(ratio)数值化。
实验结果的所有测定值均以平均±标准误差计算，统计学分析利用Prism7.05(GraphPad Software公司(GraphPad Software Inc.)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚(CA)，美国(USA))并通过单因素方差分析(1Way ANOVA)、杜基多重比较测验(Tukey’smultiple comparison test)实施，在p值(p value)为*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001的情况下，判断为具有显著性。
5.3特应性皮炎动物模型体重及细胞存活率的确认
当将特应性皮炎诱发动物模型牺牲时(第59日(D-59))测定各个组的体重，通过自动细胞计数器和细胞分析仪(Automated cell counters and cell analyzers)(NC-250TM)方法确认通过给药cMSC1及cMSC2的总细胞数及细胞存活率，将其结果在图35及图36中示出。
如图35所示，诱发特应性皮炎的动物模型及给药cMSC1、cMSC2的组的各个个体的体重没有差异，如图36所示，在以2日的间隔通过尾静脉注入3次cMSC1(100cm2及1000cm2)及cMSC2(4000cm2)的组中，确认了平均细胞存活率为90％以上。
5.4免疫球蛋白E表达抑制效果的确认
在实施例4.3中确认，与GCM-MSC给药相比，SCM-cMSC的给药在特应性皮炎动物模型中的免疫球蛋白E抑制效果更优秀。由此进行了用于确认在通过层分离培养法取得的干细胞之间，在血清示出的免疫球蛋白E抑制效果是否因密度差异而不同的酶联免疫吸附试验分析。更具体地，在第59日牺牲在实施例5.2中制备的特应性皮炎动物模型，当牺牲时从通过后腔静脉采集的血液获取血清，并进行免疫球蛋白E酶联免疫吸附试验分析。将其结果在图37中示出。
如图37所示，与Vechicle处理组相比，cMSC1、cMSC2给药组均示出免疫球蛋白E抑制效果，但在经包括低密度培养步骤的得以改善的层分离培养法的cMSC1(100细胞/cm2，1000细胞/cm2)实验组中确认了与高密度培养cMSC2相比更为优秀的免疫球蛋白E抑制效果。这为表示在低密度中培养而取得的单克隆干细胞可更显著地降低免疫球蛋白E水平，由此对于特应性皮炎具有优秀的效果的结果。
5.4皮肤病变肉眼观察的确认
向在实施例5.2中制备的共7只特应性皮炎小鼠涂敷PBC单独(Vechicle)、cMSC1(100细胞/cm2、1000细胞/cm2)、cMSC2，在皮肤病变部位通过肉眼确认特应性皮炎症状的恢复程度。作为对于病变的肉眼观察，比较在诱发特应性皮炎的背部部位中的伤口、红斑、角质程度来确认，通过苏木精-伊红染色确认了皮肤表皮的厚度变化，将其结果在图38及图39中示出。
如图38所示，通过肉眼确认到，与cMSC2相比，在cMSC1(100细胞/cm2、1000细胞/cm2)组中确认皮肤病变改善效果，在涂敷更低密度的100细胞/cm2的组中确认更为优秀的病变改善效果。
如图39所示，经确认，与cMSC2相比，在cMSC1(100细胞/cm2、1000细胞/cm2)涂敷组中显著示出表皮增厚缓解效果。
综上所述，若利用通过得以改善的工序取得的cMSC1，与通过现有的密度梯度层分离培养法取得的单克隆干细胞相比，示出更为优秀的抗炎效果，因此，确认了示出得以改善的特应性皮炎改善效果。并且，在通过包括低密度培养步骤的得以改善的层分离培养方法取得的干细胞(cMSC1)的情况下，与通过包括高密度培养步骤的层分离培养法取得的干细胞(cMSC2)相比，确认可示出更为优秀的特应性皮炎改善效果。

Claims (14)

1.一种用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物，其特征在于，包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：
步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；
步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；
步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；
步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及
步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物，其特征在于，上述步骤5)的培养通过以1000细胞/cm2的细胞密度接种于培养基中来进行。
3.根据权利要求1所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物，其特征在于，上述步骤5)的培养通过以传代2次至传代8次来培养。
4.根据权利要求1所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物，其特征在于，上述步骤5)的培养基为添加有抗氧化剂的培养基。
5.根据权利要求1所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物，其特征在于，上述单克隆干细胞缓解诱发特应性皮炎的真皮或表皮的增厚。
6.根据权利要求1所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物，其特征在于，上述单克隆干细胞抑制选自由免疫球蛋白E、免疫球蛋白G1及白细胞介素-4组成的组中的一种以上的生成或促进干扰素-γ的生成。
7.根据权利要求1所述的用于预防或治疗特应性皮炎的药学组合物，其特征在于，上述单克隆干细胞抑制肥大细胞。
8.一种用于预防或改善特应性皮炎的化妆品组合物，其特征在于，包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：
步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；
步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；
步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；
步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及
步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
9.一种用于预防或改善特应性皮炎的准药品组合物，其特征在于，包含通过下述步骤获取的单克隆干细胞：
步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；
步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；
步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；
步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及
步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
10.一种用于预防、改善或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法，其特征在于，包括通过下述步骤获取单克隆干细胞的步骤：
步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；
步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；
步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；
步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及
步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
11.根据权利要求10所述的用于预防、改善或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法，其特征在于，上述步骤5)的培养通过以1000细胞/cm2的细胞密度接种于培养基中来进行。
12.根据权利要求10所述的用于预防、改善或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法，其特征在于，上述步骤5)的培养为传代2次至传代8次的培养。
13.根据权利要求10所述的用于预防、改善或治疗特应性皮炎的组合物的制备方法，其特征在于，上述步骤5)的培养基为添加有抗氧化剂的培养基。
14.一种用于预防、改善或治疗特应性皮炎的干细胞，其特征在于，通过下述步骤获取：
步骤1)，在第一容器培养从个体分离出的骨髓；
步骤2)，仅将上述第一容器的上清液移入新的容器来进行培养；
步骤3)，培养在上述新的容器中存在的细胞并获取上清液；
步骤4)，将上述步骤3)的上清液用作步骤2)的第一容器的上清液，将步骤2)及步骤3)重复一次以上来获取单克隆干细胞；以及
步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将上述步骤4)的单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。
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