CN105368812A - 一种唾液保存液及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种唾液保存液及其制备方法和用途，所述唾液保存液包括如下组分和含量：氯化锂0.1-2mol/L，Tris-HCl1-50mmol/L，尿素0.1-2mol/L，SDS0.1-2%（w/v），EDTA1-10mmol/L，乙醇10-90%（v/v），体系pH范围在7-10之间。本发明的唾液保存液用于保存唾液，能够长期保持细胞中DNA的完整性，并且能够避免细菌等微生物的滋生。

Description

一种唾液保存液及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种唾液保存液及其制备方法和用途。

背景技术

人体组织及体液中提取得到的核酸DNA样本在法医鉴定、疾病检测与治疗等领域应用广泛。当前科研人员和临床医生主要用抗凝血提取DNA，然而抗凝血保存时间稍长后出现凝集现象对提取过程造成不便。同时，通过采血提取DNA还有如下几点不便：(1)对采血人员要求有专业的培训；(2)耗费人力，需要有人辅助完成；(3)部分人心理对抽血无法接受，甚至出现晕血等状况；(4)通量低，无法大量随时随地采集样本。

近些年来，科研和医药领域逐渐采用唾液取样的方式获取个体的DNA，因为唾液里有一些口腔上皮细胞和唾液腺来源的白细胞，这些细胞里面有DNA。唾液样本采集相对于血液样本采集来讲，对个体无创伤且无痛、操作简便、便于大量采样。此外，室温条件下保存时间较长的唾液样本仍然可以提取得到完整的基因组DNA。

唾液样本中含有大量人体分泌的体液，其中包含粘蛋白、球蛋白、消化酶和白蛋白等物质，多种有机物的存在容易滋生大量的微生物，如何避免微生物的生长同时保证脱落细胞中基因组DNA的完整，成为唾液保存液的关键作用所在。

公布号为CN102440234A的中国发明专利申请公开了一种人体唾液保存固定液及其制备与应用，该唾液保存固定液以蔗糖、Tris-HCl、氯化镁、异硫氰酸胍和水为主要成分，可用于唾液保存。但是，由于含有蔗糖成分，虽然可以很好的保持该唾液保存固定液的粘度并维持细胞渗透压，但是容易引起细菌等微生物的滋生；氯化镁作为核酸酶的激活剂，容易引起DNA的降解；异硫氰酸胍作为变性剂虽可以抑制核酸酶的活性，但是容易引起细胞的破裂，使得DNA处于暴露状态，易于断裂。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种唾液保存液及其制备方法和用途，所述唾液保存液用于保存唾液，能够长期保持细胞中DNA的完整性，并且能够避免细菌等微生物的滋生。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种唾液保存液，其包括如下组分和含量：氯化锂0.1-2mol/L，Tris-HCl1-50mmol/L，尿素0.1-2mol/L，SDS0.1-2％(w/v)，EDTA1-10mmol/L，乙醇10-90％(v/v)，体系pH范围在7-10之间。

其中，w/v表示质量体积分数，v/v表示体积分数。

在第一方面中，氯化锂以摩尔浓度计含量为0.1-2mol/L，典型但非限定性的含量例如0.12mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、1.9mol/L、0.1-0.5mol/L、0.2-0.8mol/L、0.1-1.2mol/L、0.5-1mol/L、0.8-1.5mol/L。

在第一方面中，Tris-HCl以摩尔浓度计含量为1-50mmol/L，典型但非限定性的含量例如2mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、32mmol/L、38mmol/L、42mmol/L、48mmol/L、1-20mmol/L、2-30mmol/L、1-42mmol/L、20-35mmol/L、10-45mmol/L。

在第一方面中，尿素以摩尔浓度计含量为0.1-2mol/L，典型但非限定性的含量例如0.12mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、1.9mol/L、0.1-0.5mol/L、0.2-0.8mol/L、0.1-1.2mol/L、0.5-1mol/L、0.8-1.5mol/L。

在第一方面中，SDS(十二烷基硫酸钠)以质量体积分数计含量为0.1-2％，典型但非限定性的含量例如0.12％、0.15％、0.2％、0.3％、0.5％、0.8％、1.0％、1.2％、1.5％、1.8％、1.9％、0.1-0.5％、0.2-0.8％、0.1-1.2％、0.5-1％、0.8-1.5％。

在第一方面中，EDTA(乙二胺四乙酸)以摩尔浓度计含量为1-10mmol/L，典型但非限定性的含量例如1.2mmol/L、1.5mmol/L、1.8mmol/L、2.2mmol/L、3mmol/L、3.8mmol/L、4.5mmol/L、5mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、8.8mmol/L、9.2mmol/L、1-8mmol/L、1-6mmol/L、1-5mmol/L。

在第一方面中，乙醇以体积分数计含量为10-90％，典型但非限定性的含量例如10％、12％、15％、18％、20％、25％、35％、40％、50％、58％、62％、70％、78％、85％、88％、10-60％、20-50％、20-80％、30-85％。

在第一方面中，体系pH范围在7-10之间，典型但非限定性的pH值例如7.2、7.5、7.8、8.2、8.5、9.0、9.4、9.5、9.8、7-9、7-8.5、7-8、7.5-8.5。

作为优选方案，第一方面的唾液保存液包括如下组分和含量：氯化锂0.1-1.2mol/L，Tris-HCl1-42mmol/L，尿素0.1-1.2mol/L，SDS0.1-1.2％(w/v)，EDTA1-6mmol/L，乙醇10-60％(v/v)，体系pH范围在7-8.5之间。

作为进一步优选方案，第一方面的唾液保存液包括如下组分和含量：氯化锂0.5-1mol/L，Tris-HCl20-35mmol/L，尿素0.5-1mol/L，SDS0.5-1％(w/v)，EDTA1-5mmol/L，乙醇20-50％(v/v)，体系pH范围在7-8之间。

作为最优选方案，第一方面的唾液保存液包括如下组分和含量：氯化锂0.67mol/L，Tris-HCl33mmol/L，尿素0.67mol/L，SDS0.6％(w/v)，EDTA3.3mmol/L，乙醇30％(v/v)，体系pH范围在7-8之间。

在第一方面中，所述唾液保存液的溶剂为无菌水。一般而言，所述唾液保存液由氯化锂、Tris-HCl、尿素、SDS、EDTA、乙醇和无菌水组成，不再包含其它组分，因此本发明中“包括”也可以替换为“由……组成”的表达方式。但是，为了其它特定目的，本发明的唾液保存液还可以包括苯扎氯铵和/或苯甲醇，其中苯扎氯铵是常用的医用杀毒剂，常用于伤口消毒中，加入苯扎氯铵能够进一步抑制细菌等微生物滋生。

作为优选方案，所述唾液保存液包含苯扎氯铵0.01-5％(w/v)，苯甲醇10％-90％(v/v)。

在第一方面的唾液保存液中，尿素、乙醇和SDS作为变性剂，可以将唾液中的粘蛋白和球蛋白等有机物质进行变性处理，在降低液体粘性的同时使得微生物不易于滋生；乙醇和SDS作为抑菌剂，可以杀灭或抑制保存后的唾液中的微生物滋生；氯化锂作为还原剂，可以中和保存后的唾液中氧化剂的作用，避免产生微生物滋生的环境；EDTA作为螯合剂可以螯合镁离子等核酸酶的激活剂，从而抑制核酸酶类对核酸分子的降解作用，达到保护核酸的作用；SDS作为助溶剂，可以与蛋白质形成复合物而增强蛋白质的可溶性；同时采用Tris-HCl作为缓冲液，可以维持溶液环境pH在7-10、优选7-8范围内；此外，由于不含有蔗糖，进一步抑制微生物的滋生，并防止唾液保存液变得粘稠而影响DNA的提取效果。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述的唾液保存液的方法，包括：

(1)按照终浓度的要求，分别称量尿素和氯化锂，量取正确体积的Tris-HCl母液、SDS母液、EDTA母液和乙醇，混合后搅拌溶解均匀，用无菌水定容；

(2)调节步骤(1)所得溶液的pH至目的范围，然后用微孔滤膜过滤除菌，得到所述唾液保存液。

其中，步骤(1)中Tris-HCl母液的浓度可以配制成0.1-1mol/L备用，SDS母液的浓度可以配制成5-10％(w/v)备用，EDTA母液可以配置成0.1-0.5mol/L备用；步骤(2)微孔滤膜可以选用孔径0.45微米以下、优选0.22微米以下的微孔滤膜，如Millipore的微孔滤膜。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的唾液保存液在保存唾液中的用途。

其中，第一方面的唾液保存液可用于保存哺乳动物如人、羊、马、狗等的唾液，优选用于保存人体唾液。

本发明的有益效果为：本发明的唾液保存液能够在室温条件下长期保存唾液中含基因组DNA的脱落细胞，所保存的唾液中DNA完整性好，实验证实，使用本发明的唾液保存液保存唾液2.5个月后不发生DNA的断裂损坏。此外，没有细菌等微生物的滋生，并且能够降低唾液中粘蛋白等有机物质的粘连性，便于后续提取DNA的操作。

附图说明

图1为用实施例1制备的唾液保存液室温条件保存的两个个体(个体1和个体2)的唾液样本在保存不同时间后提取的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，图中：M1和M2分别表示DNAMarker；1-5为个体1的唾液样本保存1周、2周、3周、4周和2.5个月后提取得到的DNA；6-10为个体2唾液样本保存1周、2周、3周、4周和2.5个月后提取得到的DNA。

图2为个体1的唾液样本使用实施例1的唾液保存液保存2.5个月后提取的基因组DNA为模板，以10对看家基因的扩增引物进行PCR扩增得到的琼脂糖凝胶电泳图，图中：M表示DNAMarker；NA表示空白对照；1-10分别表示10对看家基因的扩增片段。

图3为使用对比液1-6和实施例1的保存液保存人体唾液1周后，提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性的结果，图中：M1和M2分别表示DNAMarker；1-6分别表示对比液1-6保存的唾液样本的DNA，即分别用缺少了尿素、氯化锂、Tris-HCl、SDS、EDTA和乙醇的保存液保存唾液样本1周后提取的DNA；7为用实施例1的保存液保存唾液样本1周后提取的DNA。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。除非特别说明，下面实施例中所使用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。

实施例1

本实施例的唾液保存液包括如下组分和含量：氯化锂0.67mol/L，Tris-HCl33mmol/L，尿素0.67mol/L，SDS0.6％(w/v)，EDTA3.3mmol/L，乙醇30％(v/v)，体系pH为7.5。

本实施例的唾液保存液的制备方法如下：

(1)分别称取6.036g尿素和4.26gLiCl，依次倒入烧杯中(烧杯用纯水清洗干净)，注意称取过程要尽量在短时间内完成，防止样品潮解。

(2)分别量取4.95mLTris-HCl(1M)、9mLSDS(10％)、0.99mLEDTA(0.5M)及45mL乙醇，依次倒入烧杯中，用洁净的玻璃棒搅拌溶解均匀，用超纯水定容到150mL。

(3)用一次性滤膜装置将上述保存液进行过滤，保存于储液瓶中。

(4)用稀盐酸调整溶液pH值到7.5，室温保存备用。

唾液样品采集和保存方法如下：

(1)采样前60分钟漱口以除去食物残渣及残留微生物，漱口之后60分钟内不要饮食、吸烟或嚼口香糖，以免混入食物的DNA，也不要刷牙或大量饮水，以免影响脱落细胞的回收数量。哺乳期幼婴儿采样前应适量饮水，以防母乳混合污染，饮水后60分钟采样。

(2)开始吐唾液前，放松脸颊，并轻轻揉搓30秒以产生唾液。如果难以产生唾液，可以将1/4茶匙白蔗糖放在舌尖上。将唾液收集到无菌的2mLEP管中。

(3)准备消毒的医用棉签，提取前先用清水簌口，然后一手持棉签，伸进口腔，从口腔内侧左右颊粘膜处反复擦拭15-30次或以上，取出棉签，并浸泡在吐出的唾液中。

(4)按照上述方法采集两个个体(个体1和个体2)的唾液，各2mL。

(5)取与唾液等体积的本实施例制备的唾液保存液加入到唾液样品中，并颠倒混匀10-20次。

(6)混匀后样品可以放置室温保存，并分别于1周、2周、3周、4周和2.5月时提取保存的样本中的DNA。实验中观察到：采集唾液样本时唾液十分粘稠，这是由于人体体液分泌的各种蛋白和其它有机物质的存在；加入等体积唾液保存液并颠倒混匀，置于室温保存，提取DNA时唾液样品不再粘稠且基本澄清，说明唾液保存液可以去除唾液中粘蛋白等有机物质的粘连作用。长时间室温保存后不会发出由于细菌滋生而散发的异味，说明唾液保存液可以有效抑制细菌的滋生和繁殖。

唾液样品DNA的提取方法：

(1)取500μL保存过程中的唾液，加入300μLTENS裂解液(200mMNaCl,100mMTris-HCl,pH8.0,2.0％SDS,50mMEDTA,0.5％TritonX-100)或细胞裂解液(10mMTris-HCl，400mMNaCl，2mMEDTA-Na2，0.8M盐酸胍)和10μL20mg/μL的蛋白酶K，涡旋仪上震荡混匀，加入5μL10％SDS。

(2)将上述步骤(1)处理后的唾液进行56℃水浴处理30-60min。

(3)9000rpm离心10min，取上清。

(4)向上述步骤(3)的上清液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀后9000rpm离心10min，取上清。

(5)向上述步骤(4)的上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀后9000rpm离心10min，取上清。

(6)向上述步骤(5)的上清液体中加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀后沉淀1h。

(7)将上述液体13000rpm离心10min，弃上清。

(8)用800μL80％乙醇洗涤上述沉淀一次，13000rpm离心10min，弃上清。

(9)37℃晾干，用30μLEB缓冲液回溶，37℃温浴助溶10min。

(10)9000rpm离心5min，取上清，电泳检测，结果如图1所示。

结果显示：来源于两个个体的唾液样本保存1周、2周、3周、4周和2.5个月后提取得到的DNA电泳条带清晰锐利，没有弥散现象。说明使用本实施例制备的唾液保存液能够维持从不同个体获取的唾液样本在室温条件下保存至少2.5个月，并且完整性良好，因此本发明的唾液保存液可用于唾液样本的长期室温保存。

实施例2

本实施例研究了从提取到的基因组DNA进行PCR扩增10对看家基因的情况，使用实施例1中从个体1和个体2在唾液样本保存1周、2周、3周、4周和2.5个月后提取得到的DNA作为PCR扩增模板进行实验。

实验中使用的10对看家基因扩增引物列表如下：

表1

PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：

95℃4min；95℃40s，58℃30s，72℃50s，34个循环；72℃10min；16℃∝。

图2为个体1的唾液样本使用实施例1的唾液保存液保存2.5个月后提取的基因组DNA为模板，以上述10对看家基因的扩增引物进行PCR扩增得到的琼脂糖凝胶电泳图。结果显示：10对看家基因的引物均扩增出与预期大小相符的清晰的片段，说明唾液样本使用实施例1的唾液保存液保存2.5个月后提取的基因组DNA完整，并且基本无外源细菌等微生物污染影响。

实施例3

本实施例参考实施例1的制备方法分别制备低浓度和高浓度保存液，并以实施例1的唾液保存液为中浓度保存液，使用这三组保存液分别保存两个个体(个体1和个体2)的唾液样本1周、2周、3周和4周后提取DNA，进行打断、随机高通量测序和比对，研究外源性细菌等微生物的污染情况。

本实施例中，低浓度保存液包括如下组分和含量：氯化锂0.1mol/L，Tris-HCl1mmol/L，尿素0.1mol/L，SDS0.1％(w/v)，EDTA1mmol/L，乙醇10％(v/v)，体系pH为7.0。高浓度保存液包括如下组分和含量：氯化锂1.2mol/L，Tris-HCl42mmol/L，尿素1.2mol/L，SDS1.2％(w/v)，EDTA6mmol/L，乙醇60％(v/v)，体系pH为8。

使用低浓度、中浓度和高浓度保存液分别保存个体1和个体2的唾液样本1周、2周、3周、4周和2.5个月后，按照实施例1的方法提取基因组DNA。电泳检测DNA完整性，结果显示使用低浓度和高浓度保存液保存的唾液样本DNA电泳条带清晰锐利，没有弥散现象，与使用中浓度保存液保存的唾液样本DNA电泳条带(图1)没有明显差别，说明DNA完整性好。

取200ng基因组DNA构建300bp插入片段的PE文库，进行Hiseq-2000平台双末端测序：

(1)取200ng基因组DNA，用covaris仪器打断到主带在300bp长度。使用“microtube”打断样品，所用的参数“Dutycycle”、“Intensity”、“CycleBurst”分别设置均为20％、5、200，打断时间为45s。

(2)采用如下反应体系对上述打断的片段进行末端序列的补平：

反应组分	单个组分用量(μL)
		DNA	30
ddH2O	45
		PNK Buffer	10
dNTP	4
		T4 DNA聚合酶	5
T4 PNK	5
		Klenow片段	1
酶反应	20℃30min

(3)采用如下反应体系对上述片段进行3’末端序列加dATP：

反应组分	单个组分用量(μL)
		DNA	32
Blue Buffer	5
		dATP	10
Klenow(3’to5’exo)	3
		酶反应	37℃30min

(4)采用如下反应体系对上述片段连接PCR接头序列，并进行片段选择：

反应组分	单个组分用量(μL)
		DNA	10
连接缓冲液	25
		接头	10
连接酶	5
		酶反应	20℃15min

其中，接头序列：

一链：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO：21)；

二链：GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG(SEQIDNO：22)。

(5)采用如下反应体系对上述片段进行PCR扩增及Agilent2100和QPCR进行PCR扩增：

反应组分	单个组分用量(μL)
		DNA	5
ddH2O	18
		2×phusion HF master mix	25
引物1	1
		引物2	1

PCR反应程序如下：

98℃30s；98℃10s，65℃30s，72℃30s，10个循环；72℃5min；4℃∝

其中，引物序列如下：

引物1：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO：23)；

引物2：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO：24，NNNNNNNN为标签序列，即在引物合成时加入一小段已知的序列，不同的样品用带有不同标签序列的引物进行PCR后，建成的文库可混合上机，再根据不同标签序列，对数据进行拆分分析)。

(6)上机测序，测序读段对(reads)经过过滤处理后比对到NCBI数据库的humangenome19数据库，计算比对回人基因组的reads比例(％)，比对结果如表2所示。

表2

结果显示：三组保存液均能较好的保持唾液样品免受外源性细菌等微生物的污染，其中以中浓度保存液保存的唾液样品提取的基因组DNA比对回人类基因组的比率最高，说明它基本无外源细菌等污染影响。

实施例4

本实施例通过对比试验研究了实施例1的唾液保存液中各种组分的必要性情况。

首先，以实施例1中唾液保存液为基础，分别缺少其中一种组分的保存液作为对比，参照实施例1的方法配制各对比液(表3)。

表3

然后，使用各对比液1-6和实施例1的保存液保存人体唾液1周后，提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。结果如图3所示，可见使用实施例1的保存液保存人体唾液1周后提取的基因组DNA条带清晰，而使用对比液1-6保存人体唾液1周后提取的基因组DNA条带不清晰，有弥散现象，说明DNA完整性受到破坏。证明本发明中的尿素、氯化锂、Tris-HCl、SDS、EDTA和乙醇六种组分对于保存液稳定保持唾液样品中DNA的稳定性均是必须的，只有均含有六种组分的情况才能产生明显的协同作用。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种唾液保存液，其特征在于，包括如下组分和含量：氯化锂0.1-2mol/L，Tris-HCl1-50mmol/L，尿素0.1-2mol/L，SDS0.1-2%（w/v），EDTA1-10mmol/L，乙醇10-90%（v/v），体系pH范围在7-10之间。

2.根据权利要求1所述的唾液保存液，其特征在于，包括如下组分和含量：氯化锂0.1-1.2mol/L，Tris-HCl1-42mmol/L，尿素0.1-1.2mol/L，SDS0.1-1.2%（w/v），EDTA1-6mmol/L，乙醇10-60%（v/v），体系pH范围在7-8.5之间。

3.根据权利要求1所述的唾液保存液，其特征在于，包括如下组分和含量：氯化锂0.5-1mol/L，Tris-HCl20-35mmol/L，尿素0.5-1mol/L，SDS0.5-1%（w/v），EDTA1-5mmol/L，乙醇20-50%（v/v），体系pH范围在7-8之间。

4.根据权利要求1所述的唾液保存液，其特征在于，包括如下组分和含量：氯化锂0.67mol/L，Tris-HCl33mmol/L，尿素0.67mol/L，SDS0.6%（w/v），EDTA3.3mmol/L，乙醇30%（v/v），体系pH范围在7-8之间。

5.根据权利要求1-4任一项所述的唾液保存液，其特征在于，所述唾液保存液的溶剂为无菌水。

6.根据权利要求1-4任一项所述的唾液保存液，其特征在于，所述唾液保存液还包括苯扎氯铵和/或苯甲醇。

7.根据权利要求6所述的唾液保存液，其特征在于，所述唾液保存液包含苯扎氯铵0.01-5%（w/v），苯甲醇10%-90%（v/v）。

8.一种制备权利要求1-7任一项所述的唾液保存液的方法，其特征在于，包括：

（1）按照终浓度的要求，分别称量尿素和氯化锂，量取正确体积的Tris-HCl母液、SDS母液、EDTA母液和乙醇，混合后搅拌溶解均匀，用无菌水定容；

（2）调节步骤（1）所得溶液的pH至目的范围，然后用微孔滤膜过滤除菌，得到所述唾液保存液。

9.如权利要求1-7任一项所述的唾液保存液在保存唾液中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述唾液为人体唾液。