CN115418348A - 一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及细胞生物学技术领域，具体公开了一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法。本申请提供的膜积液间充质干细胞的提取与培养方法包括以下步骤：滑膜积液预处理、计数、培养；滑膜积液预处理：在无菌条件下，将所述滑膜积液置于离心管，然后加入滑膜积液体积的4‑6倍生理盐水进行稀释，获得滑膜积液稀释液；然后将所述滑膜积液稀释液用滤网进行过滤，过滤完毕并用生理盐水对滤网进行冲洗，获得干细胞滤液。本申请能够从人体滑膜积液废弃物中有效提取获得间充质干细胞，且获得的滑膜积液间充质干细胞能够诱导分化为成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞，因此在再生细胞生物学领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本申请涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法。
背景技术
近年来，随着再生细胞生物学技术的不断发展，干细胞在再生医学领域运用越来越广泛。由于干细胞可诱导分化为多种组织细胞，例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪等，因此，利用其诱导分化功能可以实现对患者骨和软骨缺损、中枢和周围神经损伤、股骨头缺血坏死、皮肤及血管损伤等疾病的修复。
干细胞从发育阶段大体可以分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类，胚胎干细胞的来源非常有限，且受伦理争议限制，故使用时存在很多阻碍；而成体干细胞的来源广泛、诱导分化效果好。成体干细胞按照来源可分为异源干细胞、异体干细胞和自体干细胞，异源干细胞来源于动物体内，因此不适用于人体治疗；异体干细胞虽已证明排斥反应等可能性较低，安全性可以保证，但是还是有很多受众介意异体移植；自体干细胞虽来源于人体自身的骨髓、脂肪等，但是其获取的过程会对人体造成二次创伤。
因此，寻找一种新型来源、成本较低、无二次创伤的异体干细胞是本领域的研究重点。
发明内容
为了避免上述成体干细胞在获取或使用过程中造成的问题，本申请提供一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法。
第一方面，本申请提供一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，采用如下的技术方案：
一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，包括以下步骤：滑膜积液预处理、计数、培养；
滑膜积液预处理：在无菌条件下，将所述滑膜积液置于离心管，然后加入滑膜积液体积的4-6倍生理盐水进行稀释，获得滑膜积液稀释液；然后将所述滑膜积液稀释液用滤网进行过滤，获得干细胞滤液；
所述滑膜积液间充质干细胞为人体滑膜积液间充质干细胞。
本申请选取人体滑膜积液作为间充质干细胞提取的来源，能够将膝关节受损或其他骨关节疾病患者体内的滑膜积液抽出，并通过本申请提供的方法进行提取与培养，可以获得滑膜积液间充质干细胞，该滑膜积液间充质干细胞具有诱导分化的功能，因此可用于修复人体组织缺失与疾病治疗。上述滑膜积液间充质干细胞来源容易、获取成本低、诱导分化效果好，因此在再生细胞生物学领域具有广泛的应用前景。
滑膜积液中含有大量的易引发炎症的杂质因子，该杂质因子会降低滑膜积液中间充质干细胞的活性、抑制滑膜积液间充质干细胞的生长与扩增。因此，本申请通过对滑膜积液进行预处理，可以大大降低滑膜积液中的杂质因子含量，进而减少后续滑膜积液间充质干细胞培养过程中杂质对间充质干细胞造成的影响，促进滑膜积液间充质干细胞快速生长与繁殖。
当人体膝关节因关节扭伤或关节损伤造成了滑膜血管翳，血液中的很多成分会渗出，从而会在关节腔内形成大量的关节积液，该关节积液即为滑膜积液，为实现滑膜积液的治疗，通常需要将滑膜积液抽出，抽出的滑膜积液通常被视为废弃物弃置。因此，本申请提供了一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，能够实现滑膜积液废弃资源的利用，然而滑膜积液中含有大量易引发炎症的杂质因子，若不将其去除，则会影响滑膜积液间充质干细胞的活性，还会降低滑膜积液间充质干细胞在移植后修复能力。因此，本申请通过对滑膜积液进行处理，能够将滑膜积液中的杂质去除，并将滑膜积液中的间充质干细胞提取出来，提取出的间充质干细胞能够定向诱导分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪等多种组织细胞，进而可用于骨和软骨缺损、皮肤和血管损伤等组织修复。
优选的，所述滤网的孔径≤50μm。
在一个具体的实施方案中，所述滤网的孔径可以为40μm或50μm。
本申请选用上述范围内孔径的滤网，能够最大程度上将滑膜积液间充质干细胞中的杂质因子去除，减少滑膜积液间充质干细胞中的杂质含量，为滑膜积液间充质干细胞创造良好生长的环境，促使其快速生长与繁殖。
进一步的，所述计数的具体步骤为：首先将所述干细胞滤液置于离心管中，400g离心10min，弃上清液；然后将沉淀物用生理盐水重悬，获得干细胞悬液；取少量所述干细胞悬液加入台盼蓝染液，并使用血球计数板在显微镜下进行计数。
进一步的，培养的具体步骤为：将所述干细胞悬液离心，弃上清液，然后利用培养基重悬，并置于36-38℃、3-7％CO2的细胞培养箱中依次进行原代培养与传代培养。
优选的，所述培养基包括基础培养基和替代物；所述基础培养基与所述替代物的重量比为100：(3-7)。
本申请采用的培养基为添加有替代物的基础培养基，该培养基能够为滑膜积液间充质干细胞提供营养基质与生存环境。替代物中含有大量的营养物质，因此本申请进一步将基础培养基与替代物的重量比控制在上述范围内，能够促进滑膜积液间充质干细胞更加快速地生长与繁殖，进而实现滑膜积液间充质干细胞的扩增。
在一个具体的实施方案中，所述基础培养基与替代物的重量比可以为100：3、100：5或100：7。
优选的，所述基础培养基与替代物的重量比为100：5。
进一步的，所述基础培养基选自MSCBM、MEM、α-MEM、DMEM-L、DMEM-H和DMEM-F12。
优选的，所述基础培养基为DMEM-L。
优选的，所述替代物选自EliteGro-Adv和PLUS Cell Cultur Supplement。
在一个具体的实施方案中，所述替代物可以为EliteGro-Adv或PLUS Cell CulturSupplement。
由于滑膜积液产生于高糖环境，故推测滑膜积液间充质干细胞适宜在高糖环境下生长。但是，发明人通过大量试验研究发现，滑膜积液间充质干细胞在高糖环境下的生长状态并不好，反而是低糖环境更适合滑膜积液间充质干细胞的生长。因此，本申请优选DMEM-L作为滑膜积液间充质干细胞的基础培养基，从而能够进一步促进滑膜积液间充质干细胞快速生长与繁殖。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请提供的滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法能够将人体滑膜积液中的间充质干细胞提取出来，并通过计数与培养实现滑膜积液间充质干细胞的扩增。上述滑膜积液间充质干细胞的提取方法简单、成本低、诱导分化效果好，将其用于人体组织修复，不会与人体不会发生免疫排斥反应，且组织相容性好，故在再生细胞生物学领域具有广泛的应用前景。
2.本申请经过提取与扩增获得的滑膜积液间充质干细胞能够定向分化为成脂细胞、成骨细胞与成软骨细胞，因此，可用于广泛用于骨和软骨缺损、皮肤和血管损伤等组织修复。
3.本申请将滑膜积液预处理步骤中滤网的孔径控制在≤50μm范围内，能够最大程度将滑膜积液中的杂质去除，进而促进滑膜积液间充质干细胞快速生长与繁殖；进一步的，本申请采用50μm的滤网进行过滤，能够最大程度地去除滑膜积液中的杂质，并最大限度地保留间充质干细胞。
4.本申请优选采用DMEM-L作为滑膜积液间充质干细胞的基础培养基，能够为滑膜积液间充质干细胞提供利于其生长的低糖环境，促进滑膜积液间充质干细胞生长与繁殖。
附图说明
图1是本申请提供的滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法流程图。
图2是实施例1获得的滑膜积液间充质干细胞在MSCBM基础培养基中(替代物为EliteGro-Adv)的生长情况。
图3是实施例9获得的滑膜积液间充质干细胞在DMEM-L基础培养基中(替代物为EliteGro-Adv)的生长情况。
图4是实施例10获得的滑膜积液间充质干细胞在DMEM-L基础培养基中(替代物为PLUS Cell Cultur Supplement)的生长情况。
图5是实施例11获得的滑膜积液间充质干细胞在DMEM-H基础培养基中(替代物为EliteGro-Adv)的生长情况。
图6是实施例12获得的滑膜积液间充质干细胞在DMEM-H基础培养基中(替代物为PLUS Cell Cultur Supplement)的生长情况。
图7是对比例1获得的滑膜积液间充质干细胞在MSCBM基础培养基中(替代物为EliteGro-Adv)的生长情况。
图8是对比例3获得的滑膜积液间充质干细胞在DMEM基础培养基中(替代物为尿激酶与小牛血清)的生长情况。
图9是实施例9获得的p2代滑膜积液间充质干细胞培养2天的细胞形态镜检图。
图10是实施例9获得的滑膜积液间充质干细胞的成脂诱导结果图。
图11是实施例9获得的滑膜积液间充质干细胞的成骨诱导结果图。
图12是实施例9获得的滑膜积液间充质干细胞的成软骨诱导结果图。
具体实施方式
本申请提供一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，具体包括以下步骤：
(1)滑膜积液预处理：抽取滑膜积液，在无菌条件下将滑膜积液置于离心管，然后加入滑膜积液体积的4-6倍生理盐水进行稀释，获得滑膜积液稀释液；然后将上述滑膜积液稀释液用滤网进行过滤，待过滤完毕，用生理盐水对滤网进行冲洗，获得干细胞滤液；其中，所述滤网的孔径≤50μm。
(2)计数：首先将所述干细胞滤液置于离心管中，400g离心10min，弃上清液；然后将沉淀物用生理盐水重悬，获得干细胞悬液；取少量所述干细胞悬液加入台盼蓝染液，并使用血球计数板在显微镜下进行计数。
(3)培养：将所述干细胞悬液离心，弃上清液，然后利用培养基重悬，并置于36-38℃、3％-7％CO2的细胞培养箱中进行原代培养；当细胞的密度达到80％～90％时，再接种于6孔板中进行传代培养；其中，所述培养基包括基础培养基和替代物；所述基础培养基与所述替代物的重量比为100：(3-7)。
进一步的，所述基础培养基可以为MSCBM、MEM、DMEM-L、或DMEM-H。所述替代物可以为EliteGro-Adv或PLUS Cell Cultur Supplement。
本申请实施例中的滑膜液取自某医院骨科的志愿者；EliteGro-Adv为EliteGro-Adv(GMP)，购自北京达科为生物技术有限公司；PLUS Cell Cultur Supplement为MSCQualified PLUS Cell Cultur Supplement，购自上海维科生物技术有限公司；其余试剂、溶剂等均可通过商购获得。
以下结合实施例、对比例、检测试验及附图说明对本申请作进一步详细说明。
实施例
实施例1
实施例1提供一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法。
上述滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，具体包括以下步骤：
(1)滑膜积液预处理：首先从志愿者膝关节腔内采集滑膜积液于采集瓶中，对采集瓶外部用75％的酒精进行喷淋消毒，然后置于无菌工作台；在无菌工作台上，从采集瓶中取5mL滑膜积液置于50mL的离心管中，并向离心管加入25mL生理盐水进行稀释，即可获得滑膜积液稀释液；然后将上述滑膜积液稀释液用50μm的滤网进行过滤，过滤完毕并用生理盐水对滤网进行冲洗，获得的滤液为干细胞滤液。
(2)计数：将所述干细胞滤液置于50mL离心管中，400g离心10min，弃上清液；然后将沉淀物用40mL生理盐水重悬，获得干细胞悬液；取上述干细胞悬液9μL，并向其中加入1μL的4％台盼蓝染液，使用血球计数板在显微镜下进行计数，并估算上述干细胞悬液中的总细胞数量。
(3)培养：将上述干细胞悬液置于50mL离心管中，400g离心10min，弃上清液，获得的沉淀为p0细胞；然后用培养基重悬p0细胞，并置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行原代培养；
当p0细胞培养14天时，将细胞培养皿置于生物安全柜的操作台面上，将培养皿中所有物质装入离心管，在400g离心10min，弃上清液，获得的沉淀为p1细胞；再次用培养基重悬p1细胞，获得p1细胞悬液；取少量p1细胞悬液，用4％台盼蓝染液进行染色计数；观察染色后的细胞密度，然后将上述p1细胞悬液接种于6孔板中，放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行传代培养，当细胞密度达到80％～90％时即可进行下次传代。
其中，所述培养基为MSCBM基础培养基，培养基中还加入了EliteGro-Adv替代物；所述MSCBM基础培养基与所述EliteGro-Adv替代物的重量比为100：5。
实施例2
实施例2提供一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法。
上述实施例与实施例1的区别之处在于：滑膜积液预处理步骤中，采用的滤网的孔径为40μm。
实施例3
实施例3提供一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法。
上述实施例与实施例1的区别之处在于：滑膜积液预处理步骤中，采用的滤网的孔径为60μm。
实施例4
实施例4提供一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法。
上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例4的培养步骤采用的培养基中，MSCBM基础培养基与EliteGro-Adv替代物的重量比为100：3。
实施例5
实施例5提供一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法。
上述实施例与实施例1的不同之处在于：实施例4的培养步骤采用的培养基中，MSCBM基础培养基与EliteGro-Adv替代物的重量比为100：7。
实施例6-13
实施例6-13分别提供一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法。
上述实施例与实施例1的不同之处在于：培养步骤中，采用的培养基，具体如表1所示。注：实施例6-13中，基础培养基与替代物的重量比均为100：5。
表1实施例1、实施例6-13中采用的培养基
对比例
对比例1
对比例1提供一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法。
上述对比例与实施例1的区别之处在于：对比例1中的滑膜积液预处理步骤中，不进行过滤处理。
对比例1的滑膜积液预处理步骤如下：首先从志愿者膝关节腔内采集滑膜积液于采集瓶中，对采集瓶外部用75％的酒精进行喷淋消毒，然后置于无菌工作台；在无菌工作台上，从采集瓶中取5mL滑膜积液置于50mL的离心管中，并向离心管加入25mL生理盐水进行稀释，即可获得30mL滑膜积液稀释液。
(注：后续计数步骤中，直接采用上述滑膜积液稀释液进行计数与培养)
对比例2
对比例2提供一种滑膜来源间充质干细胞的提取与培养方法。
上述滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法具体包括以下步骤：
(1)制备滑膜水凝胶：从兔子的两个膝关节的髌上囊获得滑膜，将获得的滑膜切碎以获得滑膜切片，并用PBS清洗；然后将清洗后的滑膜切片悬于含有100μg/mL氨基甲基苯甲酸且溶解有1单位(unit)/mL凝血酶的DMEM培养基中，并将该DMEM培养基与含有40mmol/L氯化钙且溶解有0.5％纤维蛋白原的DMEM培养基以1:1(v/v)混合以形成滑膜水凝胶；
(2)提取与培养：将包含约200mg滑膜切片的10ml滑膜水凝胶放入100mm培养容器中，并在37℃下在加湿室中培养2小时，然后对其添加10mL初级生长培养基(90％DMEM-Ham's F12、10％胎牛血清、10ng/ml表皮生长因子(EGF)、2ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10ng/mL胰岛素样生长因子(IGF)和10μg/mL庆大霉素)，在37℃下在加湿室中培养14天。培养结束后，除去培养基，添加含有5000单位尿激酶和30％小牛血清的DMEM培养基，分解成纤维蛋白的水凝胶，然后进行离心分离(150g，5分钟)，获得p1代滑膜来源间充质干细胞。
(3)再次用添加含有5000单位尿激酶和30％小牛血清的DMEM培养基重悬细胞，获得p1代滑膜来源间充质干细胞悬液；取少量上述p1代滑膜来源间充质干细胞悬液，用4％台盼蓝染液进行染色计数。根据细胞密度将上述p1细胞悬液接种于6孔板中，放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行传代培养，当细胞密度达到80％～90％时即可进行下次传代。
对比例3
对比例3提供一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法。
上述滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法具体包括以下步骤：
(1)制备滑膜水凝胶：从志愿者膝关节腔内抽取滑膜积液，将获得的滑膜积液悬于含有100μg/mL氨基甲基苯甲酸且溶解有1单位(unit)/mL凝血酶的DMEM培养基中，并将该DMEM培养基与含有40mmol/L氯化钙且溶解有0.5％纤维蛋白原的DMEM培养基以1:1(v/v)混合，形成滑膜积液水凝胶；
(2)提取与培养：取上述滑膜积液水凝胶10mL放入100mm培养容器中，并在37℃下在加湿室中培养2小时，然后对其添加10mL初级生长培养基(90％DMEM-Ham's F12、10％胎牛血清、10ng/ml表皮生长因子(EGF)、2ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10ng/mL胰岛素样生长因子(IGF)和10μg/mL庆大霉素)，在37℃下在加湿室中培养14天。培养结束后，除去培养基，添加含有5000单位尿激酶和30％小牛血清的DMEM培养基，分解成纤维蛋白的水凝胶，然后进行离心分离(150g，5分钟)，获得p1代滑膜积液间充质干细胞。
(3)再次用添加含有5000单位尿激酶和30％小牛血清的DMEM培养基重悬细胞，获得p1代滑膜积液间充质干细胞悬液；取少量上述p1代滑膜积液间充质干细胞悬液，用4％台盼蓝染液进行染色计数。根据细胞密度将上述p1细胞悬液接种于6孔板中，放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行传代培养，当细胞密度达到80％～90％时即可进行下次传代。
检测试验
表面标记表型分析
利用CD73、CD90 CD105、CD34和CD45对实施例9获得的p4代细胞进行表面标记，然后利用流式细胞仪对其进行表面标记表型分析，并分别检测标记细胞的阳性率或阴性率，确定细胞属性。
注：当检测结果显示，CD73、CD90、CD105的阳性表达率不低于95％，CD34和CD45阴性表达率不高于2％时，即可确定该细胞为间充质干细胞。
实施例9获得的p4代细胞的表面标记表型分析结果如下表2所示：
表2实施例9获得的p4代细胞的表面标记表型分析结果
由上表可以看出，经过CD73、CD90和CD105标记的细胞呈现阳性，且阳性率均大于95％；经过CD34和CD45标记的细胞呈现阳性，且阳性率均小于2％；说明本申请获得的滑膜积液间充质干细胞表达CD73、CD90和CD105，不表达CD34和CD45。因此可以确定，实施例9获得的p4代细胞为滑膜积液间充质干细胞。
细胞生长情况
在显微镜下观察上述实施例1-13、对比例1-3中获得的p0代滑膜积液间充质干细胞培养11天的生长状态，结果如表3所示。
表3实施例1-13、对比例1-3获得的间充质干细胞的生长状态
根据实施例1-13及对比例1获得的细胞生长状况可知，对比例1获得的细胞的数量较少，且含有较多杂质；而本申请1-13提供的采用过滤步骤的滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法获得的细胞数量较多，说明过滤步骤能够将滑膜积液中的杂质因子去除，使滑膜积液间充质干细胞的生长不受干扰，进而促进其生长与繁殖。
根据实施例1-3、图2的结果可知，本申请选用孔径≤50μm的滤网进行过滤，能够最大程度上将滑膜积液中的杂质去除，进而可以获得数量较多的滑膜积液间充质干细胞。
根据实施例1、实施例4-5的结果可知，本申请将基础培养基与替代物的重量比控制在100：(3-7)的范围内，可以培养出较多数量、立体感强、分布均匀的滑膜积液间充质干细胞。
根据实施例6-13、图3-6的结果可知，实施例9与实施例10提供的滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法培养的p0代的细胞长势最好；实施例1、实施例6-8、实施例11-13提供的滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法培养的p0代的细胞生长一般。因此，说明本申请采用加入了EliteGro-Adv或PLUS Cell Cultur Supplement替代物的DMEM-L基础培养基对滑膜积液间充质干细胞进行培养，获得的滑膜积液间充质干细胞的长势最好。
细胞形态检测
在显微镜下观察实施例9中的p2代细胞培养3天的生长情况，结果如图9所示。
由上图可以看出，实施例9中的p2代滑膜积液间充质干细胞的状态成纤维状，生长趋势呈现涡旋状。
多向分化特性
对实施例9获得的p2代滑膜积液间充质干细胞进行诱导培养。
成脂诱导的具体方法为：取实施例9获得的p2代滑膜积液间充质干细胞，向其中加入成脂诱导培养基；诱导培养21天后，用油红O染色进行染色并观察。其中，成脂诱导培养基为
人脐带间充质干细胞成脂诱导分化试剂盒。
成骨诱导的具体方法为：取实施例9获得的p2代滑膜积液间充质干细胞，向其中加入成骨诱导培养基；诱导21天后，用，行茜素红染色进行染色并观察钙结节。其中，成骨诱导培养基为
人脐带间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒。
成软骨诱导的具体方法为：取实施例9获得的p2代滑膜积液间充质干细胞，向其中加入成软骨诱导培养基；诱导28天后，用阿尔新蓝染色细胞的细胞外基质并观察。其中，成软骨诱导培养基为
人脐带间充质干细胞成软骨脂诱导分化试剂盒。
上述成脂诱导培养基、成骨诱导培养基、成软骨诱导培养基均购自赛业(广州)生物科技有限公司。
本申请获得的滑膜积液间充质干细胞经上述成脂、成骨及成软骨诱导培养，结果如图7-9所示。
由图10可以看出，滑膜积液间充质干细胞经成脂诱导后可以看到大量的脂肪颗粒，表明本申请获得的滑膜积液间充质干细胞可以向脂肪细胞分化。
由图11可以看出，滑膜积液间充质干细胞经成骨诱导后，细胞出现大量的钙结节，表明本申请获得的滑膜积液间充质干细胞可以向成骨细胞分化。
由图12可以看出，滑膜积液间充质干细胞经成软骨诱导后，细胞大部分阿尔新蓝着色，表明本申请获得的滑膜积液间充质干细胞可以向成软骨细胞分化。
综上所述，本申请获得的滑膜积液间充质干细胞经定向诱导，能够向脂肪、成骨、成软骨分化，因此可广泛应用于组织修复。
皮肤缺损组织修复
对实施例9获得的滑膜积液间充质干细胞进行皮肤缺损组织修复试验。
(1)试验对象：6只新西兰大白兔皮肤缺损模型(皮肤缺损程度基本相同)，分为2组(试验组与空白对照组)，每组3只。
(2)试验方法：向试验组大白兔的皮肤缺损处注射实施例9获得的滑膜积液间充质干细胞；空白对照组不进行任何治疗；在第2、5、10、15天分别观察大白兔皮肤缺损出的愈合状况，并统计每组大白兔的平均愈合时间。
(3)试验结果：上述大白兔的愈合状况及平均愈合时间如表4所示。
表4大白兔的愈合状况及平均愈合时间统计结果
由上表可以看出，本申请获得的滑膜积液间充质干细胞能够在10天降皮肤缺损修复至≥85％，并在15d左右实现皮肤缺损的完整修复，说明滑膜积液间充质干细胞利于组织增生，促进皮肤缺损后的伤口愈合。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，其特征在于，包括以下步骤：滑膜积液预处理、计数、培养；
滑膜积液预处理：在无菌条件下，将所述滑膜积液置于离心管，然后加入滑膜积液体积的4-6倍生理盐水进行稀释，获得滑膜积液稀释液；然后将所述滑膜积液稀释液用滤网进行过滤，获得干细胞滤液；
所述滑膜积液间充质干细胞为人体滑膜积液间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，其特征在于，所述滤网的孔径≤50μm。
3.根据权利要求1所述的滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，其特征在于，所述计数的具体步骤为：首先将所述干细胞滤液置于离心管中，400g离心10min，弃上清液；然后将沉淀物用生理盐水重悬，获得干细胞悬液；取少量所述干细胞悬液加入台盼蓝染液，并使用血球计数板在显微镜下进行计数。
4.根据权利要求3所述的滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，其特征在于，所述培养的具体步骤为：将所述干细胞悬液离心，弃上清液，然后利用培养基重悬，并置于36-38℃、3-7%CO2的细胞培养箱中依次进行原代培养与传代培养。
5.根据权利要求4所述的滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和替代物；所述基础培养基与所述替代物的重量比为100：（3-7）。
6.根据权利要求5所述的滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，其特征在于，所述基础培养基选自MSCBM、MEM、α-MEM、DMEM-L、DMEM-H和DMEM-F12。
7.根据权利要求5所述的滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM-L。
8.根据权利要求5所述的滑膜积液间充质干细胞的提取与培养方法，其特征在于，所述替代物选自EliteGro-Adv和PLUS Cell Cultur Supplement。
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2022
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