CN104430301A - 一种提高人二倍体细胞存活率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高人二倍体细胞存活率的方法，包括以下步骤：用胰蛋白酶液消化细胞后，离心处理，弃去上清液；并使用冻存液将细胞悬浮；冻存液的溶剂为生理盐水或者TC199无血清培养基；每毫升溶剂中含有人血白蛋白3％、二甲基亚砜5％、碳酸钠0.5％、羟乙基淀粉2％、丝氨酸5％、二甲基乙酰胺6％～10％。本发明提供的保存方法可以提高人二倍体细胞的存活率。
Description
技术领域
本发明涉及细胞保存的方法，具体涉及到一种提高人二倍体细胞存活率的方法。
背景技术
人二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。人二倍体细胞在培养后需要保存，待需要的时候解冻复苏。众所周知，细胞在液氨中冻存复苏时，不可能所有的细胞都可以存活。影响细胞复苏成活率的因素非常多，现有研究技术表明，冻存液、冻存方法、复苏的方法对细胞复苏的存活率都有直接影响。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术在冻存人二倍体细胞复苏复苏存活率低的缺陷。
为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种提高人二倍体细胞存活率的方法，包括以下步骤：
用胰蛋白酶液消化细胞后，用于消化细胞的胰蛋白酶与细胞的质量体积比0.1％～1％，胰蛋白酶消化细胞的时间为5分钟；弃去消化液胰蛋白酶，加入含有10％小牛血清的细胞培养液，使细胞悬浮，以800-1000r/min离心5min，弃去上清液；
用冻存液将细胞沉淀重新悬浮，使细胞密度达到2×106个/ml～107个/ml；封装于冻存管内，于零下80℃条件下静置15小时，然后迅速放入液氮中保存；
冻存液的溶剂为生理盐水或者TC199无血清培养基；每毫升溶剂中含有人血白蛋白3％、二甲基亚砜5％、碳酸钠0.5％、羟乙基淀粉2％、丝氨酸5％、二甲基乙酰胺6％～10％。
本发明采用了新的冻存液，可以提高人二倍体细胞的存活率。
具体实施方式
冻存液的制备
取1L的生理盐水或者TC199无血清培养基，在其中加入人血白蛋白30ml，二甲基亚砜50ml、碳酸钠5g、羟乙基淀粉20g、丝氨酸50g、二甲基乙酰胺80g；混合均匀待用。
实施例1
用胰蛋白酶液消化细胞后，弃去消化液胰蛋白酶，加入含有10％小牛血清的细胞培养液，使细胞悬浮，以800～1000r/min离心5min，弃去上清液；
用冻存液将细胞沉淀重新悬浮，使细胞密度达到2×106个/ml～107个/ml；封装于冻存管内，于零下80℃条件下静置15小时，然后迅速放入液氮中保存；
冻存液的溶剂为生理盐水；每毫升溶剂中含有人血白蛋白3％、二甲基亚砜5％、碳酸钠0.5％、羟乙基淀粉2％、丝氨酸5％、二甲基乙酰胺6％。
实施例2
用胰蛋白酶液消化细胞后，弃去消化液胰蛋白酶，加入含有10％小牛血清的细胞培养液，使细胞悬浮，以800～1000r/min离心5min，弃去上清液；
用冻存液将细胞沉淀重新悬浮，使细胞密度达到2×106个/ml～107个/ml；封装于冻存管内，于零下80℃条件下静置15小时，然后迅速放入液氮中保存；
冻存液的溶剂为TC199无血清培养基；每毫升溶剂中含有人血白蛋白3％、二甲基亚砜5％、碳酸钠0.5％、羟乙基淀粉2％、丝氨酸5％、二甲基乙酰胺8％。
对照组1
用胰蛋白酶液消化细胞后，弃去消化液胰蛋白酶，加入含有10％小牛血清的细胞培养液，使细胞悬浮，以800～1000r/min离心5min，弃去上清液；
用冻存液将细胞沉淀重新悬浮，使细胞密度达到2×106个/ml～107个/ml；封装于冻存管内，于零下80℃条件下静置15小时，然后迅速放入液氮中保存；
冻存液的溶剂为TC199无血清培养基；每毫升溶剂中含有人血白蛋白3％、二甲基亚砜5％、碳酸钠0.5％、羟乙基淀粉2％。
对照组2
用胰蛋白酶液消化细胞后，弃去消化液胰蛋白酶，加入含有10％小牛血清的细胞培养液，使细胞悬浮，以800～1000r/min离心5min，弃去上清液；
用冻存液将细胞沉淀重新悬浮，使细胞密度达到2×106个/ml～107个/ml；封装于冻存管内，于零下80℃条件下静置15小时，然后迅速放入液氮中保存；
冻存液的溶剂为生理盐水；溶剂中含有TCM-19940％，牛血清20％，乙二醇18％、DMSO15％。
存活率实验
将实施例1、实施例2、对照组1和对照组2中的人二倍体细胞在以下过程中进行复苏实验，也可以采用其他复苏方法进行实验，复苏实验不影响比较结果。
本发明所采取的复苏方法为下述方法，但是也可以采用其他复苏方法。
复苏方法：
1、将冻存细胞从液氮中取出，至于4℃的冰箱中解冻，然后在2000R/min的条件下离心处理，得到上清液和细胞沉淀；
2、将细胞沉淀至于温水中5分钟，然后加入装有生理盐水的离心管中离心5分钟，去其上清液，然后在细胞中加入第一步中的上清液，然后将细胞稀释后均分在六孔板中培养，根据每孔中的量按照600U/ml的浓度加入按照100ng/ml的CD3mAb，然后在孵化箱中培养，到达复苏的目的。
细胞存活率测定方法：将复苏后的细胞，0.5ml细胞悬液与0.5ml 0.2％台盼兰溶液混合，得到混合液；吸取10微升混合液，滴加在盖片边缘，使混合液充满盖片和计数板之间；静置1分钟；随机选取几个视野，共计数300个细胞(计数着色细胞数目，即死细胞数目)，细胞存活率＝(300-死细胞数目)/300×100％；重复计数5次，结果取5次计数的平均值；得到每组的存活率数据。
实施例1中的细胞存活率为91.2％；
实施例2中的细胞存活率为90.1％；
对照组1中的细胞存活率为75.6％；
对照组2中的细胞存活率为78.3％。
由此可见，本发明公开的冻存人二倍体细胞的方法，可以大大提高人二倍体的解冻复苏后的存活率。
Claims (3)
1.一种提高人二倍体细胞存活率的方法，包括以下步骤：
用胰蛋白酶液消化细胞后，弃去消化液胰蛋白酶，加入含有10％小牛血清的细胞培养液，使细胞悬浮，以800-1000r/min离心5min，弃去上清液；
用冻存液将细胞沉淀重新悬浮，使细胞密度达到2×106个/ml～107个/ml；封装于冻存管内，于零下80℃条件下静置15小时，然后迅速放入液氮中保存；
所述冻存液的溶剂为生理盐水或者TC199无血清培养基；每毫升溶剂中含有人血白蛋白3％、二甲基亚砜5％、碳酸钠0.5％、羟乙基淀粉2％、丝氨酸5％、二甲基乙酰胺6％～10％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：用于消化细胞的胰蛋白酶与细胞的质量体积比0.1％～1％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：胰蛋白酶消化细胞的时间为5分钟。
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