CN115590013B - 一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用，涉及细胞冻存技术领域。本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存液，所述冻存液不含血清和培养基成份，可直接应用于临床。利用所述冻存液进行NK细胞的长期冻存，经两个月的冻存，细胞活力和表型无改变，因此所述冻存液对于自然杀伤细胞有特异的保护作用。
Description
技术领域
本发明属于细胞冻存技术领域，具体涉及一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cells，NK cells)是天然免疫细胞中的重要组成部分，与T细胞不同，缺少表面的T细胞受体(T cell receptors，TCRs)，不会引发移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease，GVHD)反应，因此，NK细胞被认为是“现成的”细胞治疗产品，可以提前制备冻存备用，根据多个病人的需要进行优化和分配。
细胞冻存，如利用液氮冻存各种哺乳动物细胞，是当前应用较广的一种方法。细胞冻融过程对所有细胞和组织都有一定伤害，因此，需要开发出有效的技术来防止细胞死亡和损伤。
冷冻保护剂分为两类：一为渗透入细胞内起保护作用的，如甘油、二甲基亚砜、乙二醇、二乙基酰胺等，在冷冻时，保护剂进入细胞，可防止胞内电解质和其它物质的浓度过分增加而起保护作用；另一类额外非穿透性保护剂，如羟乙基淀粉、白蛋白、甲基纤维素、右旋糖酐40等。但是，部分低温保护剂在缓慢冷冻过程中虽然会保护细胞，却也会引起细胞毒性，尤其是在室温下。
目前，尽管大多数研究和医学领域都存在优化的冷冻保存方案和已发表的配方，但技术问题依然存在。如复苏之后质量较差，包括细胞存活率降低，细胞出现凋亡、坏死；表观遗传改变；细胞功能丧失；基因表达和形态的改变；复苏后细胞增殖缓慢等。目前并没有一种专用于NK细胞，且可直接进行静脉注射的NK细胞冻存液。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种自然杀伤细胞的冻存液、冻存方法和应用，所述冻存液可保证NK细胞的长期低温保存，并且长期保存细胞活力和表型无改变。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存液，所述冻存液包括以下体积百分含量的原料：DMSO 8～12％，右旋糖酐0.2～3％，人血白蛋白5～15％和20～200IU/mL的IL-2。
优选的，所述右旋糖酐包括右旋糖酐40氯化钠注射液。
优选的，所述人血白蛋白包括人血白蛋白静脉输注溶液。
优选的，所述IL-2包括注射用重组人白介素-2。
优选的，所述冻存液的原料还包括体积百分含量为20～50％的0.9％氯化钠注射液。
本发明还提供了上述冻存液在长期冻存NK细胞中的应用。
本发明还提供了一种长期冻存NK细胞的方法，包括以下步骤：将自然杀伤细胞置于上述冻存液中，梯度降温至-80℃进行冻存。
优选的，每mL所述冻存液中包含2×107～8×107个自然杀伤细胞。
优选的，所述冻存的时间不低于2个月。
本发明还提供了一种能够直接注射用的自然杀伤细胞混合物，所述自然杀伤细胞混合物包括上述冻存液和自然杀伤细胞。
有益效果：本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存液，所述冻存液不含血清和培养基成份，可直接应用于临床。本发明利用所述冻存液进行NK细胞的长期冻存，经两个月的冻存，细胞活力和表型无改变，因此所述冻存液对于自然杀伤细胞有特异的保护作用。
附图说明
图1为冻存液中IL-2浓度对NK细胞活力的影响；
图2为冻存前和复苏后活率变化；
图3为冻存液中IL-2浓度对细胞比例的影响，每项从上到下依次表示CD3-/CD56+NK细胞、NK中CD16+细胞、CD3+/CD56+NKT细胞、NKT中CD16+细胞、CD3+/CD56-T细胞和NK+NKT总细胞；
图4为冻存前和复苏后细胞比例变化，每项从上到下依次表示CD3-/CD56+NK细胞、NK中CD16+细胞、CD3+/CD56+NKT细胞、NKT中CD16+细胞、CD3+/CD56-T细胞和NK+NKT总细胞；
图5为含IL-2冻存液冻存的NK细胞复苏后对靶细胞杀伤的影响，每项从左到右依次表示DLD-1、H358和AGS；
图6为冻存前和复苏后对靶细胞杀伤效率(E:T＝20：1)，每项从左到右依次表示DLD-1、H358和AGS；
图7为NK冻存前后细胞活力变化；
图8为NK-21-4冻存前和复苏后活力变化；
图9为冻存前后细胞比例变化，每项从上到下依次表示CD3-/CD56+NK细胞、NK中CD16+细胞、CD3+/CD56+NKT细胞、NKT中CD16+细胞、CD3+/CD56-T细胞和NK+NKT总细胞；
图10为冻存前和复苏后细胞比值变化，每项从上到下依次表示CD3-/CD56+NK细胞、NK中CD16+细胞、CD3+/CD56+NKT细胞、NKT中CD16+细胞、CD3+/CD56-T细胞和NK+NKT总细胞；
图11为冻存前后对肿瘤靶细胞的杀伤作用，每项从左到右依次表示DLD-1、H358和AGS；
图12为NK细胞冻存前和复苏后对靶细胞杀伤变化(E:T＝20:1)，每项从左到右依次表示DLD-1、H358和AGS；
图13为冻存前后细胞活力变化；
图14为冻存前后细胞比例变化，柱形图中每项从上到下依次表示CD3-/CD56+NK细胞、NK中CD16+细胞、CD3+/CD56+NKT细胞、NKT中CD16+细胞、CD3+/CD56-T细胞和NK+NKT总细胞；
图15为冻存前后对靶细胞的杀伤效率(％)，柱形图中每项从上到下依次表示DLD-1、H358和AGS；
图16为NK细胞冻存复苏活率柱形图；
图17细胞冻存2个月前后细胞比例变化，每项从左到右依次表示CD3-/CD56+NK细胞、NK中CD16+细胞、CD3+/CD56+NKT细胞、NKT中CD16+细胞、CD3+/CD56-T细胞和NK+NKT总细胞；
图18为NK细胞冻存复苏杀伤变化，柱形图中每项从左到右依次表示DLD-1、H358和AGS；
图19为不同批次样品3h温浴结束后溶血情况图片，其中从左到右从上到下依次表示Y12-20210628A、Y12-20210628B、Y12-20210628C和Y12-20210628D；
图20为不同批次样品温浴结束且离心后，红细胞沉淀在试管底部的图片，其中从左到右从上到下依次表示Y12-20210628A、Y12-20210628B、Y12-20210628C和Y12-20210628D。
具体实施方式
本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存液，所述冻存液包括以下体积百分含量的原料：DMSO 8～12％，右旋糖酐0.2～3％，人血白蛋白5～15％和20～200IU/mL的IL-2。
本发明所述冻存液中DMSO(Dimethyl Sulfoxide)的体积百分含量优选为8～10％，最优选为10％。本发明对所述DMSO的来源并没有特殊限定，优选购自sigma(Cat.No.D2650100ml，Lot.#RNBJ400)。
本发明所述冻存液中右旋糖酐的体积百分含量优选为0.5～1％，更优选为0.5％。本发明所述右旋糖酐优选包括右旋糖酐40氯化钠注射液。本发明对所述右旋糖酐的来源并没有特殊限定，优选购自山东齐都药业有限公司(国药准字H20065232)。
本发明所述冻存液中人血白蛋白的体积百分含量优选为5～10％，更优选为10％。本发明所述人血白蛋白对冻存NK细胞有保护作用，可提高NK细胞复苏后的活力和对靶细胞的杀伤能力。本发明所述人血白蛋白优选包括人血白蛋白静脉输注溶液。本发明所述人血白蛋白优选购自杰特贝林(生产批号：P100225458)，规格为10g/瓶(20％，50mL)。
本发明所述冻存液中IL-2的浓度优选为25～150IU/mL，更优选为50～100IU/mL，最优选为50IU/mL。本发明所述IL-2对NK细胞的冻存有保护作用。本发明所述IL-2优选包括注射用重组人白介素-2。本发明对所述注射用重组人白介素-2(125Ala)的来源没有特殊限定，优选购自双鹭药业(国药准字S19991010)。
本发明所述冻存液的原料优选还包括体积百分含量为20～50％的0.9％氯化钠注射液，更优选为25～40％，最优选为29.5％。本发明所述0.9％氯化钠注射液优选购自石家庄四药有限公司(国药准字H13023200)。
本发明所述冻存液针对自然杀伤细胞(NK细胞)，且不包含培养基和血清，达到临床级别的应用要求。在本发明实施例中，利用所述细胞冻存液对NK细胞进行冻存，冻存2个月以上，NK细胞活性和细胞表型无变化。
本发明还提供了上述冻存液的制备方法，优选包括：在室温(18～26℃)条件下，在无菌工作台内避光配置所述冻存液，现配现用。且在配制时，优选将0.9％NaCl注射液、DMSO、右旋糖酐40氯化钠注射液(Dextran 40)、人血白蛋白静脉输注溶液(HSA)和注射用重组人白介素-2(125Ala)依次加入，每加入一种成分后轻轻晃动混匀。
本发明还提供了上述冻存液在长期冻存NK细胞中的应用。
本发明还提供了一种长期冻存NK细胞的方法，包括以下步骤：将自然杀伤细胞置于上述冻存液中，梯度降温至-80℃进行冻存。
本发明每mL所述冻存液中优选包含2×107～8×107个自然杀伤细胞。本发明所述NK细胞在使用前优选还包括洗涤，所述洗涤优选包括用225mL离心管收集所述细胞，1200g离心5min，室温离心后弃上清，用无菌的0.9％氯化钠注射液洗涤两次。本发明将所述NK细胞置于所述冻存液后进行梯度降温，所述梯度优选为-1℃/min。利用本发明所述方法，NK细胞可冻存的时间不低于2个月，经两个月的冻存，细胞活力和表型无改变。
本发明还提供了一种能够直接注射用的自然杀伤细胞混合物，所述自然杀伤细胞混合物包括上述冻存液和自然杀伤细胞。本发明所述混合物的比例优选为冻存前NK细胞和冻存液的比例，但是在冻存前或解冻后可直接应用于临床，如静脉注射或腹腔注射等。
下面结合实施例对本发明提供的一种自然杀伤细胞冻存液、冻存方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明以下实施例中，各冻存液的配置方法均为：室温，在无菌工作台内避光配置冻存液，现配现用。0.9％NaCl、DMSO、Dextran 40、HSA和IL-2依次加入，每加入一种成分后轻轻晃动混匀。
NK细胞冻存方法：NK细胞洗涤后加入冻存液，然后梯度降温-80℃(-1℃/min)。
试验用试剂
(1)人血白蛋白静脉输注溶液，10g/瓶(20％，50mL)，杰特贝林，生产批号：P100225458。
(2)Dimethyl Sulfoxide，sigma，Cat.No.D2650100ml，Lot.#RNBJ400。
(3)0.9％氯化钠注射液，国药准字H13023200，石家庄四药有限公司。
(4)右旋糖酐40氯化钠注射液(Dextran40，浓度6％)，国药准字H20065232，山东齐都药业有限公司。
(5)注射用重组人白介素-2(125Ala)，国药准字S19991010，双鹭药业。
实施例1
IL-2对PBMC来源NK细胞冻存的影响
(1)对细胞活力的影响
①冻存4周细胞活力变化
培养的自然杀伤细胞，第16天收集细胞，用冻存液(10％(v/v，下同)DMSO+16.7％的6％Dextran 40+N IU/mL IL-2+73.3％的0.9％NaCl注射液)冻存，其中N表示0、50、100、150、200和250；之后分别选择部分在冻存4周后复苏细胞，检测细胞活力。
细胞冻存4W后，活力较冻存前均有不同程度的降低，其中50IU/mL IL-2含量的冻存液细胞活力最高，液氮冻存4W后细胞活力(79.7％)，是冻前细胞活力(87.9％)的91％(图1)。
②冻存5个月细胞活力变化
利用上述方法将NK细胞冻存5个月后，复苏检测细胞活力，细胞活力均有所下降，各组中间差异不大(图2)。
(2)对细胞表型的影响
①冻存4周细胞表型变化
培养的NK细胞最后分3袋培养，每袋细胞悬液为2.5L。第16天分别收集细胞，用冻存液(10％DMSO+16.7％6％Dextran 40+N IU/mL IL-2+73.3％0.9％NaCl注射液)冻存，其中N表示0、50、100、150、200和250；之后分别选择部分在冻存4周后复苏细胞，检测细胞表型，3次冻存的细胞复苏后NK细胞比例较冻前有均有轻微的下降，添加IL-2的各组冻存液组检NK比例差异不大。NK中CD16+细胞比例降低。NKT细胞比例较冻前均升高。NKT中CD16+细胞比例有所降低，各组之间无明显差异。T细胞比例均有所升高。NK+NKT总体百分含量轻微降低，无显著性差异(图3)。
②冻存5个月细胞表型变化
利用上述方法将细胞冻存5个月复苏后细胞表型总体显示：NK细胞比例稍有升高，50IU/mL和100IU/mL IL-2组NK中CD16+细胞稍有升高，NKT细胞比例稍有升高，T细胞比例稍有下降，NK+NKT总体细胞稍有升高。不同IL-2剂量组之间差异较小(图4)。
(3)对靶细胞杀伤的影响
①冻存4周对靶细胞的杀伤
进行与(2)相同的NK细胞培养和分组及冻存。
经分析发现，含150IU/mL IL-2的冻存液对DLD-1的杀伤率为69％，效果最好。对H358的杀伤效率，50/100/150IU/mL IL-2组间无明显差异，在40％左右。对AGS细胞的杀伤，由冻前的52.8％均降到了10％左右(图5)。
②冻存5个月对靶细胞的杀伤
PBMC 20200331B-5批次NK细胞冻存5个月后，复苏检测细胞对靶细胞的杀伤，各组对靶细胞的杀伤效率均有不同程度的降低，含IL-2的冻存液组比不含IL-2的冻存液组对靶细胞的杀伤效果好，其中添加了200IU/mL IL-2组对靶细胞的杀伤效果最好(图6)。
冻存液中添加IL-2组比不加IL-2组冻存的NK细胞，复苏后对靶细胞的杀伤效果较强，说明冻存液中的IL-2对NK细胞的冻存有保护作用。
实施例2
HSA对PBMC来源的NK细胞的冻存影响
采用冻存液(10％DMSO+16.7％6％Dextran 40+N％20％HSA+73.3％-23.3％0.9％NaCl注射液)冻存NK细胞，其中N为0、12.5、25、37.5和50；HSA的浓度由0到10％共5个梯度。细胞冻存4周后，复苏，检测NK细胞对靶细胞的杀伤，NK的活力，表型来综合评价含HSA冻存液的冻存效果。
(1)对细胞活力的影响
①冻存4周细胞活力变化
20200331B-5批次-NK细胞冻存前后细胞活力图7所示，冻存前细胞活力为86.0％，冻存28天后复苏，不加HSA冻存液组细胞活力为75.8％，活力下降了12％。添加了HSA的冻存液对细胞的冻存具有明显的保护作用，其中添加了5％HSA的冻存液，复苏后的细胞活力最好为80.3％，为冻存前的93.4％。
②冻存5个月细胞活力变化
PBMC20200331B-5批次-NK细胞冻存5个月后，复苏检测细胞活力，复苏后细胞活力均有不同程度的降低，其中含10％HSA冻存液组细胞活力最高，其次为2.5％组，和5％HSA组(图8)。
(2)对细胞表型的影响
①冻存4周细胞表型变化
冻存前后流式检测细胞表型，CD3-CD56+NK细胞比例无明显差异，冻前NK比例为97.88％，添加HSA冻存液组，除7.5％HSA组为96.5％，其余大多在97.5％以上。冻存后NK中CD16+细胞比例都有所降低，冻前NK中CD16+细胞的比例为97.43％。不加HSA的冻存液，冻存28天复苏后NK中CD16+细胞的比例为65.95％，添加HSA的冻存液(除加7.5％HSA组)大多复苏后NK中CD16+细胞百分值比不加HSA组偏高。其中冻存后NK中CD16+细胞比例最高的一组为添加了10％HSA组。细胞冻存前后NKT细胞比例大多无明显变化，冻前为1.29％，除了7.5％组升高为2.3％外，其它组均在1.4％左右。NKT中CD16+细胞冻存后比例均降低，冻前为45.96％，冻存后不加HSA组为17.66％，其余加HSA组在14％～15％之间。CD3+CD56-T细胞比例冻存前后差异不大，冻前为0.68％，冻存后0％，2.5％，5％，10％HSA组T细胞比例在0.6％～0.8％之间。含7.5％HSA组T细胞稍有升高，为1.06％。整体的冻存前后NK+NKT细胞比例无明显差异，均在99％以上(图9)。
②冻存5个月细胞表型变化
PBMC20200331B-5细胞冻存5个月复苏后细胞表型总体如图10所示：NK细胞比例稍有升高，2.5％和5％HSA组NK中CD16+细胞稍有升高，NKT细胞比例稍有升高，T细胞比例稍有下降，NK+NKT总体细胞稍有升高。不同HSA剂量组之间差异较小。
(3)对靶细胞杀伤的影响
①冻存4周对靶细胞的杀伤
PBMC20200331B-5批次外周血来源的单个核细胞培养的NK D16天及冻存28天复苏后对人结直肠腺癌上皮细胞(DLD-1)、人非细胞肺癌细胞(H358)和人胃腺癌细胞(AGS)的杀伤效果(效应细胞与靶细胞的比例为20:1)。用10％DMSO+1％Dextran 40+N％HSA冻存液冻存细胞4周，复苏后不同冻存液组NK细胞对靶细胞的杀伤效果差异如图11所示，添加2.5％，5％和10％HSA的冻存液组NK对靶细胞的杀伤率效比不加HSA组高。冻存的NK细胞复苏后对靶细胞杀伤效率最高的为含10％HSA冻存液组。
②冻存5个月对靶细胞的杀伤
NK细胞冻存5个月复苏后细胞对靶细胞的杀伤效率，如图12所示，各冻存组对靶细胞的杀伤效率均有所降低，加HSA冻存液组比不加HSA冻存液组中细胞对靶细胞的杀伤效率较高，其中含5％HSA和10％HSA组对靶细胞的杀伤效率最高。
冻存液中添加HSA后对冻存NK细胞有保护作用，可提高NK细胞复苏后的活力和对靶细胞的杀伤能力。
实施例3
(1)四因素四水平正交试验设计
冻存液成分各组之间的浓度作用可能存在交互作用，为此设计了冻存液中DMSO，Dextran 40，HSA，IL-2四种成分不同浓度水平之间的正交实验，并添加0.9％NaCl注射液定容。各因素浓度水平如表1所示，DMSO浓度范围为4％～10％，Dextran 40的浓度范围为0.5％～3％之间，HSA的浓度范围为2.5％～10％之间，IL-2的浓度范围为25IU/mL～200IU/mL。本实验L16(44)共包括16组组合，详情见表2。
表1正交实验四因素四水平表
表2 L16(44)正交表
(2)对细胞活力的影响
NK细胞冻存前细胞活力值为86.3％，冻存28天复苏后，各组细胞活力均有不同程度的降低，C10，C12，C13组细胞的活力分别为80.4％，86.3％和85.3％，三组之间差异无统计学意义(P>0.05)(图13)。但C10对靶细胞的杀伤效率较低。
(3)对细胞表型的影响
NK细胞冻存后细胞中CD3-/CD56+NK细胞比例冻存前为80.96％，冻存复苏后C10，C12和C13组NK细胞比例均有所降低，分别为77.91％，78.41％和76.30％。NK中CD16+细胞比例大幅度降低，由冻存前的98.32％，冻存复苏后，C10，C12和C13组NK中CD16+细胞比例分别降到了41.14％，29.71％和44.90％。冻存后NKT细胞比例稍有升高，冻存前为12.58％，冻存后在10％～15％之间。NKT中CD16+细胞比例有所降低，由冻前的30.76％降到了17％左右。T细胞比例稍有升高，由冻存前的6.43％提高到8％左右(C10，C12，C13)。NK+NKT总体细胞比例稍有降低，冻存前为93.54％，冻存复苏后C10，C12，C13三组中NK+NKT细胞比例分别为92.12％，91.94％和91.59％，各组之间无明显差异(图14)。
(4)对细胞杀伤的影响
NK细胞冻存前后对靶细胞的杀伤效率(图15)表明：C10组(A3B2C4D3即8％DMSO+1％Dextran 40+10％HSA+100IU/mL IL-2)，C12(A3B4C2D1，即8％DMSO+3％Dextran 40+5％HSA+25IU/mL IL-2)，C13(A4B1C4D2，即10％DMSO+0.5％Dextran 40+10％HSA+50IU/mL IL-2)三组对靶细胞的杀伤效率最高。冻存前NK对DLD-的杀伤效率为78％，冻存复苏细胞C10，C12，C13三组对DLD-1的杀伤效率分别为65％，60.67％和70.33％。冻存前NK细胞对H358的杀伤效率为73％，冻存复苏细胞C10，C12，C13组对H358的杀伤效率分别为34％，33％和42％。冻存前NK细胞对AGS的杀伤效率为40％，冻存复苏细胞C10，C12，C13组对AGS的杀伤效率分别为8％，8％和11％。
即C13组对细胞的杀伤效率最高，C12组与C13相比，对靶细胞的杀伤稍有降低。
实施例4
细胞冻存液的验证试验
培养的NK细胞，用冻存液为10％DMSO+0.5％Dextran 40+10％HSA+50IL-2冻存的细胞，冻存4个月后复苏，检测细胞活力、表型和杀伤。
(1)对细胞活力的影响
NK细胞冻存两个月后，检测细胞活力无变化(图16)。
(2)对细胞表型的影响
NK冻存两个月后，流式检测细胞表型(图17)，NK细胞比例稍有升高，NK中CD16+细胞比例稍有升高，NKT细胞比例下降，NKT中CD16+细胞比例下降，T细胞比例稍有升高，NK+NKT细胞比例无明显变化。
(3)对细胞杀伤的影响
NK细胞冻存两个月后，杀伤效果如图18所示，对DLD-1靶细胞的杀伤无变化；对H358靶细胞的杀伤由冻存前的48.59％降至43.73％，杀伤效率是冻存前的90％；对AGS靶细胞的杀伤效率由冻存前的38.52％降到30.75％，杀伤效率是冻存前的80％。
综上，NK细胞用上述细胞冻存液冻存两个月后，细胞活力和表型无改变，对靶细胞DLD-1，H358和AGS的杀伤效率分别为冻存前的100％，90％和80％。
实施例5
NK冻存液溶血实验
采用体外试管肉眼观察法进行试验。若肉眼观察结果显示，加有冻存液的试管与阴性对照管比较出现澄明红色或结果难以判断时，则按分光光度法进行进一步判断。
1、2％红细胞混悬液的制备
取5mL外周血转移至15mL离心管中，加入10mL生理盐水，摇匀，以2500rpm离心5min，弃上清。加0.9％氯化钠注射液10mL，再离心，反复洗红细胞3～4次，至上清液无色透明止。将所得红细胞按其容积用生理盐水配成2％红细胞混悬液，供试验用。
2、试验操作
取10mL玻璃试管7支，编号后按顺序排列于试管架上，按表3中配比量依次加入2％红细胞混悬液和生理盐水，然后向1～5号试管加入不同量的冻存液，6号管加2.0mL生理盐水，为阴性空白对照，第7号管加2.0mL灭菌注射用水，为溶血阳性对照。
各试管加液混匀后，立即置37℃±0.5℃的水浴箱中进行温育3h(流式管口用封口膜封住，防止液体蒸发)。
表3溶血试验试管及样品准备
3、各种指标的检测频率及方法
(1)体外试管肉眼观察
在加入溶液后15min、30min、45min、1h、2h、3h的时间点进行观察全部试管，共观察6次。
观察各时间点血液的溶血和凝集情况，3h温育(37度)结束将试管从水浴箱平稳取出，照相；接着以1500rpm离心10min后再照相。
(2)分光光度法频率及方法
若肉眼观察结果显示，加有样品溶液的试管与阴性对照管比较出现澄明红色或结果难以判断时。对全部试管进行观察。
各试管1500rpm离心10min后取上清置于96孔板中，每个试管加2个孔，每孔200μL，在酶标仪545nm处，以灭菌注射用水为空白读取各孔OD值。取各试管OD值的平均值，计算溶血率。
3h温育结束将试管从水浴箱平稳取出，放置在试管架，进行照相(图19)，离心后再次照相(图20)，可以观察到1～6号试管中，红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血情况发生。
上清液体中没有棕红色或红棕色絮状沉淀，没有红细胞凝聚，表明没有凝血情况发生。在6号阴性对照组中，没有溶血和凝血情况的发生。在7号阳性试管中，有溶血发生。以上结果表明，在本试验条件下，冻存液不会引起溶血和凝血发生，冻存剂可供血液回输使用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种长期冻存自然杀伤细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将自然杀伤细胞置于自然杀伤细胞的冻存液中，梯度降温至-80℃进行冻存，每mL所述冻存液中包含2´107~8´107个自然杀伤细胞；
所述冻存液由以下原料组成：体积百分含量为10%的DMSO ，质量体积百分含量为0.5%的右旋糖酐，体积百分含量为10%的人血白蛋白，50IU/mL的IL-2和余量的0.9%氯化钠注射液；
所述梯度为-1℃/min；
所述冻存的时间不低于2个月。
2.一种能够直接注射用的自然杀伤细胞混合物，其特征在于，所述自然杀伤细胞混合物包括自然杀伤细胞的冻存液和自然杀伤细胞；所述冻存液由以下体积百分含量的原料组成：体积百分含量为10%的DMSO ，质量体积百分含量为0.5%的右旋糖酐，体积百分含量为10%的人血白蛋白，50IU/mL的IL-2和余量的0.9%氯化钠注射液。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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