CN106350481A - 骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的诱导分化方法 - Google Patents

骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的诱导分化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的诱导分化方法，在骨髓间充质干细胞培养基中添加诱导肽，利用诱导肽作用于培养的骨髓间充质干细胞，诱导其定向分化为心肌样细胞；所述诱导肽的序列如SEQ ID NO.1所示。诱导四周后，空白对照组和诱导组心肌样细胞诱导分化率分别为(1.6±0.2)％、(58.9±8.4)％，诱导组心肌样细胞诱导分化率显著提高。本发明提供的方法可以显著提高骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化，显著提高其分化率，有助于推动应用骨髓间充质干细胞治疗心肌损伤。

Description

骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的诱导分化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及骨髓间充质干细胞的诱导分化，具体涉及骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的诱导分化方法。
背景技术
心肌梗死后心肌细胞的自我修复能力极其有限，而近年来干细胞研究为坏死心肌的修复带来了新的希望。众多研究证实骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)移植可以改善心梗后心功能的恢复以及减少心室重构的发生率。
骨髓间充质干细胞是骨髓内除造血干细胞之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞。骨髓间充质干细胞有多向分化、自我更新、免疫耐受和调节宿主细胞存活等优势，又取材方便，易于诱导，已成为研究热点。
BMMSCs具有干细胞的特征，具备自我复制和多向分化潜能，体外在不同诱导条件下，能够向软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞、肌腱细胞、内皮细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞及心肌细胞等不同的细胞系分化。BMMSCs体外被诱导为不同细胞系分化的诱导条件是探讨疾病发生机制及防治研究的重点。随着干细胞研究的不断深入，BMMSCs在体外诱导、分化为心肌样细胞、用于细胞移植，为缺血性心肌病中晚期并发症的防治提供了新的治疗思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的诱导分化方法，以定向诱导骨髓间充质干细胞，提高向心肌样细胞分化的分化率。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的诱导分化方法：在骨髓间充质干细胞培养基中添加诱导肽，利用诱导肽作用于培养的骨髓间充质干细胞，诱导其定向分化为心肌样细胞；所述诱导肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述诱导肽浓度为5-15μmol/L。
优选地，所述骨髓间充质干细胞培养基为含10％胎牛血清的L-DMEM培养基。
所述的诱导分化方法包括骨髓间充质干细胞的分离和培养，再经诱导肽的诱导分化。
优选地，所述骨髓间充质干细胞的分离方法为：无菌超净台内预先准备2只无菌离心管，每只加入4ml淋巴细胞分离液；颈椎脱臼法将SD大鼠处死，取四肢长骨，浸泡于75％酒精5min；无菌超净台内分离出肱骨、胫骨以及股骨，分离两端骨骺，用不含胎牛血清的L-DMEM培养基反复冲洗骨髓腔并吹打混匀；将细胞悬液沿淋巴细胞分离液液面缓慢加入离心管中，1500r/min离心20min；沿液面吸中间云雾层，1500r/min离心10min，弃上清，加入5ml含10％胎牛血清的L-DMEM培养基，充分吹打混匀后，接种于无菌培养瓶培养。
优选地，所述骨髓间充质干细胞的培养方法为：接种于无菌培养瓶培养3d后对细胞首次换液，PBS洗两次，去除未贴壁的细胞，以后每3d换1次液；细胞长至80％融合时，用含2.5g/L胰蛋白酶消化，按1:1或1:2的比例传代。
优选地，骨髓间充质干细胞的诱导分化方法为：取第4代骨髓间充质干细胞使用含10％胎牛血清的L-DMEM培养基培养，培养基中添加5-15μmol/L诱导肽，培养24h后换为普通培养液继续培养4周；普通培养液为含10％胎牛血清的L-DMEM培养基，但不添加诱导肽。
上述诱导分化方法在提高骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的方法可以显著提高骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化，显著提高其分化率，有助于推动应用骨髓间充质干细胞治疗心肌损伤。
附图说明
图1：Western blotting法测定cTn I、Cx43表达的定性结果；
图2：Western blotting法测定cTn I表达的定量结果；
图3：Western blotting法测定Cx43表达的定量结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明的技术方案。未详细说明的实验方法均为本领域常规方法，未详细介绍的实验材料均为本领域技术人员可以获得的市售常规材料。
实施例1：诱导肽和强化肽的制备
诱导肽为多肽，强化肽为寡肽，多肽和寡肽的合成方法已经非常成熟，可以在实验室自己采用固相法合成，也可以直接委托给生物外包公司合成。
本发明中的涉及的多肽和寡肽均由本公司研发人员通过Fmoc法固相合成制备。
Fmoc法固相合成技术：合成反应按照从C端向N端进行，Rink介质上有自由氨基；每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-氨基酸；每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑(3:2:0.5)的混合物来封闭未连接的自由氨基，封闭反应10分钟；每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20％哌啶的二甲基甲酰胺，需15分钟；最后，所有氨基酸残基顺序连接后，用98％三氟乙酸从Rink介质上切割下来，切割在室温下进行2小时。
本发明诱导肽(SEQ ID NO.1所示)、强化肽A(Asn-Ile-His-Gly-Val-Trp-Phe)、强化肽B(Met-Lys-Gly-Ser-Thr-Glu)、强化肽C(Gln-Thr-Lys-Tyr-Asp-Ala-Leu)均经质谱鉴定无误。
实施例2：骨髓间充质干细胞的分离培养
分离培养包括如下步骤：
无菌超净台内预先准备2只无菌离心管，每只加入4ml淋巴细胞分离液；颈椎脱臼法将SD大鼠处死，取四肢长骨，浸泡于75％酒精5min；无菌超净台内分离出肱骨、胫骨以及股骨，分离两端骨骺，用不含胎牛血清的L-DMEM培养基反复冲洗骨髓腔并吹打混匀；将细胞悬液沿淋巴细胞分离液液面缓慢加入离心管中，1500r/min离心20min；沿液面吸中间云雾层，1500r/min离心10min，弃上清，加入5ml含10％胎牛血清的L-DMEM培养基，充分吹打混匀后，接种于无菌培养瓶培养。接种于无菌培养瓶培养3d后对细胞首次换液，PBS洗两次，去除未贴壁的细胞，以后每3d换1次液；细胞长至80％融合时，用含2.5g/L胰蛋白酶消化，按1:1或1:2的比例传代。
骨髓间充质干细胞的鉴定：
1、细胞形态学鉴定：每天在倒置相差电子显微镜下观察细胞生长状况和形态学变化。
2、免疫荧光鉴定：将传至第4代骨髓间充质干细胞用无菌PBS洗3次后加入2.5g/L胰蛋白酶消化3min，加入含10％胎牛血清的L-DMEM培养基终止消化，滴管吹打使细胞形成细胞悬液，离心，800r/min，5min，PBS洗2次重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，移至2.0ml EP管中，每管100μl，分别加入FITC-抗大鼠-CD44单克隆抗体、PE-抗大鼠/小鼠-CD29单克隆抗体、PE-抗大鼠-CD45单克隆抗体，终浓度分别为12.5μg/ml、10μg/ml、10μg/ml，4℃避光孵育30min，离心，PBS洗2次。每组加400μl PBS，吹打制成单细胞悬液。用流式细胞仪检测各组细胞中FITCPE红色荧光和绿色荧光阳性表达率。
鉴定结果：
1、形态学鉴定结果：刚分离的骨髓间充质干细胞为圆形，折光性较强，悬浮于培养液中。3d首次换液之后，大多数细胞呈贴壁生长，细胞大小均一，呈短梭形，有三角形，也有星形，从胞质伸出长短、粗细不一的突起，10d左右后形成数个细胞集落，向四周扩散。传代后细胞体积明显变大，为长梭形，混杂少量多角形细胞，细胞排列紊乱。传4代后，骨髓间充质干细胞排列紧密，细胞形态趋于一致。
2、免疫荧光鉴定结果：检测骨髓间充质干细胞表面特异性标志物CD29(+)、CD44(+)和CD45(-)。结果显示骨髓间充质干细胞CD29阳性表达率为(95.6±2.9)％，CD44阳性表达率为(93.7±1.8)％，而CD45阳性表达率为(2.3±0.4)％。结果与文献报道一致，证明上述方法可分离大鼠骨髓间充质干细胞，经传代培养扩增，可得到纯化的骨髓间充质干细胞。
实施例3：骨髓间充质干细胞的诱导分化
取实施例2中第4代骨髓间充质干细胞使用含10％胎牛血清的L-DMEM培养基培养，培养基中添加10μmol/L的诱导肽，培养24h后换为普通培养液继续培养4周；所述普通培养液为含10％胎牛血清的L-DMEM培养基，但不添加诱导肽。该组为诱导组。
同时设置空白对照组，空白对照组与诱导组的区别仅在于培养基中不添加诱导肽。
检测方法：
1、免疫细胞化学检测：
将诱导组和空白对照组细胞培养4周后爬片4℃预冷的丙酮固定20min，将片用中性树胶固定到载玻片上，风干，0.3％Triton-X100透膜3min，PBS冲洗2次，孵育cTnI抗体，浓度80μg/ml，4℃过夜，PBS冲洗2次，加入相应二抗，37℃孵育1h，PBS冲洗2次，Hoechst 33258常温孵育3min，PBS洗2次，风干，用甘油封片并在荧光显微镜下观察拍照。
2、Western blot检测：
将诱导组和空白对照组细胞培养4周后进行铺板，PBS洗2次，加入细胞裂解液，提取总蛋白。配胶、上样、电泳，溴酚蓝指示染料绿色条带移至距下端1cm时停止电泳并转膜，立春红染色后，剪出目的条带。用抗体稀释液稀释一抗(β-tublin 1:3000，CX43 1:5000，cTnI1:3000)，4℃过夜。TBST摇洗3次，孵相应二抗，37℃震荡孵育40min，TBST摇洗3次，加入显影液，放入凝胶成像系统中曝光并照相。结果以与β-tublin的灰度值比值来表达。
3、流式细胞计数:
将诱导组和空白对照组细胞培养4周后，胰蛋白酶消化并离心，调细胞悬液密度约至1×106个/ml，0.3％Triton-X100透膜3min，PBS冲洗2次，孵cTnI抗体，浓度80μg/ml，室温40min，PBS冲洗2次，再孵相应二抗，37℃避光40min，PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定20min。流式细胞仪检测FITC阳性标记细胞百分比。
检测结果：
1、骨髓间充质干细胞诱导4周后，呈束状排列，方向趋于一致，并出现“肌岛”样结构。
2、免疫细胞化学检测结果：空白对照组在诱导4周时不表达cTnI，免疫荧光染色阴性，诱导组表达cTnI，表达cTnI的细胞质内呈绿色荧光，细胞核染色为蓝色荧光。
3、Western blot检测结果：诱导组和空白对照组均表达cTnI、CX43，但是空白对照组表达量低，诱导组表达量明显较高，与空白对照组具有显著性差异(P＜0.01)。结果见图1-3。
4、流式细胞计数结果：诱导四周后，空白对照组和诱导组心肌样细胞诱导分化率分别为(1.6±0.2)％、(58.9±8.4)％，诱导组心肌样细胞诱导分化率显著提高。
研究中还发现，下述寡肽还可以增强诱导肽的诱导能力，分别为：强化肽A、强化肽B、强化肽C。这些强化肽本身不具有诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用，但是，可以显著提高诱导肽诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的分化率。已知使用10μmol/L的诱导肽作用于骨髓间充质干细胞后，可以将心肌样细胞诱导分化率从(1.6±0.2)％提高到(58.9±8.4)％。实验发现，使用5μmol/L的诱导肽再配合使用0.4μmol/L的强化肽A或强化肽B或强化肽C，心肌样细胞诱导分化率可以分别达到(74.5±9.1)％、(78.2±8.8)％、(73.3±8.5)％。但是，仅在培养基中添加0.4μmol/L的强化肽A或强化肽B或强化肽C时，心肌样细胞诱导分化率仅为1.5％-1.9％，与空白对照组没有显著性差异。
上述实验表明，本发明提供的方法可以显著提高骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化，显著提高其分化率，有助于推动应用骨髓间充质干细胞治疗心肌损伤。
上述实施例的作用仅在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (8)

1.一种骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的诱导分化方法，其特征在于：在骨髓间充质干细胞培养基中添加诱导肽，利用诱导肽作用于培养的骨髓间充质干细胞，诱导其定向分化为心肌样细胞；所述诱导肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的诱导分化方法，其特征在于：所述诱导肽浓度为5-15μmol/L。
3.根据权利要求1所述的诱导分化方法，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞培养基为含10％胎牛血清的L-DMEM培养基。
4.根据权利要求1所述的诱导分化方法，其特征在于：该方法先对骨髓间充质干细胞进行分离和培养，再经诱导肽诱导分化。
5.根据权利要求4所述的诱导分化方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞的分离方法为：无菌超净台内预先准备2只无菌离心管，每只加入4ml淋巴细胞分离液；颈椎脱臼法将SD大鼠处死，取四肢长骨，浸泡于75％酒精5min；无菌超净台内分离出肱骨、胫骨以及股骨，分离两端骨骺，用不含胎牛血清的L-DMEM培养基反复冲洗骨髓腔并吹打混匀；将细胞悬液沿淋巴细胞分离液液面缓慢加入离心管中，1500r/min离心20min；沿液面吸中间云雾层，1500r/min离心10min，弃上清，加入5ml含10％胎牛血清的L-DMEM培养基，充分吹打混匀后，接种于无菌培养瓶培养。
6.根据权利要求5所述的诱导分化方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞的培养方法为：接种于无菌培养瓶培养3d后对细胞首次换液，PBS洗两次，去除未贴壁的细胞，以后每3d换1次液；细胞长至80％融合时，用含2.5g/L胰蛋白酶消化，按1:1或1:2的比例传代。
7.根据权利要求6所述的诱导分化方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞的诱导分化方法为：取第4代骨髓间充质干细胞使用含10％胎牛血清的L-DMEM培养基培养，培养基中添加5-15μmol/L的诱导肽，培养24h后换为普通培养液继续培养4周；所述普通培养液为含10％胎牛血清的L-DMEM培养基，但不添加诱导肽。
8.权利要求1-7任一所述的诱导分化方法在提高骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化方面的应用。
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