JP2018138565A - 改良型細胞組成物およびその作製方法 - Google Patents

改良型細胞組成物およびその作製方法 Download PDF

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Abstract

【課題】幹細胞および胎盤細胞を含む改良型組成物の作成方法の提供。
【解決手段】細胞を含む組成物を作製する方法であって、（ａ）細胞を、デキストランおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液と接触させて細胞含有溶液を形成するステップ、（ｂ）細胞含有溶液を濾過するステップ、（ｃ）細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個を超える細胞を含む場合、細胞を、デキストランを含む第１の希釈溶液で１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個以下の細胞に希釈するステップ、および（ｄ）場合によって、細胞含有溶液を、デキストランを含むがＨＳＡを含まない第２の希釈溶液で希釈し、それによって細胞を含む組成物を作製するステップ、を含む方法。
【選択図】なし

Description

本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００８年８月２０日に出
願された米国仮出願第６１／０９０，５７７号の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく
利益を主張するものである。
細胞、例えば、幹細胞および胎盤細胞、例えば、単離されたヒト接着性胎盤多分化能細
胞、例えば、セクション５．３に記載の胎盤多分化能細胞、または胎盤灌流液から単離し
た細胞、例えば、胎盤灌流液から単離した全有核細胞を含む改良型組成物、例えば、医薬
組成物、およびこの組成物を作製するための改良方法が本明細書で提供される。
細胞組成物、例えば、幹細胞組成物は、いくつかの生理的欠陥、例えば、骨髄置換の魅
力的な療法となっている。このような組成物を必要とする個体に投与するための、細胞、
例えば、幹細胞の改良型製剤が必要とされている。
細胞、例えば、単離胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞、胎盤多分化能細胞、増殖可能であ
り少なくとも２つの異なる細胞型、例えば、骨形成原および軟骨形成細胞型に分化する能
力を有する胎盤細胞、または胎盤灌流液から単離した細胞、例えば、胎盤灌流液から単離
した全有核細胞を含む組成物、例えば、個体への投与に適する細胞を含む組成物、及び当
該組成物を作製する改良方法が本明細書で提供される。これらの改良方法は、細胞の凍結
前保存処理、凍結保存、および解凍に対する特別なステップおよび特別な組成物を使用す
る。特定の実施形態では、改良方法は、凍結保存細胞の解凍後塊を低減または除去する。
好ましい実施形態では、改良型組成物は胎盤多分化能細胞を含む。
一実施形態では、組成物を作製する方法であって、（ａ）細胞を、デキストランおよび
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液と接触させて細胞含有溶液を形成するステップ
、（ｂ）細胞含有溶液を濾過して濾過済み細胞含有溶液を形成するステップ、（ｃ）場合
によって、濾過済み細胞含有溶液を、デキストランを含む第１の希釈溶液で、１ミリリッ
トル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０
６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個の細胞に希釈するステップ、および（
ｄ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を、デキストランを含む第２の希釈溶液で希釈
するステップを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ステップ（
ｃ）は、（ｂ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１５×１０６個を超え
る細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｃ）の前記希釈は１ミリリットル当た
り約１５×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｃ）は、（ｂ）の濾
過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個を超える細胞を含む場
合に実施し、この場合のステップ（ｃ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×
１０６個の細胞である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、（ｂ）の濾過済み
細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約７．５×１０６個を超える細胞を含む場合に実施
し、この場合のステップ（ｃ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約７．５×１０６個の
細胞である。具体的な実施形態では、ステップ（ｄ）のデキストランを含む溶液はヒト血
清アルブミンを含まない。具体的な実施形態では、濾過済み細胞含有組成物の細胞をステ
ップ（ｄ）の前に凍結保存する。特定の実施形態では、細胞数がステップ（ａ）の後に１
ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である
。特定の実施形態では、細胞数がステップ（ａ）の後に１ミリリットル当たり約７．５×
１０６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。
いくつかの実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の溶液中の前記デキスト
ランは、２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０
％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％
、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７
．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．
５％、９．７５％、または１０％のデキストランである。いくつかの実施形態では、前記
第１の希釈溶液または前記第２の溶液中の前記デキストランは、約１１％、１２％、１３
％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％のデキストランであ
る。第１の希釈溶液または第２の希釈溶液中の前記デキストランは、任意の分子量のデキ
ストラン、例えば約１ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１２５ｋＤａ、約１ｋＤ
ａ〜約１００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約７５ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約
１ｋＤａ〜約２５ｋＤａの分子量を有するデキストランであってよい。いくつかの実施形
態では、第１の希釈溶液または第２の希釈溶液中のデキストランは、約１ｋＤＡ〜約１０
ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約６０ｋＤａ〜約８０ｋＤａの分子量を有
する。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前
記デキストランはデキストラン１である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶
液および前記第２の希釈溶液中の前記デキストランはデキストラン１である。別の具体的
な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは
デキストラン７０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第
２の希釈溶液中の前記デキストランはデキストラン７０である。別の具体的な実施形態で
は、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランはデキストラン
４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液
中の前記デキストランはデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１
の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン４０は、２．５％〜１０％デ
キストラン４０である。いくつかの実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の
溶液中の前記デキストラン４０は、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３
．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２
５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％
、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、
９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のデキストラン４０である
。いくつかの実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の溶液中の前記デキスト
ランは、約１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％
または２０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶
液中の前記デキストラン４０は、５．０％デキストラン４０である。別の具体的な実施形
態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０は、５．５％デキストラン４０で
ある。別の具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン４０は、１
０％デキストラン４０である。
他の実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて
、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりに多糖を含むことができる
。例えば、いくつかの実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、マルト
デキストラン（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３
．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．
５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５
％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、
９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のマルトデキストリン）、トレハロー
ス（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、
４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．
７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５
％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％
、９．５％、９．７５％、または１０％のトレハロース）、またはヘタスターチ（例えば
、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、
４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６
．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７
５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％
、９．７５％、または１０％のヘタスターチ）を含む。他の実施形態では、前記第１およ
び／または第２の希釈溶液は、スクロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％
、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、
５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．
７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５
％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のスクロ
ース）、ヘパリン（例えば、５５ＵＳＰ単位／１ｍＬのヘパリン）、またはグリコーゲン
（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４
．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７
５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％
、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、
９．５％、９．７５％、または１０％のグリコーゲン）を含む。特定の実施形態では、前
記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキストラン以
外に、すなわちデキストランの代わりにマルトデキストランを含む。別の特定の実施形態
では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキス
トラン以外に、すなわちデキストランの代わりにトレハロースを含む。別の特定の実施形
態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキ
ストラン以外に、すなわちデキストランの代わりにヘタスターチを含む。
別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１〜１７％のＨ
ＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１％
、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％
、１４％、１５％、１６％または１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、Ｈ
ＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約４〜１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形
態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約３．１２５％のＨＳＡである。別の具
体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約５％のＨＳＡである。別
の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１０％のＨＳＡであ
る。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１６．８７５
％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約
１〜１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記Ｈ
ＳＡは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１
２％、１３％、１４％、１５％、１６％または１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施
形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約４〜１０％のＨＳＡである。別の具体
的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約３．１２５％のＨＳＡである
。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約５％のＨＳＡであ
る。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１０％のＨＳＡ
である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１６．８７
５％のＨＳＡである。
他の実施形態では、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（例えば、約１％、２％、３％、４
％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１
５％のＢＳＡ）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）（例えば、約１％、２％、３％、４％、５
％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％の
ＦＢＳ）を、前記溶液中でＨＳＡに加えて、またはＨＳＡ以外に、すなわちＨＳＡの代わ
りに使用することができる。
いくつかの実施形態では、第１の溶液中のＨＳＡとデキストラン、例えばデキストラン
１、デキストラン４０またはデキストラン７０の比は、約６：１のＨＳＡ：デキストラン
と約１：２．６のＨＳＡ：デキストランの間である。いくつかの実施形態では、ＨＳＡと
デキストランの比は、約６：１、５．５：１、５：１、４．５：１、４：１、３．５：１
、３：１、２．５：１、２．０：１、１．５：１、１：１、１：１．５、１：２または１
：２．６のＨＳＡ：デキストランである。いくつかの実施形態では、第１の溶液中のＨＳ
Ａとデキストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０の
比は、約３．１３％のＨＳＡ／８．２５％のデキストランである。いくつかの実施形態で
は、第１の溶液中のＨＳＡとデキストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０ま
たはデキストラン７０の比は、約１６．８８％のＨＳＡ／２．７５％のデキストランであ
る。特定の実施形態では、第１の溶液中のＨＳＡとデキストラン、例えばデキストラン１
、デキストラン４０またはデキストラン７０の比は、約１０％のＨＳＡ／５．５％のデキ
ストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０である。
別の具体的な実施形態では、ステップ（ａ）の前記溶液または細胞含有溶液は凍結保護
剤を含む。より具体的な実施形態では、前記凍結保護剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）である。特定の実施形態では、ステップ（ａ）に挙げた溶液は、約１％〜約１５％、
約２．５％〜約１５％、約２．５％〜約１０％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％ま
たは約１０％〜約１５％のＤＭＳＯを含む。特定の実施形態では、ステップ（ａ）に挙げ
た溶液は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％
、１２％、１３％、１４％または１５％のＤＭＳＯを含む。特定の実施形態では、ステッ
プ（ａ）に挙げた溶液は約５％のＤＭＳＯを含む。別の具体的な実施形態では、前記第１
の希釈溶液は凍結保護剤をさらに含む。より具体的な実施形態では、前記凍結保護剤はジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。特定の実施形態では、前記第１の希釈溶液は、
約１％〜約１５％、約２．５％〜約１５％、約２．５％〜約１０％、約５％〜約１５％、
約５％〜約１０％または約１０％〜約１５％のＤＭＳＯをさらに含む。特定の実施形態で
は、前記第１の希釈溶液は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％
、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＤＭＳＯをさらに含む。特定
の実施形態では、前記第１の希釈溶液は、約５％のＤＭＳＯをさらに含む。
具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液は、約５．５％のデキストラン４０、約１
０％のＨＳＡ、および約５％のＤＭＳＯを含む。
特定の実施形態では、前記方法は、細胞および約２．５％、２．７５％、３．０％、３
．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．
０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５
％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、
８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のデキストラ
ン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０を含む組成物を生
成する。別の特定の実施形態では、前記方法は、細胞および約７．５％〜約９％のデキス
トラン、例えばデキストラン４０を含む組成物を生成する。別の具体的な実施形態では、
前記方法は、１ミリリットル当たり約１．５×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約
３．７５×１０６個の細胞を含む組成物を生成する。別の具体的な実施形態では、前記方
法は、１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり
約５．０±１．５×１０６個の細胞を含む組成物を生成する。他の具体的な実施形態では
、方法は、１ミリリットル当たり約１．０×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり１５
×１０６個の細胞、例えば１ミリリットル当たり約７．５×１０６個の細胞〜１ミリリッ
トル当たり１５×１０６個の細胞を含む組成物を生成する。別の具体的な実施形態では、
前記方法は、約１％のＨＳＡ〜約１５％のＨＳＡを含む組成物を生成する。別の具体的な
実施形態では、前記方法は、約１％のＨＳＡ〜約１０％のＨＳＡを含む組成物を生成する
。
組成物を作製する方法であって、（ａ）５．５％デキストラン４０および１０％ＨＳＡ
を含む溶液中の複数の細胞を７０μＭ〜１５０μＭフィルターで濾過して濾過済み細胞含
有溶液を形成するステップ、（ｂ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を５．５％のデ
キストラン４０、１０％のＨＳＡ、および５％のＤＭＳＯで、１ミリリットル当たり約１
〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×
１０６、または１〜１０×１０６個の細胞に希釈するステップ、（ｃ）細胞を凍結保存す
るステップ、（ｄ）細胞を解凍するステップ、および（ｅ）濾過済み細胞含有溶液を１０
％デキストラン４０で希釈して前記組成物を生成するステップを含む方法が本明細書でさ
らに提供される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含
有溶液が１ミリリットル当たり約１５×１０６個を超える細胞を含む場合に実施し、この
場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞である
。特定の実施形態では、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１５×
１０６個未満の細胞を含む場合、濾過は任意選択である。いくつかの実施形態では、ステ
ップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０
６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリ
ットル当たり約１０±３×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、（ａ）の濾過済
み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞を含む場合、濾
過は任意選択である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細
胞含有溶液が１ミリリットル当たり約７．５×１０６個を超える細胞を含む場合に実施し
、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約７．５×１０６個の細
胞である。特定の実施形態では、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり
約７．５×１０６個未満の細胞を含む場合、濾過は任意選択である。いくつかの実施形態
では、ステップ（ｅ）は、濾過済み細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で１：１〜
１：５（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｅ）
は、濾過済み細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に
希釈するステップを含む。より具体的な実施形態では、ステップ（ａ）の細胞含有溶液は
、凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、例えば、約２％〜約１５％のＤＭＳＯを追加的に含む。
特定の実施形態では、ステップ（ａ）に挙げた溶液は、約１％、２％、３％、４％、５％
、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＤ
ＭＳＯを追加的に含む。特定の実施形態では、ステップ（ａ）に挙げた溶液は、約５％の
ＤＭＳＯを追加的に含む。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）のフィルターは７０μ
Ｍ〜１００μＭフィルターである。
別の実施形態では、組成物を作製するための方法であって、（ａ）複数の細胞を遠心分
離にかけて細胞を回収するステップ、（ｂ）細胞を５．５％デキストラン４０に再懸濁す
るステップ、（ｃ）細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、（ｄ）細胞を、１
０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０溶液に再懸濁して細胞含有溶液を生成するス
テップ、（ｅ）細胞含有溶液を４０μＭ〜１５０μＭフィルターで濾過して濾過済み細胞
含有溶液を生成するステップ、（ｆ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を５．５％の
デキストラン４０、１０％のＨＳＡ、および凍結保護剤、例えば、ＤＭＳＯ、例えば、５
％のＤＭＳＯで、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３
０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個の細胞に
希釈するステップ、（ｇ）細胞を凍結保存するステップ、（ｈ）細胞を解凍するステップ
、および（ｉ）細胞含有溶液を１０％デキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に
希釈して前記組成物を生成するステップを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの
実施形態では、ステップ（ｆ）は、（ｅ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当た
り約１５×１０６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｆ）の前記
希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、ステ
ップ（ｆ）は、（ｅ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０
６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリ
ットル当たり約１０±３×１０６個の細胞である。いくつかの実施形態では、ステップ（
ｅ）は、（ｅ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約７．５×１０６個を超
える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当
たり約７．５×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｄ）の後に細胞
数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満である場合、濾過は任意選択である
。特定の実施形態では、ステップ（ｄ）の後に細胞数が１ミリリットル当たり約７．５×
１０６個未満である場合、濾過は任意選択である。特定の実施形態では、ステップ（ｄ）
に挙げた再懸濁が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞を含む細胞含有
溶液をもたらす場合、ステップ（ｄ）に挙げた溶液は、凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、例
えば、約２％〜約１５％のＤＭＳＯを含み、ステップ（ｆ）は実施しない。好ましい実施
形態では、ステップ（ｅ）のフィルターは７０μＭ〜１００μＭフィルターである。
組成物を作製するための方法であって、（ａ）単離胎盤細胞、５．５％のデキストラン
４０および１０％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液を、目に見える細胞塊を除
去するフィルターで濾過して、濾過済み単離胎盤細胞含有溶液を生成するステップ、（ｂ
）場合によって、前記濾過済み単離胎盤細胞含有溶液を１ミリリットル当たり約１〜５０
×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６
、または１〜１０×１０６個の細胞にするのに十分な量の、５．５％のデキストラン４０
、１０％のＨＳＡおよび５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む溶液で前記濾過
済み単離胎盤細胞含有溶液を希釈するステップ、および（ｃ）前記濾過済み単離胎盤細胞
含有溶液を１０％のデキストラン４０で希釈して前記組成物を生成するステップを含む方
法が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）
の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１５×１０６個を超える細胞を含む場
合に実施し、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０
６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有
溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個を超える細胞を含む場合に実施し、こ
の場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞
である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が
１ミリリットル当たり約７．５×１０６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合の
ステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約７．５×１０６個の細胞である。い
くつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、前記濾過済み単離胎盤細胞含有溶液を１０％
のデキストラン４０で、約１：１〜約１：１１の単離胎盤細胞含有溶液：デキストラン４
０（ｖ／ｖ）の比で希釈することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、
前記濾過済み単離胎盤細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で、約１：１〜約１：５
の単離胎盤細胞含有溶液：デキストラン４０（ｖ／ｖ）の比で希釈することを含む。特定
の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満である場合、
濾過は任意選択である。特定の実施形態では、ステップ（ａ）後の細胞数が１ミリリット
ル当たり約７．５×１０６個未満である場合、濾過は任意選択である。具体的な実施形態
では、前記フィルターは７０μＭフィルターである。別の具体的な実施形態では、前記フ
ィルターは１００μＭフィルターである。別の具体的な実施形態では、ステップ（ａ）の
フィルターは７０μＭ〜１００μＭフィルターである。
前述の方法のいずれかの具体的な実施形態では、組成物は医薬組成物である。
前述の方法のいずれかの別の具体的な実施形態では、方法は、生成した細胞組成物を１
ミリリットル当たり約５×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり１×１０８個の細胞に
濃縮するステップをさらに含む。このような組成物は、例えば、それを必要とする個体へ
の組成物の皮下投与に有用である。
別の態様では、細胞、例えば、幹細胞、単離胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤
多分化能細胞を含む組成物、例えば医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、本明
細書に記載の方法のいずれかによって組成物を作製する。本明細書において、一実施形態
では、複数の細胞、例えば、幹細胞、単離胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分
化能細胞を含む組成物、例えば溶液が本明細書で提供され、前記組成物は１ミリリットル
当たり約１．０±０．３×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約５．０±１．５×１
０６個の細胞を含み、前記組成物は目に見える細胞塊は含まない（すなわち、マクロの細
胞塊は含まない）、またはこのような目に見える塊は実質的に含まない。特定の他の実施
形態では、組成物は、１ミリリットル当たり約１．０×１０６個の細胞から１ミリリット
ル当たり１５×１０６個の間の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約７．５×１０６個
の細胞から１ミリリットル当たり約１５×１０６個の間の細胞を含む。特定の他の実施形
態では、組成物は１ミリリットル当たり約２０×１０６個未満の細胞を含む。
いくつかの実施形態では、前記組成物は、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２
５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％
、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、
７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．
７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のデキストラン、
例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０を含む。具体的な実施
形態では、前記組成物は約７．５％〜約９％のデキストラン４０を含む。具体的な実施形
態では、前記組成物は約５．５％のデキストラン４０を含む。
他の実施形態では、前記組成物は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に
、すなわちデキストランの代わりに多糖を含む。特定の実施形態では、多糖は非グルコー
ス糖サブユニットを含まないグルコースのポリマーである。他の実施形態では、前記組成
物は、マルトデキストラン（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、
３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．
２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０
％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％
、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のマルトデキストリン）
、トレハロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、
３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５
．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２
５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％
、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のトレハロース）、またはヘタスタ
ーチ（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％
、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５
．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．
５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５
％、９．５％、９．７５％、または１０％のヘタスターチ）を含む。他の実施形態では、
前記組成物は、スクロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、
３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．
２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０
％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％
、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のスクロース）、ヘパリ
ン（例えば、５５ＵＳＰ単位／１ｍＬのヘパリン）、またはグリコーゲン（例えば、約２
．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２
５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％
、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、
８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．
７５％、または１０％のグリコーゲン）を含む。特定の実施形態では、前記組成物は、デ
キストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりにマル
トデキストランを含む。別の特定の実施形態では、前記組成物は、デキストランに加えて
またはデキストランの代わりにトレハロースを含む。別の特定の実施形態では、前記組成
物は、デキストランに加えてまたはデキストランの代わりにヘタスターチを含む。
別の具体的な実施形態では、前記組成物は約１〜約１７％のＨＳＡを含む。いくつかの
実施形態では、前記組成物は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９
％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％または約１７％のＨＳＡ
を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約３．１２５％のＨＳＡを含む。いくつ
かの実施形態では、前記組成物は約５％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記
組成物は約１０％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約１６．８７
５％のＨＳＡを含む。
他の実施形態では、前記組成物は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（例えば、約１％、
２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、
１４％または１５％のＢＳＡ）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）（例えば、約１％、２％、
３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％
または１５％のＦＢＳ）を、ＨＳＡに加えて、またはＨＳＡの代わりに含む。
いくつかの実施形態では、前記組成物は、凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、例えば約１％
〜約１５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約１％〜約５％の
ＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、約１％〜約１５％、約２．５
％〜約１５％、約２．５％〜約１０％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％または約１
０％〜約１５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、約１％、２
％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１
４％または１５％のＤＭＳＯを含む。特定の実施形態では、組成物は約５％のＤＭＳＯを
含む。
具体的な実施形態では、前記細胞は凍結保存および解凍状態である。別の具体的な実施
形態では、前記細胞は７０μＭ〜１００μＭフィルターによる濾過状態である。別の具体
的な実施形態では、前記組成物は目に見える細胞塊を含まない。別の具体的な実施形態で
は、前記組成物は１０６個の細胞当たり約２００個未満の細胞塊を含み、前記細胞塊は顕
微鏡、例えば光学顕微鏡下でのみ目に見える。別の具体的な実施形態では、前記組成物は
１０６個の細胞当たり約１５０個未満の細胞塊を含み、前記細胞塊は顕微鏡、例えば光学
顕微鏡下でのみ目に見える。別の具体的な実施形態では、前記組成物は１０６個の細胞当
たり約１００個未満の細胞塊を含み、前記細胞塊は顕微鏡、例えば光学顕微鏡下でのみ目
に見える。
本明細書に記載の方法または組成物のいずれかの具体的な実施形態では、細胞は幹細胞
、例えば、血液を流出させたヒト産後胎盤から単離した幹細胞である。特定の実施形態で
は、このような細胞は増殖状態である。前述の実施形態のいずれかの別の具体的な実施形
態では、細胞は接着性細胞、すなわち、組織培養皿表面、例えば、組織培養プラスチック
皿（非コーティング、または例えばフィブロネクチン、ラミニンなどでコーティングのい
ずれか）に接着する細胞である。接着性細胞の例には、例えば、本明細書に記載の接着性
胎盤幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、線維芽細胞などがある。別の実施形態では、細胞は
ヒト細胞である。
別の実施形態では、前記細胞は胎盤灌流液から得た（例えば単離した）細胞である。よ
り具体的な実施形態では、前記細胞は有核細胞、例えば、胎盤灌流液から得た全有核細胞
である。特定の実施形態では、灌流によってそこから全有核胎盤細胞を得る胎盤は血液を
流出させ、全有核胎盤細胞を回収するための灌流前に灌流させて残留血液を除去する。特
定の他の実施形態では、灌流によってそこから全有核胎盤細胞を得る胎盤は血液を流出さ
せているが、全有核胎盤細胞を回収するための灌流前に灌流させて残留血液を除去するこ
とはない。特定の他の実施形態では、灌流によってそこから全有核胎盤細胞を得る胎盤は
血液を流出させず、全有核胎盤細胞を回収するための灌流前に灌流させて残留血液を除去
することもない。
方法の別の具体的な実施形態では、前記細胞は幹細胞である。より具体的な実施形態で
は、幹細胞は成体幹細胞、体性幹細胞、胚性幹細胞、胚生殖細胞、臍帯血幹細胞、羊水幹
細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、脂肪
由来間葉系幹細胞または骨膜由来間葉系幹細胞である。別の実施形態では、前記細胞はナ
チュラルキラー細胞である。
別の具体的な実施形態では、前記細胞は単離胎盤細胞である。特定の実施形態では、単
離胎盤細胞は単離胎盤幹細胞である。特定の他の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤
多分化能細胞である。
特定の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤幹細胞である。特定の他の実施形態では
、単離胎盤細胞は単離胎盤多分化能細胞である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は
フローサイトメトリーによって検出されるＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋で
ある。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤
細胞は胎盤幹細胞である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋
およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は多分化能胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、単
離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は、神経系の表現型の細胞、骨形
成原の表現型の細胞、または軟骨形成の表現型の細胞に分化する能力を有する。より具体
的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣ
Ｄ２００＋である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋および
ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋また
はＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およ
びＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋ま
たはＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０
５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０
＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、
ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ
９０＋およびＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０
＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５−細胞はさらにフローサイトメ
トリーによって検出されるＣＤ８０−およびＣＤ８６−である。
より具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞はさらにＣＤ
２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＳＨ３＋また
はＳＨ４＋の１つまたは複数である。別のより具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ
４４＋である。前述の単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞のいずれかの
具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦ
Ｒ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、および／またはプログ
ラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋の１つまたは複数である。
他の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋、Ｃ
Ｄ１０５＋、およびＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ
１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり、胚様体またはＯＣ
Ｔ−４＋の形成を可能にする条件下で集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細
胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、胚様体またはその任意の組
合せの形成を可能にする条件下で集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の
前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記
ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３
＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５
＋およびＣＤ２００＋胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およびＨＬＡ−
Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はＣ
Ｄ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＨＬＡ−Ｇ＋で
ある。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋胎
盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的
な実施形態では、前記ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４
−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＣ
Ｄ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−であ
る。
特定の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８
−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＣＤ
１１７−、ＣＤ１３３−、ＣＤ２００＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−
、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、ＭＨＣ−Ｉ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−
Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＰＤＬ１＋またはＡＢＣ−ｐ＋の１つまた
は複数であり、この場合ＡＢＣ−ｐは胎盤特異的ＡＢＣ輸送タンパク質（乳癌耐性タンパ
ク質（ＢＣＲＰ）としておよびミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても知ら
れる）である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３
４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ
３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、およびＯＣＴ−４＋である。別の実施形
態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−
、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋である。別の実施形態では、単離胎
盤細胞はＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、
ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。別の実施形態では、単離胎盤
細胞はＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、Ｃ
Ｄ５４＋、ＣＤ９０＋、ＨＬＡ−１＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋である。別の実施
形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＡＢＣ−ｐ＋である。別の実施形態では、
単離胎盤細胞はＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。別の実施形態
では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−で
ある。具体的な実施形態では、前記ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳ
ＳＥＡ４−細胞はさらにＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−
、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋である。別の実施形態
では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−、およびＳＨ３＋またはＳＨ４＋の
いずれかである。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４−、およびＣＤ１０＋、Ｃ
Ｄ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、またはＯＣＴ−４＋のいずれかである
。特定の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣ
Ｄ２００＋である。
別の実施形態では、本明細書に記載の治療法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋
、ＣＤ２９−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ−、ＣＤ６２−Ｅ−、ＣＤ
６２−Ｌ−、ＣＤ６２−Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、ＣＤ１０４−、
ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４
／ＣＸＣＲ４−、β２−マイクログロブリン低、ＭＨＣ−Ｉ低、ＭＨＣ−ＩＩ−、ＨＬＡ
−Ｇ低、および／またはＰＤＬ１低の１つまたは複数である。具体的な実施形態では、単
離胎盤細胞は少なくともＣＤ２９−およびＣＤ５４−である。別の具体的な実施形態では
、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ４４＋およびＣＤ１０６＋である。別の具体的な実施形
態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ２９＋である。
別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、同数の骨髄由来間葉系幹細胞より検
出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は
、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ
、Ｃ１１またはｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、Ｄ
ＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ
１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ
１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ
３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、
ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、Ｖ
ＴＮ、およびＺＣ３Ｈ１２Ａの１つまたは複数であり、前記骨髄由来間葉系幹細胞は、前
記単離胎盤細胞が経ている継代数と等しい培養の継代数を経ている。より具体的な実施形
態では、前記単離胎盤細胞は、（好ましくはＧｉｂｃｏからの）６０％のダルベッコ改変
イーグル培地（ＤＭＥＭ）−ＬＧおよび（好ましくはＳｉｇｍａからの）４０％のＭＣＤ
Ｂ−２０１；（好ましくはＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ．からの）２％ウシ胎児血清；１×
インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブ
ミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；（好ましくはＳｉｇｍａからの）１０−９Ｍのデキサメタゾン；
（好ましくはＳｉｇｍａからの）１０−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート；（好ま
しくはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの）表皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ；および（好ましく
はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの）血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍ
Ｌを含む培地において約３〜約３５の集団倍加で培養すると、前記１つまたは複数の遺伝
子を発現する。より具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、（好ましくはＧｉｂｃ
ｏからの）６０％のＤＭＥＭ−ＬＧおよび（好ましくはＳｉｇｍａからの）４０％のＭＣ
ＤＢ−２０１；（好ましくはＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ．からの）２％ウシ胎児血清；１
×インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アル
ブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；（好ましくはＳｉｇｍａからの）１０−９Ｍのデキサメタゾン
；（好ましくはＳｉｇｍａからの）１０−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート；（好
ましくはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの）表皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ；および（好まし
くはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの）血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／
ｍＬを含む培地において約３〜約３５の集団倍加で培養すると、前記１つまたは複数の遺
伝子を発現する。
別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞は、神経栄養増殖因子グリア細胞由来神経
栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、
胎盤増殖因子（ＰＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現する。
別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、その細胞の少なくとも５０％が前記
単離胎盤細胞である細胞の集団内に含有される。別の具体的な実施形態では、前記単離胎
盤細胞は、その細胞の少なくとも７０％が前記単離胎盤細胞である細胞の集団内に含有さ
れる。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、その細胞の少なくとも８０％が
前記単離胎盤細胞である細胞の集団内に含有される。別の具体的な実施形態では、前記単
離胎盤細胞は、その細胞の少なくとも９０％が前記単離胎盤細胞である細胞の集団内に含
有される。特定の他の実施形態では、前記細胞集団中の胎盤細胞は、母方の遺伝子型を有
する細胞は実質的に含まず、例えば、前記集団中の少なくとも４０％、４５％、５０％、
５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％ま
たは９９％の胎盤細胞が胎児の遺伝子型を有する、すなわち胎児起源である。特定の他の
実施形態では、前記胎盤細胞を含む細胞の集団は、母方の遺伝子型を有する細胞は実質的
に含まず、例えば、前記集団中の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、
６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の細胞
が胎児の遺伝子型を有する、すなわち胎児起源である。
特定の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４＋胎盤細胞、例えば造血胎盤細胞である
。このような細胞は、胎盤組織から、例えば臍帯血を流出させ、灌流させて残留血液を除
去した胎盤から得ることができる。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋胎盤細胞はＣＤ３８
＋である。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋胎盤細胞はＣＤ３８−である。特定の他の実
施形態では、ＣＤ３４＋胎盤細胞はＣＤ４５＋である。具体的な実施形態では、胎盤細胞
はＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＣＤ４５＋である。
単離胎盤細胞の任意の前述の実施形態では、単離胎盤細胞は、増殖培地、すなわち増殖
を促進するように処方した培地における培養中に、例えば増殖培地における増殖中に一般
に分化しない。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、増殖するためのフィー
ダー層を必要としない。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、フィーダー細
胞層の不在下での培養の結果として培養中に分化しない。
別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、血液を流出させ、灌流させて残
留血液を除去した産後胎盤、血液を流出させているが灌流させて残留血液を除去すること
はない産後胎盤、または血液を流出させておらず灌流させて残留血液を除去することもな
い産後胎盤の灌流によって得る。別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、
胎盤組織の物理的および／または酵素による破壊によって得る。
前述の方法の特定の実施形態では、単離胎盤細胞を、胎盤細胞バンクの構築の一部とし
て濾過および凍結保存する。例えば、単離胎盤細胞を胎盤または胎盤組織から単離し、培
養した後、例えばデキストラン、例えばデキストラン４０、例えば５．５％のデキストラ
ン４０を含む溶液に再懸濁する。より具体的な実施形態では、溶液は凍結保存用の調製に
おけるＨＳＡおよび／またはＤＭＳＯをさらに含む。当該バンク中の凍結保存した単離胎
盤細胞は、必要に応じて解凍し、例えば本明細書に記載するように１０％のデキストラン
４０を含む溶液で希釈する。方法の特定の実施形態では、本明細書に記載の濾過および希
釈法は単離胎盤細胞の初期単離の一部ではない。
特定の実施形態では、前記単離胎盤細胞は、血液を流出させ、灌流させて残留血液を除
去した産後胎盤の灌流によって得る。別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞
は、胎盤組織の物理的および／または酵素による破壊によって得る。
ＨＳＡ、デキストラン４０およびＤＭＳＯの解空間、および細胞の生存および増殖に対する様々な成分濃度の影響を評価するための実験設計を示す三角図である。 異なる割合（％）のＤＭＳＯを含む製剤に関する濾過保持アッセイ（ＦＲＡ）データを示す図である。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置での読み出し値として、充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。アッセイ対照＝１００％デキストラン４０溶液、細胞染色剤含む、細胞含まず。 ＨＳＡの異なる体積分率を含む細胞製剤に関するＦＲＡデータを示す図である。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置での読み出し値として、充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。アッセイ対照＝１００％デキストラン４０溶液、細胞染色剤含む、細胞含まず。 異なる割合（％）のＤＭＳＯ（０〜２０％）を含む細胞製剤に関する解凍後のトリパンブルーを用いた生存率を示す図である。 様々な濃度のＤＭＳＯ（０〜２０％）の作用（function）としての解凍後の全細胞回収率を示す図である。 ＭＴＳアッセイ（以下のセクション６．３．１を参照）によって評価した、異なる割合（％）のＤＭＳＯを含む様々な製剤の作用としての培養再建の図である。 ２５％ＨＳＡの異なる体積分率を含む細胞製剤の解凍後の細胞生存率を示す図である。 ＨＳＡ体積分率の作用としての解凍後の全細胞回収率を示す図である。 Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）水性非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の使用によって作製した、ＨＳＡの異なる分率の作用としての培養再建を評価したデータを示す図である。 異なる濃度の製剤成分を含む製剤に関するビーズ反応アッセイによって評価した免疫抑制のレベルの図である。 ＦＲＡアッセイにより決定した様々な凍結細胞密度（１〜４０×１０６個の細胞／ｍＬ）の作用としての細胞凝集の図である。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置での読み出し値として、充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。 凍結細胞密度（１００万〜４０００万個の細胞／ｍＬ）の作用としての細胞凝集の図である。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置での読み出し値として、充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。 ＦＲＡアッセイにより決定した様々な分子量のデキストランの作用としての細胞凝集の図である。デキストラン１，０００、４０，０００および７０，０００（すなわち、それぞれデキストラン１、デキストラン４０およびデキストラン７０）にわたるＦＲＡシグナル等価。充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。アッセイ対照＝１００％デキストラン４０溶液、細胞染色剤含む、細胞含まず。 異なる分子量のデキストランを含む製剤にわたる解凍後の生存率を示す図である。 異なる分子量のデキストランを含む製剤にわたる細胞回収率を示す図である。 異なる分子量のデキストランを含む製剤にわたるＣＤ１０５＋／ＣＤ２００＋を示す図である。 異なる分子量のデキストランを含む製剤にわたるビーズＴ細胞反応（ＢＴＲ）のデータを示す図である。 異なる多糖を含む製剤にわたるＦＲＡにより測定した細胞凝集を示す図である。アッセイ対照＝１００％デキストラン４０溶液、細胞染色剤含む、細胞含まず。 非デキストラン４０多糖で製剤化した細胞の解凍後の生存率を示す図である。充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。 異なる多糖を含む製剤の作用としての生存細胞回収率の図である。 デキストラン４０、またはデキストラン４０の代わりにマルトデキストラン、スクロース、トレハロース、ヘパリン、ヘタスターチもしくはグリコーゲンを含む細胞製剤におけるＣＤ１０５＋／ＣＤ２００＋の発現を示す図である。 デキストラン４０および６個の非デキストラン４０の異なる糖／多糖に関するＢＴＲデータを示す図である。 １０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む製剤にわたるＦＲＡにより測定した細胞凝集を示す図である。アッセイ対照＝１００％デキストラン４０溶液、細胞染色剤含む、細胞含まず。 １０％ＨＳＡ、１０％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳを含む製剤にわたる細胞の解凍後の生存率の図である。 １０％ＨＳＡ、４％ＨＳＡ、１０％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳを含む製剤にわたる解凍後の回収率を示す図である。 １０％ＨＳＡ、４％ＨＳＡ、１０％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳを含む製剤にわたるＣＤ１０５＋／ＣＤ２００＋の発現により測定した細胞の同一性を示す図である。 １０％ＨＳＡ、１０％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳを含む製剤にわたるＣＤ３４−／ＣＤ１０＋の発現を示す図である。 １０％ＨＳＡ、４％ＨＳＡ、１０％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳを含む製剤にわたるＢＴＲアッセイにより測定した細胞機能を示す図である。 骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に関する、ＦＲＡの細胞凝集の結果を示す図である。充填した細胞１００万個当たりのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）でデータを表す。
５．詳細な説明
５．１ 定義
本明細書で使用する用語「約」は、例えば、言及する数字または値の１０％以内を意味
する。
本明細書で使用する「マクロ細胞塊」は、拡大せずに目に見える、例えば裸眼で見える
細胞の凝集を意味し、一般に約１５０ミクロンより大きい細胞凝集を指す。
本明細書で使用する「ミクロ細胞塊」は、拡大してのみ目に見える細胞の凝集を意味し
、一般に約１５０ミクロンより小さい細胞凝集を指す。
本明細書で使用する用語「ＳＨ２」は、マーカーＣＤ１０５上のエピトープと結合する
抗体を指す。したがって、ＳＨ２＋と呼ぶ細胞はＣＤ１０５＋である。
本明細書で使用する用語「ＳＨ３」および「ＳＨ４」は、マーカーＣＤ７３上のエピト
ープと結合する抗体を指す。したがって、ＳＨ３＋および／またはＳＨ４＋と呼ぶ細胞は
ＣＤ７３＋である。
本明細書で使用する用語「単離細胞」、例えば「単離幹細胞」は、細胞が由来する組織
、例えば胎盤の他の細胞から実質的に分離された細胞を意味する。その細胞と本来結合し
ていた少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも
９９％の細胞が、例えば細胞の回収および／または培養中に細胞が除去される場合、細胞
は「単離」されている。
本明細書で使用する「多分化能」は、細胞を指すとき、細胞が、必ずしも全てではない
がいくつかの身体の細胞型、または全てではないがいくつかの身体の細胞型の特性を有す
る細胞に、分化する能力を有することを意味する。特定の実施形態では、例えば、軟骨形
成または骨形成原細胞の特性を有する細胞のいずれかに分化する能力を有する単離多分化
能細胞が、多分化能細胞である。
本明細書で使用する用語「単離細胞の集団」は、細胞の集団が由来する組織、例えば胎
盤の他の細胞から実質的に分離された細胞の集団を意味する。
本明細書で使用する用語「胎盤幹細胞」は、形態、細胞表面マーカー、または初代培養
後の継代数とは無関係に、哺乳動物の胎盤に由来する幹細胞または前駆細胞を指す。胎盤
幹細胞は、血液、例えば臍帯血または胎盤血液からは得られず、かつ入手不能である。し
かしながら、本明細書で使用する用語「胎盤幹細胞」および「胎盤多分化能細胞」は、栄
養膜細胞、血管芽細胞、血液芽細胞、胚生殖細胞、胚幹細胞ではない胎盤幹細胞および胎
盤多分化能細胞、または胚盤胞の内部細胞塊から得られる細胞、胚生殖隆起から得られる
細胞、例えば胚生殖細胞は指さない。細胞が幹細胞の特性、例えば、１つまたは複数の型
の幹細胞と関係があるマーカーまたは遺伝子発現プロファイル、培養中に少なくとも１０
〜４０回複製する能力、３つの生殖層の１つまたは複数の細胞に分化する能力、成体（す
なわち分化した）細胞の特性の欠如などを示す場合、細胞は「幹細胞」であると考えられ
る。用語「胎盤幹細胞」と「胎盤由来幹細胞」は同意義で使用することができる。本明細
書で他に記さない限り、用語「胎盤」は臍帯を含む。本明細書で開示する胎盤幹細胞は、
特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（分化条件下で）分化する、ｉｎ ｖｉｖｏで分
化する、または両方である。
本明細書で使用するように、細胞、例えば幹細胞は、そのマーカーがバックグラウンド
を超えて検出可能であるとき特定のマーカーに「陽性」である。例えば、胎盤幹細胞は例
えばＣＤ７３に陽性である。ＣＤ７３は、（例えば、アイソタイプ対照と比較して）バッ
クグラウンドを超える検出可能な量で、胎盤幹細胞において検出可能であるからである。
マーカーを使用して少なくとも１つの他の細胞型とある細胞とを区別することができると
き、または、存在時または細胞によって発現されるときにマーカーを使用して細胞を選択
または単離することができるときも、その細胞はそのマーカーに陽性である。例えば抗体
仲介の検出の状況で、特定の細胞表面マーカーが存在する指標としての「陽性」は、その
マーカーに特異的な抗体、例えば蛍光標識抗体を使用してマーカーが検出可能であること
を意味する。「陽性」は、例えばサイトメーターにおいて、バックグラウンドを超えて検
出可能であるシグナルを生成する量で、そのマーカーを示す細胞も指す。例えば、ＣＤ２
００に特異的な抗体で細胞が検出可能に標識され、抗体からのシグナルが対照（例えば、
バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）のそれより検出可能に高い場合、細胞は「Ｃ
Ｄ２００＋」である。逆に、同じ状況での「陰性」は、バックグラウンドと比較して、そ
のマーカーに特異的な抗体を使用して細胞表面マーカーが検出不能であることを意味する
。例えば、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）より高い程度でＣ
Ｄ３４に特異的な抗体を用いて細胞を再現的に検出可能に標識できない場合、細胞は「Ｃ
Ｄ３４−」である。抗体を使用して検出されない、または検出不能なマーカーは、適切な
対照を使用する同様の形式で、陽性または陰性であると決定する。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ
、スロットブロットなどのＲＮＡを検出する方法によって決定される、細胞または細胞集
団由来のＲＮＡ中で検出されるＯＣＴ−４のＲＮＡの量が、バックグラウンドを超えて検
出可能である場合、その細胞または細胞集団はＯＣＴ−４＋であると決定することができ
る。本明細書で他に記さない限り、分化集団（「ＣＤ」）マーカーは抗体を使用して検出
する。ＯＣＴ−４のＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲを使用して検出可能である場合、ＯＣＴ−４が
存在すると決定することができ、細胞は「ＯＣＴ−４＋」である。
５．２ 細胞を含む改良型組成物および組成物の作製方法
細胞、例えば、幹細胞および胎盤幹細胞を含む組成物を作製する改良方法、およびそれ
によって生成する改良型組成物、例えば、医薬組成物が本明細書で提供される。細胞を含
む組成物、例えば、液体形で投与可能な組成物は、例えば、細胞塊、特に裸眼で見える細
胞塊（すなわち、マクロの細胞塊）を、個体への医薬組成物の投与の前に除去するとき、
レシピエントによって一般に十分許容される。本明細書に記載の細胞、例えば、血液を流
出させたヒト産後胎盤由来の幹細胞などの幹細胞、胎盤細胞を含む組成物を作製する方法
は、個体に投与するとき実質的に十分許容される組成物を生成する。
一実施形態では、組成物を作製する方法であって、細胞を含む溶液を濾過して濾過済み
細胞含有溶液を形成するステップ、例えば凍結保存前に、濾過済み細胞含有溶液を第１の
希釈溶液で、１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個以下の細胞に希釈するステップ
、および場合によって、生成した濾過済み細胞含有溶液を、デキストランを含む第２の希
釈溶液で希釈して前記組成物を生成するステップを含む方法が本明細書で提供される。別
の実施形態では、組成物を作製する方法であって、細胞を含む溶液を濾過して濾過済み細
胞含有溶液を形成するステップ、例えば凍結保存前に、濾過済み細胞含有溶液を第１の希
釈溶液で、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１
０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個以下の細胞に希
釈するステップ、および場合によって、生成した濾過済み細胞含有溶液を、デキストラン
を含む第２の希釈溶液で希釈して前記組成物を生成するステップを含む方法が本明細書で
提供される。特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個
未満である場合、濾過は任意選択である。
具体的な実施形態では、細胞は幹細胞である。より具体的な実施形態では、幹細胞は骨
髄由来間葉系幹細胞、または成体幹細胞である。具体的な実施形態では、細胞は単離胎盤
細胞である。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は胎盤幹細胞または胎盤多分化能
細胞である。別の具体的な実施形態では、細胞は胎盤灌流液由来の細胞、例えば胎盤灌流
液由来の有核細胞である。胎盤灌流液細胞を得る方法は以下のセクション５．３．４に記
載する。
具体的な実施形態では、第１の希釈溶液を用いた前記希釈と前記第２の希釈溶液を用い
た前記希釈の間に、細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、第１の希釈溶液は
デキストランおよびＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の
前記デキストランは、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．
７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５
％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％
、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９
．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のデキストランである。別の具体的な実
施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、デ
キストラン１である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の
希釈溶液中の前記デキストランは、デキストラン１である。別の具体的な実施形態では、
前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、デキストラン７
０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中
の前記デキストランは、デキストラン７０である。別の具体的な実施形態では、前記第１
の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、デキストラン４０である
。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中の前記デ
キストランは、デキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶
液中の前記デキストラン４０は、約２．５％のデキストラン４０〜約１０％のデキストラ
ン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４
０は、約２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、５
．７５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、
９．５％または１０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１
の希釈溶液中の前記デキストラン４０は、約５．５％のデキストラン４０である。
他の実施形態では、前記第１および／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて
、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりに多糖を含むことができる
。特定の実施形態では、多糖はグルコースのポリマー（２個以上のサブユニット）であり
、グルコースではない糖サブユニットは含まない。他の実施形態では、前記第１および／
または第２の希釈溶液は、マルトデキストリン（例えば、約２．５％、２．７５％、３．
０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５
％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、
６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８
．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のマ
ルトデキストリン）、トレハロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．
２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０
％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％
、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８
．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のトレハロース
）、またはヘタスターチ（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３
．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２
５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％
、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、
９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のヘタスターチ）の１つま
たは複数を含む。他の実施形態では、第１および／または第２の希釈溶液は、スクロース
（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４
．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７
５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％
、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、
９．５％、９．７５％、または１０％のスクロース）、ヘパリン（例えば、約５５ＵＳＰ
単位／１ｍＬのヘパリン）、またはグリコーゲン（例えば、約２．５％、２．７５％、３
．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７
５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％
、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、
８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％の
グリコーゲン）の１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、前記第１および／または
第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキス
トランの代わりにマルトデキストランを含む。別の特定の実施形態では、前記第１および
／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわ
ちデキストランの代わりにトレハロースを含む。別の特定の実施形態では、前記第１およ
び／または第２の希釈溶液は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に、すな
わちデキストランの代わりにヘタスターチを含む。
別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１〜１７％のＨ
ＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１％
、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％
、１４％、１５％、１６％または約１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、
ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約４〜１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施
形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約３．１２５％のＨＳＡである。別の
具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約５％のＨＳＡである。
別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１０％のＨＳＡで
ある。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１６．８７
５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液はＨＳＡを含む。
別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１〜１７％のＨＳＡ
である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１％、２％
、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４
％、１５％、１６％または１７％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１
の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約４〜１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、
前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約３．１２５％のＨＳＡである。別の具体的な実施
形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約５％のＨＳＡである。別の具体的な実
施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１０％のＨＳＡである。別の具体的
な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは約１６．８７５％のＨＳＡである
。
他の実施形態では、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（例えば、約１％、２％、３％、４
％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１
５％のＢＳＡ）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）（例えば、約１％、２％、３％、４％、５
％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％の
ＦＢＳ）を、前記溶液中でＨＳＡに加えて、またはＨＳＡ以外に、すなわちＨＳＡの代わ
りに使用することができる。
いくつかの実施形態では、第１の溶液中のＨＳＡとデキストラン、例えばデキストラン
１、デキストラン４０またはデキストラン７０の比は、約６：１のＨＳＡ：デキストラン
と約１：２．６のＨＳＡ：デキストランの間である。いくつかの実施形態では、ＨＳＡと
デキストランの比は、約６：１、５．５：１、５：１、４．５：１、４：１、３．５：１
、３：１、２．５：１、２．０：１、１．５：１、１：１、１：１．５、１：２または１
：２．６のＨＳＡ：デキストランである。いくつかの実施形態では、第１の溶液中のＨＳ
Ａとデキストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０の
比は、約３．１３％のＨＳＡ／８．２５％のデキストランである。いくつかの実施形態で
は、第１の溶液中のＨＳＡとデキストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０ま
たはデキストラン７０の比は、約１６．８８％のＨＳＡ／２．７５％のデキストランであ
る。特定の実施形態では、第１の溶液中のＨＳＡとデキストラン、例えばデキストラン１
、デキストラン４０またはデキストラン７０の比は、約１０％のＨＳＡ／５．５％のデキ
ストラン、例えばデキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０である。
別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液は凍結保護剤をさらに含む。より具体
的な実施形態では、前記凍結保護剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。特定の
実施形態では、前記第１の希釈溶液は約１％〜約１５％、約２．５％〜約１５％、約２．
５％〜約１０％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％または約１０％〜約１５％のＤＭ
ＳＯをさらに含む。特定の実施形態では、前記第１の希釈溶液は、約１％、２％、３％、
４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または
１５％のＤＭＳＯをさらに含む。特定の実施形態では、前記第１の希釈溶液は、約５％の
ＤＭＳＯをさらに含む。
具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液は、約５．５％のデキストラン４０、約１
０％のＨＳＡ、および約５％のＤＭＳＯを含む。
別の具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン４０は約１０％
のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、細胞を含む前記組成物は、約２
．５％、３．０％、３．２５％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、
５．７５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％
、９．５％、または１０％のデキストランを含む。別の具体的な実施形態では、細胞を含
む前記組成物は、約７．５％〜約９％のデキストランを含む。別の具体的な実施形態では
、前記組成物は、１ミリリットル当たり約１．５×１０６個の細胞〜１ミリリットル当た
り約５．０×１０６個の細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、１ミリ
リットル当たり約１．０±０．３×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約５．０±１
．５×１０６個の細胞を含む。具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液はＨＳＡを含
まない。
本明細書で提供する方法に有用なデキストランは、約１ｋＤａと約１５０ｋＤａの間、
例えば１ｋＤａ（デキストラン１）、約４０ｋＤａ（デキストラン４０）または約７０ｋ
Ｄａ（デキストラン７０）の分子量のデキストランであってよい。
別の具体的な実施形態では、細胞を含む溶液は凍結保護剤を含む。細胞を含む溶液が１
ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞を含む場合、第１の希釈ステップは
省略することができ、特定の実施形態では、細胞を懸濁する溶液は、凍結保護剤、例えば
ＤＭＳＯ、例えば約２％〜約１５％のＤＭＳＯ、例えば約５％のＤＭＳＯを含むことがで
きる。
別の実施形態では、組成物を作製する方法であって、（ａ）細胞、例えば、単離胎盤細
胞、例えば胎盤幹細胞もしくは胎盤多分化能細胞、または胎盤灌流液から単離した細胞、
例えば、胎盤灌流液から単離した全有核細胞、デキストランおよびヒト血清アルブミン（
ＨＳＡ）を含む溶液を濾過して、濾過済み細胞含有溶液を形成するステップ、（ｂ）場合
によって、前記濾過済み細胞含有溶液を、デキストランを含む第１の希釈溶液で、１ミリ
リットル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×
１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個の細胞に希釈するステップ、およ
び（ｃ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を、デキストランを含むがＨＳＡを含まな
い第２の希釈溶液で希釈し、それによって組成物を作製するステップを含む方法が本明細
書でさらに提供される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み
細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１５×１０６個を超える細胞を含む場合に実施し
、この場合のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞
である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が
１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合
のステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞である
。前記濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞を
含むいくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の希釈は省略し、ステップ（ａ）の溶液は
凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、例えば約２％〜約１５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実
施形態では、ステップ（ｂ）は、（ａ）の濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり
約７．５×１０６個を超える細胞を含む場合に実施し、この場合のステップ（ｂ）の前記
希釈は１ミリリットル当たり約７．５×１０６個の細胞である。方法の具体的な実施形態
では、ステップ（ｃ）の前に前記細胞を凍結保存する。特定の実施形態では、細胞数が１
ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満である場合、濾過は任意選択である。方法
の具体的な実施形態では、ステップ（ｃ）の前に前記細胞を凍結保存する。別の具体的な
実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、
デキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第
２の希釈溶液中の前記デキストランは、デキストラン４０である。別の具体的な実施形態
では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０は５．０％のデキストラン４０であ
る。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０は５．５
％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記細胞を含む溶液中の前記
ＨＳＡは約１％のＨＳＡ〜約１５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第
１の希釈溶液はＨＳＡを含む。より具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記
ＨＳＡは５％のＨＳＡである。より具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記
ＨＳＡは１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液は凍結
保護剤をさらに含む。より具体的な実施形態では、前記凍結保護剤は例えばＤＭＳＯ、例
えば約２％〜約１５％のＤＭＳＯである。別の具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶
液中の前記デキストラン４０は１０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態
では、ステップ（ａ）の前記溶液は凍結保護剤を含む。
方法の一態様では、細胞を含む最終組成物中の細胞塊の数を、好ましくは凍結保存の前
に、濾過を使用して低減またはゼロにする。細胞含有溶液中の細胞を凍結保存する特定の
実施形態では、凍結保存の前に細胞含有溶液を濾過する。例えば、溶液中の細胞、例えば
胎盤幹細胞を、凍結保存の前にフィルターを通過させて、目に見える細胞塊（細胞の凝集
、すなわちマクロの細胞塊）を除去することが可能である。一実施形態では、濾過は、前
記細胞を凍結保存する前に細胞含有溶液をフィルターで濾過することを含み、前記フィル
ターは約５０μＭ径と約１５０μＭ径の間の孔を含み（すなわち、フィルターは約５０μ
Ｍフィルター〜約１５０μＭフィルターである）、フィルターは細胞を含む溶液を濾過す
るのに適している。例えば、フィルターは、約５０μＭと約８０μＭの間、約６０μＭと
約９０μＭの間、約７０μＭと約１００μＭの間、約８０μＭと約１１０μＭの間、約９
０μＭと約１２０μＭの間、約１００μＭと約１３０μＭの間、約１１０μＭと約１４０
μＭの間、または約１２０μＭと約１５０μＭの間の孔を含むフィルターであってよく、
または５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５
、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０μＭ
フィルターであってよい。具体的な実施形態では、前記フィルターは７０μＭフィルター
である。別の具体的な実施形態では、前記フィルターは１００μＭフィルターである。別
の具体的な実施形態では、前記フィルターは約７０μＭフィルター〜１００μＭフィルタ
ーである。別の具体的な実施形態では、前記細胞含有溶液は解凍後に濾過し、さらに凍結
前に濾過する。
他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の
細胞である場合、濾過は任意選択である。
様々な実施形態では、細胞、例えば、単離胎盤細胞を含む組成物を作製する方法は、１
ミリリットル当たり約５０×１０６、４０×１０６、３０×１０６、２０×１０６、１５
×１０６、１０×１０６、９．５×１０６、９×１０６、８．５×１０６、８×１０６、
７．５×１０６、７×１０６、６．５×１０６、６×１０６、５．５×１０６、５×１０
６、４．５×１０６、４×１０６、３．５×１０６、３×１０６、または２．５×１０６
個の細胞を超えない細胞を凍結保存するステップを含む。具体的な実施形態では、１ミリ
リットル当たり約１０±３×１０６個以下の細胞で細胞を凍結保存する。別の具体的な実
施形態では、１ミリリットル当たり約１５×１０６個以下の細胞で細胞を凍結保存する。
別の具体的な実施形態では、１ミリリットル当たり約５×１０６個以下の細胞で細胞を凍
結保存する。別の具体的な実施形態では、１ミリリットル当たり約５．０×１０６個〜約
７．５×１０６個の細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、１ミリリットル当
たり約５×１０６個の細胞で細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、１ミリリ
ットル当たり約７．５×１０６個の細胞で細胞を凍結保存する。具体的な実施形態では、
１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞で細胞を凍結保存する。別の具体的な
実施形態では、前記細胞を解凍しデキストラン４０、例えば１０％のデキストラン４０で
１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）、例えば１：１〜１：５（ｖ／ｖ）に希釈したとき、１０６
個の細胞当たり２個以下の目に見える細胞塊（すなわちマクロ細胞塊）の形成をもたらす
数で、前記細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、前記細胞を解凍し、デキス
トラン４０、例えば１０％のデキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）、例えば１
：１〜１：５（ｖ／ｖ）に希釈したとき、目に見える細胞塊の形成をもたらさない数で、
前記単離胎盤細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、前記細胞を解凍し、１０
％のデキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）、例えば１：１〜１：５（ｖ／ｖ）
に希釈したとき、１０６個の細胞当たり約１５０、１４０、１３０、１２０、１１０また
は１００未満のミクロ細胞塊の形成をもたらす数で、前記細胞を凍結保存する。
別の実施形態では、組成物を作製する方法であって、例えば、凍結保存後に、細胞、例
えば、単離胎盤細胞を、デキストラン４０を含む溶液と接触させるステップ、例えば、細
胞を、デキストラン４０を含む溶液に再懸濁するステップまたは細胞を希釈するステップ
を含む方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、溶液は約２．５％のデキス
トラン４０〜約１０％のデキストラン４０（ｗ／ｖ）を含む。具体的な実施形態では、溶
液は約５％のデキストラン４０〜約１０％のデキストラン４０（ｗ／ｖ）を含む。別の具
体的な実施形態では、溶液は５．０％のデキストラン溶液または１０％のデキストラン溶
液である。別の具体的な実施形態では、溶液は５．５％のデキストラン溶液または１０％
のデキストラン溶液である。他の実施形態では、デキストランは、分子量、例えば約１キ
ロダルトンと約１５０キロダルトンの間の平均分子量を有する。他の実施形態では、デキ
ストランは、分子量、例えば約１ｋＤａと約１５０ｋＤａの間、約１ｋＤａと約１２５ｋ
Ｄａの間、約１ｋＤａと約１００ｋＤａの間、約１ｋＤａと約７５ｋＤａの間、約１ｋＤ
ａと約５０ｋＤａの間、または約１ｋＤａと約２５ｋＤａの間の平均分子量を有する。他
の実施形態では、デキストランは、分子量、例えば約１ｋＤａと約１０ｋＤａの間、約３
０ｋＤａと約５０ｋＤａの間、または約６０ｋＤａと約８０ｋＤａの間の平均分子量を有
する。他の実施形態では、溶液は約２％のデキストラン〜約２５％のデキストランを含む
。具体的な実施形態では、前記溶液はＨＳＡを含まない。別の具体的な実施形態では、前
記溶液は、前記細胞、例えば、前記胎盤幹細胞と密度が適合する。例えば溶液は、単離胎
盤細胞の密度の５％、２％、１％、０．５％、０．２％または０．１％以内にある。別の
具体的な実施形態では、溶液は前記細胞と密度が適合しない。
別の実施形態では、細胞、例えば、単離胎盤細胞を含む組成物を作製する方法は、（ａ
）凍結保存前に前記細胞を含む細胞含有溶液を濾過するステップ、（ｂ）細胞を１ミリリ
ットル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１
０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個の細胞で凍結保存するステップ、（
ｃ）細胞を解凍するステップ、および（ｄ）細胞含有溶液をデキストラン４０溶液で約１
：１（ｖ／ｖ）〜約１：１１に希釈するステップを含む。特定の実施形態では、ステップ
（ｂ）において約１５×１０６個の細胞を凍結保存する。特定の実施形態では、ステップ
（ｂ）において細胞を１ミリリットル当たり最大１５×１０６個の細胞で凍結保存する。
特定の実施形態では、ステップ（ｂ）において１ミリリットル当たり約１０±３×１０６
個を超えない細胞を凍結保存する。他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当
たり約１０±３×１０６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。より具体的な
実施形態では、ステップ（ｂ）の細胞は、約５％〜約１０％のデキストラン４０およびＨ
ＳＡを含む溶液中に凍結保存する。
別の実施形態では、組成物を作製する方法は、
（ａ）細胞、５．５％デキストラン４０溶液、および１０％ＨＳＡを含む溶液を７０μ
Ｍフィルターで濾過して濾過済み細胞含有溶液を生成するステップ、
（ｂ）濾過済み細胞含有溶液を、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５
％ＤＭＳＯを含む溶液で、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６
、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個
の細胞に希釈するステップ、
（ｄ）前記濾過済み細胞含有溶液中の細胞を凍結保存するステップ、
（ｅ）細胞を解凍するステップ、および
（ｆ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を１０％デキストラン４０で希釈するステ
ップ
を含む。
特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０
６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当
たり約１０±３×１０６個の細胞である。濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり
約１０±３×１０６個未満の細胞を含む実施形態では、ステップ（ａ）の溶液は凍結保護
剤、例えばＤＭＳＯ、例えば約１％〜約５％のＤＭＳＯを含み、ステップ（ｂ）は省略す
る。他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満
の細胞である場合、濾過は任意選択である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｆ）は
、濾過済み細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希
釈するステップを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｆ）は、濾過済み細胞含有
溶液を１０％のデキストラン４０で１：１〜１：５（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む
。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物を作製する方法は、
（ａ）複数の細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、
（ｂ）細胞を５．５％デキストラン４０に再懸濁するステップ、
（ｃ）細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、
（ｄ）細胞を、１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０溶液に再懸濁して細胞含
有溶液を生成するステップ、
（ｅ）細胞含有溶液を、７０μＭフィルターで濾過して濾過済み細胞含有溶液を生成す
るステップ、
（ｆ）濾過済み細胞含有溶液を５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％
ＤＭＳＯを含む溶液中に、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６
、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個
の細胞に希釈するステップ、
（ｇ）前記濾過済み細胞含有溶液中の細胞を凍結保存するステップ、
（ｈ）細胞を解凍するステップ、および
（ｉ）場合によって、濾過済み細胞含有溶液を１０％デキストラン４０で希釈するステ
ップを含む。
特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０
６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当
たり約１０±３×１０６個の細胞である。他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリッ
トル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。ステッ
プ（ｄ）の前記再懸濁が、１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞を含む
細胞含有溶液を生成する実施形態では、ステップ（ｄ）の溶液は凍結保護剤、例えばＤＭ
ＳＯ、例えば約１％〜約５％のＤＭＳＯを含み、ステップ（ｆ）は省略する。いくつかの
実施形態では、ステップ（ｉ）は、濾過済み細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で
１：１〜１：５（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む。いくつかの実施形態では、ステッ
プ（ｉ）は、濾過済み細胞含有溶液を１０％のデキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ
／ｖ）に希釈するステップを含む。
前述の方法のいずれかの具体的な実施形態では、組成物中のＤＭＳＯの最終濃度が約２
．５％、２．０％、１．５％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０
．５％、０．４％、０．３％、０．２％または約０．１％未満であるように、細胞を含む
組成物からＤＭＳＯを実質的に除去する。ＤＭＳＯの除去は、例えば、細胞を遠心分離に
かけその細胞を１０％デキストラン４０に再懸濁することによって実施することができる
。このような遠心分離および再懸濁のステップは、１回または複数回繰り返すことができ
る。
前述の方法のいずれかの別の具体的な実施形態では、方法は、生成した細胞組成物を１
ミリリットル当たり約５×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり１×１０８個の細胞に
濃縮するステップをさらに含む。このような組成物は、例えば、その必要性がある個体へ
の組成物の皮下投与に有用である。
前述の方法のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞は胎盤幹細胞以外の細胞であ
る。より具体的な実施形態では、例えば、細胞は幹細胞または非幹細胞であってよい。細
胞が幹細胞である具体的な実施形態では、幹細胞は、例えば成体幹細胞、体性幹細胞、胚
性幹細胞、胚生殖細胞、臍帯血幹細胞、羊水幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯血由来
間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞または骨膜由来間葉系幹
細胞であってよい。別の具体的な実施形態では、細胞はナチュラルキラー細胞、例えばＣ
Ｄ３−、ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞である。
別の態様において、組成物、例えば医薬組成物が本明細書で提供される。特定の実施形
態では、前述の方法によって組成物を作製する。特定の実施形態では、組成物は目に見え
る細胞塊、すなわちマクロの細胞塊を欠く。特定の他の実施形態では、組成物は、濾過し
なかった組成物と比較して、ミクロ細胞塊（顕微鏡、例えば光学顕微鏡を用いてのみ目に
見える塊）の数が相当減少した、例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％未満のミクロ細胞塊を含む。
一実施形態では、１０％デキストラン４０を含む溶液中に、複数の細胞、例えば、複数
の単離胎盤細胞、または胎盤灌流液から単離した細胞、例えば、胎盤灌流液から単離した
全有核細胞を含む、組成物、例えば医薬組成物が本明細書で提供され、前記組成物は１ミ
リリットル当たり約１．０±３×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約５．０±１．
５×１０６個の細胞を含み、前記組成物は目に見える細胞塊を含まない（すなわちマクロ
の細胞塊を含まない）。いくつかの実施形態では、前記組成物は１ミリリットル当たり約
１．５×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約３．７５×１０６個の細胞を含む。特
定の他の実施形態では、組成物は１ミリリットル当たり約１．０×１０６個の細胞〜１ミ
リリットル当たり約１５×１０６個の細胞、例えば、１ミリリットル当たり約７．５×１
０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞を含む。特定の他の実施形
態では、組成物は１ミリリットル当たり約２０×１０６個未満の細胞を含む。具体的な実
施形態では、前記細胞は凍結保存および解凍状態である。別の具体的な実施形態では、前
記細胞を７０μＭ〜１００μＭフィルターで濾過している。別の具体的な実施形態では、
前記組成物はマクロの細胞塊を含まない。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、１
０６個の細胞当たり約２００未満のミクロ細胞塊を含む。別の具体的な実施形態では、前
記組成物は、１０６個の細胞当たり約１５０未満のミクロ細胞塊を含む。別の具体的な実
施形態では、前記組成物は、１０６個の細胞当たり約１００未満のミクロ細胞塊を含む。
別の具体的な実施形態では、前記組成物は、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．
６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満のＤＭＳＯを含む
。
いくつかの実施形態では、組成物は約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、
３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．
２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０
％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％
、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のデキストラン、例えば
デキストラン１、デキストラン４０またはデキストラン７０を含む。具体的な実施形態で
は、前記組成物は約７．５％〜約９％のデキストラン４０を含む。具体的な実施形態では
、前記組成物は約５．５％のデキストラン４０を含む。
他の実施形態では、前記組成物は、デキストランに加えて、またはデキストラン以外に
、すなわちデキストランの代わりに多糖を含む。特定の実施形態では、多糖は非グルコー
ス糖サブユニットを含まないグルコースのポリマーである。他の実施形態では、前記組成
物は、マルトデキストリン（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、
３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．
２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０
％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％
、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のマルトデキストリン）
、トレハロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、
３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５
．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２
５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％
、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のトレハロース）、またはヘタスタ
ーチ（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％
、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５
．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．
５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５
％、９．５％、９．７５％、または１０％のヘタスターチ）を含む。他の実施形態では、
前記組成物は、スクロース（例えば、約２．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、
３．５％、３．７５％、４．０％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．
２５％、５．５％、５．７５％、６．０％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０
％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％
、９．０％、９．２５％、９．５％、９．７５％、または１０％のスクロース）、ヘパリ
ン（例えば、５５ＵＳＰ単位／１ｍＬのヘパリン）、またはグリコーゲン（例えば、約２
．５％、２．７５％、３．０％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４．０％、４．２
５％、４．５％、４．７５％、５．０％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６．０％
、６．２５％、６．５％、６．７５％、７．０％、７．２５％、７．５％、７．７５％、
８．０％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９．０％、９．２５％、９．５％、９．
７５％、または１０％のグリコーゲン）を含む。特定の実施形態では、前記組成物は、デ
キストランに加えて、またはデキストラン以外に、すなわちデキストランの代わりにマル
トデキストランを含む。別の特定の実施形態では、前記組成物は、デキストランに加えて
またはデキストランの代わりにトレハロースを含む。別の特定の実施形態では、前記組成
物は、デキストランに加えてまたはデキストランの代わりにヘタスターチを含む。
別の具体的な実施形態では、前記組成物は約１〜約１７％のＨＳＡを含む。いくつかの
実施形態では、前記組成物は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９
％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％または１７％のＨＳＡを
含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約３．１２５％のＨＳＡを含む。いくつか
の実施形態では、前記組成物は約５％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組
成物は約１０％のＨＳＡを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約１６．８７５
％のＨＳＡを含む。
他の実施形態では、前記組成物は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（例えば、約１％、
２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、
１４％または１５％のＢＳＡ）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）（例えば、約１％、２％、
３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％
または１５％のＦＢＳ）を、ＨＳＡに加えて、またはＨＳＡの代わりに含む。
いくつかの実施形態では、前記組成物は、凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、例えば約１％
〜約１５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は約１％〜約５％の
ＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、約１％〜約１５％、約２．５
％〜約１５％、約２．５％〜約１０％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％または約１
０％〜約１５％のＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、約１％、２
％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１
４％または１５％のＤＭＳＯを含む。特定の実施形態では、組成物は約５％のＤＭＳＯを
含む。
細胞を含む組成物が本明細書でさらに提供され、前記組成物は本明細書で開示する方法
の１つによって生成する。例えば一実施形態では、細胞を含む組成物が本明細書で提供さ
れ、前記組成物は、細胞を含む溶液を濾過して濾過済み細胞含有溶液を形成するステップ
、例えば凍結保存前に、濾過済み細胞含有溶液を第１の希釈溶液で、１ミリリットル当た
り約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜
１５×１０６、または１〜１０×１０６個の細胞に希釈するステップ、および生成した濾
過済み細胞含有溶液を、デキストランを含むがＨＳＡを含まない第２の希釈溶液で希釈し
て前記組成物を生成するステップを含む方法によって生成する。特定の実施形態では、前
記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、前
記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞である。特定の実施形態では
、前記希釈は１ミリリットル当たり約７．５×１０６個の細胞である。他の特定の実施形
態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞である場合、濾
過は任意選択である。特定の実施形態では、第１の希釈溶液を用いた前記希釈と第２の希
釈溶液を用いた前記希釈の間に細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、第１の
希釈溶液はデキストランおよびＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、前記第１の希
釈溶液または前記第２の希釈溶液中のデキストランはデキストラン４０である。別の具体
的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中のデキストランはデ
キストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキス
トラン４０は５．０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１
の希釈溶液中の前記デキストラン４０は５．５％のデキストラン４０である。別の具体的
な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは１０％のＨＳＡである。別の具
体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液はＨＳＡを含む。より具体的な実施形態では、
前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では
、前記第１の希釈溶液は凍結保護剤を含む。より具体的な実施形態では、前記凍結保護剤
はＤＭＳＯである。別の具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラ
ン４０は約１０％のデキストラン４０である。別の具体的な実施形態では、細胞を含む前
記組成物は約７．５％〜約９％のデキストランを含む。別の具体的な実施形態では、細胞
を含む前記組成物は１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０６個の細胞〜１ミリリ
ットル当たり約５．０±１．５×１０６個の細胞を含む。別の具体的な実施形態では、細
胞を含む前記組成物は１ミリリットル当たり約１．５×１０６個の細胞〜１ミリリットル
当たり約３．７５×１０６個の細胞を含む。
別の実施形態では、細胞を含む組成物は、（ａ）凍結保存前に前記細胞を含む細胞含有
溶液を濾過して、濾過済み細胞含有溶液を生成するステップ、（ｂ）細胞を濾過済み細胞
含有溶液中に１ミリリットル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×
１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個の細胞で凍結
保存するステップ、（ｃ）細胞を解凍するステップ、および（ｄ）濾過済み細胞含有溶液
をデキストラン４０溶液で約１：１〜約１：１１（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む方
法によって作製する。特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×
１０６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。より具体的な実施形態では、ス
テップ（ｂ）の細胞は１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞で凍結保存する
。より具体的な実施形態では、ステップ（ｂ）の細胞は、約５％〜約１０％のデキストラ
ン４０およびＨＳＡを含む溶液中に凍結保存する。特定の実施形態では、ステップ（ｄ）
の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞である。
別の実施形態では、細胞を含む組成物は、（ａ）細胞を、１０％ＨＳＡを含む５．５％
デキストラン４０溶液に懸濁して細胞含有溶液を形成するステップ、（ｂ）細胞含有溶液
を７０μＭフィルターで濾過するステップ、（ｃ）細胞含有溶液を、５．５％デキストラ
ン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯを含む溶液で、１ミリリットル当たり約１〜
５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１
０６、または１〜１０×１０６個の細胞に希釈するステップ、（ｄ）細胞を凍結保存する
ステップ、（ｅ）細胞を解凍するステップ、および（ｆ）細胞含有溶液を１０％デキスト
ラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む方法によって作製する
。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０
６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の前記希釈は１ミリリットル当
たり約１０±３×１０６個の細胞である。別の実施形態では、細胞を含む組成物は、（ａ
）複数の細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、（ｂ）細胞を５．５％デキス
トラン４０に再懸濁するステップ、（ｃ）細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステッ
プ、（ｄ）細胞を、１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０溶液に再懸濁するステ
ップ、（ｅ）細胞を７０μＭフィルターで濾過するステップ、（ｆ）細胞を５．５％デキ
ストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯ中に、１ミリリットル当たり約１〜５
０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０
６、または１〜１０×１０６個の細胞に希釈するステップ、（ｇ）細胞を凍結保存するス
テップ、（ｈ）細胞を解凍するステップ、および（ｉ）細胞を１０％デキストラン４０で
１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む方法によって作製する。特定の実
施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞
である。特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は約１０±３×１０６個の細胞
／ｍＬである。他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１
０６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。
本明細書に記載の細胞を含む組成物、例えば医薬組成物は、哺乳動物幹細胞および哺乳
動物非幹細胞を含めた任意の哺乳動物細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では
、本明細書に記載の細胞を含む組成物、例えば医薬組成物は、単離胎盤細胞、例えば本明
細書に記載の任意の単離胎盤細胞を含むことができる（例えば、以下のセクション５．３
を参照）。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はフローサイトメトリーによって検出さ
れるＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋である。より具体的な実施形態では、単
離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は胎盤幹細胞である。別のより具
体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は多分化
能胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ
１０５＋胎盤細胞は、神経系の表現型の細胞、骨形成原の表現型の細胞、または軟骨形成
の表現型の細胞に分化する能力を有する。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、
ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。別のより具体的な
実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにフロー
サイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的
な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにフロ
ーサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。より具体的な
実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらに
フローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別のより
具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞はさ
らにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である。別の
より具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、Ｃ
Ｄ９０＋、ＣＤ４５−細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ８０−
およびＣＤ８６−である。
より具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞はさらにＣＤ
２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＳＨ３＋また
はＳＨ４＋の１つまたは複数である。別のより具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ
４４＋である。前述の単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞のいずれかの
具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦ
Ｒ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、および／またはプログ
ラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋の１つまたは複数である。
組成物の特定の他の実施形態では、前記単離胎盤細胞はＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ
＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋
；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり
、胚様体またはＯＣＴ−４＋の形成を可能にする条件下で前記集団を培養すると、前記単
離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、胚
様体またはその任意の組合せの形成を可能にする条件下で前記集団を培養すると、単離胎
盤細胞を含む胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。具体的な
実施形態では、前記ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４
５−、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ７３
＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およ
びＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋細
胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＨＬＡ−
Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−
Ｇ＋細胞はＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋である。別の具体
的な実施形態では、前記ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−
、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記ＯＣＴ−４＋細
胞はＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５
−である。本明細書に記載の、細胞を含む組成物内に含有することができる単離胎盤細胞
は、以下のセクション５．３でより詳細に記載する。
本明細書で提供する組成物の他の具体的な実施形態では、細胞は胎盤幹細胞以外の細胞
である。より具体的な実施形態では、例えば、細胞は幹細胞または非幹細胞であってよい
。細胞が幹細胞である具体的な実施形態では、幹細胞は、例えば成体幹細胞、体性幹細胞
、胚性幹細胞、胚生殖細胞、臍帯血幹細胞、羊水幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯血
由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞または骨膜由来間葉
系幹細胞であってよい。別の具体的な実施形態では、細胞はナチュラルキラー細胞、例え
ばＣＤ３−、ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞である。
５．３ 単離胎盤細胞および単離胎盤細胞集団
本明細書で提供する組成物、例えば、医薬組成物において有用な単離胎盤多分化能細胞
は、組織培養基質と接着し多分化能細胞または幹細胞の特性を有する、胎盤またはその一
部分から入手可能である。特定の実施形態では、本明細書で開示する方法において有用な
単離胎盤細胞は、非胎盤細胞型に分化する能力を有する。本明細書で開示する方法におい
て有用な単離胎盤細胞は、胎児起源または母方起源のいずれかであってよい（すなわち、
それぞれ胎児または母親のいずれかの遺伝子型を有してよい）。単離胎盤細胞および単離
胎盤細胞の集団は胎児起源であることが好ましい。本明細書で使用する語句「胎児起源」
または「非母方起源」は、単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団が、胎児と関係がある
、すなわち胎児の遺伝子型を有する臍帯または胎盤構造から得られることを示す。本明細
書で使用する語句「母方起源」は、細胞または細胞の集団が、母親と関係がある、例えば
母方の遺伝子型を有する胎盤構造から得られることを示す。単離胎盤細胞、または単離胎
盤細胞を含む細胞の集団は、胎児または母方起源のみである単離胎盤細胞を含むことがで
き、または胎児と母方両方の起源の単離胎盤細胞の混合集団を含むことができる。単離胎
盤細胞、および単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、以下で論じる形態、マーカー、および
培養特性によって同定および選択することができる。本明細書で記載する方法および組成
物中で使用するのに適した単離胎盤細胞は、例えば、その開示全体が参照により本明細書
に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号および米国特許第７，
４６８，２７６号に記載された単離胎盤細胞を含むことができる。
５．３．１ 物理的および形態特性
本明細書に記載の単離胎盤細胞は、初代培養または細胞培養において培養すると、組織
培養基質、例えば組織培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）、または細胞外マ
トリクスまたはラミニン、コラーゲン（例えば、天然または変性）、ゼラチン、フィブロ
ネクチン、オルニチン、ビトロネクチンなどのリガンド、および細胞外膜タンパク質（例
えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））（ＢＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ、
Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）でコーティングした組織培養表面と接着する。培養中の単
離胎盤細胞は一般に線維芽細胞様、星状の外見を呈し、いくつかの細胞質突起が中心細胞
体から広がる。しかしながら、これらの細胞は、同じ条件下で培養した線維芽細胞と形態
学的に区別することができる。単離胎盤細胞は、線維芽細胞より多数のこのような突起を
示すからである。形態学的に、単離胎盤細胞は、一般に培養中により円形の、または敷石
状の形態を呈する造血幹細胞とも区別することができる。
５．３．２ 細胞表面、分子および遺伝子マーカー
単離胎盤細胞、例えば多分化能細胞または幹細胞、および単離胎盤細胞の集団は、幹細
胞、または幹細胞を含む細胞の集団を同定および／または単離するために使用することが
できる複数のマーカーを発現する。本明細書に記載の単離胎盤細胞、および胎盤細胞集団
（すなわち、２つ以上の単離胎盤細胞）は、胎盤、またはその任意の一部分（例えば、羊
膜、絨毛膜、胎盤葉など）から直接得られる、胎盤細胞および胎盤細胞含有細胞集団を含
む。単離胎盤細胞集団は、培養中の単離胎盤細胞の集団（すなわち、２つ以上）、および
容器、例えばバッグ中の集団も含む。本明細書に記載の単離胎盤細胞は、栄養膜細胞、血
管芽細胞、血液芽細胞、胚生殖細胞または胚幹細胞ではない。本明細書に記載の方法およ
び組成物に有用である胎盤多分化能細胞は、その開示全体が参照により本明細書に組み込
まれる、米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号、および米国特許第７，０４５
，１４８号および米国特許第７，４６８，２７６号に記載され、かつ以下に記載する。
本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、マーカーＣＤ７３
、ＣＤ１０５、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ｇ、および／またはＯＣＴ−４を一般に発現し、Ｃ
Ｄ３４、ＣＤ３８、またはＣＤ４５は発現せず、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、およびＤＲ−であ
る。さらに単離多分化能細胞は、一般にＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０
＋、ＣＤ４４＋およびＣＤ３８＋である。特定の実施形態では、細胞はＳＳＥＡ３−、Ｓ
ＳＥＡ４−またはＡＢＣ−ｐ＋の１つまたは複数である。単離胎盤細胞は、ＨＬＡ−ＡＢ
Ｃ（ＭＨＣ−１）を発現することもできる。これらのマーカーは任意の組合せで使用して
、単離胎盤細胞、例えば、単離胎盤幹細胞または単離多分化能細胞を同定すること、およ
び単離胎盤細胞と他の細胞型を区別することができる。単離胎盤細胞はＣＤ７３およびＣ
Ｄ１０５を発現することができるので、それらは間葉系幹細胞様の特性を有する可能性が
ある。例えばＣＤ３４、ＣＤ３８および／またはＣＤ４５の発現の欠如によって、非造血
幹細胞として単離胎盤細胞を同定する。
特定の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤幹細胞である。特定の他の実施形態では
、単離胎盤細胞は単離胎盤多分化能細胞である。一実施形態では、単離胎盤細胞はフロー
サイトメトリーによって検出されるＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋である。
具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は胎盤幹細
胞である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤
細胞は多分化能胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０
＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、神経系の表現型の細胞、骨形成原の表現型の細胞、または
軟骨形成の表現型の細胞に分化する能力を有する。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ
３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。別の具体的な
実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ４５−
またはＣＤ９０＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、Ｃ
Ｄ１０５＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ４５−および
ＣＤ９０＋である。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０
５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０
＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０
＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出さ
れるＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である、すなわち、細胞はＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、Ｃ
Ｄ４５−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態
では、前記ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ４５−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２０
０＋細胞はさらにＣＤ８０−およびＣＤ８６−である。
具体的な実施形態では、前に記載したＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞のい
ずれかはさらにＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＳＨ３＋またはＳＨ
４＋の１つまたは複数である。別のより具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ４４＋
である。前述の単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞のいずれかの別の具
体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ
２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、および／またはＰＤＬ１
＋の１つまたは複数である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ
１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４
＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（
ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２
＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カド
ヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、Ｓ
ＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、
Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ＋、またはプログラム死−１リガン
ド（ＰＤＬ１）＋、またはこれらの任意の組合せの１つまたは複数である。より具体的な
実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ１３＋、Ｃ
Ｄ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、
ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ
７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０
６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣ
Ｒ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、Ａ
ＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ
、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ＋、およびプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、Ｃ
Ｄ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細
胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約１０％、少
なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、ま
たは少なくとも約６０％が、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞である
。前記細胞集団中の細胞の少なくとも約７０％が、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１
０５＋胎盤細胞であることが好ましい。前記細胞の少なくとも約９０％、９５％、または
９９％が、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞であることがより好まし
い。具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさら
にＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ
１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ
９０＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ
１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検
出されるＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、前に記載した
単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞のいずれかはさらにＣＤ２９＋、Ｃ
Ｄ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋の１つまたは複数である。
別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞、
または単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにＣＤ
４４＋である。前述の単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞を含む細胞集
団のいずれかの具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、
ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６
２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−
、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ
１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋
、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−
（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ
＋、またはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋、またはこれらの任意の組合せの１
つまたは複数である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５
＋細胞はさらにＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４
５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（
ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２
＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カド
ヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、Ｓ
ＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、
Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ＋、およびプログラム死−１リガン
ド（ＰＤＬ１）＋である。
特定の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３
８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４
＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、およびＡＢＣ−ｐ＋の１つまたは複数
、または全部であり、前記単離胎盤細胞は、胎盤組織の物理的および／または酵素による
破壊によって得る。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＡＢＣ−
ｐ＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−
であり、前記単離胎盤細胞は、以下の特性、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ
４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ
４−の少なくとも１つを有する。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４
＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ
９０＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−である。別の実施形態
では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−で
ある。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−であり
、かつＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかである。より具体的な実施形態では、単離胎盤
細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋である。別のより具体的な実施形
態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−
であり、かつＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかである。別のより具体的な実施形態では
、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−であり、ＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいず
れかであり、かつＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ
９０＋、ＳＳＥＡ３−、またはＳＳＥＡ４−の少なくとも１つである。別のより具体的な
実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、Ｃ
Ｄ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−で
あり、かつＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかである。
一実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、
ＣＤ２００＋またはＨＬＡ−Ｇ＋である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ２
００＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ７３
＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞はＣＤ３４
−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣ
Ｄ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細
胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の
具体的な実施形態では、前記ＣＤ２００＋またはＨＬＡ−Ｇ＋単離胎盤細胞は、胚様体の
形成を可能にする条件下での、単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団中での胚様体の形成を
容易にする。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、幹細胞または多分化能細胞で
はない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、これら
のマーカーを示さない胎盤幹細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、Ｃ
Ｄ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団である
。様々な実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０
％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも
約６０％が、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞である。前記細胞集団中の細胞の少な
くとも約７０％が、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞であることが好ましい。前記細
胞の少なくとも約９０％、９５％、または９９％が、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細
胞であることがより好ましい。単離集団の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はさらに
ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はさら
にＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、前記胎
盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋で
ある。別の実施形態では、前記単離細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養
したとき１つまたは複数の胚様体を生成する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞
集団は幹細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞
集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である胎盤細胞は、Ｃ
Ｄ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、前記
胎盤細胞はＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＣＤ３４−
、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＣＤ
３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、前記胎盤細胞
はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施
形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋胎盤細胞は、胚様体の形
成を可能にする条件下でその集団を培養すると、前記胎盤細胞の集団中での１つまたは複
数の胚様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞は幹細胞では
ない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞は、これらのマー
カーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、単
離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である
細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約１０％、
少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、
または少なくとも約６０％が、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞で
ある。別の実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約７０％が、単離ＣＤ７３
＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の
細胞の少なくとも約９０％、９５％、または９９％が、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、
ＣＤ２００＋胎盤細胞である。前記集団の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＨＬＡ
−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８
−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ３４
−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさ
らにＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実
施形態では、前記細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると１つまたは
複数の胚様体を生成する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞集団は、幹細胞では
ない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞集団は、これら
の特性を示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は
、ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ
７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞はＨＬ
Ａ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤
細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前
記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−
である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はＣ
Ｄ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋であ
る。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、胚様体の
形成を可能にする条件下で単離細胞を含む胎盤細胞の集団を培養すると、この集団による
１つまたは複数の胚様体の生成を容易にする。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ
２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的
な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、これらの特性を示さ
ない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、Ｃ
Ｄ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団である
。様々な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少
なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０
％の細胞が、単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記
細胞の少なくとも約７０％の細胞が、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞であ
る。別の実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約８０％、９０％、９５％、または
９９％の細胞が、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。単離集団の具体
的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３＋お
よびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−
４＋胎盤細胞はさらにＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２
００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である
。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣ
Ｄ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋であ
る。別の具体的な実施形態では、細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養す
ると１つまたは複数の胚様体を生成する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、
単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な
実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は
、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、単
離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８
−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋
およびＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。
別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞
はさらにＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５
＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、単
離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８
−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、
単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞は、胚様体の形成を可能にする条
件下でその集団を培養すると、前記細胞を含む胎盤細胞の集団中の胚様体の形成を容易に
する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎
盤細胞は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から
単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ
＋胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、単
離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富で
ある細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約１０％、少
なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、ま
たは少なくとも約６０％の細胞が、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細
胞である。別の実施形態では、前記細胞集団の少なくとも約７０％の細胞が、単離ＣＤ７
３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中
の少なくとも約９０％、９５％、または９９％の細胞が、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋
、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞である。前述の集団の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３
＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４
５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−
Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実
施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ
−４＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ
−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。より別の具体的な実施形態では、前記単離
ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−、Ｃ
Ｄ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、前記細
胞集団は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から
単離する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎
盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は
、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり、胚様体の形成を可能にする条件下で前記集団を
培養すると、前記ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋細胞を含む単離胎盤細胞の集団中の１つまた
は複数の胚様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、
ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具
体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、
ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、
ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４＋である。より具体的な実施形態では、前記単
離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−お
よびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋
胎盤細胞は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記
単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離す
る。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、Ｃ
Ｄ７３＋、ＣＤ１０５＋である単離胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集
団であり、胚様体の形成を可能にする条件下で前記集団を培養すると、前記細胞を含む単
離胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。様々な実施形態では
、前記細胞集団中の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少
なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％の細胞が、前記単離
ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団の少なくと
も約７０％の細胞が、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞である。別の実施形態
では、前記細胞集団中の少なくとも約９０％、９５％、または９９％の細胞が、前記単離
ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞である。前述の集団の具体的な実施形態では、前記単
離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−
である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさら
にＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単
離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形
態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。より
具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−
、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施
形態では、前記細胞集団は、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞ではない胎盤細
胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さ
ない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は
、ＯＣＴ−４＋であり、胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると、前記細胞を含む
単離胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態
では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別
の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８
−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細
胞はさらにＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤
細胞はさらにＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およ
びＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、Ｏ
ＣＴ−４＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単
離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、Ｏ
ＣＴ−４＋である単離胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団であり、胚
様体の形成を可能にする条件下で前記集団を培養すると、前記細胞を含む単離胎盤細胞の
集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。様々な実施形態では、前記細胞集
団中の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４
０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％の細胞が、前記単離ＯＣＴ−４＋
胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団の少なくとも約７０％の細胞が、前記
単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約８
０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。
前述の集団の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−
、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４
＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施
形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である
。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋であ
る。より具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３＋、Ｃ
Ｄ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−である。別の具
体的な実施形態では、前記細胞集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具
体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離す
る。
特定の他の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、Ｃ
Ｄ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、Ｓ
Ｈ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、ＭＨＣ−Ｉ＋およびＡＢＣ−ｐ＋
の１つまたは複数である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２
９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、Ｓ
Ｈ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、およびＯＣＴ−４＋である
。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、
ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋である。別
の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ
３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋で
ある。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４
−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＨＬＡ−１＋、Ｓ
Ｈ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣ
Ｔ−４＋およびＡＢＣ−ｐ＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＳＨ
２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞
は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−である。具体的な実
施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−胎
盤細胞はさらにＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５
４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋である。別の実施形態では、単
離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−であり、かつＳＨ３＋またはＳＨ４＋のいず
れかである。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４−であり、かつＣＤ１０＋、Ｃ
Ｄ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、またはＯＣＴ−４＋のいずれかである
。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は
、単離ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋胎盤細胞である。別
の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、胎盤細
胞を含む細胞の集団であり、前記細胞集団の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、
少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の細胞がＣＤ１０＋
、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞である。前述の実施形態の具体的な
実施形態では、前記胎盤細胞はさらにＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である。具体的な実施
形態では、前記胎盤細胞または胎盤細胞の集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離する
。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞または胎盤細胞の集団は、これらの特性を示
さない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起
源である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞の集団中の少なくとも約９０％
、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の前記細胞が非母方起源である。
前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、
前記細胞または集団は拡大状態であり、例えば、少なくとも、約、または最大１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、
１９、または２０回継代しており、少なくとも、約、または最大１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、
３２、３４、３６、３８または４０の集団倍化で増殖状態である。本明細書で開示する、
単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、前記
単離胎盤細胞は胎児起源である（すなわち胎児の遺伝子型を有する）。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である、胎盤細胞はＯ
ＣＴ−４＋であり、胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると、前記単離胎盤細胞の
集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記胎盤
細胞はＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞
はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記
胎盤細胞はＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、前記胎盤細胞はＣＤ７３＋
、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−である。別
の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の
具体的な実施形態では、前記胎盤細胞は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する
。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である、単離胎盤細胞
は、単離ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤細胞で
ある。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は
、単離胎盤細胞を含む細胞の集団であり、前記単離細胞集団の少なくとも約７０％、少な
くとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の
細胞が単離ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤細胞
である。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、ＨＬＡ
−Ａ、Ｂ、Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤細胞ではない胎盤細胞
から単離する。他の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。他の
具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞の集団は母方の構成成分は実質的に含まず、例
えば、前記単離胎盤細胞の集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の
前記細胞が非母方起源である。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である、単離胎盤細胞
は、単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−およびＣＤ１
３３−胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用
である細胞集団は、単離胎盤細胞を含む細胞の集団であり、前記細胞集団の少なくとも約
７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくと
も約９９％の細胞が単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７
−およびＣＤ１３３−胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または
単離胎盤細胞の集団は、前記単離胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な
実施形態では、前記単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７
−およびＣＤ１３３−胎盤細胞は非母方起源である、すなわち胎児の遺伝子型を有する。
別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞の集団中の少なくとも約４０％、４５％、
５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、
９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記単
離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する
。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である、単離胎盤細胞
は、単離ＣＤ１０−、ＣＤ３３−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤細
胞である。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集
団は、単離胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団であり、前記細胞集団
の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％
または少なくとも約９９％の細胞が単離ＣＤ１０−、ＣＤ３３−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５
−、およびＣＤ１１７−胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞また
は単離胎盤細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形
態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集
団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％
、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である
。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらの
マーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は
、単離ＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤細胞
である。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団
は、単離ＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤細
胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団であり、前記細胞集団の少なくとも約７
０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも
約９９％の細胞がＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７
−胎盤細胞を含む。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団
は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤
細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約４
０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９
０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。別の具体的な実施形
態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらの特性を示さない胎盤細
胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は
ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＣＤ４５−、ＣＤ３４−、およびＣＤ１３３−であり、さらにＣ
Ｄ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２０
０＋および／またはＨＬＡ−Ｇ＋、および／またはＣＤ１１７に陰性である。別の実施形
態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は、単離胎盤細胞を
含む細胞の集団であり、前記集団中の少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４
０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９
０％、９５％、９８％または約９９％の細胞が、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ−、ＣＤ４５−、Ｃ
Ｄ３４−、ＣＤ１３３−であり、さらにＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ
９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇに陽性であり、および／または
ＣＤ１１７に陰性である単離胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞
または単離胎盤細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実
施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記細
胞集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７
５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源で
ある。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これ
らのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は
、抗体結合により決定してＣＤ２００＋およびＣＤ１０＋である単離胎盤細胞、ならびに
抗体結合とＲＴ−ＰＣＲの両方により決定してＣＤ１１７−である単離胎盤細胞である。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、
ＣＤ１０＋、ＣＤ２９−、ＣＤ５４＋、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋、ＨＬＡクラス１−
およびβ−２−マイクログロブリン−である単離胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤
多分化能細胞である。別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用で
ある単離胎盤細胞は、少なくとも１つの細胞マーカーの発現が間葉系幹細胞（例えば、骨
髄由来間葉系幹細胞）より少なくとも２倍高い胎盤細胞である。別の具体的な実施形態で
は、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団中
の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は
、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２
−Ｅ−、ＣＤ６２−Ｌ−、ＣＤ６２−Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、Ｃ
Ｄ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低
、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２−マイクログロブリン低、ＭＨＣ−Ｉ低、ＭＨＣ−Ｉ
Ｉ−、ＨＬＡ−Ｇ低、および／またはＰＤＬ１低の１つまたは複数である単離胎盤細胞、
例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞
は少なくともＣＤ２９＋およびＣＤ５４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤
細胞は少なくともＣＤ４４＋およびＣＤ１０６＋である。別の具体的な実施形態では、単
離胎盤細胞は少なくともＣＤ２９＋である。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞集団は単離
胎盤細胞を含み、かつ前記細胞集団中の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９
０％、９５％、９８％または９９％の細胞が、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、Ｃ
Ｄ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２−Ｅ−、ＣＤ６２−Ｌ−、ＣＤ６２−Ｐ−、
ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、ＣＤ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／Ｖ
ＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２−マイク
ログロブリン低、ＭＨＣ−Ｉ低、ＭＨＣ−ＩＩ−、ＨＬＡ−Ｇ低、および／またはＰＤＬ
１低の１つまたは複数である単離胎盤細胞である。より具体的な実施形態では、前記細胞
集団中の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９
９％の細胞が、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ
＋、ＣＤ６２−Ｅ−、ＣＤ６２−Ｌ−、ＣＤ６２−Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ
１０３−、ＣＤ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−
カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２−マイクログロブリン低、ＭＨＣ−Ｉ低
、ＭＨＣ−ＩＩ−、ＨＬＡ−Ｇ低、およびＰＤＬ１低である。
単離胎盤細胞の特定の実施形態では、前記単離胎盤細胞は、増殖培地、すなわち増殖を
促進するように処方した培地における培養中に、例えば増殖培地における増殖中に分化し
ない。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、増殖するためのフィーダー層を
必要としない。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、単にフィーダー細胞層
の欠如のため、フィーダー層の不在下での培養中に分化しない。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物および方法に有用である細胞は単離胎盤
細胞であり、複数の前記単離胎盤細胞が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイによ
り評価してアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）に陽性である。このようなアッセイ
は当技術分野で知られている（例えば、Ｂｏｓｔｉａｎ ａｎｄ Ｂｅｔｔｓ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｊ．、１７３、７８７、（１９７８）を参照）。具体的な実施形態では、前記Ａ
ＬＤＨアッセイは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーとしてＡＬＤＥＦＬＵＯ
Ｒ（登録商標）（Ａｌｄａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、Ｏｒｅｇｏｎ）を使用す
る。具体的な実施形態では、前記複数の細胞は、前記細胞集団中の約３％と約２５％の間
の細胞である。別の実施形態では、単離臍帯細胞、例えば多分化能単離臍帯細胞の集団が
本明細書で提供され、複数の前記単離臍帯細胞が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の指
標としてＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）を使用するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性ア
ッセイにより評価して、アルデヒドデヒドロゲナーゼに陽性である。具体的な実施形態で
は、前記複数の細胞は、前記細胞集団中の約３％と約２５％の間の細胞である。別の実施
形態では、単離胎盤細胞または単離臍帯細胞の前記集団は、ほぼ同じ数の細胞を有し同じ
条件下で培養した骨髄由来間葉系幹細胞の集団より、少なくとも３倍、または少なくとも
５倍高いＡＬＤＨ活性を示す。
前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、
前記細胞または集団は拡大状態であり、例えば、少なくとも、約、または最大１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、
１９、または２０回継代しており、少なくとも、約、または最大１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、
３２、３４、３６、３８または４０の集団倍化で増殖状態である。本明細書で開示する、
単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、前記
単離胎盤細胞は胎児起源である（すなわち胎児の遺伝子型を有する）。
前述の単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の細胞集団のいずれかの具体的な実施形態では
、前記集団中の細胞、または少なくとも約９５％もしくは約９９％の細胞の核型は正常で
ある。前述の胎盤細胞または細胞集団のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞、ま
たは細胞の集団中の細胞は非母方起源である。
任意の前述のマーカーの組合せを有する、単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団は
、任意の比で組み合わせることができる。任意の２つ以上の前述の単離胎盤細胞集団を組
合せて、１つの単離胎盤細胞集団を形成することができる。例えば、単離胎盤細胞の集団
は、前に記載したマーカーの組合せの１つによって定義される単離胎盤細胞の第１集団、
および前に記載した別のマーカーの組合せによって定義される単離胎盤細胞の第２集団を
含むことができ、前記第１集団と第２集団は約１：９９、２：９８、３：９７、４：９６
、５：９５、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４
０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、
または約９９：１の比で組み合わせる。同様の形式で、任意の３個、４個、５個またはそ
れより多くの前に記載した単離胎盤細胞または単離胎盤細胞集団を組み合わせることがで
きる。
本明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、例えば、酵素によ
る消化（セクション５．４．３参照）または灌流（セクション５．４．４参照）ありまた
はなしで、胎盤組織の破壊によって得ることができる。例えば、単離胎盤細胞の集団は、
臍帯血を流出させ、灌流させて残留血液を除去した哺乳動物胎盤を灌流するステップ、灌
流溶液で前記胎盤を灌流するステップ、および前記灌流溶液を回収するステップであって
、灌流後の前記灌流溶液が単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を含むステップ、および前
記細胞集団から複数の前記単離胎盤細胞を単離するステップを含む方法に従って生成する
ことができる。具体的な実施形態では、灌流溶液は臍静脈と臍動脈の両方を通過させ、そ
れが胎盤から滲出した後に回収する。別の具体的な実施形態では、灌流溶液は臍静脈と臍
動脈を通過させ臍動脈から回収し、または臍動脈を通過させ臍静脈から回収する。
様々な実施形態では、胎盤の灌流から得る細胞の集団中に含有される単離胎盤細胞は、
前記胎盤細胞集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９
％または少なくとも９９．５％である。別の具体的な実施形態では、灌流によって回収さ
れる単離胎盤細胞は、胎児および母親細胞を含む。別の具体的な実施形態では、灌流によ
って回収される単離胎盤細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、
９５％、９９％または少なくとも９９．５％胎児細胞である。
別の具体的な実施形態では、本明細書で提供するのは、灌流によって回収される、本明
細書で記載する単離胎盤細胞の集団を含む組成物であり、前記組成物は、単離胎盤細胞を
回収するために使用する灌流溶液の少なくとも一部分を含む。
本明細書で記載する単離胎盤細胞の単離集団は、組織破壊酵素で胎盤組織を消化して細
胞を含む胎盤細胞の集団を得ること、および前記胎盤細胞の残りから複数の胎盤細胞を単
離、または実質的に単離することによって生成することができる。胎盤の全部、または任
意の一部分を消化して、本明細書で記載する単離胎盤細胞を得ることができる。具体的な
実施形態では、例えば、前記胎盤組織は、胎盤全体、羊膜、絨毛膜、羊膜と絨毛膜の組合
せ、または任意の前述の組合せであってよい。他の具体的な実施形態では、組織破壊酵素
はトリプシンまたはコラゲナーゼである。様々な実施形態では、胎盤の消化から得る細胞
の集団中に含有される単離胎盤細胞は、前記胎盤細胞集団の少なくとも５０％、６０％、
７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％である。
遺伝子プロファイリングによって、単離胎盤細胞、および単離胎盤細胞の集団は、他の
細胞、例えば間葉系幹細胞、例えば骨髄由来間葉系幹細胞と区別することができることを
確認する。本明細書で記載する単離胎盤細胞は、１つまたは複数の遺伝子の発現に基づい
て、例えば間葉系幹細胞と区別することができ、その発現は、骨髄由来間葉系幹細胞と比
較して、単離胎盤細胞中、または特定の単離臍帯幹細胞中において有意に高い。特に、本
明細書で提供する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞は、１つまたは複数の遺伝
子の発現に基づいて間葉系幹細胞と区別することができ、その発現は、同数の骨髄由来間
葉系幹細胞より単離胎盤細胞中で有意に高く（すなわち、少なくとも２倍高い）、細胞を
同等条件下で増殖するとき、１つまたは複数の遺伝子は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、Ａ
ＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１またはｆ９、ＣＤ２００
、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２
、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−
Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、
ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、Ｐ
ＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、Ｓ
Ｔ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、ＺＣ３Ｈ１２
Ａまたは前述の任意の組合せである。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み
込まれる米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号を参照のこと。より具体的な実
施形態では、前記単離胎盤細胞は、ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、２％ウシ胎児血清（
Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ．）、１×インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ
）、１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、１０−９Ｍのデキサメタゾ
ン（Ｓｉｇｍａ）、１０−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、表皮
増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および血小板由来増殖因子（ＰＤ
ＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地において約３〜約３
５の集団倍加で培養すると、前記１つまたは複数の遺伝子を発現する。具体的な実施形態
では、単離胎盤細胞特異的または単離臍帯細胞特異的な遺伝子はＣＤ２００である。
これらの遺伝子に関する具体的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０
０１６１５（ＡＣＴＧ２）、ＢＣ０６５５４５（ＡＤＡＲＢ１）、（ＮＭ＿１８１８４７
（ＡＭＩＧＯ２）、ＡＹ３５８５９０（ＡＲＴＳ−１）、ＢＣ０７４８８４（Ｂ４ＧＡＬ
Ｔ６）、ＢＣ００８３９６（ＢＣＨＥ）、ＢＣ０２０１９６（Ｃ１１またはｆ９）、ＢＣ
０３１１０３（ＣＤ２００）、ＮＭ＿００１８４５（ＣＯＬ４Ａ１）、ＮＭ＿００１８４
６（ＣＯＬ４Ａ２）、ＢＣ０５２２８９（ＣＰＡ４）、ＢＣ０９４７５８（ＤＭＤ）、Ａ
Ｆ２９３３５９（ＤＳＣ３）、ＮＭ＿００１９４３（ＤＳＧ２）、ＡＦ３３８２４１（Ｅ
ＬＯＶＬ２）、ＡＹ３３６１０５（Ｆ２ＲＬ１）、ＮＭ＿０１８２１５（ＦＬＪ１０７８
１）、ＡＹ４１６７９９（ＧＡＴＡ６）、ＢＣ０７５７９８（ＧＰＲ１２６）、ＮＭ＿０
１６２３５（ＧＰＲＣ５Ｂ）、ＡＦ３４００３８（ＩＣＡＭ１）、ＢＣ０００８４４（Ｉ
ＥＲ３）、ＢＣ０６６３３９（ＩＧＦＢＰ７）、ＢＣ０１３１４２（ＩＬ１Ａ）、ＢＴ０
１９７４９（ＩＬ６）、ＢＣ００７４６１（ＩＬ１８）、（ＢＣ０７２０１７）ＫＲＴ１
８、ＢＣ０７５８３９（ＫＲＴ８）、ＢＣ０６０８２５（ＬＩＰＧ）、ＢＣ０６５２４０
（ＬＲＡＰ）、ＢＣ０１０４４４（ＭＡＴＮ２）、ＢＣ０１１９０８（ＭＥＳＴ）、ＢＣ
０６８４５５（ＮＦＥ２Ｌ３）、ＮＭ＿０１４８４０（ＮＵＡＫ１）、ＡＢ００６７５５
（ＰＣＤＨ７）、ＮＭ＿０１４４７６（ＰＤＬＩＭ３）、ＢＣ１２６１９９（ＰＫＰ−２
）、ＢＣ０９０８６２（ＲＴＮ１）、ＢＣ００２５３８（ＳＥＲＰＩＮＢ９）、ＢＣ０２
３３１２（ＳＴ３ＧＡＬ６）、ＢＣ００１２０１（ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５）、ＢＣ１２６
１６０またはＢＣ０６５３２８（ＳＬＣ１２Ａ８）、ＢＣ０２５６９７（ＴＣＦ２１）、
ＢＣ０９６２３５（ＴＧＦＢ２）、Ｂ０００５０４６（ＶＴＮ）、およびＢＣ００５００
１（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）（２００８年３月現在）において見ることができる。
より具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、細胞を同等条件下で増殖するとき、
ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、
Ｃ１１またはｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳ
Ｃ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１
２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭＩ、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、Ｉ
Ｌ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、
ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰ
ＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣＩ２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧ
ＦＢ２、ＶＴＮ、およびＺＣ３Ｈ１２Ａのそれぞれを、同数の骨髄由来間葉系幹細胞より
検出可能に高いレベルで発現する。
より具体的な実施形態では、胎盤細胞集団は、骨髄由来間葉系幹細胞より検出可能に高
いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現する胎盤細胞を選択することによって選択する
ことができ、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２
、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１またはｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４
Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ
１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡ
Ｍ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、
ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、
ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬ
ＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、およびＺＣ３Ｈ１２Ａか
らなる群から選択され、かつ前記骨髄由来間葉系幹細胞は、前記胎盤細胞が経ている継代
数と等しい培養の継代数を経ている。より具体的な実施形態では、前記選択は、ＡＣＴＧ
２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１ま
たはｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、Ｄ
ＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、Ｇ
ＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、Ｉ
Ｌ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２
Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９
、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、
ＶＴＮおよびＺＣ３Ｈ１２Ａを、骨髄由来間葉系幹細胞より検出可能に高いレベルで発現
する細胞を選択することを含む。
前述の遺伝子の発現は、標準的な技法によって評価することができる。例えば、（１つ
または複数の）遺伝子の配列に基づくプローブを個別に選択することができ、従来の技法
によって構築することができる。遺伝子の発現は、例えば、１つまたは複数の遺伝子に対
するプローブを含むマイクロアレイ、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ
（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０アレイ、またはＡｆｆｙｍ
ｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌ
ｕｓ ２．０（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で評価することができ
る。これらの遺伝子の発現は、特定のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の配列が改正さ
れる場合でさえ評価することができる。改正された配列に特異的なプローブは、よく知ら
れている標準的な技法を使用して容易に作製することができるからである。
これらの遺伝子の発現レベルを使用して、単離胎盤細胞の集団の同一性を確認すること
ができ、少なくとも複数の単離胎盤細胞を含む細胞の集団などを同定することができる。
その同一性が確認される単離胎盤細胞の集団は、クローン、例えば単一の単離胎盤細胞か
ら拡大した単離胎盤細胞の集団、または幹細胞の混合集団、例えば、多数の単離胎盤細胞
から拡大した単離胎盤細胞のみを含む細胞の集団、または本明細書に記載する単離胎盤細
胞、および少なくとも１つの他型の細胞を含む細胞の集団であり得る。
これらの遺伝子の発現レベルを使用して、単離胎盤細胞の集団を選択することができる
。例えば、前述の１つまたは複数の遺伝子の発現が、同等の間葉系幹細胞の集団中よりそ
の細胞集団由来のサンプル中で有意に高い場合、細胞、例えばクローン増殖細胞の集団を
選択することができる。このような選択は、複数の単離胎盤細胞集団由来、その同一性が
知られていない複数の細胞集団由来の集団などの選択であってよい。
単離胎盤細胞は、前記１つまたは複数の遺伝子、例えば間葉系幹細胞対照中での発現レ
ベル、例えば、同数の骨髄由来間葉系幹細胞中での前記１つまたは複数の遺伝子の発現レ
ベルと比較して、１つまたは複数のこのような遺伝子の発現レベルに基づいて選択するこ
とができる。一実施形態では、同数の間葉系幹細胞を含むサンプル中の前記１つまたは複
数の遺伝子の発現レベルを、対照として使用する。別の実施形態では、特定条件下で試験
する単離胎盤細胞の対照は、前記条件下における間葉系幹細胞中での前記１つまたは複数
の遺伝子の発現レベルを表す数値である。
本明細書に記載する単離胎盤細胞は、例えば、ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、２％ウ
シ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１×インシュリ
ン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ
−ＢＳＡ）、１０−９Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０−４Ｍのアスコルビン酸
２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ）、および１００Ｕペニシリン／１０００Ｕストレプトマイシンを含む培地中
での初代培養中、または増殖中に、前述の特性（例えば、細胞表面マーカーおよび／また
は遺伝子発現プロファイルの組合せ）を示す。
前に記載した単離細胞の単離集団、および単離胎盤細胞の集団は、約、少なくとも、ま
たは最大１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、
１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×
１０１１またはそれより多くの単離胎盤細胞を一般に含むことができる。本明細書で提供
する組成物および方法に有用である単離胎盤細胞の集団は、例えばトリパンブルー色素排
除試験法により測定して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％
、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の生存状態の単離胎盤細胞を
含む。
５．３．３ 培養中の増殖
本明細書で記載する単離胎盤細胞の増殖は、任意の哺乳動物細胞に関して、増殖用に選
択する個々の培地に一部分は依存する。最適条件下において、単離胎盤細胞は、典型的に
は３〜５日で数が倍になる。培養中、本明細書で記載する単離胎盤細胞は、培養支持体、
例えば、組織培養容器の表面（例えば、組織培養皿プラスチック、フィブロネクチンコー
ティングプラスチックなど）に接着し、単層を形成する。
本明細書で記載する単離胎盤細胞の集団は、適切な条件下で培養すると、胚様体、すな
わち接着性幹細胞層上で増殖した細胞の三次元集合体を形成する。胚様体内の細胞は、非
常に初期の幹細胞、例えばＯＣＴ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４と関係
があるマーカーを発現する。胚様体内の細胞は、本明細書で記載する単離胎盤細胞と同様
に、典型的には培養支持体に接着しないが、培養中に接着性細胞に接着した状態である。
胚様体細胞は生存が接着性単離胎盤細胞に依存する。胚様体は、接着性単離胎盤細胞の不
在下で形成しないからである。したがって接着性単離胎盤細胞は、接着性単離胎盤細胞を
含む胎盤細胞の集団中での１つまたは複数の胚様体の増殖を容易にする。理論によって縛
られることは望まずに、胚様体の細胞は、胚幹細胞が細胞のフィーダー層で増殖するのと
同程度に接着性単離胎盤細胞で増殖すると考えられる。間葉系幹細胞、例えば骨髄由来間
葉系幹細胞は、培養中に胚様体に発達しない。
５．３．４ 造血胎盤幹細胞
特定の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ３４＋胎盤細胞、例えば造血胎盤細胞であ
る。しかしながら、このようなＣＤ３４＋細胞は、本明細書で使用する用語「多分化能」
によって包含されない。このような細胞は、胎盤組織から、例えば臍帯血を流出させ、灌
流させて残留血液を除去した胎盤から入手可能である。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋
単離胎盤細胞はＣＤ３８＋である。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋単離胎盤細胞はＣＤ
３８−である。特定の他の実施形態では、ＣＤ３４＋単離胎盤細胞はＣＤ４５＋である。
具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＣＤ４５＋である
。
５．３．５ 胎盤灌流液細胞
特定の実施形態では、本明細書で提供する方法によって製剤化する本明細書で提供する
組成物の細胞は、胎盤灌流液から得られる細胞である。本明細書で使用する「胎盤灌流液
から得られる細胞」は、胎盤灌流液から得た、例えば単離した全有核細胞、胎盤灌流液か
ら得た有核細胞のサブセット、または胎盤灌流液から直接得た細胞から培養もしくは増殖
した細胞を含む。胎盤灌流液は、胎盤細胞を得るための灌流前に、臍帯血を流出させ、灌
流させて残留血液を除去した胎盤から得ることができる。胎盤灌流液は、臍帯血を流出さ
せているが灌流させて残留血液を除去していない胎盤から得ることができる。胎盤灌流液
は、臍帯血を流出させず灌流させて残留血液を除去していない胎盤から得ることができる
。後の２つの実施形態では、胎盤細胞、例えば、胎盤灌流液からの有核細胞、例えば、胎
盤灌流液からの全有核細胞は、胎盤血および／または臍帯血からの有核細胞を含む。胎盤
灌流液を得るための方法、および胎盤灌流液から細胞を得るための方法は以下のセクショ
ン５．４．４に記載する。
５．４ 単離胎盤細胞を得る方法
５．４．１ 幹細胞回収組成物
本明細書でさらに提供するのは、胎盤細胞、例えば前のセクション５．２に記載した単
離胎盤細胞を回収および単離する方法である。一般に、このような細胞は、生理的に許容
される溶液、例えば幹細胞回収組成物を使用して哺乳動物胎盤から得る。細胞回収組成物
は、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ Ｐｌａｃｅｎ
ｔａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ Ｏｒｇａｎｓ」という
表題の関連米国特許出願公開第２００７／０１９００４２号中に詳細に記載される。
細胞回収組成物は、細胞、例えば本明細書に記載する単離胎盤細胞の回収および／また
は培養に適した任意の生理的に許容される溶液、例えば生理食塩水溶液（例えば、リン酸
緩衝生理食塩水、クレブス液、改変クレブス液、イーグル液、０．９％のＮａＣｌなど）
、培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｈ．ＤＭＥＭなど）などを含むことができる。
細胞回収組成物は、回収時から培養時まで、単離胎盤細胞を保存する傾向がある、すな
わち、単離胎盤細胞が死ぬのを防ぐ、または単離胎盤細胞の死を遅延させる、死滅する細
胞集団中の単離胎盤細胞の数を減らすなどの、１つまたは複数の構成成分を含むことがで
きる。このような構成成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤
またはＪＮＫ阻害剤）、血管拡張剤（例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナ
トリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、アドレノコルチコトロピン、コルチコトロピン放出ホ
ルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、
インドメタシンまたは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）、壊死阻害
剤（例えば、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、
ピロリジンジチオカルバメート、またはクロナゼパム）、ＴＮＦ−α阻害剤、および／ま
たは酸素含有ペルフルオロカーボン（例えば、臭化ペルフルオロオクチル、臭化ペルフル
オロデシルなど）であってよい。
細胞回収組成物は、１つまたは複数の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セ
リンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ＲＮａｓｅ、またはＤＮａｓｅなどを含むことが
できる。このような酵素には、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩま
たはＩＶ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼなど
）、ジスパーゼ、テルモリシン、エラスターゼ、トリプシン、ＬＩＢＥＲＡＳＥ、ヒアル
ロニダーゼなどがあるが、これらだけには限られない。
細胞回収組成物は、殺菌的または静菌的に有効な量の抗生物質を含むことができる。特
定の非制限的な実施形態では、抗生物質はマクロライド（例えばトブラマイシン）、セフ
ァロスポリン（例えばセファレキシン、セファラジン、セフロキシム、セフプロジル、セ
ファクロル、セフィキシムまたはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマ
イシン、ペニシリン（例えばペニシリンＶ）またはキノロン（例えばオフロキサシン、シ
プロフロキサシンまたはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンな
どである。特定の実施形態では、抗生物質はグラム（＋）および／またはグラム（−）細
菌、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ ａｕｒｅｕｓなどに対して活性がある。
細胞回収組成物は、１つまたは複数の以下の化合物、アデノシン（約１ｍＭ〜約５０ｍ
Ｍ）、Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）、マグネシウムイオン（約１ｍＭ〜
約５０ｍＭ）、一実施形態では、内皮完全性および細胞生存性を維持するのに十分な量で
存在する、分子量２０，０００ダルトン超えの高分子（例えば、約２５ｇ／ｌ〜約１００
ｇ／ｌ、または約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌで存在する、合成または天然に存在するコロ
イド、デキストランまたはポリエチレングリコールなどの多糖）、抗酸化剤（例えば、約
２５μＭ〜約１００μＭで存在する、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキ
シトルエン、グルタチオン、ビタミンＣまたはビタミンＥ）、還元剤（例えば、約０．１
ｍＭ〜約５ｍＭで存在するＮ−アセチルシステイン）、細胞へのカルシウムの進入を妨げ
る作用物質（例えば、約２μＭ〜約２５μＭで存在するベラパミル）、ニトログリセリン
（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）、一実施形態では、残留血液の凝固の妨
げを手助けするのに十分な量で存在する、抗凝固剤（例えば、約１０００単位／ｌ〜約１
００，０００単位／ｌの濃度で存在するヘパリンまたはヒルジン）、またはアミロリド含
有化合物（例えば、約１．０μＭ〜約５μＭで存在する、アミロリド、エチルイソプロピ
ルアミロリド、ヘキサメチレンアミロリド、ジメチルアミロリドまたはイソブチルアミロ
リド）を含むこともできる。
５．４．２ 胎盤の回収および処理
一般に、ヒト胎盤は生後のその娩出直後に回収する。好ましい実施形態では、胎盤は、
インフォームドコンセント後に患者から、および患者の完全な病歴を得て胎盤と関連付け
た後に回収する。病歴は送達後に続くことが好ましい。このような病歴を使用して、胎盤
またはそこから採取した幹細胞の二次的使用を調節することができる。例えば、病歴を鑑
みて、胎盤に関する幼児のオーダーメイド医療に、または幼児の両親、兄弟または他の親
戚に、ヒト胎盤幹細胞を使用することができる。
単離胎盤細胞を回収する前に、臍帯血および胎盤血を除去する。特定の実施形態では、
送達後、胎盤中の臍帯血を回収する。胎盤には従来の臍帯血回収プロセスを施すことがで
きる。典型的には、流注下でニードルまたはカニューレを使用して胎盤から採血する（例
えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、米国特許第５，３７２，５８１号；Ｈｅｓｓｅｌら、米国特許
第５，４１５，６６５号を参照）。ニードルまたはカニューレは通常臍静脈中に配置し、
胎盤を穏やかにマッサージして胎盤からの臍帯血の流出を容易にすることができる。この
ような臍帯血の回収は市販用に実施することができる、例えば、ＬｉｆｅＢａｎｋ ＵＳ
Ａ、Ｃｅｄａｒ Ｋｎｏｌｌｓ、Ｎ．Ｊ．、ＶｉａＣｏｒｄ、Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｒ
ｅｇｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｒｙｏｃｅｌｌ。胎盤はさらなる操作なしで流注により出血
して、臍帯血回収中の組織破壊を最小にすることが好ましい。
典型的には、胎盤は、例えば灌流または組織解離による臍帯血の回収および幹細胞の回
収のため、分娩室または出生室から別の場所、例えば実験室に運ばれる。胎盤は、例えば
、胎盤、および固定した近位臍帯を滅菌状態のジップロック式プラスチックバッグ中に置
き、次いでそれを断熱容器中に置くことによって、（胎盤の温度を２０℃と２８℃の間に
維持する）滅菌状態の、断熱輸送デバイスに運ばれることが好ましい。別の実施形態では
、係属中の米国特許第７，１４７，６２６号に実質的に記載されたように臍帯血回収キッ
トに胎盤を運ぶ。送達後４〜２４時間で胎盤は実験室に送達することが好ましい。特定の
実施形態では、近位臍帯を、好ましくは臍帯血回収前に胎盤ディスクの挿入の４〜５ｃｍ
（センチメートル）以内に固定する。他の実施形態では、近位臍帯を、臍帯血回収後ただ
し胎盤のさらなる処理前に固定する。
胎盤は細胞回収前に、滅菌条件下において、室温または５〜２５℃の温度（摂氏）のい
ずれかで保存することができる。胎盤は、胎盤を灌流させて任意の残留臍帯血を除去する
前に、４〜２４時間、最大４８時間、または４８時間より長い時間の間保存することがで
きる。一実施形態では、娩出後約０時間と約２時間の間に胎盤を採取する。胎盤は５〜２
５℃の温度（摂氏）で抗凝固剤溶液中に保存することが好ましい。適切な抗凝固剤溶液は
当技術分野でよく知られている。例えば、ヘパリンまたはワルファリンナトリウムの溶液
を使用することができる。好ましい実施形態では、抗凝固剤溶液はヘパリンの溶液を含む
（例えば、１：１０００溶液中に１％ｗ／ｗ）。採血した胎盤は、胎盤細胞を回収する前
に最大３６時間保存することが好ましい。
哺乳動物胎盤またはその一部分は、概して前述のように回収し調製した後、任意の当技
術分野で知られている方法で処理することができる、例えば、灌流または破壊することが
でき、例えば、１つまたは複数の組織破壊酵素で消化して単離胎盤細胞を得ることができ
る。
５．４．３ 胎盤組織の物理的破壊および酵素による破壊
一実施形態では、器官の一部または全部の物理的破壊によって、哺乳動物胎盤から幹細
胞を回収する。例えば、胎盤、またはその一部分は、例えば、破砕する、せん断する、細
分する、さいの目に切る、細切れにする、細かく砕くなどすることができる。次いで組織
を培養して、単離胎盤細胞の集団を得ることができる。典型的には、胎盤組織は、例えば
胎盤細胞回収組成物に使用して破壊する（セクション５．２および以下参照）。
物理的破壊および／または酵素による消化および幹細胞回収の前に、胎盤をいくつかの
成分に切断することができる。胎盤幹細胞は、完全胎盤由来のものを含めて、羊膜、絨毛
膜、臍帯、胎盤葉、またはこれらの任意の組合せの全部または一部から得ることができる
。単離胎盤細胞は、羊膜および絨毛膜を含む胎盤組織から得ることが好ましい。典型的に
は、単離胎盤細胞は、胎盤組織の小さな塊、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８
、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３０
０、４００、５００、６００、７００、８００、９００または約１０００立方ミリメート
ル体積である胎盤組織の塊の破壊によって得ることができる。例えばトリパンブルー色素
排除試験法により測定して、破壊法が複数、より好ましくは大部分、およびより好ましく
は少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の前記器
官中の細胞を生存状態にするという条件で、任意の物理的破壊法を使用することができる
。
幹細胞は一般に、娩出後の最初の約３日以内の任意の時間で、胎盤、またはその一部分
から回収することができるが、娩出後約８時間と約１８時間の間が好ましい。
特定の実施形態では、単離胎盤細胞の増殖に適した組織培養培地中で、破壊した組織を
培養する（例えば、単離胎盤細胞の培養を記載する以下のセクション５．５を参照）。
別の特定の実施形態では、単離胎盤細胞は胎盤組織の物理的破壊によって回収し、この
場合物理的破壊は酵素による消化を含み、これは１つまたは複数の組織消化酵素を使用す
ることによって実施することができる。胎盤、またはその一部分は物理的に破壊し、１つ
または複数の酵素で消化し、次いで生成した物質を細胞回収組成物に浸すか、または混合
することもできる。
好ましい細胞回収組成物は、１つまたは複数の組織破壊酵素を含む。酵素による消化は
、酵素の組合せ、例えば、マトリクスメタロプロテアーゼと中性プロテアーゼの組合せ、
例えば、コラゲナーゼとジスパーゼの組合せを使用することが好ましい。一実施形態では
、胎盤組織の酵素による消化は、マトリクスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、お
よびヒアルロン酸消化用の粘液酵素の組合せ、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、およびヒアル
ロニダーゼの組合せ、またはＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）とヒアルロニダーゼの組合せな
どを使用する。胎盤組織を破壊するために使用することができる他の酵素には、パパイン
、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、また
はエラスターゼなどがある。セリンプロテアーゼは血清中でアルファ２マイクログロブリ
ンによって阻害される可能性があり、したがって、消化に使用する培地は通常無血清であ
る。一般にＥＤＴＡおよびＤＮａｓｅを酵素による消化の手順中で使用して、細胞回収の
効率を増大させる。消化剤を希釈して、粘性消化物内の細胞の捕捉を避けることが好まし
い。
組織消化酵素の任意の組合せを使用することができる。組織消化酵素に関する典型的な
濃度は、例えば、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＶについては５０〜２００Ｕ／ｍ
Ｌ、ジスパーゼについては１〜１０Ｕ／ｍＬ、およびエラスターゼについては１０〜１０
０Ｕ／ｍＬを含む。プロテアーゼは組合せで、すなわち２つ以上のプロテアーゼを同じ消
化反応中で使用することができ、または同時に使用して胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞およ
び胎盤多分化能細胞を切り離すことができる。例えば、一実施形態では、胎盤、またはそ
の一部分を、例えば３０分間約１〜約２ｍｇ／ｍｌで適量のコラゲナーゼＩを用いて最初
に消化して、次に３７℃において例えば１０分間約０．２５％の濃度で、トリプシンを用
いて消化する。セリンプロテアーゼは、他の酵素の使用後に連続して使用することが好ま
しい。
別の実施形態では、胎盤細胞回収組成物に、または胎盤細胞回収組成物を用いた胎盤細
胞の単離前に、その中で組織を破壊および／または消化する溶液に、キレート剤、例えば
、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸（
ＥＧＴＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えることによって、組織をさ
らに破壊することができる。
消化後、消化物を例えば培養培地で三回洗浄し、洗浄した細胞は培養フラスコに接種す
る。次いで細胞は差次的接着によって単離し、例えば、生存性、細胞表面マーカー、分化
などを特徴付ける。
胎盤全体、または胎盤の一部分が胎児細胞と母親細胞の両方を含む場合（例えば、この
場合胎盤の一部分は絨毛膜または胎盤葉を含む）、回収する胎盤細胞は、胎児源と母親源
の両方由来の、胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞の混合物を含み得る
ことは理解されよう。胎盤の一部分が、母親細胞を含まない、または無視できる程度数の
母親細胞を含む場合（例えば羊膜）、回収する胎盤細胞は、ほぼ胎児胎盤細胞、例えば胎
盤幹細胞または胎盤多分化能細胞のみを含み得る。
胎盤細胞は、差次的トリプシン処理（以下のセクション５．４．５を参照）、次に１つ
または複数の新たな培養容器、新たな増殖培地中での培養、場合によって、次に第２の差
次的トリプシン処理ステップによって、破壊した組織から単離することができる。
５．４．４ 胎盤灌流
胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞は、哺乳動物胎盤の灌流によって
得ることもできる。胎盤細胞を得るための哺乳動物胎盤の灌流法は、例えば、それぞれそ
の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｉｒｉ、米国特許第７，０４５，１
４８号および米国特許第７，２５５，７２９号、および関連米国特許出願公開第２００７
／０１９００４２号に開示されている。
例えば灌流溶液として細胞回収組成物を使用する、例えば胎盤血管系を介した灌流によ
って、胎盤細胞を回収することができる。一実施形態では、臍動脈と臍静脈の一方または
両方を介して灌流溶液を通すことにより哺乳動物胎盤を灌流する。胎盤を介した灌流溶液
の流入は、例えば胎盤への流注を使用して実施することができる。灌流溶液は、ポンプ、
例えば蠕動ポンプを使用して胎盤に送ることが好ましい。例えば臍静脈は、滅菌済みチュ
ーブなどの滅菌済み接続装置に接続した、カニューレ、例えばＴＥＦＬＯＮ（登録商標）
またはプラスチックカニューレでカニューレ処理することができる。滅菌済み接続装置は
灌流マニホールドに接続する。
灌流のための調製では、臍動脈と臍静脈が胎盤の最高点に位置するような形式で、胎盤
を配向する（例えば懸垂状態にする）ことが好ましい。胎盤血管系および周辺組織を介し
て灌流液を通すことにより、胎盤を灌流することができる。臍静脈への灌流液の通過およ
び臍動脈からの回収、または臍動脈への灌流液の通過および臍静脈からの回収によって、
胎盤を灌流することもできる。
一実施形態では、例えば、臍動脈と臍静脈を、例えば灌流溶液の貯蔵容器と柔軟なコネ
クターを介して接続したピペットに同時に接続する。灌流溶液は臍静脈および臍動脈に通
す。灌流溶液は血管壁から胎盤の周辺組織に滲出および／またはそこを介して通過し、妊
娠中の母親の子宮と結合した胎盤の表面から適切な開放容器中で回収する。灌流溶液を臍
帯の隙間に導入し、母親の子宮壁と連結した胎盤壁中の隙間から流出または浸透させるこ
とも可能である。「パンニング」法と呼ぶことができるこの方法によって回収される胎盤
細胞は、典型的には胎児細胞と母親細胞の混合物である。
別の実施形態では、灌流溶液は臍静脈を通過させ臍動脈からの回収し、または臍動脈を
通過させ臍静脈から回収する。「閉回路」法と呼ぶことができるこの方法によって回収さ
れる胎盤細胞は、典型的にはほぼ全てが胎児細胞である。
それによって灌流液が母親側の胎盤から滲出した後にそれを回収する、すなわちパンニ
ング法を使用する灌流は、胎児細胞と母親細胞の混合物をもたらすことは理解されよう。
結果として、この方法によって回収される細胞は、胎児と母親の両方の起源の胎盤細胞、
例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞の混合集団を含む。対照的に、それによって灌
流液を１つまたは２つの胎盤血管に通し（１つまたは複数の）残りの血管を介してのみ回
収する、閉回路法での胎盤血管系のみを介した灌流は、ほぼ全てが胎児起源である胎盤細
胞集団の回収をもたらす。
閉回路灌流法は、一実施形態では、以下のように実施することができる。出生後約４８
時間以内に産後の胎盤を得る。臍帯は固定しクランプで切断する。臍帯は廃棄することが
でき、または処理して例えば臍帯血幹細胞を回収することができ、および／または生体材
料の生成用に臍帯膜を処理することができる。羊膜は灌流中に保持することができ、また
は例えば指による鈍的剥離を使用して、絨毛膜から分離することができる。灌流前に羊膜
を絨毛膜から分離する場合、それを例えば廃棄、または処理して、例えば酵素による消化
によって胎盤細胞を得ることができ、または例えば羊膜の生体材料、例えば米国出願公開
第２００４／００４８７９６号に記載された生体材料を生成することができる。例えば滅
菌済みガーゼを使用して、胎盤の全ての目に見える血塊および残留血液を清掃した後、臍
帯血管を、例えば臍帯膜を部分的に切断して臍帯の断面を露出させることによって露出さ
せる。血管を確認し、例えば各血管の切断末端に閉鎖型アリゲータクランプを挿入するこ
とによって開く。灌流デバイスまたは蠕動ポンプと接続した装置、例えばプラスチックチ
ューブを、次いで胎盤動脈のそれぞれに挿入する。ポンプは目的に適した任意のポンプ、
例えば蠕動ポンプであってよい。滅菌済み回収貯蔵容器、例えば２５０ｍＬ回収バッグな
どの血液バッグと接続したプラスチックチューブを、次いで胎盤静脈に挿入する。あるい
は、ポンプと接続したチューブを胎盤静脈に挿入し、（１つまたは複数の）回収貯蔵容器
に対するチューブを胎盤動脈の一方または両方に挿入する。次いで胎盤を一定体積の灌流
溶液、例えば約７５０ｍｌの灌流溶液で灌流する。次いで灌流液中の細胞を、例えば遠心
分離によって回収する。
別の実施形態では、例えば、胎盤灌流液細胞を回収するための灌流は以下のように実施
する。胎盤血を含有する（１つまたは複数の）胎盤を、例えば蠕動ポンプを使用して、滅
菌０．９％ＮａＣｌ（例えば約７５０ｍＬ）をポンプで注入することにより胎盤血管系の
みを介して灌流させ、生成した灌流液は回収バッグ中に回収する。灌流液からの細胞は例
えば約４２０ｇでの遠心分離によって回収し、次に過剰な上清（ＮａＣｌ、血漿、抗凝固
剤）を除去する。次いでヘタスターチを灌流液細胞に加えて３０％の希釈を得る。次いで
灌流液細胞を、例えば約１時間、血漿抽出装置中に置いて赤血球を分離する。生成した血
漿および有核細胞は回収バッグから分離し、血漿抽出装置中に再度置く。残りの細胞は、
約２０ｍＬの最終体積中に５％ヒト血清アルブミンで再懸濁する。事前に混合したＤＭＳ
Ｏ／ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ Ａ（登録商標）（１：１ｖ／ｖ）を加えて約２４ｍＬの体積
を得る。生成した細胞は凍結保存する。この方法の具体的な実施形態では、そこから灌流
液を得る胎盤は臍帯血を流出させているが、胎盤細胞を回収するための灌流前に灌流しな
い。別の具体的な実施形態では、そこから灌流液を得る胎盤は臍帯血を流出させ、胎盤細
胞を回収するための灌流前に灌流して残留血液を除去する。
一実施形態では、近位臍帯を灌流中に固定し、およびより好ましくは胎盤ディスク中へ
の胎盤挿入の４〜５ｃｍ（センチメートル）以内に固定する。
胎盤細胞を回収するために使用する灌流液の体積は、回収する細胞の数、胎盤の大きさ
、１つの胎盤から行う回収の数などに応じて変わる可能性がある。様々な実施形態では、
灌流液の体積は、５０ｍＬ〜５０００ｍＬ、５０ｍＬ〜４０００ｍＬ、５０ｍＬ〜３００
０ｍＬ、１００ｍＬ〜２０００ｍＬ、２５０ｍＬ〜２０００ｍＬ、５００ｍＬ〜２０００
ｍＬ、または７５０ｍＬ〜２０００ｍＬであってよい。典型的には、胎盤は採血後に７０
０〜８００ｍＬの灌流液で灌流する。
数時間または数日間の行程にわたり複数回、胎盤を灌流することができる。胎盤を複数
回灌流する場合、それを容器または他の適切な器中で無菌条件下に維持または培養するこ
とができ、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒド
ロキシクマリン）を含むまたは含まない、および／または抗菌剤（例えば、β−メルカプ
トエタノール（０．１ｍＭ）；ストレプトマイシン（例えば、４０〜１００μｇ／ｍｌで
）、ペニシリン（例えば、４０Ｕ／ｍｌで）、アンホテリシンＢ（例えば、０．５μｇ／
ｍｌで）などの抗生物質）を含むまたは含まない、細胞回収組成物、または標準的な灌流
溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」などの正常生理食塩水溶液））で灌流
することができる。一実施形態では、灌流および灌流液の回収前に１、２、３、４、５、
６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３、または２４時間、または２もしくは３日間以上、胎盤が維持または
培養されるように、灌流液を回収せずに単離胎盤を一定時間維持または培養する。灌流胎
盤はさらに１回または複数回、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または
２４時間より長く維持することができ、例えば７００〜８００ｍＬの灌流液で２回目に灌
流することができる。胎盤は１、２、３、４、５回以上、例えば、１、２、３、４、５ま
たは６時間毎に一度灌流することができる。好ましい実施形態では、胎盤の灌流および灌
流溶液、例えば細胞回収組成物の回収を、回収する有核細胞の数が１００細胞／ｍｌ未満
の範囲になるまで繰り返す。異なる時点における灌流液をさらに個別に処理して、時間依
存性の細胞集団、例えば幹細胞を回収することができる。異なる時点からの灌流液をプー
ルすることもできる。好ましい実施形態では、娩出後約８時間と約１８時間の間に１回ま
たは複数回幹細胞を回収する。
灌流は、前記溶液で灌流せず、かつ胎盤細胞を得るために（例えば、組織破壊、例えば
酵素による消化によって）他に処理しなかった哺乳動物胎盤から入手可能な数より、有意
に多い胎盤細胞の回収をもたらすことが好ましい。この文脈において、「有意に多い」は
少なくとも１０％を超えることを意味する。灌流は、例えば胎盤、またはその一部分を培
養した培養培地から入手可能な胎盤細胞の数より、有意に多い胎盤幹細胞をもたらす。
１つまたは複数のプロテアーゼまたは他の組織破壊酵素を含む溶液での灌流によって、
胎盤から胎盤細胞を単離することができる。具体的な実施形態では、胎盤またはその一部
分（例えば、羊膜、羊膜および絨毛膜、胎盤小葉または胎盤葉、臍帯、または前述の任意
の組合せ）を２５〜３７℃にし、３０分間２００ｍＬの培養培地中で１つまたは複数の組
織破壊酵素と共にインキュベートする。灌流液からの細胞を回収し、４℃にし、５ｍＭの
ＥＤＴＡ、２ｍＭのジチオスレイトールおよび２ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む
低温の阻害剤混合物で洗浄する。胎盤細胞は、低温の（例えば４℃）幹細胞回収組成物で
数分後に洗浄する。
５．４．５ 胎盤幹細胞の単離、選別、および特徴付け
単離胎盤細胞、例えば、前のセクション５．３に記載した細胞は、灌流によって、また
は物理的破壊によって、例えば酵素による消化によって得ようと、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配
遠心分離によって他の細胞から初期に精製する（すなわち、それらから単離する）ことが
できる。このような遠心分離は、遠心分離速度などに関する任意の標準的なプロトコルに
従うことができる。一実施形態では、例えば、胎盤から回収した細胞を、室温で１５分間
５０００×ｇでの遠心分離によって灌流液から回収し、これは例えば汚染細胞片および血
小板から細胞を分離する。別の実施形態では、胎盤灌流液を約２００ｍｌに濃縮し、Ｆｉ
ｃｏｌｌで穏やかに層状にし、２２℃において２０分間約１１００×ｇで遠心分離にかけ
、細胞の低密度界面層をさらなる処理用に回収する。
細胞ペレットは、新たな幹細胞回収組成物、または幹細胞の維持に適した培地、例えば
２Ｕ／ｍｌのヘパリンおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＩＭＤＭ無血清培地（Ｇｉｂｃ
ｏＢＲＬ、ＮＹ）中に再懸濁することができる。全単核細胞分画は、例えば製造者の勧め
る手順に従いＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒ
ｗａｙ）を使用して単離することができる。
灌流または消化によって得られる胎盤細胞は、例えばさらに、または初期に、例えば０
．０５％トリプシンおよび０．２％ＥＤＴＡの溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｍ
Ｏ）を使用して、差次的トリプシン処理によって単離することができる。単離胎盤細胞は
典型的には約５分以内にプラスチック表面から脱着し、一方他の接着性集団は典型的には
２０〜３０分を超えるインキュベーションを必要とするので、差次的トリプシン処理は可
能である。脱着した胎盤細胞は、トリプシン処理、および例えばトリプシン中和溶液（Ｔ
ＮＳ、Ｃａｍｂｒｅｘ）を使用したトリプシン中和後に採取することができる。接着性細
胞の単離の一実施形態では、例えば約５〜１０×１０６個の細胞のアリコートを、いくつ
かのＴ−７５フラスコ、好ましくはフィブロネクチンコーティングＴ７５フラスコのそれ
ぞれに置く。このような実施形態では、細胞は市販の間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ
）（Ｃａｍｂｒｅｘ）で培養し、組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中に
置くことができる。１０〜１５日後、ＰＢＳで洗浄することにより非接着性細胞をフラス
コから除去する。次いでＰＢＳをＭＳＣＧＭと交換する。フラスコは様々な接着性細胞型
の存在に関して、特に線維芽細胞様細胞の塊の同定および増殖用に毎日調べることが好ま
しい。
哺乳動物胎盤から回収する細胞の数および型は、例えば、フローサイトメトリー、細胞
選別、免疫組織化学法（例えば、組織特異的または細胞マーカー特異的抗体を用いた染色
）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）などの標準的な細
胞検出技法を使用して形態および細胞表面マーカーの変化を測定すること、光学または共
焦点顕微鏡を使用して細胞の形態を調べることによって、および／またはＰＣＲおよび遺
伝子発現プロファイルなどの当技術分野でよく知られている技法を使用して、遺伝子発現
の変化を測定することによってモニターすることができる。これらの技法を使用して、１
つまたは複数の特定マーカーに陽性である細胞を同定することもできる。例えば、ＣＤ３
４に対する抗体を使用して、前述の技法を使用して、細胞が検出可能な量のＣＤ３４を含
むかどうか決定することができ、その場合細胞はＣＤ３４＋である。同様に、細胞がＲＴ
−ＰＣＲによって検出するのに十分なＯＣＴ−４のＲＮＡ、または成体細胞より有意に多
いＯＣＴ−４のＲＮＡを生成する場合、その細胞はＯＣＴ−４＋である。細胞表面マーカ
ー（例えば、ＣＤ３４などのＣＤマーカー）に対する抗体、およびＯＣＴ−４などの幹細
胞特異的遺伝子の配列は、当技術分野でよく知られている。
胎盤細胞、特にＦｉｃｏｌｌ分離、差次的接着、または両方の組合せによって単離した
細胞は、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を使用して選別することができる。蛍光活性
化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、粒子の蛍光性に基づいて細胞を含めた粒子を分離するための
、よく知られている方法である（Ｋａｍａｒｃｈ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、１５１：１５０〜１６５）。個々の粒子における蛍光成分のレーザー励起はわず
かな電荷をもたらし、混合物からのプラスの粒子とマイナスの粒子の電磁気的分離を可能
にする。一実施形態では、細胞表面マーカー特異的抗体またはリガンドを異なる蛍光標識
で標識する。細胞は細胞選別器によって処理し、使用する抗体と結合するそれらの能力に
基づく細胞の分離を可能にする。ＦＡＣＳにより選別した粒子は、９６ウエルまたは３８
４ウエルプレートの個々のウエル中に直接置いて、分離およびクローニングを容易にする
ことができる。
一選別スキームでは、胎盤由来の細胞、例えば胎盤幹細胞および胎盤多分化能細胞を、
マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ−４
および／またはＨＬＡ−Ｇの発現に基づいて選別する。培養中のそれらの接着性に基づい
て幹細胞を選択するための手順と関連して、これを実施することができる。例えば、接着
性に基づく幹細胞の選択は、マーカーの発現に基づいた選別の前後に実施することができ
る。一実施形態では、例えば、それらのＣＤ３４の発現に基づき細胞を最初に選別し、Ｃ
Ｄ３４−細胞は保持し、ＣＤ２００＋ＨＬＡ−Ｇ＋である細胞は全ての他のＣＤ３４−細
胞から分離する。別の実施形態では、胎盤由来の細胞をそれらのマーカーＣＤ２００およ
び／またはＨＬＡ−Ｇの発現に基づいて単離し、例えば、これらのマーカーのいずれかを
示す細胞はさらなる使用のために単離する。例えば、ＣＤ２００および／またはＨＬＡ−
Ｇを発現する細胞は、具体的な実施形態では、それらのＣＤ７３および／またはＣＤ１０
５の発現、または抗体ＳＨ２、ＳＨ３もしくはＳＨ４によって認識されるエピトープ、ま
たはＣＤ３４、ＣＤ３８またはＣＤ４５の発現の欠如に基づいてさらに選別することがで
きる。例えば、一実施形態では、胎盤細胞は、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ７３、ＣＤ
１０５、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５の発現、またはその欠如によって選別し、Ｃ
Ｄ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およ
びＣＤ４５−である胎盤細胞は、さらなる使用のため他の胎盤細胞から単離する。
胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞の抗体介在の検出および選別に関
して、特定マーカーに特異的な任意の抗体を、細胞の検出および選別に適した任意のフル
オロフォアまたは他の標識と組合せて使用することができる（例えば、蛍光活性化細胞選
別）。特異的マーカーに対する抗体／フルオロフォアの組合せには、ＨＬＡ−Ｇに対する
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合モノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅ
ｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａから入手可能）、ＣＤ１０（ＢＤ
Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉａから入手可能）、ＣＤ４４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ
ｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）、およびＣＤ１０５（Ｒ＆
Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入手
可能）、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＤ１１７、およびＣＤ１３に対するフィコエリスリン
（ＰＥ）結合モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ
ｎ）、ＣＤ３３およびＣＤ１０に対するフィコエリスリン−Ｃｙ７（ＰＥＣｙ７）結合モ
ノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、アロフィ
コシアニン（ＡＰＣ）結合ストレプトアビジンおよびＣＤ３８に対するモノクローナル抗
体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびビオチニル化ＣＤ
９０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）があるが、これらだけに
は限られない。使用することができる他の抗体には、ＣＤ１３３−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎ
ｙｉ）、ＫＤＲ−ビオチン（ＣＤ３０９、Ａｂｅａｍ）、サイトケラチンＫ−ＦＩＴＣ（
ＳｉｇｍａまたはＤａｋｏ）、ＨＬＡＡＢＣ−ＦＩＴＣ（ＢＤ）、ＨＬＡＤＲ、ＤＱ、Ｄ
Ｐ−ＰＥ（ＢＤ）、β−２−マイクログロブリン−ＰＥ（ＢＤ）、ＣＤ８０−ＰＥ（ＢＤ
）およびＣＤ８６−ＡＰＣ（ＢＤ）があるが、これらだけには限られない。
使用することができる他の抗体／標識の組合せには、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（ペリジン
クロロフィルタンパク質）、ＣＤ４４−ＰＥ、ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ１０−Ｆ（フルオレ
セイン）；ＨＬＡ−Ｇ−Ｆおよび７−アミノ−アクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）、Ｈ
ＬＡ−ＡＢＣ−Ｆなどがあるが、これらだけには限られない。
本明細書で提供する単離胎盤細胞は、例えばＣＤ１１７またはＣＤ１３３に対するフィ
コエリスリン−Ｃｙ５（ＰＥＣｙ５）結合ストレプトアビジンおよびビオチン結合モノク
ローナル抗体を使用して、ＣＤ１１７またはＣＤ１３３に関してアッセイすることができ
るが、しかしながら、このシステムを使用すると、比較的高いバックグラウンドのため、
細胞がそれぞれＣＤ１１７またはＣＤ１３３に関して陽性に見える可能性がある。
本明細書で提供する単離胎盤細胞は、１つのマーカーに対する抗体で標識し、検出およ
び／選別することができる。胎盤細胞は、異なるマーカーに対する多数の抗体で同時に標
識することもできる。
別の実施形態では、磁気ビーズを使用して細胞を分離することができる。細胞は、磁気
活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技法、磁気ビーズ（０．５〜１００μｍ径）と結合するそれ
らの能力に基づいて粒子を分離するための方法を使用して選別することができる。特定の
細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含めた、様々な
有用な修飾を磁性ミクロスフェアに実施することができる。次いでビーズを細胞と混合し
て結合を可能にする。次いで細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞
を分離する。一実施形態では、これらの細胞を次いで単離して、他の細胞表面マーカーに
対する抗体と結合した磁気ビーズと再度混合することができる。再度細胞を磁場に通して
、両抗体と結合した細胞を単離する。次いでこのような細胞を、クローン単離用のマイク
ロタイター皿などの別々の皿中に希釈することができる。
単離胎盤細胞は、細胞形態および増殖特性に基づいて特徴付けおよび／または選別する
こともできる。例えば、単離胎盤細胞は、例えば培養中の線維芽細胞様の外見を有すると
して特徴付けすることができ、および／またはそれに基づいて選択することができる。単
離胎盤細胞は、胚様体を形成するその能力を有するとして特徴付けすることができ、およ
び／またはそれに基づいて選択することもできる。一実施形態では、例えば、線維芽細胞
様の形状である単離胎盤細胞はＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、培養中に１つまたは
複数の胚様体を生成し、他の胎盤細胞から単離する。別の実施形態では、培養中に１つま
たは複数の胚様体を生成するＯＣＴ−４＋胎盤細胞を、他の胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、コロニー形成単位アッセイによって、単離胎盤細胞を同定および特
徴付けすることができる。ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂ
ｉａ）などのコロニー形成単位アッセイは当技術分野で一般に知られている。
単離胎盤細胞は、トリパンブルー色素排除アッセイ、フルオレセイン二酢酸取り込みア
ッセイ、ヨウ化プロピジウム取り込みアッセイ（生存率を評価するため）およびチミジン
取り込みアッセイ、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（増殖を評価するため）などの、当技術分野
で知られている標準的な技法を使用して、生存率、増殖能力、および寿命に関して評価す
ることができる。長期培養中の集団倍化の最大数の決定などの、当技術分野でよく知られ
ている方法によって寿命を決定することができる。
単離胎盤細胞は、当技術分野で知られている他の技法、例えば望ましい細胞の選択的増
殖（陽性選択）、望ましくない細胞の選択的破壊（陰性選択）、例えばダイズ凝集素を用
いた混合集団中の差次的細胞凝集に基づいた分離、凍結−解凍手順、濾過、従来型および
ゾーン遠心分離、遠心分離洗浄（カウンターストリーミング遠心分離）、単位重力による
分離、向流分配、電気泳動などを使用して、他の胎盤細胞から分離することもできる。
５．５ 単離胎盤細胞の培養
５．５．１ 培養培地
単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団、またはそこから胎盤幹細胞が増殖する細胞
もしくは胎盤組織を使用して、細胞培養を開始する、または接種することができる。細胞
は一般に、非コーティング状態、または細胞外マトリクスまたはラミニン、コラーゲン（
例えば、天然または変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン
などのリガンド、および細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））
（ＢＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）でコーテ
ィング状態のいずれかの滅菌済み組織培養容器に移す。
単離胎盤細胞は、細胞、例えば幹細胞を培養するのに許容できるとして当技術分野で認
められている、任意の培地中、および任意の条件下で培養することができる。培養培地は
血清を含むことが好ましい。単離胎盤細胞は、例えば、ＩＴＳ（インシュリン−トランス
フェリン−セレン）、ＬＡ＋ＢＳＡ（リノール酸−ウシ血清アルブミン）、デキストロー
ス、Ｌ−アスコルビン酸、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、およびペニシリン／ストレプ
トマイシンを含有するＤＭＥＭ−ＬＧ（ダルベッコ改変最小培地、低グルコース）／ＭＣ
ＤＢ２０１（ヒヨコ線維芽細胞基礎培地）、１％〜２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む
ＤＭＥＭ−ＨＧ（高グルコース）、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＨＧ、１０％ＦＢＳ、
１０％ウマ血清、およびヒドロコルチゾンを含むＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッ
コ培地）、１０％ＦＢＳ、ＥＧＦ、およびヘパリンを含むＭ１９９、１０％ＦＢＳ、ＧＬ
ＵＴＡＭＡＸ（商標）およびゲンタマイシンを含むα−ＭＥＭ（最小必須培地）、１０％
ＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）およびゲンタマイシンを含むＤＭＥＭなどにおいて培
養することができる。
胎盤細胞を培養するために使用することができる他の培地には、ＤＭＥＭ（高または低
グルコース）、イーグルの基礎培地、ＨａｍのＦ１０培地（Ｆ１０）、ＨａｍのＦ−１２
培地（Ｆ１２）、Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧ
Ｍ）、ＬｉｅｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地、ＭＣＤＢ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６
４０、最新ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）、および
ＣＥＬＬ−ＧＲＯ ＦＲＥＥがある。
例えば、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）
；ウマ（馬）血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ））、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）
、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）、１つまたは複数の増殖因子、例えば、血小板由
来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
Ｆ）、インシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内
皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびエリスロポイエチン（ＥＰＯ）、Ｌ−バリンを含めたア
ミノ酸、および細菌汚染を調節するための１つまたは複数の抗菌剤および／または抗真菌
剤、例えば、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシ
ン、およびニスタチンなどを含めた１つまたは複数の成分を、単独または組合せで培養培
地に補充することができる。
単離胎盤細胞は、標準的な組織培養条件において、例えば組織培養皿またはマルチウエ
ルプレートにおいて培養することができる。単離胎盤細胞は、懸滴法を使用して培養する
こともできる。この方法では、単離胎盤細胞を約５ｍＬの培地に１ｍＬ当たり約１×１０
４個の細胞で懸濁し、一滴または複数滴の培地を、組織培養容器、例えば１００ｍＬペト
リ皿の蓋の内側に置く。滴は、例えばマルチチャネルピペッターからの、一滴、または複
数滴であってよい。蓋を注意深く反転させ、一定体積の液体、例えば皿雰囲気中の水分含
量を維持するのに十分な滅菌済みＰＢＳを含有する、皿の底部表面に置き、幹細胞を培養
する。
一実施形態では、単離胎盤細胞は、単離胎盤細胞において未分化状態の表現型を維持す
るように作用する化合物の存在下で培養する。具体的な実施形態では、化合物は置換３，
４−ジヒドロピリジモール［４，５−ｄ］ピリミジンである。より具体的な実施形態では
、化合物は、以下の化学構造を有する化合物である：
Figure 2018138565
化合物は、例えば、約１μＭ〜約１０μＭの濃度で、単離胎盤細胞、または単離胎盤細
胞の集団と接触させることが可能である。
５．５．２ 胎盤細胞の拡大および増殖
単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団（例えば、幹細胞または幹細胞の集団と通常
ｉｎ ｖｉｖｏで関係がある胎盤細胞の、少なくとも５０％から分離した胎盤細胞または
胎盤細胞の集団）を得た後、細胞または細胞の集団をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖および拡大
することができる。例えば、単離胎盤細胞の集団を、細胞が７０〜９０％の集合状態に増
殖するのに十分な時間、すなわち細胞およびそれらの子孫が組織培養容器の培養表面積の
７０〜９０％を占めるまで、組織培養容器、例えば皿、フラスコ、マルチウエルプレート
などにおいて培養することができる。
単離胎盤細胞は、細胞増殖を可能にする密度で培養容器に接種することができる。例え
ば、細胞は低密度（例えば、約１，０００〜約５，０００個の細胞／ｃｍ２）〜高密度（
例えば、約５０，０００個以上の細胞／ｃｍ２）で接種することができる。好ましい実施
形態では、空気中に約０〜約５体積パーセントのＣＯ２の存在下で細胞を培養する。いく
つかの好ましい実施形態では、空気中に約２〜約２５体積パーセントのＯ２、好ましくは
空気中に約５〜約２０体積パーセントのＯ２で細胞を培養する。細胞は好ましくは約２５
℃〜約４０℃、好ましくは３７℃で培養する。細胞はインキュベーター内で培養するのが
好ましい。培養培地は固定状態であってよく、または例えばバイオリアクターを使用して
攪拌してよい。胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞は、（例えば、グル
タチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、Ｎ−アセチルシステインなど
を加えて）低い酸化ストレス下で増殖させるのが好ましい。
約１００％未満、例えば７０〜９０％の集合状態を得た後、細胞を継代することができ
る。例えば、当技術分野でよく知られている技法を使用して、細胞を酵素により処理、例
えばトリプシン処理して、組織培養表面からそれらを分離することができる。除去後、細
胞をピペッティングし、細胞を計数し、約１０，０００〜１００，０００個の細胞／ｃｍ
２、好ましくは約５０，０００個の細胞／ｃｍ２を、新たな培養培地を含有する新しい培
養容器に継代する。典型的には、新しい培地は、そこから単離胎盤細胞を除去した同じ型
の培地である。単離胎盤細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
、１２、１４、１６、１８、または２０回以上継代することができる。
胎盤細胞塊の生成
産後胎盤から単離した細胞、例えば、前のセクション５．３に記載した単離胎盤細胞を
いくつかの異なる方法で培養して、一組のロット、例えば一組の個別に投与可能な用量の
単離胎盤細胞を生成することができる。このようなロットは、例えば、胎盤灌流液由来の
細胞から、または酵素により消化した胎盤組織由来の細胞から得ることができる。複数の
胎盤から得た数組の胎盤細胞のロットは、例えば長期の貯蔵用に、単離胎盤細胞の塊に並
べることができる。一般に、組織培養プラスチック接着性胎盤細胞を胎盤材料の初期培養
から得て接種培養物を形成し、それを制御条件下で増殖してほぼ同数の倍化から細胞の集
団を形成する。ロットは一胎盤の組織に由来することが好ましいが、複数の胎盤の組織に
由来してよい。
一実施形態では、胎盤細胞のロットを以下のように得る。最初に胎盤組織を、例えば切
断によって破壊し、適切な酵素、例えばコラゲナーゼで消化する（前のセクション５．４
．３を参照）。胎盤組織は、例えば一胎盤由来の羊膜全体、絨毛膜全体、または両方を含
むことが好ましいが、羊膜または絨毛膜の一部分のみを含むことができる。消化した組織
は、例えば、約１〜３週間、好ましくは約２週間培養する。非接着性細胞を除去した後、
形成する高密度コロニーは、例えばトリプシン処理によって回収する。これらの細胞を回
収し、好都合な体積の培養培地に再懸濁し、次いでこれらを使用して増殖培養物を接種す
る。増殖培養物は、別の細胞培養装置、例えばＮＵＮＣ（商標）によるＣｅｌｌ Ｆａｃ
ｔｏｒｙの任意の配列であってよい。細胞は例えば１×１０３、２×１０３、３×１０３
、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１×１
０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８
×１０４、９×１０４、または１０×１０４個の幹細胞で増殖培養物を接種する任意の程
度に細分することができる。約１×１０３〜約１×１０４個の細胞／ｃｍ２を使用して、
それぞれの増殖培養物を接種することが好ましい。増殖培養物の数は、そこから細胞を得
る個々の（１つまたは複数の）胎盤に応じて、これより多数または少数であってよい。
増殖培養物は、培養中の細胞の密度が特定の値、例えば約１×１０５個の細胞／ｃｍ２
に達するまで増殖する。細胞はこの時点で回収および凍結保存のいずれかが可能であり、
または前に記載したように新しい増殖培養物に継代することができる。細胞は使用前に例
えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１
７、１８、１９または２０回継代することができる。集団倍化の累積数の記録は（１回ま
たは複数回の）増殖培養中維持されることが好ましい。細胞は２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、
３４、３６、３８または４０の倍化、または最大６０の倍化で増殖することができる。し
かしながら、細胞集団を個々の用量に分ける前の集団倍化の数は、約１５と約３０の間で
あることが好ましい。細胞は増殖プロセスを通じて連続的に培養することができ、または
増殖中に１つまたは複数の地点で凍結することができる。
個々の用量で使用する細胞は、後の使用のために凍結、例えば凍結保存することができ
る。個々の用量は、例えば１ｍｌ当たり約１００万個〜約５０００万個の細胞を含むこと
ができ、合計で約１０６個と約１０１０個の間の細胞を含むことができる。
一実施形態では、したがって胎盤細胞塊は、第１の複数集団倍化でヒト産後胎盤由来の
初代培養胎盤細胞を増殖すること、前記胎盤細胞を凍結保存してマスター細胞塊を形成す
ること、第２の複数集団倍化でマスター細胞塊から複数の胎盤細胞を増殖すること、前記
胎盤細胞を凍結保存して作業用細胞塊を形成すること、第３の複数集団倍化で作業用細胞
塊から複数の胎盤細胞を増殖すること、および前記胎盤細胞を個々の用量で凍結保存する
ことを含み、前記個々の用量が胎盤細胞塊を集合的に構成する方法によって作製すること
ができる。別の具体的な実施形態では、前記初代培養胎盤細胞は、胎盤灌流液由来の胎盤
細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記初代培養胎盤細胞は、消化胎盤組織由来の
胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記初代培養胎盤細胞は、胎盤灌流液由来
および消化胎盤組織由来の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞初
代培養物中の前記胎盤細胞の全てが同じ胎盤に由来する。別の具体的な実施形態では、こ
の方法は、前記作業用細胞塊由来の前記複数の前記胎盤細胞からＣＤ２００＋もしくはＨ
ＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞またはＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細
胞を選択して、個々の用量を形成するステップをさらに含む。別の具体的な実施形態では
、前記個々の用量は約１０４個〜約１０５個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態で
は、前記個々の用量は約１０５個〜約１０６個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態
では、前記個々の用量は約１０６個〜約１０７個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形
態では、前記個々の用量は約１０７個〜約１０８個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施
形態では、前記個々の用量は約１０８個〜約１０９個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実
施形態では、前記個々の用量は約１０９個〜約１０１０個の胎盤細胞を含む。
本明細書で提供する胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含む組成物
を作製する方法は、前に記載した任意のステップで胎盤細胞塊の構築に組み込むことがで
きる。一実施形態では、医薬組成物を、マスター細胞塊を生成した後、および前記マスタ
ー細胞塊からの１つまたは複数の作業用細胞塊の生成中、または前記作業用細胞塊からの
胎盤細胞の増殖中に生成する。例えば、胎盤細胞を作業用細胞塊から解凍し、複数集団倍
化で培養することができる。一実施形態では、望ましい数の細胞が生じるとき、または望
ましい数の集団倍化が起こるとき、胎盤細胞は例えば遠心分離によって回収し、例えばデ
キストラン４０、例えば５．５％デキストラン４０を含む溶液に再懸濁することができる
。特定の実施形態では、胎盤幹細胞を２回目に回収し、デキストランおよび凍結保護剤を
含む溶液、例えば１０％ＨＳＡおよび５％ＤＭＳＯを含む５．５％デキストラン４０溶液
に再懸濁し、凍結保存する。凍結保存した胎盤細胞は、例えば使用直前に、例えば前のセ
クション５．２に記載した組成物の最終生成の直前に解凍する。
胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含む組成物を生成する前述の方
法を、胎盤細胞塊の生成および／または使用中に、例えば、胎盤細胞が凍結保存され得る
各地点、または例えば、胎盤細胞を最終凍結保存前に個々の投与用に調製する地点で、お
よび個体への投与前の解凍時に、一度使用することができる。
好ましい実施形態では、そこから胎盤を得るドナー（例えば母親）を少なくとも１つの
病原体に関して試験する。母親が試験病原体に陽性反応を示す場合、胎盤由来の全ロット
を廃棄する。このような試験は、初期細胞培養の確定前後を含めた胎盤細胞ロットの生成
中、または増殖培養中の任意の時間で実施することができる。その存在に関して試験する
病原体は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス
（ＩおよびＩＩ型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどを非制限的に含むこ
とができる。
５．６ 胎盤細胞の保存
単離胎盤細胞、例えば前のセクション５．２に記載した単離胎盤多分化能細胞は、例え
ば回収中に保存することができる、すなわち、例えば本明細書に記載する方法を使用して
、例えば回収中または本明細書に記載する組成物の生成前に、長期の貯蔵を可能にする条
件下、または例えばアポトーシスまたは壊死による細胞死を抑制する条件下に置くことが
できる。
胎盤細胞は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる関連米国出願公開第２
００７／０１９００４２号に記載されたように、例えばアポトーシス阻害剤、壊死阻害剤
および／または酸素含有ペルフルオロカーボンを含む組成物を使用して保存することがで
きる。一実施形態では、本明細書に示す細胞を含む組成物において使用する細胞集団を保
存する方法は、アポトーシス阻害剤および酸素含有ペルフルオロカーボンを含む細胞回収
組成物と前記細胞集団を接触させることを含み、前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシ
ス阻害剤と接触していない細胞集団と比較して、前記細胞集団中のアポトーシスを低減ま
たは予防するのに十分な量および時間存在する。具体的な実施形態では、前記アポトーシ
ス阻害剤はカスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害
剤はＪＮＫ阻害剤である。より具体的な実施形態では、前記ＪＮＫ阻害剤は前記細胞の分
化または増殖を調節しない。別の実施形態では、前記細胞回収組成物は、前記アポトーシ
ス阻害剤および前記酸素含有ペルフルオロカーボンを分離相で含む。別の実施形態では、
前記細胞回収組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素含有ペルフルオロカーボ
ンをエマルジョン中に含む。別の実施形態では、前記細胞回収組成物は、乳化剤、例えば
レシチンをさらに含む。別の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフル
オロカーボンは細胞との接触時は約０℃と約２５℃の間である。別のより具体的な実施形
態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、細胞との接触時は
約２℃と１０℃の間、または約２℃と約５℃の間である。別のより具体的な実施形態では
、前記接触は前記細胞集団の輸送中に実施する。別のより具体的な実施形態では、前記接
触は、前記細胞集団の凍結および解凍中に実施する。
胎盤細胞の集団は、例えば、アポトーシス阻害剤および臓器保存用化合物と前記細胞集
団を接触させることを含む方法によって保存することができ、前記アポトーシス阻害剤は
、アポトーシス阻害剤と接触していない細胞集団と比較して、前記細胞集団中のアポトー
シスを低減または予防するのに十分な量および時間存在する。具体的な実施形態では、臓
器保存用化合物は、ＵＷ溶液（米国特許第４，７９８，８２４号に記載される；ＶｉａＳ
ｐａｎとしても知られる；Ｓｏｕｔｈａｒｄら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ４９（
２）：２５１〜２５７（１９９０）も参照）またはＳｔｅｍら、米国特許第５，５５２，
２６７号に記載される溶液である。別の実施形態では、前記臓器保存用化合物は、ヒドロ
キシエチルスターチ、ラクトビオン酸、ラフィノース、またはこれらの組合せである。別
の実施形態では、細胞回収組成物は、２相中またはエマルジョンとしてのいずれかで酸素
含有ペルフルオロカーボンをさらに含む。
方法の別の実施形態では、灌流中に、アポトーシス阻害剤および酸素含有ペルフルオロ
カーボン、臓器保存用化合物、またはこれらの組合せを含む細胞回収組成物と胎盤幹細胞
を接触させる。別の実施形態では、前記細胞は、組織破壊、例えば酵素による消化のプロ
セス中に接触させる。別の実施形態では、灌流による回収後、または組織破壊、例えば酵
素による消化による回収後に、胎盤細胞を前記細胞回収化合物と接触させる。
典型的には、胎盤細胞の回収、濃縮および単離中は、低酸素および機械的ストレスによ
る細胞ストレスを最小化または排除することが好ましい。したがって、方法の別の実施形
態では、細胞、または細胞集団を、前記保存中に６時間未満、回収、濃縮または単離中に
低酸素状態に曝し、低酸素状態は正常血中酸素濃度未満である酸素濃度である。より具体
的な実施形態では、前記細胞集団を、前記保存中に２時間未満前記低酸素状態に曝す。別
のより具体的な実施形態では、前記細胞集団を、回収、濃縮または単離中に１時間未満、
または３０分未満前記低酸素状態に曝す、または低酸素状態に曝さない。別の具体的な実
施形態では、前記細胞集団を、回収、濃縮または単離中にせん断応力に曝さない。
胎盤細胞は、本明細書で開示する一般的または具体的方法において、凍結保存すること
ができる。一実施形態では、胎盤細胞を凍結保存するために使用する凍結保護剤はＤＭＳ
Ｏである。別の実施形態では、凍結保護剤はプロピレングリコール、例えば約１．５Ｍプ
ロピレングリコールである。凍結保護剤は、例えばグリセロール、エチレングリコール、
ポリフェノール（例えば、約３０〜約１２０ｐｐｍ）などであってもよい。他の実施形態
では、凍結保護剤は、ＤＭＳＯ、トレハロース、およびデキストランの１つまたは複数の
と組合せたウシ胎児血清、ヒト血清、またはヒト血清アルブミンである。具体的な実施形
態では、凍結保護剤はヒト血清、ＤＭＳＯ、およびトレハロースであり、またはウシ胎児
血清およびＤＭＳＯである。特定の実施形態では、胎盤細胞は、小容器、例えばアンプル
中の、凍結保存培地中に凍結保存する。胎盤細胞は、凍結保存中約１℃／分で冷却するこ
とが好ましい。好ましい凍結保存温度は約−８０℃〜約−１８０℃、好ましくは約−１２
５℃〜約−１４０℃である。凍結保存した細胞は、使用するために解凍直前に液体窒素に
移すことができる。いくつかの実施形態では、例えば、アンプルが約−９０℃に達した後
、それらを液体窒素貯蔵領域に移す。速度制御フリーザーを使用して凍結保存を行うこと
もできる。凍結保存した細胞は、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度で、好ましくは約
３７℃の温度まで解凍する。
５．７ 細胞含有組成物
５．７．１ 胎盤細胞を含む組成物
本明細書、例えばセクション５．３に記載する胎盤細胞は、本明細書に記載する１つま
たは複数の胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含むことができ、これ
らの細胞は胎盤、例えばヒト胎盤から単離されている。別の具体的な実施形態では、任意
の前述の組成物はマトリクスを含む。より具体的な実施形態では、前記マトリクスは三次
元骨格である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは、コラーゲン、ゼラチ
ン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチンまたはビトロネクチンを含む。
別のより具体的な実施形態では、マトリクスは、羊膜または羊膜由来生体材料である。別
のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは細胞外膜タンパク質を含む。別のより具
体的な実施形態では、前記マトリクスは合成化合物を含む。別のより具体的な実施形態で
は、前記マトリクスは生物活性化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記生物
活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体、または５，０００ダルトン未満の有機分
子である。
別の実施形態では、本明細書で提供する組成物、例えば医薬組成物において有用な組成
物は、任意の前述の胎盤細胞、または任意の前述の胎盤細胞集団によって条件付けされる
培地を含む。具体的な実施形態では、任意のこのような組成物は、胎盤に由来しない幹細
胞を含む。より具体的な実施形態では、前記幹細胞は胚性幹細胞である。別の具体的な実
施形態では、前記幹細胞は間葉系幹細胞である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞
は骨髄由来幹細胞である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は造血前駆細胞である
。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は体性幹細胞である。さらにより具体的な実施
形態では、前記体性幹細胞は、神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓
幹細胞、または筋肉幹細胞である。
５．７．１．１ 医薬組成物
単離胎盤細胞の集団、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、医薬組成物内に含有さ
れる、またはその構成成分である。単離胎盤細胞は、個体に容易に投与可能である形、例
えば、医学用途に適した容器内に含有される胎盤灌流液細胞または単離胎盤細胞に調製す
ることができる。このような容器は、例えば、シリンジ、滅菌済みプラスチックバッグ、
フラスコ、ジャー、またはそこから胎盤幹細胞集団を容易に分配することができる他の容
器であってよい。例えば容器は、レシピエントへの液体の静脈内投与に適した、血液バッ
グ、または他のプラスチック製の、医学的に許容されるバッグであってよい。特定の実施
形態では、容器は単離胎盤細胞集団の凍結保存を可能にする容器である。
一実施形態では、容器は、本明細書に記載する１つまたは複数の方法ステップの実施を
容易にする、または可能にする容器である。例えば、細胞を含む組成物を生成する方法が
、例えば、（ａ）前記細胞を、デキストランおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む
溶液と接触させて細胞含有溶液を生成するステップ、（ｂ）溶液を濾過するステップ、（
ｃ）前記細胞をデキストランを含む第１の希釈溶液で、１ミリリットル当たり約１〜５０
×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６
、または１〜１０×１０６個の細胞に希釈するステップ、および（ｄ）前記細胞を、デキ
ストランを含みＨＳＡを含まない第２の希釈溶液で希釈するステップを含む場合、細胞、
例えば単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞を、例えばステップ（ｃ）と（ｄ）の間に容器
中に置くことができ、容器は例えば、凍結保存を容易にする、および／または細胞を必要
とする個体への細胞の送達を容易にする容器などである。特定の実施形態では、前記希釈
は１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、前記希釈
は１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞である。他の特定の実施形態では、
細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞である場合、濾過は任意
選択である。
例えば、単離胎盤細胞は、例えばバッグ、例えば血液バッグまたは同様のバッグ中に凍
結保存することができ、解凍し、同じバッグ中に最終的に希釈することができる。別の実
施形態では、細胞を含む組成物を生成する方法が、例えば、（ａ）複数の細胞、例えば胎
盤灌流液細胞または単離胎盤細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、（ｂ）細
胞を５．５％デキストラン４０に再懸濁するステップ、（ｃ）細胞を遠心分離にかけて細
胞を回収するステップ、（ｄ）細胞を、１０％のＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０
溶液に再懸濁するステップ、（ｅ）細胞を７０μＭ〜１００μＭフィルターで濾過するス
テップ、（ｆ）細胞を、５．５％のデキストラン４０、１０％のＨＳＡ、および５％のＤ
ＭＳＯ中に１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞に希釈するステップ、（ｇ
）細胞を凍結保存するステップ、（ｈ）細胞を解凍するステップ、および（ｉ）１０％デ
キストラン４０で細胞を１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈して前記医薬組成物を生成す
るステップを含む場合、例えば、凍結保存および／または細胞を必要とする個体への細胞
の投与を容易にする容器中の細胞の配置は、ステップ（ｅ）後の任意のステップで例えば
実施することができる。特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリット
ル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６
、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、ス
テップ（ｆ）の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞である。他の特
定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞であ
る場合、濾過は任意選択である。具体的な実施形態では、細胞、例えば単離胎盤細胞また
は胎盤灌流液細胞を、濾過後に容器中に置くことができ、次いで容器中で希釈、凍結保存
、解凍し、および／または個体への投与前に最終的に希釈することができる。
本明細書で提供する組成物、例えば医薬組成物中の単離胎盤細胞は、１ドナー由来、ま
たは複数のドナー由来の胎盤細胞を含むことができる。単離胎盤細胞は、目的のレシピエ
ントと完全にＨＬＡ適合状態、または部分的もしくは完全にＨＬＡミスマッチであってよ
い。
したがって、一実施形態では、本明細書で提供する組成物中の単離胎盤細胞を、その必
要性のある個体に投与する。具体的には、前記単離胎盤細胞は、筋肉内、皮内、腹膜内、
動脈内、皮下、静脈内または眼内投与する。一実施形態では、本明細書で提供する組成物
中の単離胎盤細胞を、容器中に単離胎盤細胞を含む組成物の形で、その必要性のある個体
に投与する。別の具体的な実施形態では、容器はバッグ、フラスコ、またはジャーである
。より具体的な実施形態では、前記バッグは滅菌済みプラスチックバッグである。より具
体的な実施形態では、前記バッグは、例えば、静脈内注入、ボーラス注射などによる前記
単離胎盤細胞の静脈内投与に適している、それを可能にするまたは容易にする。バッグは
、相互接続して投与前または最中の単離胎盤細胞と１つまたは複数の他の溶液、例えば薬
剤の混合を可能にする、多数の内腔または区画を含むことができる。別の具体的な実施形
態では、凍結保存前に、単離胎盤細胞を含む溶液は、組合せ細胞の凍結保存を容易にする
１つまたは複数の化合物を含む。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は生理的
に許容される水溶液中に含有される。より具体的な実施形態では、前記生理的に許容され
る水溶液は０．９％のＮａＣｌ溶液である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細
胞は、前記細胞集団のレシピエントとＨＬＡ適合状態である胎盤細胞を含む。別の具体的
な実施形態では、前記組合せ細胞は、前記細胞集団のレシピエントと少なくとも部分的に
ＨＬＡミスマッチである胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞は複
数のドナーに由来する。
医薬組成物中の単離胎盤細胞は、本明細書に記載する任意の単離胎盤細胞であってよい
。具体的な実施形態では、本明細書に記載する単離胎盤細胞は、容器中に含有されるＣＤ
１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞である。具体的な実施形態では、
本明細書に記載する単離胎盤細胞は、容器中に含有されるＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋細
胞である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、容器中に含有されるＣＤ７３＋
、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は
、容器中に含有されるＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋細胞である。別の具体的な実施形態で
は、単離胎盤細胞は、容器中に含有されるＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋細胞であり、前記細
胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で胎盤細胞集団と共に培養すると１つまたは複数
の胚様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、凍結保存さ
れ容器中に含有されるＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋細胞である。別の具体的
な実施形態では、単離胎盤細胞は容器中に含有されるＯＣＴ−４＋細胞であり、前記細胞
は、胚様体の形成を可能にする条件下で胎盤細胞集団と共に培養すると１つまたは複数の
胚様体の形成を容易にする。任意の前述の胎盤細胞の具体的な実施形態では、前記容器は
バッグである。
様々な具体的な実施形態では、前記容器は、約、少なくとも、または最大１×１０６個
の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０６個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細
胞、１×１０７個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０７個の単離胎盤細胞ま
たは胎盤灌流液細胞、１×１０８個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０８個
の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、１×１０９個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細
胞、５×１０９個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、または１×１０１０個の単離胎
盤細胞または胎盤灌流液細胞を含む。他の実施形態では、一回単位用量の単離胎盤細胞ま
たは胎盤灌流液細胞は、様々な実施形態では、約、少なくとも、または最大１×１０５、
５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０
８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１またはそれよ
り多くの単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞を含むことができる。他の実施形態では、単
離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞の容器または用量は、１×１０５〜５×１０５個の単離
胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０５〜１×１０６個の単離胎盤細胞または胎盤灌
流液細胞、１×１０６〜５×１０６個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０６
〜１×１０７個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、１×１０７〜５×１０７個の単離
胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０７〜１×１０８個の単離胎盤細胞または胎盤灌
流液細胞、１×１０８〜５×１０８個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０８
〜１×１０９個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、１×１０９〜５×１０９個の単離
胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×１０９〜１×１０１０個の単離胎盤細胞または胎盤
灌流液細胞、１×１０１０〜５×１０１０個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、５×
１０１０〜１×１０１１個の単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞、またはそれより多くの
単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、レシ
ピエント１キログラム当たり約２×１０７〜約１０×１０７個の細胞を投与するのに十分
な数の、単離胎盤細胞または胎盤灌流液細胞を含む。
任意の前述の凍結保存集団の他の具体的な実施形態では、前記細胞は、約、少なくとも
、または最大５回、最大１０回、最大１５回、または最大２０回継代した。任意の前述の
凍結保存細胞の別の具体的な実施形態では、前記細胞は前記容器内で増殖させた。
本明細書で記載する胎盤幹細胞を含む医薬組成物は、本明細書で他の箇所に記載する、
任意の単離胎盤細胞集団、または単離胎盤細胞型、または任意の組合せを含むことができ
る。医薬組成物は、胎児、母親、または胎児と母親両方の胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞ま
たは胎盤多分化能細胞を含むことができる。本明細書で提供する医薬組成物は、一個体ま
たは胎盤から、または複数の個体または胎盤から得る単離胎盤細胞をさらに含むことがで
きる。
本明細書で提供する医薬組成物は、５０％以上生存状態である細胞（すなわち、集団中
の少なくとも５０％の細胞が機能的または生存している）を含む細胞の集団を含む。集団
中の少なくとも６０％の細胞が生存状態であることが好ましい。医薬組成物内の集団中の
少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が生存状態であること
がより好ましい。
一実施形態では、医薬組成物は、実質的、または完全に非母型起源である、すなわち胎
児の遺伝子型を有する、例えば少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％または約１
００％が非母型起源である、単離胎盤細胞を含む。例えば、一実施形態では、医薬組成物
は単離胎盤細胞の集団を含み、それらはＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋、
ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３＋、Ｃ
Ｄ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり、胚様体またはＯ
ＣＴ−４＋の形成を可能にする条件下で前記胎盤細胞集団を培養すると、前記単離胎盤細
胞集団を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、胚様体
または前述の任意の組合せの形成を可能にする条件下で前記胎盤細胞集団を培養すると、
前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記胎盤細胞集団中の１つまたは複数の胚様体の形成
を容易にし、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の前記胎盤細胞
は非母型起源である。別の実施形態では、医薬組成物は単離胎盤細胞の集団を含み、それ
らはＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ３４−；ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２０
０＋およびＣＤ３４−；ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−およびＣ
Ｄ９０＋またはＣＤ４５−の少なくとも１つ；ＣＤ１０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、
ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−；ＣＤ１０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、
ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−；ＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７
３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３
＋、ＣＤ１０５＋、およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり、胚様体
；ＯＣＴ−４＋の形成を可能にする条件下で前記胎盤細胞集団を培養すると、前記単離胎
盤細胞を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、胚様体
；ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，
Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−および／またはＰＤＬ１＋の１つまたは複数；または
前述の組合せの形成を可能にする条件下で前記胎盤細胞集団を培養すると、前記単離胎盤
細胞を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、少なくと
も７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の前記単離胎盤細胞は非母型起源であ
る。具体的な実施形態では、医薬組成物は、胎盤から得られない幹細胞をさらに含む。
本明細書で提供する医薬組成物は、例えば生着を容易にする１つまたは複数の化合物（
例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体、免疫抑制剤など）、例えばアルブミン、デキストラン４０
、ゼラチン、ヒドロキシエチルスターチ、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅなどの安定剤を含むこと
ができる。
５．７．２ 造血胎盤細胞または胎盤灌流液細胞を含む組成物
本明細書で提供する組成物の特定の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４＋胎盤幹細
胞、例えば造血胎盤細胞または前駆細胞である。このような細胞は、胎盤組織から、例え
ば臍帯血を流出させ、灌流させて残留血液を除去した胎盤から入手可能である。特定の実
施形態では、ＣＤ３４＋胎盤幹細胞はＣＤ３８＋である。特定の実施形態では、ＣＤ３４
＋単離胎盤幹細胞はＣＤ３８−である。特定の他の実施形態では、ＣＤ３４＋単離胎盤細
胞はＣＤ４５＋である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４＋、ＣＤ３８−
およびＣＤ４５＋である。特定の実施形態では、細胞は造血細胞である。より具体的な実
施形態では、胎盤ＣＤ３４＋細胞は造血細胞である。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細
胞または造血細胞は胎盤灌流液から得る。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞または造
血細胞は、胎盤組織の酵素による消化または物理的破壊によって得る。ＣＤ３４＋細胞お
よび造血細胞は、１つの胎盤から、または２つ以上の胎盤から得ることができる。
特定の実施形態では、本明細書で提供する方法によって製剤化した本明細書で提供する
組成物の細胞は、胎盤灌流液から得た細胞である。本明細書で使用する「胎盤灌流液から
得た細胞」は、胎盤灌流液から得た、例えば単離した全有核細胞、胎盤灌流液から得た有
核細胞のサブセット、または胎盤灌流液から直接得た細胞から培養もしくは増殖した細胞
を含む。胎盤灌流液は、胎盤細胞を得るための灌流前に、臍帯血を流出させ、灌流させて
残留血液を除去した胎盤から得ることができる。胎盤灌流液は、臍帯血を流出させている
が灌流させて残留血液を除去していない胎盤から得ることができる。胎盤灌流液は、臍帯
血を流出させておらず灌流させて残留血液を除去してもいない胎盤から得ることができる
。後の２つの実施形態では、胎盤細胞、例えば胎盤灌流液からの有核細胞、例えば、胎盤
灌流液からの全有核細胞は、胎盤血および／または臍帯血からの有核細胞を含む。胎盤灌
流液細胞は、１つの胎盤から、または２つ以上の胎盤から得ることができる。
５．７．３ 不死化胎盤細胞系
哺乳動物胎盤細胞は、増殖促進遺伝子、すなわち適切な条件下で、増殖促進タンパク質
の生成および／または活性が外部因子により制御可能であるように、トランスフェクト細
胞の増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含有する、任意の適切なベクターを
用いたトランスフェクションによって、条件付きで不死化することができる。好ましい実
施形態では、増殖促進遺伝子は、ｖ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＳＶ４
０高分子Ｔ抗原、ポリオーマ高分子Ｔ抗原、Ｅ１ａアデノウイルスまたはヒトパピローマ
ウイルスのＥ７タンパク質だけには限られないが、これらなどの癌遺伝子である。
増殖促進タンパク質の外部制御は、外部制御可能なプロモーター、例えばトランスフェ
クト細胞の温度または細胞と接触する培地の組成を改変することによって、その活性を制
御することができるプロモーターの制御下に、増殖促進遺伝子を置くことによって実施す
ることができる。一実施形態では、テトラサイクリン（ｔｅｔ）制御遺伝子発現系を利用
することができる（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
９：５５４７〜５５５１、１９９２；Ｈｏｓｈｉｍａｒｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１５１８〜１５２３、１９９６を参照）。ｔｅｔの不在下に
おいて、このベクター内のｔｅｔ制御転写活性化因子（ｔＴＡ）は、ｐｈＣＭＶ−１、ｔ
ｅｔオペレーター配列と融合したヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターから
の転写を強く活性化する。ｔＴＡは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌのトランスポゾ
ン−１０由来ｔｅｔ耐性オペロンのリプレッサー（ｔｅｔＲ）と単純ヘルペスウイルスの
ＶＰ１６の酸性ドメインの融合タンパク質である。低い、非毒性濃度のｔｅｔ（例えば、
０．０１〜１．０μｇ／ｍＬ）は、ｔＴＡによる転写活性化をほぼ完全になくす。
一実施形態では、ベクターは、選択可能マーカー、例えば薬剤耐性を与えるタンパク質
をコードする遺伝子をさらに含有する。細菌ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）は、本
発明の方法内で利用することができる１つのこのようなマーカーである。ｎｅｏＲを有す
る細胞は、例えば増殖培地に１００〜２００μｇ／ｍＬのＧ４１８を加えることなどの、
当業者に知られている手段によって選択することができる。
レトロウイルス感染だけには限らないが、これを含めた当業者に知られている様々な手
段のいずれかによって、トランスフェクションを実施することができる。一般に、ベクタ
ー用に生産者細胞系から回収した条件付き培地とＮ２サプリメントを含有するＤＭＥＭ／
Ｆ１２の混合物とのインキュベーションによって、細胞培養物をトランスフェクトするこ
とができる。例えば、前に記載したように調製した胎盤細胞培養物は、１体積の条件付き
培地および２体積のＮ２サプリメント含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２における約２０時間のインキ
ュベーションによって、例えば５日後にｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させることが可能である
。次いで選択可能マーカーを有するトランスフェクト細胞を、前に記載したように選択す
ることができる。
トランスフェクション後、増殖を可能にする、例えば少なくとも３０％の細胞が２４時
間の間に倍化するのが可能である表面で培養物を継代する。支持体は、ポリオルニチン（
１０μｇ／ｍＬ）および／またはラミニン（１０μｇ／ｍＬ）でコーティングされた組織
培養プラスチックからなるポリオルニチン／ラミニン支持体、ポリリシン／ラミニン支持
体またはフィブロネクチンで処理した表面であることが好ましい。次いで培養物を３〜４
日毎に増殖培地に供給し、増殖培地には１つまたは複数の増殖促進因子を補充してよい、
または補充しなくてよい。培養物が５０％未満の集合状態（confluent）であるとき、増
殖促進因子を増殖培地に加えることができる。
条件付き不死化胎盤細胞系は、８０〜９５％の集合状態時に、標準的な技法を使用して
、トリプシン処理などによって継代することができる。いくつかの実施形態では、約２０
代の継代まで、（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含有する細胞にＧ４１８を加えるこ
とによって）選択を維持することが有益である。細胞は長期の貯蔵用に液体窒素中に凍結
することもできる。
クローン細胞系は、前に記載したように調製した条件付き不死化ヒト胎盤細胞系から単
離することができる。一般に、このようなクローン細胞系は、標準的な技法を使用して、
限界希釈またはクローニングリングの使用などによって単離し、増殖することができる。
クローン細胞系は、一般に前に記載したように供給し継代することができる。
必要はないがクローンであってよい、条件付き不死化ヒト胎盤細胞系は、分化を容易に
する培養条件下で増殖促進タンパク質の生成および／または活性を抑制することによって
、一般に分化を誘導することができる。例えば、増殖促進タンパク質をコードする遺伝子
が外部制御可能なプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば温度または培地の組成
を改変して、増殖促進遺伝子の転写を抑制することができる。前に論じたテトラサイクリ
ン制御型遺伝子発現系に関して、テトラサイクリンを加えて増殖促進遺伝子の転写を抑制
することによって、分化を実施することができる。一般に、４〜５日間で１μｇ／ｍＬの
テトラサイクリンが分化を開始するのに十分である。さらなる分化を促進するために、追
加的な作用物質を増殖培地に含めることができる。
５．７．４ キット
別の態様では、本発明の単離胎盤細胞含有組成物の生成および／または投与用のキット
が本明細書でさらに提供される。
一実施形態では、別個の容器中に、デキストラン、例えばデキストラン４０を含む１つ
または複数の溶液、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、および凍結保護剤を含む溶液を含む
キットが本明細書で提供される。具体的な実施形態では、キットは複数の単離胎盤細胞、
例えば凍結保存した単離胎盤細胞を含む。具体的な実施形態では、キットは、５．５％デ
キストラン４０（ｗ／ｖ）および１０％ＨＳＡ（ｗ／ｖ）を含む溶液を含む容器を含む。
別の具体的な実施形態では、キットは、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡおよび
５％ＤＭＳＯを含む溶液を含む容器を含む。別の具体的な実施形態では、キットは、１０
％デキストラン４０の溶液を含む容器を含む。
別の実施形態では、キットは、細胞懸濁液を濾過するのに適したフィルター、または複
数のフィルターを含む。具体的な実施形態では、キット中の１つまたは複数のフィルター
は、約５０μＭ径と約１５０μＭ径の間の孔を含む。より別の実施形態では、フィルター
は７０μＭフィルターである。別の具体的な実施形態では、フィルターは１００μＭフィ
ルターである。
別の実施形態では、キットは、本明細書に記載する組成物の１つの生成または使用に適
した、１つまたは複数のガラス製品またはプラスチック製品を含む。例えばキットは、例
えば、細胞懸濁液、例えば単離胎盤細胞の懸濁液の凍結保存または希釈または送達に適し
た、プラスチックバッグを含むことができる。別の実施形態では、キットは、（１）例え
ば１つまたは複数のバイアル中に、複数の単離胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多
分化能細胞、（２）例えば２〜３継代の前記単離胎盤細胞を培養するのに十分なプラスチ
ック製品、（３）５．５％デキストラン４０（ｗ／ｖ）および１０％ＨＳＡ（ｗ／ｖ）を
含む溶液を含む容器、（４）５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡおよび５％ＤＭＳ
Ｏを含む溶液を含む容器、（５）１０％デキストラン４０溶液を含む容器、および（６）
細胞を含む溶液を濾過するのに適した約５０μＭ径と約１５０μＭ径の間の孔を含む１つ
または複数のフィルターを含む。
６．１ 単離胎盤細胞を含む投与可能な組成物を生成する改良方法
この実施例は、ヒトまたは動物に投与するための、均質で、高い生存能力の単離胎盤細
胞を生成するための、凍結保存前後のヒトＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ
２００＋単離胎盤細胞の製剤化を実証する。生成する組成物は、解凍後少なくとも４時間
にわたり高い生存能力を示す単離胎盤細胞を含み、マクロの細胞塊は含まない。マウスの
急性投薬試験は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスが、（呼吸困難、循環、および運動失調によっ
て示される）いかなる心臓または肺毒性もなく、静脈内注入投与により以下に記載する最
終製剤を使用して、マウス当たり少なくとも１５０万個の細胞（１ｋｇ当たり約７５００
万個の細胞、２０グラムの平均重量を想定）の最大用量、および皮下投与により１ｋｇ当
たり最大２億５０００万個の細胞に耐性があったことを実証し、以前の製剤に優る改良点
を実証した。以下の実施例は、特定の表面マーカーを発現する単離胎盤細胞の製剤を記載
するが、本明細書に示す結果は、これらの方法および製剤が、他の細胞、例えば、異なる
表面マーカーを発現する哺乳動物細胞と共に使用することができ、それと適合性があるこ
とを示す。
細胞塊アッセイ
細胞塊（凝集体）を、マクロ細胞塊またはミクロ細胞塊として分類した。マクロ細胞塊
およびミクロ細胞塊は、存在した場合、以下の手順に従い同定した。
マクロ細胞塊アッセイ
氷の小片のみが容器中に残るまで、細胞を３７℃の水浴中において容器中で解凍した。
１６ゲージのニードルを備えるシリンジを使用して容器から細胞を取り出し、細胞は容器
から５０ｍＬのコニカルチューブに分配した。マクロ細胞塊の有無は目視によって評価し
た。
ミクロ細胞塊アッセイ
細胞を計数して細胞濃度を決定した。次いで細胞を１０％デキストラン４０で４×１０
６個の細胞／ｍｌに希釈し、５０μＬの細胞、４０μＬの１０％デキストラン４０、およ
び１０μＬの４０μＭの測定ビーズ溶液を１．７ｍＬのマイクロ遠心分離チューブに加え
た。チューブの中身を穏やかに混合した。１０μＬの混合サンプルをスライドガラス上に
置き、カバースリップで覆った。３個以上の細胞を含む全てのミクロ細胞塊を計数した。
使用した胎盤細胞は、本明細書に記載したように凍結保存前に４〜６回の継代を経た接
着性胎盤細胞の集団を含有した、セルバンクから最初に得た。
２つの異なる単離胎盤細胞系を使用したｉｎ ｖｉｖｏ注射適合バッファーの比較のデ
ータは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡ、および１％のヒト
血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）が、解凍
後５時間の後にいずれも細胞の高い生存能力を維持することができることを示した。バッ
ファー中の最終細胞濃度は２５×１０６個の細胞／ｍｌであった。試験バッファーに関し
て細胞の高い生存能力を促進するため、ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡを選択した。表１０ａお
よび表１０ｂ中で実証されたように、高い生存能力が解凍後数時間維持され、さらに、名
目上の表現型は解凍後３時間にわたり変わらなかった。解凍後製剤中の細胞の生存能力は
、２６ゲージのニードルを介した細胞の継代後に有意に影響を受けることはなかった。こ
の２つの実験中の細胞塊の決定は、使用したサンプル体積が少量であるため可能ではなか
った。
表１ａおよび表１ｂのデータに基づいて、解凍後製剤は以下のように最終状態にした。
細胞を３７℃において水浴中で解凍し、解凍バッファー（２．５％ＨＳＡ＋５％デキスト
ラン４０）で即座に１：１（ｖ／ｖ）に希釈した。次いで細胞を４００ｇで５分間遠心分
離にかけ、ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡ＋１％ＨＳＡ中に再懸濁した。
Figure 2018138565
Figure 2018138565
マウスの生体内分布試験
前述の解凍後製剤をマウスの生体内分布パイロット試験において施用した。マクロの細
胞塊は解凍後の細胞調製中に、特にＰｌａｓｍａｌｙｔｅを加えた後に観察した。この細
胞調製によって、それぞれ５０万個の細胞の二回反復静脈内注入によりマウス（約２０ｇ
）当たり１００万個の細胞の用量で、急性肺毒性を観察した。この２つの観察は、胎盤細
胞製剤のさらなる調査を促した。
デキストラン４０ではなく、ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡの添加後に顕著な細胞塊を誘導し
たマウスの生体内分布パイロット試験からの観察に基づいて、デキストラン４０は、この
試験ではＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡ、ＨＳＡおよびＰＢＳと共に希釈培地として使用した。
Figure 2018138565
ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡ＋１０％ＨＳＡ＋５％ＤＭＳＯ中に事前に凍結した細胞を３７
℃において水浴中で解凍し、それぞれのバッファーで１：７に希釈した。表２中のデータ
は、デキストラン４０およびＨＳＡが、試験した培地の中で最小数の細胞塊を誘導したこ
とを示す。
細胞凝集体を解凍直後に様々な製剤において観察した。解凍後の細胞を１００μｍフィ
ルターで濾過した濾過ステップの追加によって、細胞凝集体を排除した。２ロットの胎盤
細胞を、個々の希釈剤と組合せて濾過の影響に関して試験した。解凍後４時間にわたり１
０％デキストラン４０で細胞を１：１に希釈したとき、濾過後にマクロの細胞塊は形成さ
れなかった。表３ａ〜３ｃを参照。さらに、生存率は依然として高かった。同様の結果を
いくつか異なるロットの胎盤細胞で観察した。
Figure 2018138565
Figure 2018138565
Figure 2018138565
前述の試験に基づき、解凍後の製剤胎盤細胞を以下の手順で単純化（simplify）した。
細胞を最大３分間３７℃の水浴中で解凍し、次いで１００μＭストレーナーを介して濾過
した。濾過した細胞を次いで１０％デキストラン４０で１：１（ｖ：ｖ）に希釈した。
凍結前製剤
細胞処理の凍結前の段階においても細胞塊を観察した。凍結培地、凍結細胞密度および
懸濁濾過ステップを試験して、凍結前に細胞凝集体を低減および／または排除した。
凍結培地
前述の解凍後製剤におけるデキストラン４０の成功に基づいて、凍結培地としてのＰｌ
ａｓｍａｌｙｔｅとデキストラン４０を比較した。ロット３からの細胞を、Ｐｌａｓｍａ
ｌｙｔｅＡ＋１０％ＨＳＡ＋５％ＤＭＳＯ中、または５％デキストラン４０＋１０％ＨＳ
Ａ＋５％ＤＭＳＯ中のいずれかに１ｍＬ当たり１７００万個の細胞の濃度で凍結した。細
胞塊の存在は以下のように評価した。
Figure 2018138565
Figure 2018138565
Figure 2018138565
これらの実験中でのデキストラン４０の使用は、ＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡの使用より、
少ないマクロ細胞塊、少ないミクロ細胞塊、および高い細胞生存率をもたらした。これら
の結果に基づいて、凍結培地としてデキストラン４０を選択した。
凍結細胞密度および凍結前濾過
マクロ細胞塊を排除しミクロ細胞塊を最小にするために、細胞密度および凍結前濾過を
以下のように調べた。
Figure 2018138565
Figure 2018138565
Figure 2018138565
表５ｂおよび５ｃに示す結果は、凍結前濾過が解凍後マクロの細胞塊形成を排除したこ
とを明らかに示す。データは、高い細胞濃度、例えば２０×１０６個の細胞／ｍｌを有す
るサンプルが、解凍後にミクロの細胞塊を形成する可能性がより高いことも示す。結果と
して、細胞塊形成に対する凍結細胞密度の影響をさらに調べた。
Figure 2018138565
Figure 2018138565
Figure 2018138565
表６ｂおよび６ｃに示す結果は、７．５×１０６個の細胞／ｍｌ以下での凍結密度は解
凍後マクロの細胞塊を誘導しないことを実証する。さらに、１０×１０６個の細胞／ｍｌ
までの濃度で、ミクロ細胞塊の数はかなり少なく、２００未満のミクロ細胞塊／細胞１０
０万個であった。
前述の結果に基づいて、凍結前および解凍後製剤を以下のように作製した。凍結前製剤
用に、液体培養物由来の胎盤細胞を２２０×ｇで５分間遠心分離にかけ、約７．５×１０
６個の細胞／ｍｌまで５％デキストラン４０中に再懸濁した。細胞は４００×ｇで１０分
間遠心分離にかけ、次いで約７．５×１０６個の細胞／ｍｌまで６％デキストラン４０お
よび１０％ＨＳＡ中に再懸濁した。再懸濁した細胞は、次いで重力により７０μＭフィル
ターを通過させた。濾過した細胞は、次いで約７．５×１０６個の細胞／ｍｌの濃度まで
、５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯ中に希釈した。希釈した細
胞は低温バッグ中に置き、凍結し、気相窒素下で保存した。解凍後製剤用に、凍結細胞を
３７℃の水浴中で解凍し、次いで１：１〜１：５の細胞含有バッファー：デキストラン４
０の様々な体積比で１０％デキストラン４０を用いて希釈した。
胎盤細胞製剤の評価
１．解凍後のマクロの細胞塊形成なし
５ロットの胎盤細胞を前述の製剤化法を使用して生成した（以下に記載したロット１１
およびロット１２を含む）。解凍後のマクロの細胞塊は５ロットのいずれにおいても観察
されず、ミクロ細胞塊の数は依然として少なかった。
２．表現型に対する影響なし
胎盤細胞の表現型は改良型製剤によって影響を受けなかった。製剤中の９０％を超える
細胞が依然としてＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋であった。
３．ＧＬＰマウス試験
ロット１２の細胞はマウスの生体内分布試験に使用した。前述の製剤中の胎盤細胞を、
単回および／または反復尾静脈注射として、オスとメス両方のＮＯＤ−ＳＣＩＤまたはオ
スのＣ５７ＢＬ／１０ＳｇＳｎＡｉ−Ｒａｇ２（ｔｍｉ）γｃ（ｔｍｉ）マウスに投与し
た。マウスは治療後第４、１４、２８または４７日で屠殺し、肺、肝臓、心臓、腎臓、脾
臓、副腎、骨髄、および脳のサンプルを処理し、ｈＴＥＲＴがヒトテロメラーゼ逆転写酵
素遺伝子である、ｈＴＥＲＴのＤＮＡ配列の存在に関してＱ−ＰＣＲによって分析した。
静脈内投与後、ヒトＤＮＡを、投薬投与後第４日に屠殺したマウス中の肺、脳、心臓およ
び／または肝臓のサンプルから単離した全ＤＮＡ中で検出した。最高レベルのＤＮＡは肺
中で検出した。マウスは、いかなる心臓または肺毒性もなく、静脈内注入による１ｋｇ当
たり２５００万〜１億個の細胞の投与に耐えることができた。ロット１１はマウスの発癌
性試験に使用した。マウスには副作用を伴わずに１ｋｇ当たり最大２億５０００万個の細
胞を皮下（ＳＣ）投与した。
６．２ 改良された投与可能な組成物
この実施例は、凍結保存後でさえ、ヒトまたは動物に投与するのに適した、均質で、高
い生存能力の細胞を示す、ヒト多分化能組織培養プラスチック接着性ＣＤ３４−、ＣＤ１
０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞の製剤化を実証する。製剤の細胞は、静脈内
（intravenous）マウスモデルにおいて、形成される凝集体の量の平均４００倍の低下、
および以前の製剤より約３倍改良された改良性最大耐量（ＭＴＤ）を示す（データ示さず
）。以下の実施例は、特定の表面マーカーを発現する単離胎盤細胞の製剤を記載するが、
本明細書に示す結果は、これらの方法および製剤が他の細胞、例えば、異なる表面マーカ
ーを発現する哺乳動物細胞とともに使用することができ、また、当該哺乳動物細胞と適合
性があることを示す。
（「製剤Ｂ」で表す）製剤は、５．５％（ｗ／ｖ）デキストラン４０、１０％（ｗ／ｖ
）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、および５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）を含有する溶液中に１０±３×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で、前述の細胞表現型の
胎盤細胞を含む。本明細書で使用するＨＳＡおよびデキストラン４０は臨床等級であり、
ＤＭＳＯはＧＭＰ等級である。
「製剤Ａ」で表すＰｌａｓｍａｌｙｔｅベースの製剤を記載し、表７中で、製剤Ｂ、デ
キストラン４０ベースの製剤と比較する。製剤Ｂの調製では７０μｍメッシュを介して懸
濁液中の細胞を濾過するが、製剤Ａの調製では濾過しない。
Figure 2018138565
製剤Ａを解凍すると有意な細胞凝集を観察した。後の調査によって、製剤培地の組成、
および細胞の凍結濃度を含めたいくつかのパラメーターは、細胞凝集の重要な要因であっ
たことを示した。最適化試験を実施して、製剤Ｂがこれらの細胞凝集効果を低減または排
除することを具体的に示した。さらに、プロセスの一部として７０μｍメッシュを介した
細胞懸濁液の濾過を導入して、製剤化中に細胞懸濁液のより良い対照を得た。
製剤化中の細胞凝集を定量化するために、フィルター保持アッセイを開発ツールとして
考案し、これを使用して製剤Ａと製剤Ｂの両方によって生成した一連の胎盤細胞組成物群
を比較した。これは特に重要となった。製剤Ｂにおける細胞凝集は、それが裸眼によって
それ以上確実に識別できない地点まで低減したからである。製剤Ａおよび製剤Ｂの代表群
から分析した多数のサンプルの比較は表８中に示す。この方法は、フィルターのデジタル
画像により、異なるサンプル由来のフィルター上に保持される予め染色した細胞凝集体を
定量化し、凝集体によって覆われたフィルターの面積（「平均面積」）を報告する。表８
中に示すように、製剤Ｂには製剤Ａより一貫して少ない面積範囲（凝集）があり、平均的
な差は４００倍であった。データは、製剤Ｂに関する優れたプロセス制御および再現性も
示す。ｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用した２つの製剤の単離胎盤細胞組成物ロットも表１６中
に示す。製剤Ａから製剤Ｂへの変更によって、静脈内ｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおい
て最大耐量（ＭＴＤ）が約３倍改善された（データ示さず）。
Figure 2018138565
キー：「バッグ」は、そのロットに関する、解凍し試験した単離細胞組成物のバッグの
数を示す。「フィルター」は、そのロットに関する、アッセイ反復の合計数を示す。「平
均面積」は、フィルターに施用したピクセル／細胞１００万個単位の、そのロットに関す
るフィルターの平均面積範囲を示す。「Ｓｔｄ Ｄｅｖ」＝標準偏差、「ＣＶ」＝変動係
数。
６．３ 改良された投与可能な組成物の特徴付け
この実施例は、ＨＳＡ、デキストラン４０、およびＤＭＳＯを含む医薬製剤のさらなる
特徴付けを与える。以下に記載する１つまたは複数の実験中で使用する方法は以下の通り
である。
細胞生存能力の評価：血球計またはＶｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のいずれかを使用
して、トリパンブルー色素排除試験アッセイによって生存能力を評価した。生存能力は、
全細胞中の生存細胞の割合（％）として表した。
細胞計数：血球計またはＶｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏ
ｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のいずれかを使用して細胞を
計数した。細胞計数は１ミリリットル当たりの数百万個の細胞（ＭＭ／ｍＬ）として表す
。
細胞凝集：細胞凝集の量を、細胞を染色しそれらを７０μｍフィルターに通すことによ
って細胞凝集の量を測定する、濾過保持アッセイ（ＦＲＡ）を使用して測定した。７０μ
ｍより大きい細胞凝集体はフィルターを通過することができず、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存
能力分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉａ）を使用して画像分析によって定量化する。データは充填した細胞１００万個当た
りのピクセル数（ｐｘ／ＭＭ）として表す。
フローサイトメトリー：フローサイトメトリーによって細胞マーカーＣＤ１０、ＣＤ３
４、ＣＤ１０５およびＣＤ２００のレベルに関して細胞を評価した。値は特定マーカー、
またはマーカーの組合せに陽性および／または陰性である細胞の割合（％）として表す。
免疫抑制：以下に記載する製剤中の細胞の免疫抑制活性は、抗原性ビーズに対するＴ細
胞応答を抑制する細胞の能力を測定する、ビーズＴ細胞反応（ＢＴＲ）アッセイを使用し
て評価した。
以下の実施例は、特定の表面マーカーを発現する単離胎盤細胞の製剤を記載するが、本
明細書に示す結果は、これらの方法および製剤が、他の細胞、例えば、異なる表面マーカ
ーを発現する哺乳動物細胞とともに使用することができ、また当該哺乳動物細胞と適合性
があることを示す。
６．３．１ ＤＭＳＯおよびデキストラン：ＨＳＡ比の特徴付け
この実施例は、細胞凝集、細胞生存能力および回収率、ならびに細胞表現型および機能
に対する、ＨＳＡ、デキストラン、およびＤＭＳＯの濃度の変化による影響、ならびにデ
キストランとＨＳＡの比の変化による影響を記載する。
実験条件
細胞製剤に関する３成分（ＨＳＡ、デキストラン４０およびＤＭＳＯ）の解空間を、図
１中の三角図に示す条件で調べた。実験条件は、２軸、一方はデキストラン：ＨＳＡ比を
一定に保ちながら異なる割合（％）のＤＭＳＯを試験し（以下の製剤１〜４を参照）、他
方はＤＭＳＯの割合（％）を一定に保ちながらデキストラン：ＨＳＡの比を変えて選択し
た（以下の製剤３、５〜８を参照）。
方法および材料
約１２００万個の凍結保存ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤
多分化能細胞を、Ｎｕｎｃ（商標）１０−ｔｒａｙ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓにお
いて、以下の製剤のいずれか１つで、約１．２×１０８個の細胞に増殖した。細胞は０．
２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて室温で１０分間のインキュベーションによって採取
した。解離した細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に２５０ｍＬの２％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する５００ｍＬ遠心分離チューブに移した。次いで細胞を
、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ３ＢＰ遠心分離において、５００ｍＬチューブ中で１０４０ＲＰ
Ｍにおいて遠心分離にかけた。細胞は０．９％生理食塩水／５％デキストラン４０溶液に
再懸濁した。次いで細胞を１０分間１４２０ＲＰＭにおいて遠心分離にかけ、以下の８製
剤（デキストラン：ＨＳＡ比は製剤５〜８に関して「２５％ＨＳＡの体積分率」（ＶＦ
ＨＳＡ）の単位で示す）の１つの１０ｍＬに懸濁した。
製剤１：２０％ＤＭＳＯ、８．５％ＨＳＡ、４．６％デキストラン４０
製剤２：１０％ＤＭＳＯ、９．５％ＨＳＡ、５．２％デキストラン４０
製剤３：５％ＤＭＳＯ、１０％ＨＳＡ、５．５％デキストラン４０（ＶＦ ＨＳＡ＝０
．４）（対照製剤）
製剤４：０％ＤＭＳＯ、１０．５％ＨＳＡ、５．８％デキストラン４０
製剤５：５％ＤＭＳＯ、０％ＨＳＡ、９．５％デキストラン４０（ＶＦ ＨＳＡ＝０）
製剤６：５％ＤＭＳＯ、３．１２５％ＨＳＡ、８．２５％デキストラン４０（ＶＦ Ｈ
ＳＡ＝０．１２５）
製剤７：５％ＤＭＳＯ、１６．８８％ＨＳＡ、２．７５％デキストラン４０（ＶＦ Ｈ
ＳＡ＝０．６７５）
製剤８：５％ＤＭＳＯ、２３．７５％ＨＳＡ、０％デキストラン４０（ＶＦ ＨＳＡ＝
０．９５）
以下のストック溶液：１００％ＤＭＳＯ（Ｂｉｏｎｉｃｈｅ Ｐｈａｒｍａ、Ｂｅｌｌ
ｅｖｉｌｌｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ）、２５％ＨＳＡ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、Ｈｏｂｏｋｅ
ｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）および０．９％生理食塩水中（Ｈｏｓｐｉｒａ、Ｌａｋｅ
Ｆｏｒｅｓｔ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）の１０％デキストラン４０から製剤を調製した。
濾過保持アッセイ：濾過保持アッセイの使用によって細胞凝集を評価した。細胞濃度は
濾過前に約１．２×１０７個の細胞／ｍＬに調節した。濾過量（単位濾過面積当たりの細
胞数）は約２．４×１０８個の細胞／濾過で一定に保った。細胞は７．５×１０６個の細
胞／ｍＬの濃度で、Ｔｈｅｒｍｏ速度制御フリーザー中に−７０℃で凍結保存した。細胞
は使用前に解凍し、サンプルは解凍直後に処理した。非希釈細胞懸濁液の１００μＬサン
プルを解凍後に得て、９００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｖｉ−Ｃ
ｅｌｌ細胞生存能力分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して二連（duplicate）で細胞計数を実施し、細胞１００
万個当たりのピクセル数として報告した（多数のピクセルは多数の細胞凝集を示す）。
細胞生存能力アッセイ（ＭＴＳアッセイ）：細胞生存能力は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６
（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ）を使用して決定した。製造者の指示に従い、９６ウエルプレート中の細胞は、
（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェ
ニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）（ＭＴＳ）およびフェナ
ジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、電子カップリング試薬と組合せた。ＭＴＳの細胞内生
物学的還元によって生じた生成ホルマザン産物の、４９０ｎｍにおける吸光度を次いで決
定した。
アネキシンウエルプレートアッセイ：解凍した細胞は、アネキシン−Ｖ標識溶液（Ｒｏ
ｃｈｅ、カタログ番号１１８２８６８１００１）中に１×１０５個の細胞／ｍＬの濃度に
希釈した。１００μＬの細胞懸濁液を９６ウエルプレートに三連（triplicate）で加え、
露光せずに室温で１５分間インキュベートした。１５分間後、それぞれのウエル内の３箇
所の異なる位置を、明視野および蛍光下でイメージングした（４８８ｎｍの励起波長およ
び波長５２８ｎｍで検出）。自動細胞計数ソフトウェア（Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ）を使用
して、像当たりの全細胞を計数した。アポトーシス／壊死細胞集団は、それぞれの位置で
アネキシン陽性細胞を計数すること（蛍光像）、およびそれぞれの位置における全細胞で
割ること（明視野像）によって決定した。条件当たりのアポトーシス／壊死細胞集団は、
３ウエルの３箇所の異なるウエル位置において計算した集団を平均することによって決定
した。
結果
細胞凝集
ＤＭＳＯの割合（％）を、例えば０〜２０パーセントで変えた場合（製剤１〜４）、図
２中に示すように、細胞凝集に対する影響は全く観察されなかった。全ＤＭＳＯ条件が、
５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０および１０％ＨＳＡを含む対照製剤に関して観
察した範囲内の凝集レベルを示した。ＨＳＡおよびデキストラン濃度も一定５％ＤＭＳＯ
濃度で変え（図３）、条件はＨＳＡなし（ＨＳＡ体積分率＝０）〜デキストランなし（Ｈ
ＳＡ体積分率＝０．９５）の範囲であった。０．１２５〜０．９５の２５％ＨＳＡ（それ
ぞれ、最終濃度３．１２５％〜２３．７５％のＨＳＡ）の体積分率にわたるＦＲＡ値は、
最小の凝集を示した。ＨＳＡの存在下で観察した凝集のレベルは、５％ＤＭＳＯ、５．５
％デキストラン４０および１０％ＨＳＡを含む対照製剤以下であった。
解凍後の生存率および回収率
異なる割合（％）のＤＭＳＯ（０、５、１０および２０％）にわたる解凍後の生存率（
図４）および解凍後の回収率（図５）を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ自動細胞計数器を使用しトリパ
ンブルー色素排除試験によって測定して、それぞれの製剤の凍結保護能力を評価した。解
凍後の生存率はそれぞれ０％、５％および１０％のＤＭＳＯを含む製剤で９０％を超え、
最大値は５％のＤＭＳＯで観察し、一方生存率は２０％のＤＭＳＯを含む製剤で７５％未
満であった。培養再建（culture reestablishment）はＭＴＳアッセイによって測定した
。培養再建は５％のＤＭＳＯで最大であったことを観察した（図６）。
２５％ＨＳＡの異なる体積分率、すなわち異なる比のデキストラン：ＨＳＡにわたる生
存率プロファイルは図７〜９に示す。トリパンブルー色素排除試験により決定した解凍後
の生存率は、様々な体積分率のＨＳＡにわたり８３．５％〜９８．５％の範囲の値を示し
た（図７）。最大値は０．４０分率の２５％ＨＳＡ、すなわち１０％のＨＳＡ：５．５％
のデキストラン４０で得た。解凍後の細胞回収率も計算し、値は８０％〜１２０％の範囲
であったが、少なくとも０．２体積分率の２５％ＨＳＡを含むサンプルは１００％〜１２
０％の範囲の値を示した（図８）。ＭＴＳアッセイにより決定した培養再建のデータは、
解凍後の生存率のそれと同様のプロファイルを示し、最大値は０．１２５分率の２５％Ｈ
ＳＡ、すなわち３．１３％のＨＳＡ：８．２５％のデキストラン４０で生じた（図９）。
トリパンブルー色素排除試験の生存率には、アポトーシス細胞を検出する能力はない。
しかしながら、細胞の大きさ分布の分析は細胞健康状態の変化を示すことができる。ＤＭ
ＳＯの不在下で凍結した細胞から解凍した細胞集団中のアポトーシス細胞の割合（％）を
推定するために、解凍後のウエルプレートアネキシンアッセイを実施した。このアッセイ
によって、５％ＤＭＳＯ中で凍結したときの１５％のアポトーシス細胞と異なり、０％Ｄ
ＭＳＯ中で凍結した細胞の５１％がアポトーシス細胞であったと推定した（データ示さず
）。
表現型および機能
細胞のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋表現型を維持する能力を
、フローサイトメトリーによって異なる割合（％）の成分について試験した。製剤２（１
０％ＤＭＳＯ、９．５％ＨＳＡ、５．２％デキストラン４０）、製剤５（５％ＤＭＳＯ、
０％ＨＳＡ、９．５％デキストラン４０）、製剤６（５％ＤＭＳＯ、３．１３％ＨＳＡ、
８．２５％デキストラン４０）および製剤７（５％ＤＭＳＯ、１６．８８％ＨＳＡ、２．
７５％デキストラン４０）、および対照製剤３中に製剤化した細胞は、この表現型をほぼ
維持しており、８０．３％と８４．５％の間のＣＤ１０５＋／ＣＤ２００＋値を有してい
た。さらに、ＣＤ１０＋／ＣＤ３４−の発現はそれぞれの製剤に関して９５％を超えてい
た。おそらく残骸がフローサイトメトリーアッセイに影響を与えたため、条件１、４およ
び８は細胞の物理的特性の変化を示した。
細胞の機能は、抗原性ビーズに対するＴ細胞応答を抑制する細胞の能力を測定する、ビ
ーズＴ細胞反応（ＢＴＲ）アッセイによって評価した（図１０）。製剤６（５％ＤＭＳＯ
、３．１３％ＨＳＡ、８．２５％デキストラン４０）、および製剤７（５％ＤＭＳＯ、１
６．８８％ＨＳＡ、２．７５％デキストラン４０）は、５％ＤＭＳＯ／１０％ＨＳＡおよ
び５．５％デキストラン４０を含む対照製剤３の１標準偏差以内で抑制があった。これら
の３サンプルは、最高のトリパンブルー生存率および培養再建値を有していた。他のサン
プルには、低レベルの抑制、減少したＭＴＳと一般に関係がある低減があった。
結論：
０〜２０％の範囲の濃度のＤＭＳＯを含む製剤は、５％ＤＭＳＯ、１０％ＨＳＡ、およ
び５．５％デキストラン４０を含む対照製剤に関して観察したレベルと同程度の細胞凝集
のレベルを示す。しかしながら、２０％のＤＭＳＯを含む製剤に細胞を凍結保存すると細
胞生存率は低下し、０％のＤＭＳＯ中に凍結した細胞は、５％のＤＭＳＯ中に凍結した細
胞と比較して、有意に増大したアポトーシスを解凍後に示した。５％および１０％のＤＭ
ＳＯを含む製剤に関して、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋表現型
の感知され得る劣化はなかった。したがって、前述の結果は、５％〜１０％のＤＭＳＯを
含む製剤の使用が、解凍後の生存率を維持するのに好ましいことを実証する。
ＨＳＡ：デキストランの比の変更に関して、２３．７５％のＨＳＡ、０％のデキストラ
ンを含む製剤は、解凍後の生存率および培養再建のある程度の低減を示し、一方解凍後の
生存率、免疫抑制活性および再建値は、（ｉ）３．１３％のＨＳＡと８．２５％のデキス
トラン、（ｉｉ）１０％のＨＳＡと５．５％のデキストラン、および（ｉｉｉ）１６．８
８％のＨＳＡと２．７５％のデキストランにおけるデキストラン：ＨＳＡ比を含む製剤に
関して最高であった。したがって、これらの結果は、本明細書に記載する製剤のＨＳＡ：
デキストラン比は、１０％ＨＳＡと５．５％デキストラン４０におけるＨＳＡ：デキスト
ラン比を含む製剤と比較して、細胞生存率の感知され得る損失、解凍後の細胞回収、ＣＤ
１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋表現型の劣化、または免疫抑制活性な
しで、定義した範囲内で変えることができることを実証する。本明細書に示すデータは、
少なくとも約６：１のＨＳＡ：デキストラン〜約１：２．６のＨＳＡ：デキストランのＨ
ＳＡ：デキストラン比の作用範囲を支持する。
６．３．２ 凍結細胞密度の影響
この実施例は、細胞生存能力、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋
表現型、細胞凝集、および細胞の免疫抑制機能に対する、細胞濃度、例えば、１〜４０×
１０６個の細胞／ｍＬの範囲の凍結細胞密度の影響を記載する。
方法および材料
ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を３日間培養し、採
取し、遠心分離にかけ、５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡを含む
製剤に約３．５×１０７個の細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁し、７０μｍフィルターで濾過
した。濾過後細胞を前述の製剤に連続希釈して、滅菌済みバッグ中に、以下の細胞密度、
１×１０６個の細胞／ｍＬ、７．５×１０６個の細胞／ｍＬ、１５×１０６個の細胞／ｍ
Ｌ、および２０×１０６個の細胞／ｍＬを含む細胞サンプルを作製した。細胞を別個に採
取して、４．０×１０７個の細胞／ｍＬを含む別個の細胞サンプルを作製した。４．０×
１０７個の細胞／ｍＬサンプルの細胞を、５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１
０％ＨＳＡを含む５ｍＬ製剤に約４．６×１０７個の細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁し、７
０μｍフィルターで濾過し、前述の製剤を使用して２０ｍＬバッグ中に４．０×１０７個
の細胞／ｍＬまで希釈した。４．０×１０７個の細胞／ｍＬサンプルの１つの２０ｍＬバ
ッグ、１×１０６個の細胞／ｍＬ、７．５×１０６個の細胞／ｍＬ、１５×１０６個の細
胞／ｍＬ、および２０×１０６個の細胞／ｍＬサンプルの二連の２０ｍＬバッグ、および
それぞれのサンプルの５本の２８０μＬバイアルを、速度制御フリーザーを使用して−７
０℃に凍結した。これらのサンプルを後に解凍し、分析して（１）細胞計数、（２）生存
率、（３）表現型、（４）細胞凝集、および（５）効能を含めた様々な細胞特性に対する
凍結濃度の影響を決定した。
濾過保持アッセイ：濾過保持アッセイの使用によって細胞凝集を評価した。細胞濃度は
濾過前に約１．２×１０７個の細胞／ｍＬに調節した。濾過量（単位濾過面積当たりの細
胞数）は約２．４×１０８個の細胞／濾過で一定に保った。細胞は７．５×１０６個の細
胞／ｍＬの濃度で、Ｔｈｅｒｍｏ速度制御フリーザー中に−７０℃で凍結保存した。細胞
は使用前に解凍し、サンプルは解凍直後に処理した。非希釈細胞懸濁液の１００μＬサン
プルを解凍後に得て、９００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｖｉ−Ｃ
ｅｌｌ細胞生存能力分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して二連で細胞計数を実施し、細胞１００万個当たりのピ
クセル数として報告した（多数のピクセルは多数の細胞凝集を示す）。
結果：
細胞計数／生存率
それぞれの解凍バッグから１〜２個の１ｍＬサンプルを、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力
分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ）を使用して、製造者の指示に従い生存細胞計数および生存率決定のために採取した。
平均生存率は、約９７％で、全ての条件に関して一定状態であった。生存細胞計数は、初
期凍結濃度に対応した（以下の表９参照）。
Figure 2018138565
表現型
細胞のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋表現型を維持する能力を
、フローサイトメトリーによって異なる細胞密度にわたり試験した。表１０中に示すよう
に、表現型は異なる凍結濃度間で変わらない。全ての条件に関して、ＣＤ２００＋／ＣＤ
１０５＋の発現は約８６％で維持され、ＣＤ３４−／ＣＤ１０＋の発現は約９９％で維持
された。
Figure 2018138565
細胞凝集
それぞれの条件の再現を濾過保持アッセイによって分析して、異なる凍結濃度における
細胞凝集の程度を決定した（図１１）。二連のアッセイを１×１０６個の細胞／ｍＬ、７
．５×１０６個の細胞／ｍＬ、１５×１０６個の細胞／ｍＬ、および２０×１０６個の細
胞／ｍＬサンプルについて実施した。１つの細胞サンプルは４０×１０６個の細胞／ｍＬ
サンプルで二連でアッセイした。４０×１０６個の細胞／ｍＬサンプルは、試験した全細
胞密度に関して最高の細胞凝集シグナルをもたらした。全ての他のサンプルは、５％ＤＭ
ＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ中に７．５×１０６個の細胞／ｍＬで事
前に凍結保存した対照サンプルを用いて観察した凝集の量以下であった。
他の、別個の細胞凝集アッセイを実施して、７．５×１０６個の細胞／ｍＬおよび２０
×１０６個の細胞／ｍＬで、５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡを
含む製剤中に凍結保存した細胞を試験した（図１２）。他のデータは２０×１０６個の細
胞／ｍＬで増大したシグナルを示し、２０×１０６個の細胞／ｍＬで凍結した細胞は様々
な細胞凝集の結果をもたらすことを示した。結果として、この濃度以上で凍結した細胞は
凝集に関して高い能力を有する。これらのデータは、凝集は細胞濃度の増大と共に増大し
、２０×１０６個の細胞／ｍＬの凍結細胞密度は、７．５×１０６個の細胞／ｍＬの凍結
細胞密度と比較して細胞凝集の増大を示し得ることを実証する。
機能
それぞれの条件からのバイアルを混合白血球反応（ＭＬＲ）およびビーズＴ細胞反応（
ＢＴＲ）分析に使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の抑制により測定
して、様々な凍結細胞密度での細胞の免疫調節性を評価した。ＭＬＲの結果は、１５×１
０６個の細胞／ｍＬおよび４０×１０６個の細胞／ｍＬでＣＤ４およびＣＤ８の抑制の低
下を示したが、２０×１０６個の細胞／ｍＬでの抑制は、１×１０６個の細胞／ｍＬおよ
び７．５×１０６個の細胞／ｍＬで観察した抑制と同程度であった。しかしながらＢＴＲ
の結果は、２０×１０６個の細胞／ｍＬおよび４０×１０６個の細胞／ｍＬでＣＤ４およ
びＣＤ８抑制の低下を示す。
Figure 2018138565
結論：
前述の結果は、細胞の生存率およびＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２０
０＋表現型は、凍結細胞密度の作用として変わらないことを実証する。しかしながら、２
０×１０６個の細胞／ｍＬの密度で凍結保存した細胞は、細胞凝集の可変的増大および免
疫抑制活性の可変的低下を実証し、一方４０×１０６個の細胞／ｍＬの密度で凍結保存し
た細胞は、細胞凝集の不変的増大および免疫抑制活性の不変的低下を示した。このように
、細胞生存率またはＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋表現型を示す
細胞数の感知され得る低下なしに、最大、例えば４０×１０６個の細胞／ｍＬの密度で本
明細書に記載する製剤中に細胞を製剤化することはできるが、１．０〜１５×１０６個の
細胞／ｍＬの範囲の凍結細胞密度が、解凍時の細胞凝集を最小にするのに好ましい。
６．３．３ デキストランの分子量の影響
この実施例は、細胞凝集、生存率、回収率、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、
ＣＤ２００＋表現型および機能に対する、様々な分子量のデキストラン、例えば、デキス
トラン１（ＭＷ＝１０００）、デキストラン４０（ＭＷ＝４０，０００）およびデキスト
ラン７０（ＭＷ＝７０，０００）の影響を記載する。
方法および材料
１２００万個の凍結保存ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤多
分化能細胞を、Ｎｕｎｃ（商標）１０−ｔｒａｙ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓにおい
て、以下の製剤のいずれか１つで約１．２×１０８個の細胞に増殖した。細胞は０．２５
％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて室温で１０分間のインキュベーションによって採取した
。解離した細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に２５０ｍＬの２％ウシ
胎児血清（ＦＢＳ）を含有する５００ｍＬ遠心分離チューブに移した。次いで細胞を、Ｓ
ｏｒｖａｌｌ ＲＣ３ＢＰ遠心分離において５００ｍＬチューブ中で１０４０ＲＰＭにお
いて遠心分離にかけた。細胞は０．９％生理食塩水／５％デキストラン４０溶液に再懸濁
した。次いで細胞を１０分間１４２０ＲＰＭにおいて遠心分離にかけ、以下の１０ｍＬの
製剤に懸濁した。
製剤１：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０（Ｈｏｓｐｉｒａ、Ｌａｋｅ Ｆｏ
ｒｅｓｔ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、１０％ＨＳＡ（対照）
製剤２：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン１（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）、１０
％ＨＳＡ
製剤３：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）、１
０％ＨＳＡ
製剤４：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン７０（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）、１
０％ＨＳＡ
濾過保持アッセイ：濾過保持アッセイの使用によって細胞凝集を評価した。細胞濃度は
濾過前に約１．２×１０７個の細胞／ｍＬに調節した。濾過量（単位濾過面積当たりの細
胞数）は約２．４×１０８個の細胞／濾過で一定に保った。細胞は７．５×１０６個の細
胞／ｍＬの濃度で、Ｔｈｅｒｍｏ速度制御フリーザー中に−７０℃で凍結保存した。細胞
は使用前に解凍し、サンプルは解凍直後に処理した。非希釈細胞懸濁液の１００μＬサン
プルを解凍後に得て、９００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｖｉ−Ｃ
ｅｌｌ細胞生存能力分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して二連で細胞計数を実施した。
結果：
細胞凝集
それぞれの製剤内の細胞凝集を、濾過保持アッセイを使用して評価した。製剤２（デキ
ストラン１）、製剤３（デキストラン４０）、および製剤４（デキストラン７０）は、５
％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、および１０％ＨＳＡを含む対照製剤以下の細胞
凝集率を実証した（図１３）。
生存率および回収率
デキストラン１、デキストラン４０、またはデキストラン７０を含むサンプルに関する
解凍後の生存率は９６．０％〜９７．７％の生存率の範囲であった（図１４）。同様に、
解凍後の回収率は対照製剤のそれと同程度であり、細胞の生存率は対照製剤の９２％〜１
０９％の範囲であった（図１５）。
表現型および機能
細胞のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋表現型を維持する能力を
、フローサイトメトリーによって異なるデキストラン分子量にわたり試験し、細胞の免疫
抑制能力はＢＴＲアッセイにおいて試験した。試験した全ての製剤にわたるＣＤ２００＋
／ＣＤ１０５＋の発現は８９．１％〜９１．６％の範囲であり、ＣＤ３４−／ＣＤ１０＋
の発現は全ての条件に関して９５％を超えた（図１６）。さらに、異なるデキストラン分
子量にわたるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の抑制は、デキストラン４０を含む標準対照
製剤の４回の異なる反復実験から誘導した期待値の１標準偏差の範囲内であった（図１７
）。
結論：
これらの結果は、細胞凝集、生存率、回収率、表現型または免疫抑制能力に影響を与え
ずに、本明細書に記載する製剤において、デキストラン１またはデキストラン７０をデキ
ストラン４０と置換することができることを実証する。
６．３．４ 異なる多糖の影響
この実施例は、細胞の生存率および増殖に対する、細胞製剤中のデキストラン４０以外
の多糖の影響を記載する。
方法および材料
１２００万個の凍結保存ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤多
分化能細胞を、Ｎｕｎｃ（商標）１０−ｔｒａｙ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓにおい
て、以下の製剤のいずれか１つで約１．２×１０８個の細胞に増殖した。細胞は０．２５
％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて室温で１０分間のインキュベーションによって採取した
。解離した細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に２５０ｍＬの２％ウシ
胎児血清（ＦＢＳ）を含有する５００ｍＬ遠心分離チューブに移した。次いで細胞を、Ｓ
ｏｒｖａｌｌ ＲＣ３ＢＰ遠心分離において５００ｍＬチューブ中で１０４０ＲＰＭにお
いて遠心分離にかけた。細胞は０．９％生理食塩水／５％デキストラン４０溶液に再懸濁
した。次いで細胞を１０分間１４２０ＲＰＭにおいて遠心分離にかけ、以下の１０ｍＬの
製剤に懸濁した。
製剤１：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ（対照）
製剤２：５％ＤＭＳＯ、５．５％マルトデキストリン、１０％ＨＳＡ
製剤３：５％ＤＭＳＯ、５．５％スクロース、１０％ＨＳＡ
製剤４：５％ＤＭＳＯ、５．５％トレハロース、１０％ＨＳＡ
製剤５：５％ＤＭＳＯ、５５ＵＳＰ／ｍＬヘパリン、１０％ＨＳＡ
製剤６：５％ＤＭＳＯ、３．３％ヘタスターチ、１０％ＨＳＡ
製剤７：５％ＤＭＳＯ、５．５％グリコーゲン、１０％ＨＳＡ
濾過保持アッセイ：濾過保持アッセイの使用によって細胞凝集を評価した。細胞濃度は
濾過前に約１．２×１０７個の細胞／ｍＬに調節した。濾過量（単位濾過面積当たりの細
胞数）は約２．４×１０８個の細胞／濾過で一定に保った。細胞はＴｈｅｒｍｏ速度制御
フリーザー中に−７０℃で凍結保存した。細胞は使用前に解凍し、サンプルは解凍直後に
処理した。非希釈細胞懸濁液の１００μＬサンプルを解凍後に得て、９００μＬのリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して二連で
細胞計数を実施した。
結果：
細胞凝集
それぞれの製剤内の細胞凝集を、濾過保持アッセイを使用して評価した。製剤２〜７は
、５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、および１０％ＨＳＡを含む対照製剤以下の
細胞凝集をもたらすと決定した（図１８）。トレハロースを含む製剤４、ヘパリンを含む
製剤５、グリコーゲンを含む製剤７は、実質的に対照製剤未満の細胞凝集率を実証した。
解凍後の生存率および回収率
解凍後の生存率、生存細胞の回収率および細胞の大きさのデータを製剤１〜７のそれぞ
れにわたり評価して、製剤の凍結保護能力を評価した。解凍後の生存率は、トリパンブル
ー色素排除試験用Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅ
ｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって評価した。解凍後の生存率は
９５．２％〜９８．６％の範囲であり、スクロースおよびグリコーゲンが範囲の下端であ
った（図１９）。対照デキストラン製剤は細胞の９８％の生存率をもたらした。解凍後の
生存細胞の回収率を計算して、凍結／解凍プロセスにわたる細胞消失を理解し、値は異な
る多糖にわたり８４％〜１１５％の範囲であった（図２０）。
表現型および機能
細胞のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋表現型を維持する能力を
、フローサイトメトリーによって異なる多糖にわたり試験した。製剤２〜４および６に製
剤化した細胞は対照製剤１とほぼ同様にこの表現型を維持し、８９．４％〜９２．９％の
ＣＤ１０５＋／ＣＤ２００＋であった。ＣＤ１０＋／ＣＤ３４−の発現はそれぞれの製剤
に関して９５％を超えた。ヘパリン中に凍結した細胞の中で、８５．４％がＣＤ１０５＋
／ＣＤ２００＋の表現型を維持した（図２１）。
細胞の機能は、抗原性ビーズに対するＴ細胞応答を抑制する細胞の能力を測定する、ビ
ーズＴ細胞反応（ＢＴＲ）アッセイによって評価した。スクロースに製剤化した細胞は、
デキストラン４０を含む標準対照製剤の４回の異なる反復実験から誘導した期待値の１標
準偏差範囲内のそれと比較して、低下したＴ細胞抑制を示した（図２２）。他の多糖では
、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞抑制は期待値の１標準偏差の範囲内にある。
結論：
細胞凝集、解凍後の生存率、解凍後の細胞回収率および表現型の維持に関して、マルト
デキストリン、トレハロースおよびヘタスターチを含む製剤の使用は、デキストラン４０
製剤の使用とほぼ同じ特性を有する胎盤細胞集団をもたらした。このように、スクロース
、ヘパリンまたはグリコーゲンを含む製剤を使用して、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１
０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞を製剤化することはできるが、デキストラン４０、マル
トデキストリン、トレハロースまたはヘタスターチを含む製剤の使用が好ましい。
６．３．５ ＨＳＡのタンパク質代替の影響
この実施例は、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡおよび５％ＤＭＳＯ製剤にお
いて、ヒト血清アルブミン濃度を低減することができること、およびＨＳＡはウシ血清ア
ルブミンまたはウシ胎児血清に置き換えることができることを実証する。
製剤１（Ｆ１）は５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡおよび５％ＤＭＳＯを含む
。Ｆ１内のＨＳＡの役割を理解するため、および細胞組成物に対するその影響を理解する
ために、ヒト血清アルブミンに類似した類似タンパク質、すなわちウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ）およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む代替製剤を試験した。
方法および材料
１２００万個の凍結保存ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤多
分化能細胞を、Ｎｕｎｃ（商標）１０−ｔｒａｙ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓにおい
て、以下の製剤のいずれか１つで約１．２×１０８個の細胞に増殖した。細胞は０．２５
％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて室温で１０分間のインキュベーションによって採取した
。解離した細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に２５０ｍＬの２％ウシ
胎児血清（ＦＢＳ）を含有する５００ｍＬ遠心分離チューブに移した。次いで細胞を、Ｓ
ｏｒｖａｌｌ ＲＣ３ＢＰ遠心分離において５００ｍＬチューブ中で１０４０ＲＰＭにお
いて遠心分離にかけた。細胞は０．９％生理食塩水／５％デキストラン４０溶液に再懸濁
した。次いで細胞を１０分間１４２０ＲＰＭにおいて遠心分離にかけ、以下の１０ｍＬの
製剤に懸濁した。
製剤１：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ（対照）
製剤２：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、４％ＨＳＡ
製剤３：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＢＳＡ
製剤４：５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０％ＦＢＳ
濾過保持アッセイ：濾過保持アッセイの使用によって細胞凝集を評価した。細胞濃度は
濾過前に約１．２×１０７個の細胞／ｍＬに調節した。濾過量（単位濾過面積当たりの細
胞数）は約２．４×１０８個の細胞／濾過で一定に保った。細胞は、Ｔｈｅｒｍｏ速度制
御フリーザー中に−７０℃で凍結保存した。細胞は使用前に解凍し、サンプルは解凍直後
に処理した。非希釈細胞懸濁液の１００μＬサンプルを解凍後に得て、９００μＬのリン
酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して二連
で細胞計数を実施した。
結果：
細胞凝集
濾過保持アッセイ（ＦＲＡ）によって測定した細胞凝集は、全条件に関して一平方ミリ
メートル当たり１００ピクセル以下であった（図２３）。しかしながら、１０％ＨＳＡお
よび１０％ＢＳＡは、４％ＨＳＡおよび１０％ＦＢＳより明らかに少ない凝集をもたらし
たようである。
それぞれの溶液の凍結保護能力を理解するために、解凍後の生存率、回収率および細胞
の大きさを、トリパンブルー色素排除試験用Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の使用によ
って評価した。それぞれの条件にわたる解凍後の生存率はアッセイ変動性の範囲内であり
、９５％〜９８％の生存率の範囲であった（図２４）。同様に、解凍後の細胞回収率は１
０％ＨＳＡ対照のそれと同程度であり、値は１００〜１２７％の範囲であった（図２５）
。
表現型および機能
細胞のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋表現型を維持する能力を
、フローサイトメトリーによって異なる製剤にわたり試験した。（図２６および２７）。
製剤２〜４に製剤化した細胞は対照１０％ＨＳＡ製剤とほぼ同様にこの表現型を維持し、
値は試験した細胞の８８．２％〜９３．５％であった。ＣＤ１０＋／ＣＤ３４−の発現は
それぞれの製剤に関して９５％を超えた。
細胞の機能はビーズＴ細胞反応アッセイによって評価した。他の条件と比較して、ＣＤ
４およびＣＤ８Ｔ細胞の抑制は細胞をＦＢＳに製剤化すると高まり、値は１０％ＨＳＡを
含む標準対照製剤の４回の異なる反復実験から誘導した期待値の１．５標準偏差の範囲内
であった（図２８）。全ての他の条件では、抑制は期待値の１標準偏差内であった。
結論：
前述の結果は、細胞生存能力の感知され得る消失、解凍後の細胞回収率、ＣＤ１０＋、
ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋表現型の劣化、または免疫抑制活性なしで、４
％ＨＳＡ、１０％ＢＳＡ、または１０％ＦＢＳを１０％ＨＳＡに置き換えることができる
ことを実証する。したがって、少なくとも約４％〜約１０％のＨＳＡ、ＢＳＡおよび／ま
たはＦＢＳの範囲は、本明細書に記載する製剤に特に適している。
６．３．６ 異なる細胞型との適合性
この実施例は、骨髄由来間葉系幹細胞およびナチュラルキラー細胞を、胎盤多分化能細
胞と同じ形式で製剤化することができることを実証する。したがって、この実施例は、胎
盤多分化能細胞以外の他の細胞を、本明細書で示す形式で製剤化することができることを
示す。
方法および材料
骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を増殖させ
、以下の製剤を使用して採取した。
Ｆ１：３日間細胞を培養し、次に回収し、細胞を５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン
４０、１０％ＨＳＡに再懸濁し、細胞を７０μｍフィルターで濾過し、約７．５×１０６
個の細胞／ｍＬに細胞を凍結保存したもの。
Ｆ２：４日間細胞を培養し、次に回収し、細胞を５％ＤＭＳＯおよび１０％ＨＳＡを含
むＰｌａｓｍａｌｙｔｅＡに再懸濁したもの。
細胞は速度制御フリーザーを使用して−７０℃で凍結した。ＢＭＭＳＣは２０ｍＬバッ
グにおけるＦ２製剤中および１０ｍＬバッグにおけるＦ１製剤中に凍結保存し、ＣＤ３−
、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞は１０ｍＬバッグＦ２製剤中および１．５ｍＬバイアルＦ１製剤中
に凍結保存した。これらのサンプルを後に解凍し、分析して細胞特性に対する凍結製剤の
影響を決定した。
濾過保持アッセイ：濾過保持アッセイの使用によって細胞凝集を評価した。細胞濃度は
濾過前に約１．２×１０７個の細胞／ｍＬに調節した。濾過量（単位濾過面積当たりの細
胞数）は約２．４×１０８個の細胞／濾過で一定に保った。細胞は、Ｔｈｅｒｍｏ速度制
御フリーザー中に−７０℃で凍結保存した。細胞は使用前に解凍し、サンプルは解凍直後
に処理した。非希釈細胞懸濁液の１００μＬサンプルを解凍後に得て、９００μＬのリン
酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存能力分析装置（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して二連
で細胞計数を実施した。
結果
生存率
解凍後サンプルを使用して、異なる条件下で凍結した細胞の生存率を決定した。ＢＭＭ
ＳＣおよびＮＫ細胞の生存率は、凍結条件によって有意に影響を受けなかった。
表現型
ＮＫマーカーをアッセイして、ＮＫ表現型（ＣＤ３−、ＣＤ５６＋）に対するＦ１およ
びＦ２製剤の影響を決定した。使用した２つの製剤は、ＮＫ表現型を示すＮＫ細胞の割合
（％）に有意に影響を与えなかった。ＢＭＭＳＣはＣＤ１０、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ
４５、ＣＤ９０、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１６６、ＣＤ２００、Ｐａｎ
−サイトケラチン、およびＫＤＲの発現に関しても分析した。これらのマーカーの発現、
または発現の欠如が、Ｆ１またはＦ２製剤に製剤化したＢＭＭＳＣにおいて有意に変わる
ことはなかった。
細胞凝集
濾過保持アッセイにおいて、２回のそれぞれのＢＭＭＳＣ製剤化、および１回アッセイ
のＮＫ製剤化を実施した。ＢＭＭＳＣ細胞とＮＫ細胞の両方に関してＦ１製剤化はＦ２製
剤化より有意に少ない凝集をもたらしたが、しかしながら製剤Ｆ２の影響は、ＮＫ細胞に
関してよりＢＭＭＳＣに関して顕著であった（図２９）。
結論：
前述の結果は、骨髄由来間葉系幹細胞およびナチュラルキラー細胞は、同じ製剤中にＣ
Ｄ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤多分化能細胞のそれと同様に細
胞凝集、生存率および表現型を保持して５％ＤＭＳＯ、５．５％デキストラン４０、１０
％ＨＳＡ中に首尾よく製剤化することができることを実証する。さらに、胎盤多分化能細
胞に関して、ＢＭＭＳＣおよびＮＫ細胞のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ含有製剤は有意に高い細
胞凝集率を示し、このように、デキストラン含有製剤が好ましい。
均等物：
本明細書で開示する組成物および方法は、本明細書で記載する具体的な実施形態によっ
て範囲が制限されない。実際、記載したもの以外に組成物および方法の様々な変更形態が
、前述の記載および添付の図面から当業者に明らかとなる。このような変更形態は、添付
の特許請求の範囲の範疇にあるものとする。
様々な刊行物、特許および特許出願を本明細書で引用し、それらの開示全体は参照によ
り本明細書に組み込まれる。

Claims (42)

  1. 細胞を含む組成物を作製する方法であって、
    （ａ）前記細胞を、デキストランおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液と接
    触させて細胞含有溶液を形成するステップ、
    （ｂ）細胞含有溶液を濾過するステップ、
    （ｃ）前記細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個を超える細胞を
    含む場合、前記細胞を、デキストランを含む第１の希釈溶液で１ミリリットル当たり約１
    ０±３×１０６個以下の細胞に希釈するステップ、および
    （ｄ）場合によって、細胞含有溶液を、デキストランを含むがＨＳＡを含まない第２の
    希釈溶液で希釈し、それによって細胞を含む組成物を作製するステップ
    を含む方法。
  2. 前記細胞をステップ（ｃ）の後およびステップ（ｄ）の前で凍結保存する、請求項１に
    記載の方法。
  3. 前記第１の希釈溶液または第２の希釈溶液中の前記デキストランがデキストラン４０で
    ある、請求項１に記載の方法。
  4. 前記第１の希釈溶液および第２の希釈溶液中の前記デキストランがデキストラン４０で
    ある、請求項１に記載の方法。
  5. 前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン４０が５．５％デキストラン４０である、請
    求項１に記載の方法。
  6. ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡが１０％ＨＳＡである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記第１の希釈溶液がＨＳＡを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡが１０％ＨＳＡである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記第１の希釈溶液が凍結保護剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記凍結保護剤がＤＭＳＯである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン４０が１０％デキストラン４０である、請求
    項１に記載の方法。
  12. ステップ（ａ）の前記溶液が凍結保護剤を含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記細胞を含む組成物が約７．５％〜約９％のデキストランを含む、請求項１に記載の
    方法。
  14. 前記細胞を含む組成物が、１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０６個〜約５．
    ０±１．５×１０６個の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
  15. 前記細胞が胎盤細胞である、請求項１に記載の方法。
  16. 前記幹細胞が単離ヒト接着性胎盤細胞である、請求項１５に記載の方法。
  17. 細胞を含む組成物を作製する方法であって、
    （ａ）複数の単離ヒト接着性胎盤細胞を５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ溶液
    に懸濁して細胞含有溶液を形成するステップ、
    （ｂ）細胞含有溶液を７０μＭフィルターで濾過するステップ、
    （ｃ）細胞含有溶液を５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯ
    中に約１０±３×１０６個細胞／ｍＬ以下に希釈するステップ、
    （ｄ）細胞を凍結保存するステップ、
    （ｅ）細胞を解凍するステップ、および
    （ｆ）場合によって、細胞含有溶液を１０％デキストラン４０で１：１〜１：１１に希
    釈して、前記細胞を含む組成物を生成するステップ
    を含む方法。
  18. 細胞を含む組成物を作製する方法であって、
    （ａ）複数の単離ヒト接着性胎盤細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、
    （ｂ）細胞を５．５％デキストラン４０に再懸濁するステップ、
    （ｃ）細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、
    （ｄ）細胞を、１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０溶液に再懸濁して細胞含
    有溶液を形成するステップ、
    （ｅ）細胞含有溶液を７０μＭ〜１００μＭフィルターで濾過するステップ、
    （ｆ）細胞含有溶液を５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯ
    中に約１０±３×１０６個細胞／ｍＬ以下に希釈するステップ、
    （ｇ）細胞を凍結保存するステップ、
    （ｈ）細胞を解凍するステップ、および
    （ｉ）場合によって、細胞含有溶液を１０％デキストラン４０で１：１〜１：１１に希
    釈して、前記細胞を含む組成物を生成するステップ
    を含む方法。
  19. 単離ヒト接着性胎盤細胞を含む組成物を作製するための方法であって、
    （ａ）複数の単離ヒト接着性胎盤細胞を５．５％デキストラン４０および１０％ヒト血
    清アルブミン（ＨＳＡ）を含む溶液中に供給して、単離ヒト接着性胎盤細胞を含む溶液を
    形成するステップ、
    （ｂ）前記単離ヒト接着性胎盤細胞を含む溶液を、目に見える細胞塊を除去するフィル
    ターで濾過して濾過済み単離ヒト接着性胎盤細胞を生成するステップ、
    （ｃ）前記濾過済み単離ヒト接着性胎盤細胞を１ミリリットル当たり約１０±３×１０
    ６個の細胞にするのに十分な量の、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡおよび５％
    ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む溶液で前記濾過済み単離ヒト接着性胎盤細胞を
    希釈するステップ、および
    （ｄ）前記単離ヒト接着性胎盤細胞を１０％デキストラン４０で、約１：１〜約１：１
    １の単離ヒト接着性胎盤細胞：デキストラン４０の比で希釈して前記組成物を生成するス
    テップ
    を含む方法。
  20. 前記フィルターが７０μＭフィルターである、請求項１に記載の方法。
  21. 前記フィルターが１００μＭフィルターである、請求項１に記載の方法。
  22. 前記細胞が単離ヒト接着性胎盤細胞である、請求項１、６、７または８のいずれかに記
    載の方法。
  23. 前記単離ヒト接着性胎盤細胞がＣＤ１０＋、ＣＤ３４−およびＣＤ１０５＋である、請
    求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−およびＣＤ１０５＋細胞がＣＤ２００＋である、請求項２
    ３に記載の方法。
  25. 前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋細胞がＣＤ４５−また
    はＣＤ９０＋のいずれかである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋細胞がＣＤ４５−およ
    びＣＤ９０＋である、請求項２４に記載の方法。
  27. 請求項１、６、７または８のいずれかに記載の方法によって作製される組成物。
  28. 単離ヒト接着性胎盤細胞を含む組成物を作製する方法であって、前記単離ヒト接着性胎
    盤細胞を、５．５％デキストランおよび１０％ＨＳＡを含む溶液と接触させるステップ、
    単離ヒト接着性胎盤細胞を濾過するステップ、および前記単離ヒト接着性胎盤細胞を、１
    ０％デキストラン４０（ｗ／ｖ）を含む溶液で１ミリリットル当たり約１０±３×１０６
    個の細胞に希釈するステップを含む方法。
  29. 複数の単離ヒト接着性胎盤細胞を、１０％デキストラン４０を含む溶液中に含む組成物
    であって、１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０６個〜約５．０±１．５×１０
    ６個の細胞を含み、マクロの細胞塊は含まない組成物。
  30. 前記胎盤幹細胞が解凍した凍結保存細胞である、請求項２９に記載の組成物。
  31. バッグ内に含有される、請求項２９に記載の組成物。
  32. マクロの細胞塊を含まない、請求項２９に記載の組成物。
  33. １０６個の細胞当たり約２００未満のミクロ細胞塊を含む、請求項２９に記載の組成物
    。
  34. １０６個の細胞当たり約１５０未満のミクロ細胞塊を含む、請求項２９に記載の組成物
    。
  35. １０６個の細胞当たり約１００未満のミクロ細胞塊を含む、請求項２９に記載の組成物
    。
  36. 前記単離ヒト接着性胎盤細胞がＣＤ１０＋、ＣＤ３４−およびＣＤ１０５＋である、請
    求項２９に記載の組成物。
  37. 前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−およびＣＤ１０５＋細胞がＣＤ２００＋である、請求項３
    ６に記載の組成物。
  38. 前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋細胞がＣＤ４５−また
    はＣＤ９０＋のいずれかである、請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋細胞がＣＤ４５−およ
    びＣＤ９０＋である、請求項３７に記載の組成物。
  40. 医薬組成物である、請求項２７および２９〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. １ミリリットル当たり約５×１０６個〜１×１０８個の細胞を含む組成物を濃縮するス
    テップをさらに含む、請求項１または請求項１４に記載の方法。
  42. 対象に細胞を含む組成物を皮下投与するステップをさらに含む、請求項４１に記載の方
    法。
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