CN102440234B - 人体唾液保存固定液及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人体唾液保存固定液及其制备与应用，本发明的人体唾液保存固定液包括如下组分：蔗糖、Tris-HCl、MgCl₂、异硫氰酸胍及水。本发明的唾液固定液具有很好的保存作用，其保存效果明显优于使用单一组分保存唾液，且成本较低，配制方便，有望成为唾液作为基因组DNA来源的广泛应用所必需的较佳固定液。

Description

人体唾液保存固定液及其制备与应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及到一种人体唾液保存固定液的配方、制备及应用。

背景技术

在分子生物学科研中，血样中的DNA提取在基因工程和分子生物学研究中占有重要地位。通常用于PCR反应和其他分子测试的DNA主要从抗凝血中提取，但保存时间较长的血样，即使添加枸橼酸钠或EDTA抗凝剂，也会形成血块，给提取带来不便。同时，由于采集血液对人体能造成一定的创伤而且需要一定的专业技能才能完成，限制了血液作为DNA来源的广泛应用。

人体唾液中含有口腔黏膜脱落细胞，收集唾液作为DNA样本来源有以下优点：①无穿刺、无伤害取样，避免了采血的痛苦和取尿的尴尬；②一些人群并不适合采血，如小孩、老人。另一些人群则抗拒取血，如某些精神疾病患者，患者的亲属；③简便易行，唾液收集只需离心管：④廉价、高效，不需要配备注射器、消毒用具，也不用培训专业的抽血人员．节省了大量人力物力；即使经过2周的室温存放，依然能提取出完整的基因组DNA。当大范围收集样本时，唾液样本适合在各地区的实验室和收集点之间传递。

人体的唾液中99%是水，有机物主要是唾液淀粉酶、粘多糖、粘蛋白及溶菌酶等，无机物有钠、钾、钙、氯等离子，同时还含有多种细菌、口腔脱落细胞等。因此，如何避免唾液腐败、保持脱落细胞内基因组DNA完整，对唾液作为基因组DNA来源的应用至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种人体唾液保存固定液及其制备及应用。

本发明的人体唾液保存固定液包括如下组分：蔗糖、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、MgCl₂、异硫氰酸胍及水。

蔗糖为0.05mol/L～0.5mol/L,MgCl₂为0.5mmol/L～20mmol/L，pH为7～10的Tris-HCl为1mmol/L～30mmol/L，异硫氰酸胍为0.5mol/L～10mol/L。

较佳的，蔗糖为0.1mol/L～0.4mol/L,MgCl₂为2mmol/L～15mmol/L，pH为7～10的Tris-HCl为3mmol/L～20mmol/L，异硫氰酸胍为1mol/L～6mol/L。

优选的，蔗糖为0.2mol/L～0.4mol/L,MgCl₂为2mmol/L～10mmol/L，pH为7～9的Tris-HCl为5mmol/L～15mmol/L，异硫氰酸胍为2mol/L～5mol/L。

最佳的，蔗糖为0.25mol/L～0.35mol/L,MgCl₂为3mmol/L～8mmol/L，pH为7～8.5的Tris-HCl为8mmol/L～12mmol/L，异硫氰酸胍为2.5mol/L～3.5mol/L。

本发明人体唾液保存固定液的配制方法包括下列步骤：

（1）分别配制Tris-HCl缓冲液、蔗糖、MgCl₂及异硫氰酸胍的水溶液并灭菌；

（2）无菌条件下，将经步骤1获得溶液与无菌水一起按比例混合配制获得人体唾液保存固定液。

本发明的人体唾液保存固定液可用于保存人体唾液。该固定液能够杀灭唾液中含有的细菌、抑制核酶的活性，保存基因组DNA的完整性。

保存及基因组DNA抽提实验结果表明，本发明的唾液固定液具有很好的保存作用，其保存效果明显优于使用单一组分保存唾液，且成本较低，配制方便，有望成为唾液作为基因组DNA来源的广泛应用所必需的较佳固定液。

附图说明

图1实施例1抽提的唾液基因组DNA电泳图

1为基因组DNA

图2实施例2固定液固定后放置于不同温度、不同时间的唾液样本基因组DNA抽提琼脂糖凝胶电泳图

1为4℃放置2周

2为25℃放置2周

3为37℃放置2周

4为37℃放置1个月

图3实施例3固定液处理后提取的唾液基因组DNA经PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图条带为扩增片段DNA

图4实施例4不同成分的固定液固定后的唾液样本基因组DNA抽提琼脂糖凝胶电泳图固定液1无异硫氰酸胍；固定液2中无Mgcl2；固定液3中无Tris；固定液4中无蔗糖

图5实施例5不同成分对提取唾液基因组DNA的因素效应图

图6实施例5固定液处理后提取的唾液基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图编号1-9分别对应实验方案中的实验编号。

具体实施方式

以下列举具体实施例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。

实施例1  固定液固定后唾液基因组DNA抽提

人体唾液保存固定液的配方为：0.25mol/L蔗糖，8mmol/L Tris-HCl（pH为8），3mmol/L MgCl₂，2.5mol/L异硫氰酸胍。

人体唾液保存固定液的配制方法：

（1）先配制1M蔗糖，1M MgCl₂，6M异硫氰酸胍，1M Tris-HCl（pH为8.0）和dd H₂0，分别经1.1kgf/cm²灭菌20分钟；

（2）以配制100ml固定液为例，按下述比例混合各种试剂即可：

实验步骤：

（1）取500ul唾液样本（含等体积固定液和唾液，已于一定温度下放置一定时间）；

（2）将500ul混合液放入1.5ml离心管，12000g/5min；

（3）弃上清液，用漩涡振荡器振荡片刻；

（4）加入500ul提取液（KCl、Tris、MgCl2、白明胶和NP40）和6ul10mg/ml的蛋白酶K；

（5）将混合液放置于60℃水浴箱，保温1h；

（6）加入等体积氯仿，振荡混匀，于12000g/10min离心，取上清液于1.5ml离心管内；

（7）加5M Nacl6ul于上清液中，使其终浓度达到0.1M，再加等体积的异丙醇，混匀后于-20℃冷冻1h;

（8）离心：15000g/15min,可见DNA沉淀，加入70%的酒精清洗DNA；

（9）离心：15000g/10min，弃上清夜；

（10）加入TE80ul溶解DNA，4℃冰箱保存待用,如长期保存放置于-20℃；

（11）准备1%的琼脂糖凝胶,含溴化乙锭(EB)20ul/100ml凝胶液中；

（12）在锡纸上将点样缓冲液和DNA溶液混匀；

（13）分别将样品加入准备好的凝胶电泳场电泳,电泳缓冲液为TBE；

（14）30min后取凝胶在凝胶成像系统中分析，观察DNA条带，如图1。

结果说明：如图1显示，用该固定液提取人类唾液基因组DNA效率高，分子量大，DNA完整。

实施例2  固定液固定后放置于不同温度、不同时间的唾液样本基因组DNA抽提

人体唾液保存固定液的配方同实施例1

人体唾液保存固定液的配制方法同实施例1

实验步骤同实施例1，结果如图2。

如图2显示：1号为固定液固定人类唾液后，放置室温（25℃）7天后提取基因组DNA;

2号为固定液固定人类唾液后，放置37℃7天后提取基因组DNA;

3号为固定液固定人类唾液后，放置-20℃冰箱7天后提取基因组DNA；

4号为固定液固定人类唾液后，放置4℃冰箱7天后提取基因组DNA.

由图中结果表明该固定液对人类唾液样本DNA保存具有明显效果，无论是不同温度下（37℃，25℃，4℃，-20℃）还是不同天数均具有有效的提取效果。

实施例3  固定液固定后室温下放置一个月后的唾液样本基因组DNA抽提及PCR扩增

人体唾液保存固定液的配方同实施例1

人体唾液保存固定液的配制方法同实施例1。

实验步骤：

1.抽提方法同实施例1；

2.PCR扩增条件：

1）95℃3min

2）94℃30s

3）50℃30s

4）72℃30s

5）72℃延伸5min

6）4℃冷却。

步骤2）至步骤4）循环35次

实验结果如图3：

图3为采用本唾液固定液提取5个不同来源样本基因组DNA，经上述PCR扩增后均有明显产物，表明该固定液固定人类唾液所提取的基因组DNA适合进行PCR实验。

（图3是Leptin基因的PCR产物，引物分别为5’-TTTCCTGTAATTTTCCCGTGAG-3’和5‘-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA-3’)

实施例4  不同成分的固定液固定后的唾液样本基因组DNA抽提

人体唾液保存固定液的配方为：

（1）0.25mol/L蔗糖，8mmol/L Tris-Hcl（pH为8），3mmol/L MgCl₂；

（2）0.25mol/L蔗糖，8mmol/L Tris-Hcl（pH为8），2.5mol/L异硫氰酸胍；

（3）0.25mol/L蔗糖，3mmol/L MgCl₂，2.5mol/L异硫氰酸胍；

（4）8mmol/L Tris-Hcl（pH为8），3mmol/L MgCl₂，2.5mol/L异硫氰酸胍。

人体唾液保存固定液的配制方法同实施例1按上述配方中试剂内容进行配制。

实验步骤：

唾液用四种不同成分的固定液固定后，基因组DNA抽提实验步骤同实施例1。

实验结果如图4：图4结果表明固定液中四种成分缺少任何一种将导致唾液基因组DNA抽提效果变差。

实施例5  不同配比的固定液固定后的唾液样本基因组DNA抽提

实验步骤：

对固定液做四因素、三水平正交实验设计，抽提方法同实施例1,实验方案如下：

实验的效应曲线图如图5：

从效应曲线图可以看出，第一种配比组合为较佳：即蔗糖0.25mol/L,Tris8.0mmol/L，Mgcl2为3mmol/L，异硫氰酸胍为2.5mol/L。

九次实验抽提的唾液基因组DNA电泳图谱如图6：

由电泳图中可以看出，1号方案中的基因组DNA得率最高。

Claims (6)

1.一种人体唾液保存固定液，包括如下组分：蔗糖、Tris-HCl、MgCl₂、异硫氰酸胍及水，所述人体唾液保存固定液中，蔗糖为0.05mol/L～0.5mol/L,MgCl₂为0.5mmol/L～20mmol/L，pH为7～10的Tris-HCl为1mmol/L～30mmol/L，异硫氰酸胍为0.5mol/L～10mol/L。

2.如权利要求1所述人体唾液保存固定液，其特征在于，所述人体唾液保存固定液中，蔗糖为0.1mol/L～0.4mol/L,MgCl₂为2mmol/L～15mmol/L，pH为7～10的Tris-HCl为3mmol/L～20mmol/L，异硫氰酸胍为1mol/L～6mol/L。

3.如权利要求2所述人体唾液保存固定液，其特征在于，所述人体唾液保存固定液中，蔗糖为0.2mol/L～0.4mol/L,MgCl₂为2mmol/L～10mmol/L，pH为7～9的Tris-HCl为5mmol/L～15mmol/L，异硫氰酸胍为2mol/L～5mol/L。

4.如权利要求3所述人体唾液保存固定液，其特征在于，所述人体唾液保存固定液中，蔗糖为0.25mol/L～0.35mol/L,MgCl₂为3mmol/L～8mmol/L，pH为7～8.5的Tris-HCl为8mmol/L～12mmol/L，异硫氰酸胍为2.5mol/L～3.5mol/L。

5.如权利要求1-4任一权利要求所述人体唾液保存固定液的制备方法，包括下列步骤：

（1）分别配制Tris-HCl缓冲液、蔗糖、MgCl₂及异硫氰酸胍的水溶液并灭菌；

（2）无菌条件下，将经步骤1获得溶液与无菌水一起按比例混合配制获得人体唾液保存固定液。

6.如权利要求1-4任一权利要求所述人体唾液保存固定液用于保存人体唾液。

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