CN102230030B - 一种猪瘟病毒强毒Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鉴别检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪瘟病毒强毒(CSFV)Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鉴别检测方法，包括以下步骤：(1)合成引物：CSFV强毒的检测引物CSFV-S-F/CSFV-S-R，CSFV弱毒的检测引物为CSFV-C-F/CSFV-C-R；(2)提取病毒RNA、合成cDNA模板；(3)PCR扩增，可从弱毒模板中扩增出1条256bp的条带；可从强毒模板中扩增出1条428bp的条带。该方法只需要在反转录之后进行一次PCR，适合一般实验室开展进行猪瘟病毒强毒和弱毒的鉴别检测，可以有效减少免疫未感染猪被误杀，而产生一定的经济效益。

Description

一种猪瘟病毒强毒Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鉴别检测方法

技术领域

本发明涉及一种猪瘟病毒强毒(CSFV)Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鉴别检测方法，属于分子生物技术领域。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)或(Hog cholera，HC)是一种严重危害猪的烈性病毒性传染病。由于CSF对养猪业危害巨大，且难以有效控制，世界动物卫生组织(OIE)曾经将其列为A类动物疫病，在2008版的《陆生动物法典》1.2.3.5中将其列为必须报告的7种猪的重要传染病之一。2008年我国农业部公告1125号《一、二、三类动物疫病病种名录》中也将其列为17种一类动物传染病之一。世界各国对CSF都采取严格的防控措施，将其控制或扑灭。OIE的最新资料显示，目前在中美洲、南美洲、欧洲、亚洲和非洲部分地区都有CSF的发生，北美、澳大利亚和新西兰已经消灭了CSF。但从20世纪90年代开始，CSF又在部分国家和地区出现暴发和流行，如新西兰(1997)、德国(1993-2001)、比利时(1990，1993，1994)、意大利(1995，1996，1997)、英国(2000)、罗马尼亚(2000)、斯洛伐克(2000)、西班牙(2000)、新加坡(2007)。保加利亚在2009年8月发生过CSF，2008-2010年1月俄罗斯、2009年墨西哥、2009年巴西、2010年瓜地马拉等国家和地区都有CSF发生病例的报告，可见CSF依然是目前猪群中重要的疫病。虽然各国都对其采取了严厉的措施，但不时仍有新病例的出现乃至疫病的暴发。对猪瘟的根除还需要下很大的气力，在本病的研究上也还有许多未知的方面，需要进一步的深入研究。

在猪瘟的防控方面，国外发达国家主要采取扑杀患病猪和带毒猪而达到对该病的净化，如欧盟从20世纪90年代开始采取对猪瘟患猪和猪瘟病毒感染猪进行宰杀的方式而达到对CSF净化的目的；中国采取的是疫苗免疫接种为主的政策，猪瘟弱毒疫苗是目前生产中主要使用的疫苗，使用最广泛的是猪瘟兔化弱毒疫苗(C-株)，其免疫保护确实，在猪瘟的防控上起到了重要作用。弱毒疫苗免疫猪虽然可以产生完全的免疫保护，但也存在无法从血清学上区分CSFV自然感染猪和疫苗免疫猪的问题，给CSFV感染猪和疫苗免疫猪的鉴别检测带来了很大困难；近年来研制的新型猪瘟疫苗，在防止弱毒疫苗毒力返强方面有其优势，但也存在临床应用的问题，如各种猪瘟亚单位疫苗存在免疫效率低，不能提供完全的免疫保护的问题，也不能满足CSFV感染时的紧急免疫需要。尤其是20世纪70年代后期国内猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化，在临床表现趋于复杂化，出现了所谓“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”，典型性病例减少，给疾病的诊断带来困难。由于发达国家对猪瘟采取扑杀而非免疫政策，对猪瘟的诊断还是以血清学为主，因此某些注射了猪瘟弱毒疫苗的猪群有可能全部被扑杀掉。因此，亟待建立一种可以准确鉴别诊断CSFV野毒感染猪和疫苗免疫猪的敏感而特异的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种猪瘟病毒强毒Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鉴别检测方法。

一种猪瘟病毒强毒Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR鉴别检测方法，包括以下步骤：

(1)合成引物，参照GenBank收录的CSFV基因组序列，通过MegAlign软件对其序列进行了比较，在高度保守和强弱毒有明显差异的区段设计引物：

CSFV强毒的检测引物为CSFV-S-F/CSFV-S-R：

上游引物(CSFV-S-F)：5’-CAGAAACATCAAATAC-3’(10666-10681)；

下游引物(CSFV-S-R)：5’-CGTCGGCACAGATT-3’(11093-11080)；

CSFV弱毒的检测引物为CSFV-C-F/CSFV-C-R：

上游引物(CSFV-C-F)：5’-CATGGAGGCGCTGGCA-3’(7532-7547)；

下游引物(CSFV-C-R)：5’-CACAAATTTCCTTCCGTCT-3’(7796-7778)；

(2)提取病毒RNA、合成cDNA模板；

(3)PCR扩增，可从弱毒模板中扩增出1条256bp的条带；可从强毒模板中扩增出1条428bp的条带。

本方法在分析国内外提交的CSFV兔化弱毒疫苗株、Shimen株全基因序列的基础上，分析对比CSFV强毒株和弱毒疫苗株存在基因差异的区域，设计特异性引物。通过对标准Shimen株和C株的扩增表明，引物可以特异性扩增猪瘟病毒强毒和猪瘟病毒弱毒且强毒和弱毒之间未见交叉反应，该方法未能在其他猪源病毒(PRRSV、PPV、PRV、PCV-2)中扩增出片段，证明该方法具有良好的特异性。

该方法只需要进行在反转录之后进行一次PCR，适合一般实验室开展进行猪瘟病毒强毒和弱毒的鉴别检测，可以有效减少免疫未感染猪被误杀，而产生一定的经济效益。

附图说明

图1猪瘟病毒强毒和弱毒的扩增结果；M.DNA Marker DL 2000；1.弱毒引物+弱毒模板；2.强毒引物+强毒模板；3.阴性对照。

图2猪瘟病毒强弱混合毒的扩增结果；M.DNA Marker DL 2000plus；1.强弱毒引物+强弱毒模板；2.阴性对照。

图3猪瘟病毒强毒和弱毒的交叉PCR；M.DNA Marker DL 2000；1.强毒引物+强毒cDNA；2.强毒引物+弱毒cDNA；3.弱毒引物+弱毒cDNA；4.弱毒引物+强毒cDNA。

图4强弱毒引物特异性；M.DNA Marker DL 2000；1.阴性对照；2.强弱毒引物+强弱毒模板；3.强弱毒引物+PPV；4.强弱毒引物+PRV；5.强弱毒引物+PRRSV；6.强弱毒引物+PCV-2。

图5猪瘟病毒强毒株PCR敏感性；M.DNAMarker DL 2000；1.阴性对照；2.1μLcDNA；3.0.1μL cDNA；4.0.01μL cDNA；5.0.001μL cDNA。

图6猪瘟病毒弱毒株PCR敏感性；M.DNA Marker DL 2000；1.阴性对照；2.1μLcDNA；3.0.1μL cDNA；4.0.01μL cDNA；5.1×10^-3μL cDNA；6.1×10^-4μL cDNA；7.1×10^-5μL cDNA。

图7猪瘟病毒强弱毒株双重PCR的敏感性；M.DNAMarker DL2000；1.阴性对照；2.2μL cDNA；3.0.2μL cDNA；4.0.02μL cDNA；5.2×10^-3μL cDNA；6.2×10^-4μL cDNA；7.2×10^-5μL cDNA。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.1.1试剂

TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；DNA Marker DL 2000、pMD19-T载体、反转录试剂盒，均购自均大连TaKaRa公司；2×Taq PCR Mix，胶回收试剂盒购自Vigorous。其余均为国产或进口分析纯。

1.1.1.2主要仪器

纯水仪(法国MILIPORE)，台式高速离心机(美国Sigma 1-15)，微量移液器(德国eppendorf)，冰箱(日本SANYO MDF-U4086S)，电子天平(美国Adventurer)，制冰机(美国GRANT FM70-FM100-FM130)，电泳仪(DYY-Ⅲ 8B北京六一仪器厂)，微波炉(Haier MO-2270M1)，干烤箱(上海福玛DGX-9143B-1)，恒温培养箱(上海福玛DPX-9082B-1)，超净工作台(DL-CJ-1N哈尔滨东联电子有限公司)，PCR仪(德国eppendorf Master cycler，美国MJ Research PTC-100)；高速低温离心机(美国Sigma3-18，德国eppendorf centrifuge 5414R)。

1.1.1.3毒株及检测样品

猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)、猪瘟病毒强毒株(Shimen株)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)，所用病毒株均购自中国兽药监察所。

1.1.2方法

1.1.2.1引物合成

参照GenBank收录的CSFV兔化弱毒疫苗株和Shimen株的基因序列，通过MegAlign软件对不同分离株的序列进行了比较，在高度保守和强弱毒有明显差异的区段设计引物。CSFV强毒的检测引物为CSFV-S-F/CSFV-S-R，预期扩增产物大小428bp。CSFV弱毒的检测引物为CSFV-C-F/CSFV-C-R，预期扩增产物长度256bp。引物由北京六合华大基因生物工程技术服务有限公司合成，使用浓度为10μmol/L。

(1)猪瘟病毒强毒shimen株引物序列(参考毒株AF092448)

上游引物(CSFV-S-F)：5’-CAGAAACATCAAATAC-3’(10666-10681)，(SEQ IDNO：1)；

下游引物(CSFV-S-R)：5’-CGTCGGCACAGATT-3’(11093-11080)，(SEQ ID NO：2)；

预期扩增片段长度为428bp。

(2)猪瘟病毒弱毒引物序列(参考毒株AF091507)

上游引物(CSFV-C-F)：5’-CATGGAGGCGCTGGCA-3’(7532-7547)，(SEQ ID NO：3)；

下游引物(CSFV-C-R)：5’-CACAAATTTCCTTCCGTCT-3’(7796-7778)，(SEQ IDNO：4)；

预期扩增片段长度为256bp。

1.1.2.2猪瘟病毒强毒Shimen株和疫苗弱毒C株检测RT-PCR方法建立

1.1.2.2.1病毒RNA提取及cDNA合成

分别取100μL猪瘟病毒强毒和弱毒细胞培养物，按照Trizol试剂使用说明书方法抽提总RNA。具体步骤如下：

(1)于1.5mL离心管中加病毒细胞培养物100μL，再加Trizol 1mL，充分混匀，室温放置10min；

(2)加入200μL氯仿，颠倒混匀(轻轻)，室温孵育10min；

(3)4℃，12000r/min离心15min，将上层水相转移到一新1.5mL离心管中；

(4)在上清中加入等体积冰冷异丙醇沉淀RNA，室温放置20min，4℃12000r/min离心10min；

(5)弃上清，用75％乙醇(1‰DEPC水配制)洗涤沉淀，每1mL Trizol处理样品加至少1mL 75％乙醇振荡离心管，悬浮沉淀，4℃8000r/min离心5min；

(6)小心吸去上清，室温干燥沉淀5～10min，用无RNase酶水(30μL)溶解沉淀，加1μL(40U/μL)RNA酶抑制剂(冰上操作)，置-80℃备用。

对提取的RNA反转录合成cDNA，反转体系如下：

置37℃25min后，85℃5s终止反应，将cDNA产物置于-20℃保存。

1.1.2.2.2PCR扩增

分别以反转录获得的猪瘟病毒强毒shimen株和疫苗弱毒C株的cDNA为模板，用设计的强、弱毒引物进行PCR扩增。PCR体系为总体积20μL，其成分组成如下：

PCR反应条件为：95℃3min；94℃30s，50℃30s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min，置于4℃保存。

取10μL PCR产物，在2.0％琼脂糖凝胶上电泳50min，用溴化乙淀染色后，在凝胶成像系统中观察记录结果。

1.1.2.2.3PCR产物鉴定

PCR产物的胶回收按照下列程序进行：

(1)在紫外灯下，用干净的手术刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到的凝胶体积越小越好；

(2)将切下含有DNA条带的凝胶放入1.5mL离心管中，称重；(称一个空的1.5mL离心管后，放入凝胶块再称一次，两次之差即为凝胶的重量。)

(3)加入3倍体积凝胶的溶胶结合液DB(例如凝胶重为0.1g即100mg，则其体积可视为100μL，因此需要加入300μL的DB。如果凝胶浓度大于2％，则应加入6倍体积凝胶的溶胶结合液DB。凝胶块最大不能超过400mg，如果超过400mg，则需要用多个离心柱)，56℃水浴10min；

(4)每100mg最初的凝胶重量加入150μL异丙醇，震荡混合；

(5)将上步所得溶液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，12000r/min离心30s～60s，倒掉收集管中的废液；

(6)加入700μL漂洗液WB，12000r/min离心1min，弃掉废液；

(7)加入500μL漂洗液WB，12000r/min离心1min，弃掉废液；

(8)将吸附柱AC放回空的收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

(9)取出AC，放入一个洁净的1.5mL离心管中，在其吸附膜的中间部位加50μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中加热效果更好)，室温静置2min，12000r/min离心1min。如需较多量的DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，12000r/min离心1min，离心管底部的液体即为所需的DNA，-20℃保存，备用。

PCR产物直接连接T载体，体系如下：

PMD19-T Vector        0.5μL

DNA                   4.5μL

Solution Ⅰ                   5μL

在16℃，连接2小时以上。

连接产物转化DH5a大肠埃希菌感受态细胞：无菌条件将连接产物加到50μL DH5a感受态细胞中，轻弹混匀后，冰浴30min，期间弹匀2-3次；将转化体系置42℃水浴中热休克90s，注意不要摇动离心管；快速将离心管置于冰上1-2min，使细胞冷却；加入800μL预热到37℃的无抗生素LB液体培养基，37℃以225r/min慢摇培养45min，使细胞复苏；吸取100-200μL培养物，均匀涂布于含Ampicillin(100μg/mL)的LB琼脂平板上；将平板置于室温直至液体完全被吸收；倒置平皿，37℃温箱中培养，12-16h左右。

挑取典型单菌落进行PCR鉴定，其体系与普通PCR体系相同；将阳性菌落培养后将菌液送北京六合华大基因生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

1.1.2.2.4猪瘟病毒强毒shimen株和疫苗弱毒C株检测双重PCR的建立

(1)分别取80μL强毒细胞培养物和20μL弱毒细胞培养物混合，Trizol提取混合毒的RNA，过程同1.1.2.2.1。将获得的RNA溶解于30μL RNase-free水；

(2)对于提取的混合毒RNA使用反转录试剂盒进行反转录合成混合毒cDNA，体系和方法同前；

(3)以猪瘟病毒强弱混合毒cDNA为模板，进行双重PCR。

体系如下：

PCR扩增条件为：95℃3min；94℃30s，50℃30s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。

(4)将PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶上电泳50min，用溴化乙淀染色后，在凝胶成像系统中观察记录结果。

1.1.2.3RT-PCR方法的特异性试验

(1)以猪瘟病毒强毒cDNA为模板，用猪瘟病毒弱毒引物进行PCR扩增；同时以猪瘟病毒弱毒cDNA为模板，用强毒引物进行PCR扩增，观察引物之间是否存在交叉扩增现象。PCR体系如下：

①强毒模板+弱毒引物

②弱毒模板+强毒引物

PCR扩增条件为：95℃3min；94℃30s，50℃30s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min，置于4℃保存。

将PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶上电泳50min，溴化乙淀染色后，在凝胶成像系统中观察记录结果。

(2)强/弱毒引物+强弱毒cDNA猪瘟强弱混合毒

PCR反应条件同上。

(3)双重PCR扩增PRRSV、PPV、PCV-2和PRV

在双重PCR体系中分别加入PRRSV cDNA 2μL，或PPV、PCV-2、PRV DNA2μL进行PCR扩增，检验引物的特异性。

PRRSV RNA抽提和cDNA合成同猪瘟病毒；PPV、PCV-2、PRV细胞培养物DNA提取根据Axygen DNA提取试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)说明书进行，简要过程如下：

取100μL病毒细胞培养物加入到1.5mL灭菌离心管中，然后加249.1μL的PBS液和0.9μL的RNaseA，混匀，使总体积为350μL；加入150μL Buffer C-L和20μL PKBuffer，漩涡震荡1min，56℃水浴10min；加入350μLBuffer P-D，漩涡震荡30s，混匀，12000r/min离心10min；将DNA制备管置于2mL离心管中，将上述混合液转移至制备管中，12000r/min离心1min，弃去滤液，将制备管放回原来的2mL离心管中；加入500μL Buffer W1，12000r/min离心1min，弃去滤液，将制备管放回到原来的2mL离心管中；加入700μL Buffer W2，12000r/min离心1min，弃去滤液，将制备管放回到原来的2mL离心管中；再加入700μL Buffer W2，12000r/min离心1min，弃去滤液，将制备管放回到原来的2mL离心管中，再12000r/min离心1min；将DNA制备管置于另一洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加100-200μL Eluent或去离子水，室温静置1min，12000r/min离心1min，洗脱DNA。然后用移液枪将离心下来的液体再转移至制备管中，静置1min后，再12000r/min离心1min，这样离心管底部的液体即为提取的病毒总DNA，保存于-20℃，备用。

PCR反应体系和条件同前。

1.1.2.4RT-PCR方法的敏感性试验

(1)分别将猪瘟病毒强毒和弱毒株的cDNA进行10倍梯度稀释。PCR反应体系和条件同前，将PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶上电泳50min，用溴化乙淀染色后，在紫外凝胶成像系统中观察记录结果；

(2)将猪瘟病毒强弱混合毒的cDNA进行10倍梯度稀释。PCR反应体系和条件同双重PCR。

1.1.2.5样品检测

用建立的猪瘟病毒强毒shimen株和疫苗弱毒株RT-PCR方法对收集的病料进行实验性检测，病料中猪瘟病毒的提取和RT-PCR方法同前，对检测结果进行统计分析。

2.2结果

2.2.1猪瘟病毒RT-PCR检测方法的建立

(1)分别用设计的CSFV强毒特异性引物(CSFV-S-F/CSFV-S-R)和CSFV弱毒特异性引物(CSFV-C-F/CSFV-C-R)，扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)、Shimen株强毒cDNA。发现用弱毒引物可从弱毒模板中扩增出1条256bp的条带；强毒引物可以从强毒模板中扩增出1条428bp的条带(图1)。

(2)用猪瘟病毒强毒/弱毒引物，扩增猪瘟病毒强/弱毒混合cDNA。可同时扩增出大小分别是428bp和256bp的两条条带(图2)。

(3)PCR产物测序表明，猪瘟病毒Shimen株的PCR产物为428bp，C株的PCR产物长度为256bp，产物序列与参考毒株的核苷酸相似性均在98.0％以上，表明PCR产物有良好地特异性。

猪瘟病毒强毒PCR产物测序结果如下：

CAGAAACATCAAATACTATGAAACCGCGATCCCAAAGAATGAGAAGAGGGACGTCAATGATGACTGGACCGCTGGTGACTTCGTGGATGAGAAGAAGCCCAGAGTCATACAATACCCTGAAGCAAAAACAAGGCTGGCCATCACCAAGGTGATGTATAAGTGGGTGAAGCAGAAGCCAGTAGTTATACCCGGGTATGAAGGGAAGACACCTCTGTTCCAAATTTTTGACAAAGTAAAGAAGGAATGGGATCAATTCCAAAATCCAGTAGCAGTGAGCTTCGACACTAAGGCGTGGGACACCCAGGTAACCACAAAAGATTTGGAGCTGATAAAGGACATACAAAAGTACTATTTCAAGAAGAAATGGCATAAATTTATAGACACCCTGACCATGCATATGACAGAAGCACCCGTAATCTGTGCCGACG，(SEQ ID NO：5)；

产物序列和参考标准猪瘟病毒shimen株的相似性为98.4％。

猪瘟病毒弱毒PCR产物测序结果如下：

CATGGAGGCGCTGGCAGACAGTAAAGAAGACATCATAAAATATGGGCTGTGGGGGACGCACACAGCCTTATATAAGAGCATCAGTGCCAGGCTTGGGGGTGAGACTGCGTTCGCTACCCTGGTAGTGAAGTGGATGGCATTTGGGGGTGAATCAATAGCAGACCATGTCAAACAAGCGGCCACAGACTTGGTCGTTTACTATATCATCAACAGACCTCAGTTCCCAGGAGACACGGAGACACAACAAGACGGAAGGAAATTTGTG，(SEQ ID NO：6)；

产物序列和参考标准猪瘟病毒弱毒疫苗C株的相似性为99.6％。

2.2.2RT-PCR方法的特异性

(1)用猪瘟病毒强毒引物分别扩增猪瘟病毒强毒和弱毒的模板cDNA；用弱毒引物分别扩增猪瘟病毒弱毒和强毒的模板cDNA。结果表明，强毒引物仅能从强毒模板中大小为428bp的条带，不能从猪瘟病毒弱毒模板中扩增出条带；用弱毒引物仅能从弱毒模板中扩增出大小为256bp的条带，不能从猪瘟病毒强毒中扩增出条带(图3)。

(2)猪瘟病毒强/弱毒引物扩增猪瘟病毒强/弱毒，及扩增PPV、PRV、PPRSV、PCV-2，结果发现，在PPV、PRV、PPRSV、PCV-2中均不能扩增出条带(图4)。

2.2.3RT-PCR方法的敏感性结果

(1)将猪瘟病毒强毒株和弱毒株cDNA分别进行10倍梯度稀释，然后进行PCR扩增。结果发现，强毒可稀释到10^-2，弱毒可稀释到10^-4。测得强毒cDNA浓度为7.9ng/μL、弱毒cDNA核酸浓度为1139.9ng/μL，猪瘟病毒强毒的最小检测量为7.9pg/μL cDNA含量，弱毒为11.4pg/μL的cDNA含量，结果如图5和6所示。

(2)将猪瘟病毒强毒和弱毒cDNA等量混合，然后进行10倍梯度稀释，以双重PCR检测其敏感性。结果发现，双重PCR的最小检测量与单重PCR一致(图7)。

2.2.4样品检测结果

在对收集的8份猪血液样品用建立的猪瘟病毒强毒shimen株和疫苗弱毒C株鉴别检测双重RT-PCR进行检测，结果发现，在6份血液中可以检测到猪瘟强毒，1份血样中检出强毒和弱毒同时存在(表1)。

表1样品检测结果

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种猪瘟病毒强毒Shimen株和疫苗弱毒C株RT-PCR非诊断性鉴别检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成引物，参照GenBank收录的CSFV基因组序列，通过MegAlign软件对其序列进行了比较，在高度保守和强弱毒株有明显差异的区段设计引物：

CSFV强毒的检测引物为CSFV-S-F/CSFV-S-R：

上游引物(CSFV-S-F)：5’-CAGAAACATCAAATAC-3’；

下游引物(CSFV-S-R)：5’-CGTCGGCACAGATT-3’；

CSFV弱毒的检测引物为CSFV-C-F/CSFV-C-R：

上游引物(CSFV-C-F)：5’-CATGGAGGCGCTGGCA-3’；

下游引物(CSFV-C-R)：5’-CACAAATTTCCTTCCGTCT-3’；

(2)提取病毒RNA、合成cDNA模板；

(3)PCR扩增，可从弱毒模板中扩增出1条256bp的条带；可从强毒模板中扩增出1条428bp的条带。

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