JP2023179507A - 単一クローナル幹細胞を用いたアトピー皮膚炎の治療方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】単一クローナル幹細胞を投与してアトピー皮膚炎を予防または治療するための方法及び組成物、また、単一クローナル幹細胞投与に適したアトピー皮膚炎患者を選別し、これらの予後を予測するための組成物及び方法を提供する。【解決手段】ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上；またはこれらの発現を測定する製剤を含む、単一クローナル幹細胞投与に適したアトピー皮膚炎患者選別用組成物および、予後予測用組成物を提供する。【効果】本発明の改善された幹細胞の層分離培養及び増殖方法によれば、単一クローナル中間葉幹細胞の速い増殖を通して短時間で所望の単一クローナル中間葉幹細胞の大量収得が可能である。また、これを通して収得される単一クローナル中間葉幹細胞をアトピー皮膚炎を有する患者に定められた投与周期、用法、容量で投与して患者のアトピー症状を効果的に改善できる。【選択図】なし

Description

本発明は、単一クローナル幹細胞を投与してアトピー皮膚炎を予防または治療するための方法及び組成物に関する。また、本発明は、前記方法及び組成物を適用するために、単一クローナル幹細胞投与に適したアトピー皮膚炎患者を選別し、これらの予後を予測するための組成物及び方法に関する。
アトピー性湿疹とも知られているアトピー皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、ＡＤ）は、非常にありふれた炎症性皮膚疾患であり、急性アトピー皮膚炎の発病機序は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び好酸球の皮膚浸透、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）及びＴｈ２サイトカインの分泌増加を媒介とするＴｈ２炎症反応と関連するという報告がある。アトピー皮膚炎は、激しい掻痒症と皮膚乾燥症等の症状を伴い、アトピーは、血液内で高いＩｇＥ発現量を示し、好酸球の増加のような特徴を有する。近年、アトピー皮膚炎は、総人口の約１０～２０％で発病しているものと推算されているが、完治させることのできる明確な治療法がない実情であり、特に５歳以下の幼い年齢にほとんど診断され、このうち５０％は、６ヶ月から２４ヶ月の間に診断される。韓国小児アレルギー呼吸器学会で施行した全国疫学調査で近年１０年間アトピー皮膚炎の有病率が次第に増加しており、これに対する社会的関心が高まっている。アトピー皮膚炎患児の５０～７５％で喘息、鼻炎へ進行するアレルギー性疾患の経過を示すため、アレルギーへの進行の開始点であるアトピー皮膚炎を早期に診断して管理することが成人アレルギー進行の予防に非常に重要である。
アトピー皮膚炎は、Ｔリンパ球の活性化、サイトカイン体系の異常、細胞媒介性免疫の減少、ＩｇＥの増加のような免疫学的異常と生理学的要因、そして皮膚の生化学的欠陥のような多くの要素によって引き起こされる。このようなアトピー皮膚炎を治療するためには、乾燥した皮膚の保湿を始めとして代表的にステロイドのような薬物を用いた治療が必要である。アトピー皮膚炎の治療剤として、症状が軽い場合は、保湿剤局所ステロイド剤、抗ヒスタミン剤、抗生剤及び局所免疫反応調節剤等を使用する。重症のアトピー皮膚炎である場合は、全身ステロイド剤や免疫抑制剤を使用するようになるが、長期間使用する場合、副作用があり、薬の服用を中断すると病変の再発可能性が高いので、長期的に使用しても安全で効果的な治療法が要求される。
近年、多様な炎症性疾患の治療に幹細胞を利用しようとする試みが進行している。幹細胞は、我々の体の２１０個余りの全ての器官の組織に成長できる潜在的能力を有しており、無限に分裂でき、適切な操作を通して所望の臓器に分化できる。このような幹細胞の特性のため、幹細胞は新たな治療剤として脚光を浴びており、幹細胞を用いた難病の治療可能性は非常に高く、白血病、骨粗鬆症、肝炎、パーキンソン病、老人性認知症、やけど等、数多くの疾病治療が可能であるものと期待されている。
しかし、幹細胞の場合、それを大量で収得することが難しいという点で依然として多くの制約事項がある。幹細胞を収得する方法として、冷凍胚芽細胞から得る方法が効率的であるといえるが、倫理的な面で未だ多くの論争がある。このような問題点を解消するために、体細胞核移植方法や成体幹細胞を利用して幹細胞を収得する方法もまた多くの研究が進められている。胚芽幹細胞に関する研究より盛んに行われる分野は、成体幹細胞の研究である。成体幹細胞は、中枢神経系や骨髄等、各種の臓器に残って成長期の臓器発達と損傷時の再生に関与する細胞であって各種の臓器に存在するため、骨髄、脾臓、脂肪細胞等を含む様々な部位から得ることができるが、骨髄から得る方法が最もよく施行される。しかし、多くの様々な種類の骨髄細胞の中で中間葉幹細胞を分離、培養するにあたって常に均一な形態の細胞を得るには困難があり、このような問題点を補完するための研究が行われている。
本発明者は、新規な層分離培養法と命名された幹細胞の分離方法を発明しており、大韓民国特許出願ＫＲ１０－２００６－００７５６７６号を通して特許出願し、その登録を受けた。前記層分離培養法は、他の方法に比して少ないコストで遂行できるだけではなく、汚染の問題がなく、他の幹細胞が混ざる恐れなしにクローナル中間葉幹細胞（ｃＭＳＣ）を効果的に得ることができるという点において他の幹細胞収得方法に比して卓越した優秀性を有している。しかし、前記方法の優秀性にもかかわらず、層分離培養法は、中間葉幹細胞を大量生産して最終産物に使用するためには、ワーキングセルバンクを製造し、それを通して最終産物を収得する工程を経てはじめて十分な量の中間葉幹細胞を収得することができ、最小１０継代（Ｐａｓｓａｇｅ）以上の培養が必要であるという点で速い単一クローナル中間葉幹細胞の集団収得が難しい限界点があった。
また、幹細胞が実際に治療が必要な個体に投与されてアトピー皮膚炎の多様な臨床的な症状を効果的に改善できるかに関する研究は不足した実情であり、幹細胞の投与によって卓越した効果を期待できる患者群情報についての研究もまた全くない。従って、優れたアトピー皮膚炎の治療効果を奏することができる幹細胞を大量生産できる課題を解決すると同時に、それを利用してアトピー皮膚炎を治療できる新たな治療方法の確立が必要である。
本発明者らは、幹細胞を用いた効果的なアトピー皮膚炎の治療方法について研究していた中、本出願人の独創的な方法により収得された単一クローナル中間葉幹細胞を特定の細胞濃度、周期で適切な患者群に投与する場合、アトピー皮膚炎を効果的に治療できることを確認し、本発明を完成した。
従って、本発明の目的は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上；またはこれらの発現を測定する製剤を含む、単一クローナル幹細胞投与に適したアトピー皮膚炎患者選別用組成物または単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎患者の予後予測用組成物を提供することである。
また、本発明の目的は、１）アトピー皮膚炎患者の試料でＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上の発現を測定するステップ；を含む単一クローナル幹細胞投与法に適したアトピー皮膚炎患者選別方法、単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎治療予後予測に対する情報を提供する方法を提供することである。
また、本発明の目的は、特定患者群投与用途の単一クローナル幹細胞を含むアトピー皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
また、本発明の目的は、本発明の方法を通して収得された単一クローナル幹細胞を１回１×１０３～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｋｇの投与量で１～３週間隔で個体に投与するステップ；を含むアトピー皮膚炎の治療方法を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上；またはこれらの発現を測定する製剤を含む、単一クローナル幹細胞投与に適したアトピー皮膚炎患者選別用組成物を提供する。
また、本発明は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上；またはこれらの発現を測定する製剤を含む、単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎患者の予後予測用組成物を提供する。
また、本発明は、前記選別用組成物を含む単一クローナル幹細胞投与に適したアトピー皮膚炎患者選別用キットを提供する。
また、本発明は、前記予後予測用組成物を含む単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎患者の予後予測用キットを提供する。
また、本発明は、１）アトピー皮膚炎患者の試料でＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上の発現を測定するステップ；を含む単一クローナル幹細胞投与法に適したアトピー皮膚炎患者選別方法を提供する。
また、本発明は、１）アトピー皮膚炎患者の試料でＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上の発現を測定するステップ；を含む単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎治療予後予測に対する情報を提供する方法を提供する。
また、本発明は、単一クローナル幹細胞を含むアトピー皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物であり、前記薬学的組成物は、治療前患者のｉ）ＩＬ－１０が２０ｐｇ／ｍｌ以上及びＩＬ－１３が１００ｐｇ／ｍｌ以上である場合、ｉｉ）ＩＦＮｇ及びＩＬ－５が検出されない場合、またはｉｉｉ）ＩＬ－１７が検出される場合の投与用である、薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、１）個体から分離された骨髄を第１容器で培養するステップ；２）前記第１容器の上層液だけを新たな容器に移動して培養するステップ；３）前記新たな容器に存在する細胞を培養し、上層液を収得するステップ；４）前記３）ステップの上層液を２）ステップの第１容器の上層液として２）及び３）ステップを１回以上繰り返して単一クローナル幹細胞を得るステップ；５）前記４）ステップの単一クローナル幹細胞を５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種及び培養して単一クローナル幹細胞を収得するステップ；及び６）前記収得された単一クローナル幹細胞を１回１×１０３～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｋｇの投与量で１～３週間隔で個体に投与するステップ；を含むアトピー皮膚炎の治療方法を提供する。
本発明の改善された幹細胞の層分離培養及び増殖方法によれば、単一クローナル中間葉幹細胞の速い増殖を通して短時間で所望の単一クローナル中間葉幹細胞の大量収得が可能である。また、これを通して収得される単一クローナル中間葉幹細胞をアトピー皮膚炎を有する患者に定められた投与周期、用法、容量で投与して患者のアトピー症状を効果的に改善できるだけではなく、特に、本治療に適した患者群をマーカーによって確認し、選別投与することで、優れたアトピー皮膚炎の治療効果を達成できる。
骨髄から単一クローナル中間葉幹細胞を分離する従来の層分離培養法を示した図である。 細胞培養密度及び細胞継代培養による単一クローナル中間葉幹細胞の形態学的変化を顕微鏡観察を通して確認した結果を示した図である。 細胞培養密度及び細胞継代培養による単一クローナル中間葉幹細胞の細胞大きさ及び粒度（ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ）の変化をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；ＦＡＣＳ）分析を通して前方散乱（ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）（Ａ）及び側方散乱（ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）（Ｂ）光の平均値で確認した結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。 細胞培養密度及び細胞継代培養を異にした単一クローナル中間葉幹細胞をベータガラクトシダーゼ（ベータｇａｌ）の活性度を染色を通して細胞が老化したか否かを確認した結果を示した図である。 継代１５（Ｐａｓｓａｇｅ １５；Ｐ１５）の単一クローナル中間葉幹細胞を細胞培養密度を異にして培養した後、老化関連遺伝子であるｐ１５、ｐ１６及び増殖マーカーであるＰＣＮＡをＲＴ－ＰＣＲで確認した結果を示した図である。 細胞培養密度及び細胞継代培養による単一クローナル中間葉幹細胞の増殖能を細胞群倍加時間（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｔｉｍｅ；ＰＤＴ）及び細胞数増殖水準（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ；ＰＤＬ）を通して確認した結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。 細胞培養密度及び細胞継代培養による単一クローナル中間葉幹細胞の分化能力を確認した結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。図７のＡは、細胞培養及び細胞継代培養による単一クローナル中間葉幹細胞の脂肪細胞への分化能をＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織学的染色を通して確認した結果であり、図７のＢは、Ａの組織学的染色程度を定量化して示した図である。図７のＣは、細胞培養及び細胞継代培養による単一クローナル中間葉幹細胞の骨化細胞への分化能をＡｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ組織学的染色を通して確認した結果であり、図７のＤは、Ｃの組織学的染色程度を定量化して示した図である。 細胞培養密度及び細胞継代培養によって単一クローナル中間葉幹細胞で生産される総活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）生産（Ａ）及びこれによるＤＮＡ損傷をｃｏｍｅｔ ａｓｓａｙを通して確認（Ｂ）した結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。 細胞培養密度及び細胞継代培養によって生産される活性酸素種によるＤＮＡ損傷程度を確認するために８－オキソ－デオキシグアノシン（８－ｈｙｄｒｏｘｙ－２’－ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ；８－ＯＨｄＧ）の濃度を測定した結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。 継代１１（Ｐ１１）乃至１５（Ｐ１５）の単一クローナル中間葉幹細胞を高密度条件単独（ＨＤ）または高密度条件＋アスコルビン酸（抗酸化剤の一種）追加（ＨＤ＋ＡＡ）を通して培養した後、細胞増殖能の変化を確認した結果を示した図である。 継代１５（Ｐ１５）の単一クローナル中間葉幹細胞を高密度条件単独（ＨＤ）または高密度条件＋アスコルビン酸追加（ＨＤ＋ＡＡ）で培養した後、生産される活性酸素種水準を比較した結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。 従来の層分離培養法及び改善された層分離培養法の実験方法を比較して示した図である。 改善された層分離培養法の模式図であり、従来の層分離培養法と異なる継代２以後に該当する低密度培養を示した模式図である。 層分離培養法を通して収得されたＳＣＭ０１乃至ＳＣＭ０８単一クローナル中間葉幹細胞を１０００または４０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の密度で接種し、抗酸化剤添加の有無を異にしたＬＧ－ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ）、α－ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ α）培養培地を利用して培養した細胞の増殖率を確認した結果を示した図である。各図のＡは、各実験群の継代１（Ｐ１）乃至継代５（Ｐ５）による細胞数の変化を、各図のＢは、各実験群の細胞群倍加時間（ＰＤＴ）及び細胞数増殖水準（ＰＤＬ）の結果を示した図である。 抗酸化剤が添加されていないＬＧ－ＤＭＥＭ培地を利用し、１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞密度だけを異にした実験群での細胞増殖率を確認した結果を示した図である。 抗酸化剤が添加されていないＬＧ－ＤＭＥＭ培地を利用し、１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞密度だけを異にした実験群での細胞群倍加時間（ＰＤＴ）及び細胞数増殖水準（ＰＤＬ）を確認した結果を示した図である。 抗酸化剤が添加されたα－ＭＥＭ培地を利用し、１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞密度だけを異にした実験群での細胞増殖率を確認した結果を示した図である。 抗酸化剤が添加されたα－ＭＥＭ培地を利用し、１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞密度だけを異にした実験群でのＰＤＴ及びＰＤＬを確認した結果を示した図である。 細胞密度を１０００細胞／ｃｍ２の密度に固定し、培養培地をＬＧ－ＤＭＥＭまたはα－ＭＥＭに異にした実験群での細胞増殖率を確認した結果を示した図である。 細胞密度を１０００細胞／ｃｍ２の密度に固定し、培養培地をＬＧ－ＤＭＥＭまたはα－ＭＥＭに異にした実験群でのＰＤＴ及びＰＤＬを確認した結果を示した図である。 本発明に係るアトピー皮膚炎臨床プロトコルの模式図である。 患者Ａの臨床スコア測定結果を訪問回次別に確認した結果を示した図である（図２８Ａ ＥＡＳＩ、図２８Ｂ ＳＣＯＲＡＤ、図２８Ｃ ＢＳＡ結果）。 Ａ患者のＥＡＳＩ、ＳＣＯＲＡＤ、ＢＳＡ数値及びＩＧＡ、好酸球計数結果を示した図である。 患者Ｂの臨床スコア測定結果を訪問回次別に確認した結果を示した図である（図３０Ａ ＥＡＳＩ、図３０Ｂ ＳＣＯＲＡＤ、図３０Ｃ ＢＳＡ結果）。 Ｂ患者のＥＡＳＩ、ＳＣＯＲＡＤ、ＢＳＡ数値及びＩＧＡ、好酸球計数結果を示した図である。 Ｂ患者で掻痒症と睡眠障害尺度を示すＰｒｕｒｉｔｕｓ及びＳｌｅｅｐ数値を点数化して確認した結果を示した図である。 本発明の単一クローナル幹細胞投与によるＡ患者の血中アトピー関連因子の変化を確認した結果を示した図である。 本発明の幹細胞投与によるＢ患者の血中アトピー関連因子の変化を確認した結果を示した図である。 治療効果が非常に優れるように現れて本発明の治療方法適用が適したものと確認されたＡ及びＢ患者群と相対的に治療効果が低く現れた患者群のマーカー発現を比較した結果を示した図である。
本発明は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上；またはこれらの発現を測定する製剤を含む、単一クローナル幹細胞投与に適したアトピー皮膚炎患者選別用組成物に関する。
また、本発明は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上；またはこれらの発現を測定する製剤を含む、単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎患者の予後予測用組成物に関する。
また、本発明は、前記選別用組成物を含む単一クローナル幹細胞投与に適したアトピー皮膚炎患者選別用キット、または前記予後予測用組成物を含む単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎患者の予後予測用キットに関する。
また、本発明は、１）アトピー皮膚炎患者の試料でＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上の発現を測定するステップ；を含む単一クローナル幹細胞投与法に適したアトピー皮膚炎患者選別方法；及び１）アトピー皮膚炎患者の試料でＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上の発現を測定するステップ；を含む単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎治療予後予測に対する情報を提供する方法に関する。
本発明においては、アトピー皮膚炎患者に本発明に係る単一クローナル幹細胞を必要な用法、容量、周期、好ましくは、１回１×１０３～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｋｇの投与量で１～３週間隔で個体に投与、より好ましくは、例えば、単一クローナル幹細胞を１～５サイクル繰り返し投与しながら、０．５～７ｍ／分の速度で５～１５分間投与してアトピー皮膚炎患者の各種の臨床症状及び血清学的指標を確認し、その結果、アトピー皮膚炎患者でＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７の測定、検出を通して、本発明の単一クローナル幹細胞の投与時、優れた治療効果を奏することのできる適したアトピー皮膚炎患者を効果的に選別でき、これらから合理的に優れた予後を期待できることを確認した。
本発明において、前記発現を測定する製剤は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７のｍＲＮＡ発現水準またはタンパク質水準を測定する製剤であってよく、ｍＲＮＡ発現水準を測定する製剤は、遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するセンス及びアンチセンスプライマー、またはプローブであり、タンパク質水準を測定する製剤は、前記遺伝子が暗号化するタンパク質に特異的に結合する抗体であってよい。
本発明において、「アトピー皮膚炎」とは、胎熱を含むことができ、皮膚乾燥症及び掻痒症を主症状とする皮膚のアレルギー疾患を制限なく含むことができる。
本発明において、「本発明の単一クローナル幹細胞」は、幹細胞を速く汚染なしに収得できる層分離培養法の長所に加えて、単一クローナル幹細胞、好ましくは、単一クローナル中間葉幹細胞の速い増殖を通してＷＣＢ（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）製造ステップなしでも短時間で所望の単一クローナル幹細胞を大量収得できる改善された層分離培養方法を通して収得される幹細胞である。前記の方法を通して収得される単一クローナル幹細胞は、従来の層分離培養方法を通して収得される幹細胞と比較してアトピー皮膚炎の治療効果が増大された幹細胞であることを特徴とする。
具体的に、本発明において使用される単一クローナル幹細胞は、下記の方法で収得され得る：
１）個体から分離された骨髄を第１容器で培養するステップ；
２）前記第１容器の上層液だけを新たな容器に移動して培養するステップ；
３）前記新たな容器に存在する細胞を培養し、上層液を収得するステップ；
４）前記３）ステップの上層液を２）ステップの第１容器の上層液として２）及び３）ステップを１回以上繰り返して単一クローナル幹細胞を得るステップ；及び
５）前記４）ステップの単一クローナル幹細胞を５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種及び培養するステップ。
前記２）及び３）ステップの培養は、３０～４０℃で４時間以下、好ましくは１時間～３時間、より好ましくは１時間３０分～２時間３０分培養し、繰り返し培養は、３０～４０℃で４時間以下、好ましくは１時間～３時間、より好ましくは１時間３０分～２時間３０分培養後、３０～４０℃で１２～３６時間、好ましくは１８時間～３０時間培養を２～３回繰り返し、次いで３０～４０℃で２４～７２時間、３６時間～６０時間、好ましくは３６時間～６０時間で培養し、毎度上層液を新たな培養容器に移動させて遂行することができる。
本発明の実施例において分離した方法を簡単に要約すると、次のとおりである。
培養した細胞は、単一クローナル細胞群を形成するが、この単一クローナル細胞群を分離した後、継代培養を遂行することができ、本発明は、従来の層分離培養方法に加えて５）ステップの継代培養ステップを含むことを特徴とする。
本発明において、「層分離培養（Ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ、ＳＣＭ）」は、幹細胞を比重によって分離する方法を意味し、まず、ヒト骨髄を抽出して細胞培養液に培養した後、上層液だけを収得して、それをコーティング剤が処理されたか、または処理されていない培養容器に移して培養した後、同一の過程を数回繰り返す工程をいう。このような層分離培養は、遠心分離過程なしに上層液を繰り返して収得して培養する工程を繰り返すことを特徴とし、最終的に他の細胞の汚染なしに単一クローナル幹細胞、好ましくは単一クローナル中間葉幹細胞を収得できる長所がある。
本発明の前記１）乃至５）ステップのうち１）乃至４）ステップは、ＫＲ１０－２００６－００７５６７６号またはＫＲ１０－２０１４－０１７００４５号に記載の層分離培養方法と同一または同等に遂行され得、ＫＲ１０－２００６－００７５６７６号は、本発明に全体として参考になり得る。
また、従来のＫＲ１０－２０１４－０１７００４５号においては、アトピー皮膚炎の治療と関連して細胞を得る方法として、（ｉ）骨髄由来中間葉幹細胞を含むサンプルを第１容器に培養して上層液を収得するステップ；（ｉｉ）第１容器の上層液を第２容器に移すステップ；（ｉｉｉ）前記第２容器に存在する細胞を培養して上層液を収得するステップ；（ｉｖ）（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）ステップを３回以上繰り返すステップ；（ｖ）単一細胞由来コロニーを分離するステップ；及び（ｖｉ）前記コロニーから成長培地に細胞を移し、細胞を培養するステップ；を含む層分離培養法を通して収得したクローナル幹細胞を収得し、それを用いたアトピー性皮膚炎の予防または治療方法を開示しており、これは遠心分離なしに密度差だけで単一クローナル幹細胞を収得する方法であるという点でＫＲ１０－２００６－００７５６７６号の従来の層分離培養方法を利用する。
しかし、前記ＫＲ１０－２００６－００７５６７６号及びＫＲ１０－２０１４－０１７００４５号の層分離培養方法は、単一クローナル幹細胞を低い継代で効果的に収得し、これを通してアトピー皮膚炎の治療効果が顕著に改善された単一クローナル幹細胞を得るための方法を開示していない。
従来の層分離培養方法は、図１から確認されるように、単一コロニーから得られた全ての細胞を６ウェルに移動させて８０－９０％のコンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）で増殖させた後、増殖された状態の継代１（Ｐ１）細胞をｓｅｅｄ ｃｅｌｌとして密度調節に対する認識なしに多くの細胞を収得するために４０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）で高密度培養を遂行する。
これに対して、本発明は、継代２以後の培養で細胞密度を調節することでアトピー皮膚炎の予防、治療、改善効果に優れた幹細胞を効果的に収得できることを基にした「改善された層分離培養方法」に関し、従来の層分離培養方法とｓｅｅｄ ｃｅｌｌ以後の培養ステップを異にすることを特徴とする。例えば、具体的に「５）前記４）ステップの単一クローナル幹細胞を５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種して培養するステップ」を含む。改善された層分離培養方法は、従来の層分離培養方法に対比して速い単一クローナル幹細胞の増殖を誘導できるので、最終産物を速く収得でき、好ましくはＰ２乃至Ｐ８のような継代１０未満の培養だけでもＭＣＢ（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を製造し、優れたアトピー皮膚炎の予防または治療効果を奏する単一クローナル幹細胞を収得することができる。
本発明の単一クローナル幹細胞は、既存の工程のように４０００細胞／ｃｍ２の高密度で培養される場合、細胞増殖能が顕著に減少し、中間葉幹細胞のマーカーが変化し、幹細胞の分化能が喪失され得る。従って、改善された層分離培養法を通して収得された単一クローナル幹細胞は、低密度乃至中間程度の密度、４０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）未満の低い細胞密度、例えば、３０００細胞／ｃｍ２以下、好ましくは２０００細胞／ｃｍ２以下、より好ましくは５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培養されたことを意味し得る。
１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）以下の細胞密度で単一クローナル中間葉幹細胞を培養する場合、細胞の増殖能は、４０００細胞／ｃｍ２のように高密度で培養された中間葉幹細胞と比較して長期間の培養期間の終始顕著に高く維持されるので、多くの継代を繰り返さなくても所望の量の大量の単一クローナル細胞を速く収得できる長所がある。従って、本発明の改善された層分離培養方法は、ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ以後の継代培養ステップを継代１０未満、好ましくは継代８以下でのみ遂行することを特徴とすることができ、従来の層分離培養方法が十分な数の細胞を確保するために最大２５継代まで培養しなければならなかったのと比較して少ない継代培養だけでも単一クローナル幹細胞の大量生産が可能な長所がある。
また、前記細胞密度で単一クローナル中間葉幹細胞を培養する場合、該当細胞はＤＮＡ損傷が少なく、老化が抑制されて幹細胞の分化能を効果的に維持できる長所があり、速く迅速に優れた幹細胞特性を有する単一クローナル中間葉幹細胞を収得することができる。
また、本発明の方法によって収得される単一クローナル幹細胞は、４０００細胞／ｃｍ２のように高密度で培養された単一クローナル幹細胞と比較して優れたアトピー皮膚炎の予防、改善または治療効果を奏する。
本発明に使用される培地は、抗酸化剤を含まない培地、前記培地に抗酸化剤が加えられた培地または抗酸化剤を含む培地をいずれも含むことができる。
抗酸化剤を含まない培地としては、これに制限されるものではないが、ＤＭＥＭ培地を使用することができ、必要に応じて前記培地に抗酸化剤をさらに加えて培養を遂行することができる。また、必要に応じて抗酸化剤が含まれたα－ＭＥＭ培地を利用して培養を遂行することができる。
本発明の抗酸化剤は、細胞培養に使用され得る抗酸化剤を制限なく含むことができ、グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、システイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、システアミン（Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）、ユビキノール（Ｕｂｉｑｕｉｎｏｌ）、ベータ－メルカプトエタノール（ｂ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）及びアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ；ＡＡ）からなる群から選択された１種以上であってよい。抗酸化剤が培地に加えられる場合、前記抗酸化剤は、１０～５０、好ましくは１０～３０、さらに好ましくは２５μｇ／ｍｌの濃度で加えられ得る。
本発明の一例においては、抗酸化剤を含まない培地としてＤＭＥＭ、さらに好ましくはＬＧ－ＤＭＥＭ培地を使用し、抗酸化剤としてアスコルビン酸を含む培地としてα－ＭＥＭ培地を使用する。
一方、本発明の方法によれば、単一クローナル幹細胞を非常に効果的に増殖できるので、ＭＣＢを利用してＷＣＢ（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を製造する工程が省略され得る。これは、既存の層分離培養法がＭＣＢ製造後、ＷＣＢを製造する工程を伴わなければならないのと比較して工程を単純化したものである。
本発明の培養培地として抗酸化剤を含む培地を利用する場合、前記培養培地には、抗生剤としてゲンタマイシンが加えられ得る。
本発明の方法を通して収得された中間葉幹細胞は、最終的に好ましくはＰ２乃至Ｐ１０未満の中間葉幹細胞であってよく、さらに好ましくはＰ２乃至Ｐ８の中間葉幹細胞、さらにより好ましくはＰ２乃至Ｐ６の中間葉幹細胞であってよい。
これは、最小Ｐ１０乃至Ｐ１２の中間葉幹細胞が最終産物として収得される既存の工程に対比してさらに低い継代で収得される幹細胞であり、細胞接種密度調節を通して低い継代で速く増殖された中間葉幹細胞を容易に大量収得できることを示す。
本発明において、前記のような改善された層分離培養法、好ましくは２０００細胞／ｃｍ２以下、さらに好ましくは１０００細胞／ｃｍ２以下の低密度及び抗酸化条件の改善された層分離培養法の方法で収得された単一クローナル幹細胞と比較して、細胞大きさがさらに小さく均質に形成され得、アトピー皮膚炎が誘発された皮膚真皮または表皮の肥厚を緩和させ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１及びＩＬ－４からなる群から選択された１種以上の生成を抑制し、ＩＮＦ－γの生成を促進し、肥満細胞を抑制する効果に優れている。
本発明において、本発明の単一クローナル幹細胞投与に適したアトピー皮膚炎患者選別または単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎患者の予後予測は、下記のように遂行され得る。
まず、アトピー皮膚炎患者の試料でＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上の発現を測定または検出し、前記患者のｉ）ＩＬ－１０が２０ｐｇ／ｍｌ以上及びＩＬ－１３が１００ｐｇ／ｍｌ以上である場合、ｉｉ）ＩＦＮｇ及びＩＬ－５が検出されない場合、および／またはｉｉｉ）ＩＬ－１７が検出される場合、単一クローナル幹細胞投与法に適した患者と選別するか、この患者が単一クローナル幹細胞の投与を受けたとき、優れたアトピー皮膚炎の治療予後が現れるものと情報を提供することができる。
本発明において、前記ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上の発現を測定または検出する方法は、当分野に通常利用される方法を制限なく利用できるが、好ましくはＥＬＩＳＡであってよい。
本発明において、単一クローナル幹細胞投与法に適した患者でＩＬ－１０の発現は２０ｐｇ／ｍｌ以上、好ましくは２０ｐｇ／ｍｌ～５００ｐｇ／ｍｌであってよく、ＩＬ－１３の発現は１００ｐｇ／ｍｌ以上、好ましくは１００ｐｇ／ｍｌ～４０００ｐｇ／ｍｌであってよい。
本発明において、試料は、アトピー皮膚炎患者の血液、血清、血漿、リンパ液、脳脊髄液、腹水、尿及び組織生検からなる群から選択され得る。
前記のような方法を通して単一クローナル幹細胞投与法に適した患者と選別されるか、治療予後に優れるものと確認される場合、本発明の単一クローナル幹細胞を投与してアトピー皮膚炎を治療でき、例えば、１回１×１０３～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｋｇの投与量で１～３週間隔で投与、好ましくは前記投与を２～５回を１サイクルとして投与し、患者の状態によって、２～５サイクル繰り返し投与できる。また、前記投与は、好ましくは静脈投与で遂行され得、静脈投与で治療する場合、０．５～７ｍ／分の速度で５～１５分間投与することが好ましくあり得る。
本発明の最も好ましい一具現例においては、２週間の間隔で計３回投与することを１サイクルとしており、患者の状態、好転度によってこれを２～５サイクル繰り返し投与できる。
これによって、本発明は、アトピー皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物を提供することができ、特に、前記組成物は、単一クローナル幹細胞治療法に適していると選別された患者の治療に使用する用途であってよい。
従って、本発明は、単一クローナル幹細胞を含むアトピー皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物であり、前記薬学的組成物は、治療前患者のｉ）ＩＬ－１０が２０ｐｇ／ｍｌ以上及びＩＬ－１３が１００ｐｇ／ｍｌ以上である場合、ｉｉ）ＩＦＮｇ及びＩＬ－５が検出されない場合、またはｉｉｉ）ＩＬ－１７が検出される場合の投与用である、薬学的組成物を提供する。
本発明の薬学的組成物に含まれる単一クローナル幹細胞は、特に１）個体から分離された骨髄を第１容器で培養するステップ；２）前記第１容器の上層液だけを新たな容器に移動して培養するステップ；３）前記新たな容器に存在する細胞を培養し、上層液を収得するステップ；４）前記３）ステップの上層液を２）ステップの第１容器の上層液として２）及び３）ステップを１回以上繰り返して単一クローナル幹細胞を得るステップ；及び５）前記４）ステップの単一クローナル幹細胞を５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種及び培養して単一クローナル幹細胞を収得するステップ；により収得された単一クローナル幹細胞であることが好ましい。
また、本発明は、１）個体から分離された骨髄を第１容器で培養するステップ；２）前記第１容器の上層液だけを新たな容器に移動して培養するステップ；３）前記新たな容器に存在する細胞を培養し、上層液を収得するステップ；４）前記３）ステップの上層液を２）ステップの第１容器の上層液として２）及び３）ステップを１回以上繰り返して単一クローナル幹細胞を得るステップ；５）前記４）ステップの単一クローナル幹細胞を５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種及び培養して単一クローナル幹細胞を収得するステップ；及び６）前記収得された単一クローナル幹細胞を１回１×１０３～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｋｇの投与量で１～３週間隔で個体に投与するステップ；を含むアトピー皮膚炎の治療方法を提供する。
本発明に係るアトピー皮膚炎の予防または治療方法及び組成物において、前記単一クローナル幹細胞は、例えば、骨髄由来中間葉幹細胞であってよい。
前記幹細胞をアトピー皮膚炎の予防または治療、改善の目的で利用する場合、幹細胞は、新鮮型または凍結型の形態で制限なく使用され得、新鮮型の場合、投与周期をより長く、凍結型の場合、新鮮型より投与周期をより短縮して投与できる。
本発明に係る単一クローナル中間葉幹細胞を個体に投与する場合、１回当たり１×１０３～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｋｇで投与でき、例えば、１～３週間隔で計２～５回個体に投与できる。また、最も好ましくは、１回当たり１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇで患者に２週間隔で計３回投与することを１サイクルとして投与でき、患者の状態によって前記サイクルを１～５サイクル繰り返すことができる。
また、本発明は、本発明に係る投与用法、容量、周期に合わせた効果的な投薬のための目的でアトピー皮膚炎の予防または治療用キットを提供する。
前記キットは、適切な用法、容量の使用のために、幹細胞を１×１０３～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｋｇの濃度で含む１区画を基本構成として、これを１～１０区画含むキットであってよく、その形態は制限されない。例えば、３回の投与を目的とする場合、前記キットは、３個の区画を含むことができ、１０回の投与を目的とする場合、１０個の区画を含むことができる。
本発明の単一クローナル幹細胞は、幹細胞治療のための多様な経路を通して個体に投与され得る。好ましくは静脈内投与され得、静脈に投与される場合、患者の体重、健康状態、疾病の状態によってその速度を適宜調整できるが、例えば、０．５～１０ｍ／分、０．５～７ｍ／分の速度で５～１５分間投与され得る。
本発明の治療方法、組成物及びキットにおいて、前記幹細胞は、特に、１）個体から分離された骨髄を第１容器で培養するステップ；２）前記第１容器の上層液だけを新たな容器に移動して培養するステップ；３）前記新たな容器に存在する細胞を培養し、上層液を収得するステップ；４）前記３）ステップの上層液を２）ステップの第１容器の上層液として２）及び３）ステップを１回以上繰り返して単一クローナル幹細胞を得るステップ；及び５）前記４）ステップの単一クローナル幹細胞を５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種及び培養して単一クローナル幹細胞を収得するステップ；により収得された単一クローナル幹細胞であることが好ましい。
前記幹細胞は、また、５）ステップの培地が抗酸化剤が加えられた培地で培養して収得された単一クローナル幹細胞であってよく、前記５）ステップの培養が継代２乃至継代８で培養することである方法で収得された単一クローナル幹細胞であってよい。
本発明の治療方法に適したアトピー皮膚炎個体は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上；またはこれらの発現を測定して選別でき、これらを利用して予後を予測できる。
従って、本発明のアトピー皮膚炎の予防または治療用組成物の投与を受ける個体または本発明のアトピー皮膚炎の治療方法を遂行する個体は、治療前ＩＬ－１０を２０ｐｇ／ｍｌ以上、ＩＬ－１３を１００ｐｇ／ｍｌ以上発現することを特徴とするか、治療前ＩＦＮｇ、ＩＬ－５を発現せず、ＩＬ－１７を発現することを特徴とする個体であることが好ましい。
本発明において、前記「個体」は、アトピー皮膚炎の予防または治療が必要な個体を含み、哺乳類またはヒトを除く哺乳類であってよい。
本発明の単一クローナル幹細胞を個体に投与する場合、当分野に公知になったアトピー皮膚炎の予防または治療薬物と併用して投与でき、許可または人体に無害なものと確認された当分野の公知になった幹細胞治療剤賦形剤と共に剤形化された形態で投与され得る。
本発明の単一クローナル幹細胞は、アトピー皮膚炎が誘発された皮膚で現れる経皮、真皮の肥厚及び角質症状を効果的に緩和でき、特に真皮または表皮の肥厚を緩和させることを特徴とすることができる。
また、本発明の単一クローナル幹細胞は、アトピー皮膚炎で誘発される各種の免疫、炎症因子を改善でき、好ましくはＩｇＥ、ＩＬ－１８、ＩＬ－１３を減少させ、乾性病変で増加するマーカーと知られたＩＬ－１７も効果的に減少させることができる。また、Ｔｈ２ケモカインでアレルギー疾患診断及び中等度を反映する生体指標であるＣＣＬ１７及びＣＣＬ２２の血中濃度及び表皮の過増殖を起こすＩＬ－２２を減少させることができる。
本発明の方法を通して得られる単一クローナル幹細胞は、従来の密度勾配遠心分離方法により収得される幹細胞（ＧＣＭ－ＭＳＣ）だけではなく、従来の層分離培養法により収得されるクローナル幹細胞と比較してもアトピー性皮膚炎と関連した組織学的、生理学的因子の改善効果に優れていることを特徴とすることができる。
また、本発明の単一クローナル幹細胞を用いたアトピー皮膚炎の予防または治療方法及び組成物は、アトピー皮膚炎の臨床的重症度を評価するＥＡＳＩ、ＳＣＯＲＡＤ、ＢＳＡ数値及びＩＧＡ、好酸球数値を効果的に改善でき、アトピー皮膚炎患者に伴われる睡眠障害及び掻痒症を改善する効果がある。
本発明の薬学的組成物は、投与のために前記有効成分以外にさらに薬学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造できる。本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイル等を含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤等をさらに含むことができる。
本発明の薬学的組成物の投与量は、前記薬学的組成物の製剤化方法、投与方式、投与時間および／または投与経路等により多様になり得、前記薬学的組成物の投与で達成しようとする反応の種類と程度、投与対象になる個体の種類、年齢、体重、一般的な健康状態、疾病の症状や程度、性別、食餌、排泄、該当個体に同時または移植に共に使用される薬物その他の組成物の成分等を始めとする様々な因子及び医薬分野においてよく知られた類似因子によって多様になり得、当該技術の分野における通常の知識を有する者は、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定し、処方できる。
本発明の薬学的組成物の投与経路及び投与方式は、それぞれ独立的であってよく、その方式において特に制限されず、目的とする該当部位に前記薬学的組成物が達することができる限り、任意の投与経路及び投与方式によることができる。
前記薬学的組成物は、経口投与または非経口投与方式で投与できる。前記非経口投与方式としては、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与または皮下投与等が含まれ、前記薬学的組成物を疾患部位に塗布するか噴霧、吸入する方法もまた利用できるが、最も好ましくは、静脈投与で投与する。
本発明の治療方法及び製造方法において、前記において組成物で記述された内容が同一に適用され得、重複する内容は、明細書の記載の複雑性を避けるために省略する。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されることはない。
＜実施例１＞改善された層分離培養法の確立
アトピー皮膚炎に優れた効果を奏する単一クローナル中間葉幹細胞を製造するために、改善された中間葉幹細胞層分離培養法及び増殖方法を利用した。改善された中間葉幹細胞層分離培養法及び増殖方法は、大韓民国特許出願１０－２００６－００７５６７６号に記載の層分離培養法の培養条件のうち細胞密度及び培養培地を変更したことを特徴とする。以下、実験においては、層分離培養法を通して収得された単一クローナル中間葉幹細胞（ｃＭＳＣ）の細胞培養密度をそれぞれ５０細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）（低密度）、１０００細胞／ｃｍ２（中間密度）、４，０００細胞／ｃｍ２（高密度）に異にして、それによる細胞の特性を分析した。
１．１ 細胞密度による中間葉幹細胞の形態学的変化の確認
まず、長期間培養で細胞密度による中間葉幹細胞の形態学的変化を確認するための実験を遂行した。長期間培養条件を与えるために、継代５（Ｐ５）、継代１０（Ｐ１０）、継代１５（Ｐ１５）の中間葉幹細胞を利用し、それぞれ低密度、中間密度、高密度の条件でＬＧ－ＤＭＥＭ培地に接種した。この後、細胞の形態学的変化を顕微鏡を通して観察して幹細胞が老化したか否かを判断し、その結果を図２に示した。
図２に示したように、継代５（Ｐ５）及び継代１０（Ｐ１０）では、細胞密度によって細胞大きさと形態学的パターンで差を示し、特にＰ１５の場合、高密度培養条件で平らで大きくなった形態の中間葉幹細胞が観察された。このような形態は、典型的な中間葉幹細胞の老化を示すものであり、長期間培養で細胞の密度調節が中間葉幹細胞の老化を調節できることを確認した。
１．２ 細胞密度によるＭＳＣ細胞大きさ及び粒度の確認
細胞密度による幹細胞の変化をさらに確認するために、老化した細胞で増加すると知られている細胞大きさ及び細胞の粒度（ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ）をフローサイトメトリーを通して定量分析し、その結果を図３に示した。
図３に示したように、細胞の大きさは、Ｐ５では有意的な差を示さなかったが、Ｐ１０及びＰ１５である場合、細胞密度によって有意的な差を示すことを確認した。特に、Ｐ１０及びＰ１５では、高い細胞密度の培養条件で細胞の大きさが有意的に増加し、細胞老化がさらに促進されることを確認することができた。これと同様に、細胞の粒度もまた全ての継代（Ｐａｓｓａｇｅ）で細胞の密度が高くなるほど有意的に増加する結果を示した。
従って、中間葉幹細胞の長期間培養において、細胞の密度調節が細胞老化を調節する因子になり得ることを確認し、細胞培養密度を下げることで後期継代で現れる形態学的変化を改善できることを確認した。
１．３ 培養細胞密度による中間葉幹細胞の老化の確認
実施例１．１及び１．２で確認された形態学的変化が実際に中間葉幹細胞の老化依存的（ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）な現象であるかを確認するために、老化細胞を選択的に染色できるベータガラクトシダーゼを用いた染色分析法を遂行し、老化関連遺伝子であるｐ１５、ｐ１６及び増殖マーカーであるＰＣＮＡ遺伝子の発現をＲＴ－ＰＣＲを通して比較した。その結果をそれぞれ図４及び図５に示した。
図４に示したように、継代５（Ｐ５）及び継代１０（Ｐ１０）では、全ての細胞密度で老化した細胞の染色を確認することができなかったが、継代１５（Ｐ１５）では、細胞密度が高くなるほど老化した細胞の染色が明確に増加することを確認した。また、図５に示したように、継代１５（Ｐ１５）では、細胞の培養密度が増加するほど老化関連遺伝子であるＣＤＫ抑制剤ｐ１５及びｐ１６の遺伝子発現が増加し、増殖マーカーであるＰＣＮＡは減少した。
このような結果は、中間葉幹細胞の形態学的変化が中間葉幹細胞の老化と関連のあることを示す結果であり、継代培養時、細胞培養密度の調節が中間葉幹細胞の老化を調節できることを示す結果である。
１．４ 培養細胞密度による中間葉幹細胞の増殖能変化の確認
中間葉幹細胞の増殖能力は、継代が進み、細胞の老化が進むにつれて漸次に減少すると知られている。従って、増殖能は、中間葉幹細胞の老化を確認できる基準に使用され得、長期間の細胞培養時、細胞培養密度による中間葉幹細胞の増殖能の比較を遂行した。各細胞の増殖能は、初期接種細胞数と培養が終了した後に得られる細胞の数を通して各継代による増殖率を計算して確認し、その結果を表１及び図６に示した。
表１に示したように、低密度で培養された中間葉幹細胞（ＭＳＣ）の場合、継代５（Ｐ５）、継代１０（Ｐ１０）、継代１５（Ｐ１５）で増加倍数（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）が８８．４、３４．３、１６．４であるのに対し、中間密度で培養された中間葉幹細胞は、８．５、４．９、３．１、高密度で培養された中間葉幹細胞は、３．０、１．９、１．１であることを確認した。また、図６に示したように、細胞群倍加時間（ＰＤＴ）及び細胞数増殖水準（ＰＤＬ）も増加倍数のようなパターンで現れることを確認した。このような結果は、長期間の中間葉幹細胞培養で細胞密度を下げることで中間葉幹細胞の増殖能を維持させることができることを示す結果であり、同じ継代培養を遂行しても、中間葉幹細胞の老化を抑制させ、寿命を延ばすことができることを示す。
１．５ 培養細胞密度による中間葉幹細胞（ＭＳＣ）の分化能変化の確認
細胞培養密度が幹細胞能に影響を与えるかを確認するために、Ｐ５乃至Ｐ１５培養による分化能を比較した。幹細胞能で脂肪細胞分化能及び骨細胞分化能を確認し、それぞれの継代及び密度で定性、定量分析を遂行した。具体的に、脂肪細胞分化培養液は、Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｓｏｓｅ ＤＭＥＭ培養液にＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、１０－７ｍｏｌデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）、１００μＭインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）を添加した培地を作って実験し、７日分化後にＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織化学染色を通して確認した。また、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織化学染色後、イソプロピルアルコールで溶出させ、５００ｎｍで測定後、定量分析して確認した。
骨細胞分化培養液は、α－ＭＥＭ培養液にＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、５０μｇ／ｍｌ ａｓｃｏｒｂｉｃ ２ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｓｉｇｍａ）、１０－８ｍｏｌデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭベータグリセロホスフェート（β－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｓｉｇｍａ）を添加した培地を使用し、２１日分化後にＡｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ組織化学染色を通して確認した。また、Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ組織化学染色後、１０％酢酸で溶出させ、４０５ｎｍで測定し、定量分析して確認した。前記のような方法で脂肪細胞分化能及び骨細胞分化能を確認した結果を図７に示した。
図７に示したように、脂肪細胞分化能は、継代が進むにつれて全体的に減少したが、密度による差が明確に現れていないのに対し、骨細胞分化能の場合、高密度条件の継代１５（Ｐ１５）培養群で有意に減少することを確認した。このような結果を通して、中間葉幹細胞の骨細胞分化能は、低い細胞密度で培養する場合、さらによく維持され得ることを確認した。
１．６ 培養細胞密度による中間葉幹細胞の抗原プロファイルの分析
細胞培養密度が幹細胞の抗原発現にも影響を及ぼすか否かを確認するための実験を遂行し、各継代及び培養密度による陽性及び陰性抗原発現の変化をフローサイトメトリーで確認し、その結果を表２に示した。
表２に示したように、陰性マーカー発現の変化は明確に確認されなかったが、一部の陽性マーカーの場合、同じ継代でも細胞培養密度によって発現量の変化が現れることを確認した。
特に、継代１５（Ｐ１５）では、高い密度で細胞を培養する場合、ほとんどの陽性マーカーの発現量が顕著に減少しただけではなく、ＣＤ７３、ＣＤ１０５は陰性発現を示し、細胞密度を低く維持して細胞培養を遂行することが非常に重要な因子になり得ることを確認した。
１．７ 培養細胞密度による活性酸素種（ＲＯＳ）生産及びＤＮＡ損傷の比較
中間葉幹細胞の機能の減少とＤＮＡ損傷は関連があると知られており、特に、活性酸素種であるＲＯＳにより誘導されるＤＮＡ損傷は、中間葉幹細胞（ＭＳＣ）の老化を促進すると知られている。従って、培養密度によって総活性酸素種（ＲＯＳ）生産及びこれによるＤＮＡ損傷が異なるように現れるか否かを確認するために、継代及び細胞培養密度による総細胞性活性酸素種（ＲＯＳ）量を蛍光強度分析を通して比較し、ｃｏｍｅｔ分析を通してＤＮＡ損傷程度を確認し、その結果を図８に示した。
図８に示したように、総ＲＯＳ生産は、全ての継代で細胞培養密度が増加するほど増加する傾向を確認し、特に、継代１０（Ｐ１０）と継代１５（Ｐ１５）では、有意的にＲＯＳ生産が増加することを確認した（Ａ）。ｃｏｍｅｔ分析では、ＤＮＡ損傷が最も弱いＣＣ１から損傷が最も激しいＣＣ５に分類してデータを分析し、損傷が最も激しいＣＣ５の場合、細胞培養密度が高くなるほど有意的に増加することを確認した。これに対し、ＣＣ１は、細胞密度が高くなるほど有意的に低くなる傾向を示した（Ｂ）。
さらに、ＤＮＡ損傷がＲＯＳにより誘発されたかを確認するために、ＲＯＳによるＤＮＡ損傷を確認する８－ＯＨｄＧの濃度を確認する実験を遂行した。８－ＯＨｄＧ分析方法は、次のとおりである。それぞれの細胞から得たＤＮＡ試料５０μｌを８－ＯＨｄＧが結合されたプレート（８－ＯＨｄＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）に入れた後、常温で１０分間培養した。その後、抗－８－ＯＨｄＧ抗体（ａｎｔｉ－８－ＯＨｄＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ）をさらに入れて常温で１時間培養し、３回洗浄後、ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅを各ウェル（ｗｅｌｌ）に入れた後、さらに１時間の間常温で培養した。この後、さらに３回洗浄後、基質溶液（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れて常温で３０分間培養した。最後に、停止溶液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れた後、４５０ｎｍで吸光度を測定して確認し、その結果を図９に示した。
図９に示したように、ＤＮＡ損傷が最も激しいものと現れた継代１５（Ｐ１５）群では、細胞培養密度が高くなるほど８－ＯＨｄＧの濃度が有意的に増加することを確認した。このような結果を通して、高密度培養条件で生産されるＲＯＳによりＤＮＡ損傷が増加するのであり、これによって中間葉幹細胞の老化が促進されるということを示す。
このような結果は、細胞培養密度を低く調節することが中間葉幹細胞のＲＯＳ生産増加によるＤＮＡ損傷から中間葉幹細胞を保護する役割を果たすことができることを示す結果である。
１．８ 抗酸化剤処理による中間葉幹細胞（ＭＳＣ）増殖及び活性酸素種（ＲＯＳ）生産能の確認
中間葉幹細胞の増殖が高密度培養条件で生産されるＲＯＳによって影響を受けるか否かを確認するために、ＲＯＳ消去実験を遂行した。継代１１（Ｐ１１）乃至継代１５（Ｐ１５）で高密度培養条件及び高密度培養条件に抗酸化剤であるアスコルビン酸２５μｇ／ｍｌを培地に添加して培養した後、両グループ間の増殖率の増加倍数（Ｆｏｌｄ）を比較し、その結果を図１０に示した。
図１０に示したように、高密度培養条件で増加倍数がＰ１１乃至Ｐ１５でそれぞれ２．６、１．９、１．６と、継代数が増加するほど増殖能が減少して老化が現れ始めたが、抗酸化剤を処理した場合、全ての継代で約５０％程度増殖能が高く維持されることを確認した。また、抗酸化剤処理群で成長増加倍数（ｇｒｏｗｔｈ ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）はＰ１１乃至Ｐ１５でそれぞれ３．８、２．９、２．５とＰ１５までも増殖能が高く維持された。
最後の時点（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ）であるＰ１５で高密度培養条件単独及び高密度培養条件＋抗酸化剤処理の両グループ間のＲＯＳ水準を確認した結果を図１１に示した。
図１１に示したように、抗酸化剤であるアスコルビン酸を処理して増殖が増加した条件では、ＲＯＳの水準もまた減少していることを確認した。従って、ＭＳＣ培養は、高密度でない低い細胞密度で遂行することが好ましく、高密度細胞培養で誘導されるＲＯＳ生産を抗酸化剤で消去する場合、中間葉幹細胞の増殖能を増加させることができることを確認した。即ち、高密度条件は、ＲＯＳにより中間葉幹細胞の増殖能が抑制され、細胞密度が低くなるほどＲＯＳが減少して中間葉幹細胞増殖能が促進され得る。
このような結果をまとめると、層分離培養を通して得られた単一クローナル中間葉幹細胞の増殖、培養及び幹細胞能を維持するためには、培養条件のうち細胞密度を１０００細胞／ｃｍ２以下の密度に調節することが重要であり、抗酸化剤を添加して培養する場合、細胞培養で誘発され得る酸化ストレスを抑制して中間葉幹細胞増殖を効果的に促進できることを確認した。また、同じ低い細胞密度条件培養を比較すると、Ｐ１５のような継代１０以上である幹細胞は、継代５のような継代１０未満の幹細胞と比較したとき、細胞の形態学的変化が目立ち、幹細胞の老化促進、分化能減少のような結果が確認されるので、１０００細胞／ｃｍ２以下の密度で継代１０未満の低い継代数で培養することが最も効果的であることを確認した。
＜実施例２＞改善された層分離培養法の検証
前記実施例１を通して、層分離培養法で収得した中間葉幹細胞培養において、細胞密度の調節、継代調節及び抗酸化剤の添加が重要な因子になり得ることを確認したので、大韓民国特許出願１０－２００６－００７５６７６号に記載の層分離培養法の既存の工程で収得した単一クローナル中間葉幹細胞を細胞培養密度を異にし、抗酸化剤であるアスコルビン酸が添加された培地で培地を異にして継代培養を遂行して収得される単一コロニーＭＳＣの増殖能及びこれによる細胞収得効果を比較した。
以前の大韓民国特許出願１０－２００６－００７５６７６号の実施例１では、図１のような層分離培養方法を通して骨髄から中間葉幹細胞を分離及び培養する方法を開示しており、層分離ステップを経て収得される単一性細胞群であるコロニーを１ウェル当たり１００～６００の細胞数で培養容器に移動するという事実を開示する。
また、大韓民国特許出願１０－２０１４－０１７００４５号は、層分離培養法を利用して骨髄由来中間葉幹細胞を分離及び培養する方法を開示し、コロニーを５０～１００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で塗抹するという事実を開示している。
しかし、大韓民国特許出願１０－２００６－００７５６７６号及び１０－２０１４－０１７００４５号は、層分離培養法により収得された単一性細胞群コロニーを計数して６ウェルプレートに移動させた後、低濃度で塗抹して継代培養のためのｓｅｅｄ ｃｅｌｌ製造のために拡張する構成、即ち、継代１に該当するコロニー培養の条件を開示しているだけで、継代２以後のコロニーでない個別細胞の繰り返した培養細胞密度調節に対する構成及びこれによる効果は開示されていない。前記出願に記載の従来の層分離培養法によれば、十分な量のアトピー皮膚炎の予防、治療、改善効果がある単一クローナル幹細胞を得るために最小１０継代以上の培養を遂行しなければならない。これに対し、本発明の改善された層分離培養方法においては、継代２以後、低い細胞密度条件、最大８継代以下の少ない継代培養数を通して効果的に目的とする単一クローナル幹細胞を大量収得できる。
具体的に、本改善方法においては、層分離培養方法を通して収得された継代１（Ｐ１）のコロニーを培養した後、継代２（Ｐ２）以後の継代培養では低い密度である１０００細胞／ｃｍ２以下で細胞を分注し、これを４０００細胞／ｃｍ２細胞培養の効果と比較した。また、細胞培養培地を抗酸化剤が含まれたα－ＭＥＭ培地と抗酸化剤が含まれていないＬＧ－ＤＭＥＭ培地に異にし、これによる細胞増殖効果を比較した。
改善された層分離培養法の効果を確認するための実験群を下記表３に、従来の層分離培養法に対比して改善された層分離培養方法の工程改善部分を図１２ａ及び図１２ｂに模式化して示した。
図１２ａに示したように、継代１を収得する工程までは従来の層分離培養法と改善された層分離培養法が工程を同一に進行するが、改善された層分離培養法は、拡張された継代１細胞をｓｅｅｄ ｃｅｌｌに利用して培養するステップ以後の継代培養工程が従来の層分離培養法と異なる。既存の層分離培養法は、密度調節に対する認識なしに多くの細胞を収得するための目的で４０００細胞／ｃｍ２以上の高密度継代培養を遂行するが、改善された層分離培養法は、継代培養の密度を低い密度である１０００細胞／ｃｍ２以下に調節することで、継代２以後、最大継代８以下の培養だけでも最終産物を収得できる。継代２以後の培養工程を図１２ｂに詳細に示した。
前記表３の細胞株は、層分離培養方法により分離された細胞株であり、ＳＣＭ０１乃至ＳＣＭ０８とそれぞれ命名した。
２．１ 細胞株密度及び培地による増殖効果の確認
前記ＳＣＭ０１乃至０８細胞株を利用して培養を遂行し、継代１０未満である継代５までの継代培養による細胞増殖効果を細胞数、細胞群倍加時間（ＰＤＴ；Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｔｉｍｅ）、細胞数増殖水準（ＰＤＬ；Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）でそれぞれ比較し、それを図１３乃至図２０に示した。
図１３乃至図２０から確認したように、１ｃｍ２当たり１０００個の細胞密度で接種して培養された全ての実験群において、１ｃｍ２当たり４０００個の細胞密度で接種して培養した実験群より優れた細胞増殖効果を示した。また、同じ１０００個の細胞密度群であっても、抗酸化剤であるアスコルビン酸が含まれたα－ＭＥＭ培地で培養された１０００ａｌｐｈａ実験群でさらに顕著な細胞増殖効果を確認した。
２．２ 細胞株密度による増殖効果の比較
培養細胞数による増殖率のより正確な比較のために、培養培地をそれぞれＬＧ ＤＭＥＭまたはα－ＭＥＭ培地に固定し、１ｃｍ２当たり１０００または４０００個の細胞接種密度の継代培養による細胞増殖効果を比較し、その結果を図２１乃至図２４に示した。
図２１に示したように、ＬＧ ＤＭＥＭで培養されたＳＣＭ０１乃至ＳＣＭ０８細胞株の継代２（Ｐ２）乃至継代５（Ｐ５）での増殖率が１ｃｍ２当たり４０００個の細胞数接種群より１０００個の細胞数で接種して培養した時に顕著に高いことを確認し、継代５（Ｐ５）で確認された１ｃｍ２当たり４０００個の細胞接種に対比した１０００個の細胞接種群の増殖率は、最小３．０８乃至最大４８．５０倍であることを確認した。
また、図２２に示したように、１ｃｍ２当たり１０００個の細胞接種群のＰＤＴ値も全ての細胞株で１ｃｍ２当たり４０００個細胞株接種より低いか類似した水準で現れ、ＰＤＬ値は、全ての細胞株で１ｃｍ２当たり４０００個細胞接種に対比して高い値を確認した。
また、図２３に示したように、α－ＭＥＭで培養されたＳＣＭ０１乃至ＳＣＭ０８細胞株はいずれも１０００個の細胞数で接種して培養したとき、ＤＭＥＭ実験群のような傾向を示し、継代５（Ｐ５）で確認された１ｃｍ２当たり４０００個の細胞株接種に対比した１ｃｍ２当たり１０００個の細胞接種群の増殖率は、最小６．３２乃至最大８５．６３倍であることを確認した。また、図２４に示したように、１ｃｍ２当たり１０００個の細胞接種群のＰＤＴ値も全ての細胞株で１ｃｍ２当たり４０００個細胞接種より低いか類似した水準で現れ、ＰＤＬ値は、全ての細胞株で１ｃｍ２当たり４０００個細胞接種に対比して高い値を確認した。
このような結果は、１ｃｍ２当たり４０００個の高密度細胞接種培養に比して１ｃｍ２当たり１０００個以下の細胞接種を通して速い単一クローナル中間葉幹細胞の増殖を誘導できることを示す結果である。
２．３ 培養培地による増殖効果の比較
先に実施例２．２を通して１０００細胞／ｃｍ２培養が４０００細胞／ｃｍ２培養に対比して優れた増殖効果を奏することができることを確認したので、細胞数を１０００個に固定し、培地を変数で変化させながら細胞増殖効果を比較することで、培養培地条件による増殖効果をさらに検証し、その結果を図２５及び図２６に示した。
図２５に示したように、培養培地をα－ＭＥＭ及びＤＭＥＭで異にして細胞増殖率を比較した結果、ＬＧ－ＤＭＥＭに対比してα－ＭＥＭ培地を用いた実験群で最小１．７７倍乃至６．３９倍の高い細胞増殖率を確認した。また、図２６に示したように、ＰＤＴが全てのα－ＭＥＭ実験群で低く現れ、ＰＤＬは増加したことを確認した。
このような実験結果は、細胞接種密度を１ｃｍ２当たり１０００個以下の細胞に調節して継代２（Ｐ２）乃至継代５（Ｐ５）のような継代１０未満の低い継代で培養することに加えて抗酸化剤が添加された培地を利用して培養する場合、細胞増殖効率を極大化できることを示す。
＜実施例３＞改善工程の樹立
前記実施例を通して、中間葉幹細胞培養において細胞密度の調節及び抗酸化剤の添加が重要な因子になり得ることを確認したので、大韓民国特許出願１０－２００６－００７５６７６号及び１０－２０１４－０１７００４５に記載の層分離培養法の既存の工程に加えて、継代培養時、細胞培養密度及び培地条件を異にして単一コロニーの中間葉幹細胞を継代１０未満の低い継代で効果的に収得できる改善された工程を確立し、それをまとめて下記表４（ＤＭＥＭ培地を用いた培養条件）及び表５（α－ＭＥＭ培地を用いた培養条件）に示した。
より具体的に、本発明の骨髄由来中間葉幹細胞の層分離培養工程及び増殖培養を下記のように遂行した。
骨髄提供者の臀部を局所麻酔剤で麻酔させた後、骨盤に注射針を刺して骨髄を採取した。１００ｍｍ培養容器に２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む１４ｍｌ ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ，ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）、ヒト骨髄１ｍｌを入れて３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で２時間培養した。培養後、培養容器を一方に軽く傾けて底面に付いた細胞ができるだけ取れないように最大限に培養容器の上層培養液だけを新たな容器に移した。
同一の過程をもう一度繰り返した後、収得した培養液を底面に膠原質（ｃｏｌｌａｇｅｎ）がコーティングされた培養容器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移した後、３７℃で２時間培養した。培養液をまた新たな膠原質がコーティングされた容器に移し、２４時間後、また新たな容器に移し、２４時間後、また新たな容器に移した。最後に、４８時間後、新たな容器に移した後、残っている細胞が培養容器底面に付いて育つことを目視で確認した。先の数々の層分離ステップを経てこのステップにまで来ることができる細胞は、細胞の比重が他の細胞より飛び切り小さな細胞であることを推測できる。
約１０～１４日の時間が過ぎると細胞が単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙ）を形成するが、この単一クローナル細胞群をトリプシンを処理して分離した後、６－ウェル培養容器に移した。３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で４～５日培養した後、約８０％育ったとき、細胞を０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ）を処理して収得した後、Ｔ１７５培養容器に移して低い細胞密度で継代培養した。
このように、継代１０未満、好ましくは継代８以下の継代２（Ｐ２）乃至継代５（Ｐ５）で細胞密度を１０００細胞／ｃｍ２の水準に下げて培養する場合、他の工程は全て同一に調節したにもかかわらず、中間葉幹細胞の増殖能及び幹細胞特性が優れるように維持され、同じ継代でも増殖が効果的に誘導されることを確認した。特に、細胞密度を下げて培養する場合、既存の工程で必要としていた、中間葉幹細胞でＷＣＢ（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を製造する過程を省略でき、細胞製造期間を効果的に短縮できる。特に、継代を少なくすれば、老化が比較的にあまり進んでいない細胞を多くの量で収得でき、このような細胞を治療剤として利用する場合、治療効能に優れるものと期待することができる。
また、培養培地として抗酸化剤が添加されたα－ＭＥＭを利用する場合、高い密度の細胞培養で誘導されるＲＯＳストレスが抗酸化剤処理により効果的に改善され、中間葉幹細胞の細胞増殖能が回復でき、既存の工程に対比して細胞の継代を顕著に短縮し、中間葉幹細胞の特性を維持する老化が進んでいない新鮮な状態の単一コロニー中間葉幹細胞を速く安定して収得できるという特徴がある。
前記のような内容をまとめると、低密度細胞培養は、短時間で多くの細胞を得ることができ、製造工程は簡素化させるだけではなく、長期間培養（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ）でも、中間葉幹細胞の特性を完全に維持する老化していない状態の細胞を収得できるので、良質の幹細胞生産を可能にすることを確認した。
これによって、以下、アトピー皮膚炎の治療のための臨床研究で前記実施例を通して構築した改良方法を通して得られる幹細胞を利用した。
＜実施例４＞単一クローナル中間葉幹細胞のアトピー皮膚炎治療プロトコルの樹立 ヒトアトピー患者に適用してアトピー皮膚炎の治療効果を誘導できる臨床プロトコルの確立が必要である。従って、実施例１乃至３の改良された層分離培養法を通して収得された同種骨髄由来単一クローナル幹細胞を新鮮型（以下、ＳＣＭ－ＣＧＨ）及び凍結型（以下、ＳＣＭ－ＡＧＨ）でアトピー患者の応急臨床に適用し、その治療効果を確認した。
４．１ 臨床参加患者の条件
アトピー応急患者に対する臨床プロトコルの模式図を図２７に示した。臨床は、仁荷大学校病院医科大学（仁川、大韓民国）で遂行し、臨床プロトコルの承認後、２４ヶ月間ＳＣＭ－ＣＧＨまたはＳＣＭ－ＡＧＨを患者に投与した。ＳＣＭ－ＣＧＨまたはＳＣＭ－ＡＧＨを重症乃至深刻な程度のアトピー疾患を有する２０乃至６０歳の成人に多回投与し、その効果及び安全性を確認した。
本臨床に参加したアトピー患者は、６ヶ月間アトピー症状のある患者を対象とし、アトピー患者のうち臨床該当基準（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）及び臨床除外基準（Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）は下記表６に示し、同時処置許容または同時処置が禁止される基準は表７に示した。
４．２ 臨床プロトコルの確立
臨床試験は、計４週間、３回の訪問で進められ、患者の症状程度によってサイクル（ｃｙｃｌｅ）の追加を決定した。具体的に、ＳＣＭ－ＣＧＨまたはＳＣＭ－ＡＧＨは、患者の静脈を通して１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇの濃度で投与し、１回目の投与後、２週間隔で２回、計３回投与した（１回目のサイクル；１ｓｔ ｃｙｃｌｅ）。２～４．５ｍ／分の速度で１０分間患者に投与し、投与によるアトピー皮膚炎の治療効果を確認するために病変目視観察及び患者の血清分析を遂行した。ＳＣＭ－ＣＧＨまたはＳＣＭ－ＡＧＨの３回投与以後である５回次の訪問からＳＣＭ－ＣＧＨまたはＳＣＭ－ＡＧＨの投与なしに血清だけを回収して分析に利用した。
１回目のサイクルが完了した後、時間の経過によって患者の症状が再発する場合、追加のサイクルを進行した。
４．３ アトピー皮膚炎の治療効果の確認方法
ＳＣＭ－ＣＧＨまたはＳＣＭ－ＡＧＨの投与による効果は、３回の投与以後、１２週間、アトピー患者の重症度の相対的減少の平均値をＥＡＳＩ、ＳＣＯＲＡＤ、ＢＳＡ、ＶＡＳ及びＩＧＡで計算して確認し、バイオマーカー分析のためにＳＳＴ（チューブ５ｍｌ×３個、計１５ｍｌ）血液を予定されたスケジュールの訪問時に採血して遂行した。２次及び３次のＩＰ投薬訪問（Ｖｉｓｉｔ３、Ｖｉｓｉｔ４）時、ＩＰ投薬前に採血を遂行した。血清バイオマーカーでＩｇＥ；Ｔｈ２サイトカイン及びケモカインであるＩＬ４、ＩＬ１３、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ）；Ｔｈ１サイトカインであるＩＬ１８；Ｔｈ１７サイトカインであるＩＬ１７；及びＴｈ２２サイトカインであるＩＬ２２を分析し、耐薬性及び安全性は、副作用反応、精神的反応、バイタル、血液及び小便検査等を通して確認し、副作用の発生の有無は、投与後、４時間後に評価した。
臨床試験の間に遂行された評価内容を下記表８に示した。
ＥＡＳＩ（Ｅｃｚｅｍａ Ａｒｅａ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）は、アトピー皮膚炎の重症度及び程度を測定し、身体の４個の解剖学的領域（頭部、胴体、上肢及び下肢）で紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ）、浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、擦り傷（ｅｘｃｏｒｉａｔｉｏｎ）及び苔蘚化（ｌｉｃｈｅｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を測定するのに使用された。総ＥＡＳＩ点数は、０（最小）から７２（最大）までであり、高い点数は、アトピー皮膚炎の深刻度を反映する。
ＳＣＯＲＡＤ（ＳＣＯＲｉｎｇ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）は、ヨーロッパで開発されたアトピー皮膚炎の重症度を評価するための臨床道具であって国際的に最も多く使用されている。主観的徴候（不眠症等）だけではなく、湿疹の範囲と強度を評価し、点数を示す。発疹の範囲、発疹形態の程度、主観的な症状である掻痒症と睡眠障害等の要素を２：６：２の比率で評価する。総点数は、０から１０３（重症）までである。
アトピー皮膚炎により影響を受ける患者の身体部位をＢＳＡ（Ｂｏｄｙ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｅａ）で評価した。各部位で最高点数は、頭及び首９％、前部トランク（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｔｒｕｎｋ）１８％、背中（ｂａｃｋ）１８％、上肢（ｕｐｐｅｒ ｌｉｍｂｓ）１８％、下肢（ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｂｓ）３６％及び生殖器（ｇｅｎｉｔａｌｓ）１％で示す。
ＶＡＳ（Ｖｉｓｕａｌ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｓｃａｌｅ）は、かゆい程度の測定のための臨床試験で最も一般的に使用され、高い信頼性と効力（ｖａｌｉｄｉｔｙ）を特徴とする。左側端の箇所は「掻痒感なし」を示し、右側端の箇所は「最も想像できない掻痒感」を示す。ＶＡＳ ０＝掻痒症なし；ＶＡＳ＜３＝軽い掻庠症；ＶＡＳ≧３～＜７＝重症度掻庠症；ＶＡＳ≧７～＜９＝重症掻痒症；ＶＡＳ≧９＝非常に激しい掻痒症を示す。
ＩＧＡ（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ’ｓ Ｇｌｏｂａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）は、アトピー皮膚炎の全般的な皮膚徴候程度を５ステップで評価する方法であり、０＝透明；１＝ほぼ透明；２＝弱い；３＝普通；４＝深刻を示す。治療に対する反応がある場合は、ＩＧＡ点数が０または１の時である。
４．４ アトピーの治療効果の確認
１）患者情報及び投与手順
臨床試験に参加した患者及び投与情報は、下記表９に示した。
Ａ患者は、２４歳の女性であり、４．２で確立した臨床プロトコルによってＳＣＭ－ＣＧＨを１回目の投与後、２週間隔で２回追加投与した（１ｓｔ Ｃｙｃｌｅ）。４週間、計３回投与し、血清を回収して４．３の評価方法によって治療効果を確認した。
Ｂ患者には、ＳＣＭ－ＣＧＨを１回目の投与後、２週間隔で２回追加投与して、４週間、計３回投与（１ｓｔ Ｃｙｃｌｅ）し、１回目のサイクルが終了して７ヶ月後、また２週間隔で２回投与して、４週間、計３回投与した（２ｎｄ Ｃｙｃｌｅ）。
２）患者の重症度減少の確認
ＳＣＭ－ＣＧＨの投与によるＡ患者のアトピー皮膚炎重症度改善効果を図２８に示した。
図２８のＡに示したように、Ａ患者は、ＳＣＭ－ＣＧＨ後、アトピー皮膚炎の重症度を示すＥＡＳＩが明確に減少することを確認した。具体的に、Ａ患者は、最初のサイクル（１ｓｔ Ｃｙｃｌｅ）進行後、１２週目（即ち、臨床開始後、１６週）にＥＡＳＩが８７％減少し、最初のサイクル進行後、１年以上が過ぎた５４週目にもＥＡＳＩが７．４水準に維持され、８０％以上減ることを確認した。
図２８のＢに示したように、ＳＣＯＲＡＤは、ＦＵ（ｆｌｏｌｌｏｗ－ｕｐ）エンディングポイント以後、５４週次まで少しずつ増加する傾向を示してはいたが、ＦＵエンディングポイントで７０％減少効果を示した。
図２８のＣに示したように、ＢＳＡは、最初のサイクル進行後、１２週目に減少し、ＥＡＳＩと類似した様相で現れることを確認した。
Ａ患者のＥＡＳＩ、ＳＣＯＲＡＤ、ＢＳＡ数値及びＩＧＡ、好酸球計数結果を図２９に示した。
図２９に示したように、アトピー皮膚炎の評価指標で一様な症状改善効果が確認された。
ＳＣＭ－ＣＧＨの投与によるＢ患者のアトピー皮膚炎重症度改善効果を図３０に示した。
Ｂ患者は、最初のサイクル進行後、アトピー皮膚炎症状の改善効果が確認されたが、この後、症状がまた始まることが発見され、７ヶ月後、２回目のサイクルを進行した。
図３０のＡに示したように、Ｂ患者は、最初のサイクル進行後、１２週目（即ち、臨床開始後１６週）にＥＡＳＩが８０％以上減少し、２回目のサイクル進行後には、ＥＡＳＩが５０％以上減少した。
図３０のＢに示したように、ＳＣＯＲＡＤは、１回目のサイクルが過ぎた後、５０％以上減少する傾向を示し、特に２回目のサイクル以後には、持続的に低い水準のＳＣＯＲＡＤ減少を確認した。
図３０のＣに示したように、ＢＳＡ測定の結果、Ｂ患者は、１回目のサイクル以後、非常に優れたＢＳＡ減少傾向を示し、２回目のサイクル以後には、減少した数値が一定に長期間維持され得ることを確認した。
Ｂ患者の場合、１回目のサイクル投与だけでもアトピー皮膚炎症状が非常に効果的に好転したが、時間が経過するにつれて症状が再発し、そこで、また同じサイクルを繰り返したとき、１回目のサイクル減少幅よりは少ない水準に数値が減少し、このような減少した数値が長期間維持され得ることを確認した。全体的にＢ患者はＥＡＳＩスコアリングが５０％以上減少した水準を維持しており、最初の投与後、約６０週後基準にＥＡＳＩ７２％、ＳＣＯＲＡＤ５５％の減少水準が維持され、本発明に係る臨床適用の結果、長期間のアトピー皮膚炎改善効果を奏することができることを示した。
Ｂ患者のＥＡＳＩ、ＳＣＯＲＡＤ、ＢＳＡ数値及びＩＧＡ、好酸球計数結果を図３１に示した。
図３１に示したように、Ｂ患者もまた１回目及び２回目のサイクルの幹細胞投与によってアトピー皮膚炎評価指標で一様な症状改善効果が確認された。
さらにＢ患者では掻痒症と睡眠障害の尺度を示すＰｒｕｒｉｔｕｓ及びＳｌｅｅｐを調査した。Ｂ患者は、掻痒症及び睡眠障害を０点から１０点まで点数で評価し、その結果を図３２に示した。
図３２に示したように、２回目のサイクル後、患者は掻痒症と睡眠障害が５０％以上改善され、２回目のサイクル後、３４週が過ぎた時点では掻痒症及び睡眠障害が非常に顕著に好転したことを確認した。
３）患者の血清分析の確認
分子遺伝学的分析（ＥＬＩＳＡ）を通してアトピー皮膚炎患者からアレルギー疾患の診断及び重症度の有意的な変化を検討するために、幹細胞治療剤の注入前と後の血清を回収及び分析した。具体的に、Ａ患者及びＢ患者から血清を収得してＥＬＩＳＡ分析を遂行した。血清以外にも血漿、喀痰、気管支肺胞液で安定的に測定可能であり、再現性に優れて喘息及びアトピー皮膚炎のようなアレルギー疾患の診断及び重症度を反映する生体指標として使用可能なＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２を測定し、Ｔｈ１細胞からＩＦＮ－ｇの生成を促進するサイトカインであるＩＬ－１８、ＩＬ－１２及びＩＬ－２２を測定した。
患者Ａ及び患者Ｂで効果を測定した結果を図３３及び図３４に示した。
図３３に示したように、Ａ患者にＳＣＭ－ＣＧＨの投与後、血中アトピー関連因子が訪問回次によって持続的に減少することを確認した。具体的に、アトピーのマーカーであるＩｇＥの濃度を確認した結果、有意的に減少する傾向を示した。また、アトピー皮膚炎の重症程度を示すＩＬ－１８及びＩＬ－１３も減少し、乾性病変で増加するマーカーと知られたＩＬ－１７も顕著に減少した。Ｔｈ２ケモカインでアレルギー疾患診断及び重症度を反映する生体指標であるＣＣＬ１７及びＣＣＬ２２の血中濃度もまた顕著に減少し、特に、表皮の自然免疫反応を活性化させ、乾性病変で増加して表皮の過増殖を起こすＩＬ－２２が非常に顕著に減少することを確認した。
図３４に示したように、Ｂ患者にＳＣＭ－ＣＧＨの投与後、血中アトピー関連因子の変化を分析した結果、Ｂ患者でも類似した結果を確認した。Ｂ患者の血中ＩｇＥの濃度は、１回目のサイクル投与以後に減少し、２回目のサイクル投与後にはさらに減少した。ＩＬ－１８、ＩＬ－１７及びＩＬ－２２は、１回目のサイクル投与以後に減少して増加したが、２回目のサイクル投与後に減少した。ＩＬ－１３、ＣＣＬ１７及びＣＣＬ２２の血中濃度は、１回目のサイクル投与後に減少し、２回目のサイクル投与後にさらに減少した。
このような結果を通して、実施例４．２により確立された臨床プロトコルを通して本発明に係る単一クローナル中間葉幹細胞を投与する場合、実際の臨床でアトピー皮膚炎を治療及び改善できることを確認した。
４．５ アトピー治療患者群確認マーカーの選別
本発明において樹立された臨床プロトコルによって、Ａ及びＢ患者では、非常に有意味な臨床的なアトピー皮膚炎の治療効果を実施例４．４を通して確認した。しかし、一部の患者群では、アトピー皮膚炎改善効果が現れてはいたが、Ａ及びＢ患者群に対比して臨床症状緩和効果が僅かなものと現れ、特に本発明の臨床プロトコルに適したアトピー治療患者群を選別するためのマーカーを追加分析した。治療効果が相対的に僅かなものと確認された患者群をＣ乃至Ｅの比較群に設定し、患者群の情報を表１０に示した。
患者に幹細胞治療剤の注入前と後に血液を得た後、血液から血清を分離して分析を遂行した。具体的に、Ａ乃至Ｅ患者から血清を収得して製造会社のプロトコルによりＥＬＩＳＡ分析プログラムを利用してマーカー発現を比較分析した。
治療効果が非常に優れるように現れて本発明の治療方法の適用が適したものと確認されたＡ及びＢ患者群と相対的に治療効果が低く現れた患者群のマーカー発現を比較した結果、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５で有意味な発現の差が確認され、その結果を図３５に示した。
図３５に示したように、Ａ及びＢ患者群は、共通してＩＬ－１０が２０ｐｇ／ｍｌ以上、ＩＬ－１３が１００ｐｇ／ｍｌ以上と、ＩＬ－１０が６～１５ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－１３が１．５～４０ｐｇ／ｍｌの水準に低く現れるＣ乃至Ｅ患者群と比較して高いＩＬ－１０、ＩＬ－１３発現様相を示した。
また、驚くべきことに、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７発現の側面で完全に異なる様相を示すことを確認した。Ａ及びＢ患者の場合、ＩＦＮｇ及びＩＬ－５の発現が幹細胞注入前に検出されず、ＩＬ－１７発現が確認されたが、Ｃ乃至Ｅ患者の場合、これとは逆にＩＦＮｇ及びＩＬ－５発現が検出され、ＩＬ－１７発現が検出されなかった。
このような差は、本発明の治療方法の適用前、特に本発明の治療方法に特に適したアトピー患者群を前記マーカー発現程度の測定を通して予め選別し、確認して予後を予測できることを示す結果である。

Claims (22)

  1. ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上；またはこれらの発現を測定する製剤を含む、単一クローナル幹細胞投与に適したアトピー皮膚炎患者選別用組成物。
  2. ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上；またはこれらの発現を測定する製剤を含む、単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎患者の予後予測用組成物。
  3. 前記単一クローナル幹細胞は、
    １）個体から分離された骨髄を第１容器で培養するステップ；
    ２）前記第１容器の上層液だけを新たな容器に移動して培養するステップ；
    ３）前記新たな容器に存在する細胞を培養し、上層液を収得するステップ；
    ４）前記３）ステップの上層液を２）ステップの第１容器の上層液として２）及び３）ステップを１回以上繰り返して単一クローナル幹細胞を得るステップ；及び
    ５）前記４）ステップの単一クローナル幹細胞を５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種及び培養して単一クローナル幹細胞を収得するステップ；により収得された単一クローナル幹細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 請求項１に記載の組成物を含む、単一クローナル幹細胞投与に適したアトピー皮膚炎患者選別用キット。
  5. 請求項２に記載の組成物を含む、単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎患者の予後予測用キット。
  6. １）アトピー皮膚炎患者の試料でＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上の発現を測定するステップ；を含む単一クローナル幹細胞投与法に適したアトピー皮膚炎患者選別方法。
  7. 前記患者の
    ｉ）ＩＬ－１０が２０ｐｇ／ｍｌ以上及びＩＬ－１３が１００ｐｇ／ｍｌ以上である場合、
    ｉｉ）ＩＦＮｇ及びＩＬ－５が検出されない場合、または
    ｉｉｉ）ＩＬ－１７が検出される場合、単一クローナル幹細胞投与法に適した患者と選別することである、請求項６に記載の単一クローナル幹細胞投与法に適したアトピー皮膚炎患者選別方法。
  8. １）アトピー皮膚炎患者の試料でＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５及びＩＬ－１７からなる群から選択された１種以上の発現を測定するステップ；を含む単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎治療予後予測に対する情報を提供する方法。
  9. 前記患者の
    ｉ）ＩＬ－１０が２０ｐｇ／ｍｌ以上及びＩＬ－１３が１００ｐｇ／ｍｌ以上である場合、
    ｉｉ）ＩＦＮｇ及びＩＬ－５が検出されない場合、または
    ｉｉｉ）ＩＬ－１７が検出される場合、単一クローナル幹細胞の投与時に予後が優れるものと予測することである、請求項８に記載の単一クローナル幹細胞投与によるアトピー皮膚炎治療予後予測に対する情報を提供する方法。
  10. 前記単一クローナル幹細胞は、
    １）個体から分離された骨髄を第１容器で培養するステップ；
    ２）前記第１容器の上層液だけを新たな容器に移動して培養するステップ；
    ３）前記新たな容器に存在する細胞を培養し、上層液を収得するステップ；
    ４）前記３）ステップの上層液を２）ステップの第１容器の上層液として２）及び３）ステップを１回以上繰り返して単一クローナル幹細胞を得るステップ；及び
    ５）前記４）ステップの単一クローナル幹細胞を５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種及び培養して単一クローナル幹細胞を収得するステップ；により収得された単一クローナル幹細胞である、請求項６乃至９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 単一クローナル幹細胞を含むアトピー皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物であって、
    前記薬学的組成物は、
    治療前患者の
    ｉ）ＩＬ－１０が２０ｐｇ／ｍｌ以上及びＩＬ－１３が１００ｐｇ／ｍｌ以上である場合、
    ｉｉ）ＩＦＮｇ及びＩＬ－５が検出されない場合、または
    ｉｉｉ）ＩＬ－１７が検出される場合の投与用である、薬学的組成物。
  12. 前記単一クローナル幹細胞は、
    １）個体から分離された骨髄を第１容器で培養するステップ；
    ２）前記第１容器の上層液だけを新たな容器に移動して培養するステップ；
    ３）前記新たな容器に存在する細胞を培養し、上層液を収得するステップ；
    ４）前記３）ステップの上層液を２）ステップの第１容器の上層液として２）及び３）ステップを１回以上繰り返して単一クローナル幹細胞を得るステップ；及び
    ５）前記４）ステップの単一クローナル幹細胞を５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種及び培養して単一クローナル幹細胞を収得するステップ；により収得された単一クローナル幹細胞である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
  13. １）個体から分離された骨髄を第１容器で培養するステップ；
    ２）前記第１容器の上層液だけを新たな容器に移動して培養するステップ；
    ３）前記新たな容器に存在する細胞を培養し、上層液を収得するステップ；
    ４）前記３）ステップの上層液を２）ステップの第１容器の上層液として２）及び３）ステップを１回以上繰り返して単一クローナル幹細胞を得るステップ；
    ５）前記４）ステップの単一クローナル幹細胞を５０～１０００細胞／ｃｍ２（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の細胞密度で培地に接種及び培養して単一クローナル幹細胞を収得するステップ；及び
    ６）前記収得された単一クローナル幹細胞を１回１×１０３～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｋｇの投与量で１～３週間隔で個体に投与するステップ；を含むアトピー皮膚炎の治療方法。
  14. 前記単一クローナル幹細胞は、新鮮型または凍結型である、請求項１３に記載のアトピー皮膚炎の治療方法。
  15. 前記５）ステップの培地は、抗酸化剤が加えられた培地である、請求項１３に記載のアトピー皮膚炎の治療方法。
  16. 前記５）ステップの培養は、継代２乃至継代８で培養することである、請求項１３に記載のアトピー皮膚炎の治療方法。
  17. 前記６）ステップの投与を２～５回遂行することを１サイクルとする、請求項１３に記載のアトピー皮膚炎の治療方法。
  18. 前記５）ステップの単一クローナル幹細胞を１～５サイクル繰り返し投与することである、請求項１７に記載のアトピー皮膚炎の治療方法。
  19. 前記投与は、静脈投与のものである、請求項１３に記載のアトピー皮膚炎の治療方法。
  20. 前記静脈投与は、０．５～７ｍ／分の速度で５～１５分間投与されるものである、請求項１９に記載のアトピー皮膚炎の治療方法。
  21. 前記個体は、治療前、ＩＬ－１０を２０ｐｇ／ｍｌ以上、ＩＬ－１３を１００ｐｇ／ｍｌ以上発現することを特徴とする、請求項１３に記載のアトピー皮膚炎の治療方法。
  22. 前記個体は、治療前、ＩＦＮｇ、ＩＬ－５を発現せず、ＩＬ－１７を発現することを特徴とする、請求項１３に記載のアトピー皮膚炎の治療方法。
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