JP2016507231A - 幹細胞を使用する歯様構造物の調製 - Google Patents

Abstract

歯様構造物の調製における幹細胞の使用が提供されている。培地、上皮様細胞を調製するための方法、エナメル芽細胞を調製するためのキット、エナメル芽細胞を調製するための方法も提供されている。具体的には、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である基礎培地、Ｎ２サプリメント、レチノイン酸、およびＢＭＰ−４を含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
無し。

本開示は、バイオテクノロジーの分野に関し、特に、本開示は、歯様構造物の調製における幹細胞の使用、培地、上皮様細胞を調製するための方法、エナメル芽細胞を調製するためのキット、エナメル芽細胞を調製するための方法に関する。

ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）の分化産物は、疾患、傷害、および加齢、例えば、パーキンソン病、ベータ−サラセミア、肝疾患、および脊髄損傷などの動物モデルにおいて首尾よく使用されている。

しかし、固形臓器または歯などの組織は、ヒトｉＰＳＣでまったく生成されていない。

これを考慮して、本開示は、歯様構造物の調製における幹細胞の使用、培地、上皮様細胞を調製するための方法、エナメル芽細胞を調製するためのキット、エナメル芽細胞を調製するための方法を提供することを対象とする。

本開示の第１の態様では、本開示の一実施形態によれば、歯様構造物の調製における幹細胞の使用が提供されうる。一実施形態では、歯様構造物は、異種移植によって哺乳動物内で生成される。一実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、ブタ、イヌ、およびサルからなる群から選択される少なくとも１種である。一実施形態では、幹細胞が、異種移植の前に上皮様細胞を形成するように誘導されうる。一実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である。一実施形態では、人工多能性幹細胞は、ヒト細胞から産生させることができ、ヒト細胞は、尿細胞、皮膚線維芽細胞、および歯周靱帯幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種でもよい。一実施形態では、歯様構造物は、エナメル芽細胞を含有する。

「歯様構造物」の用語は、組織学切片で識別することができ、ヒト特異的抗体ヒト白血球抗原−Ｉ（ＨＬＡ−Ｉ、１：５０、ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ７０３２８）およびヒト核抗原（ｈＮＡ、１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号１９６９０９８）で染色され、歯様構造物中のヒト細胞の構造および誘導体を示すことができる。アメロブラスチン（Ａｍｅｌ、１：１００、Ｓａｎｔａ、カタログ番号ｓｃ−５０５３４）での免疫組織化学染色を使用して、ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣに由来する上皮シートによって生成される歯様構造物中のエナメル分泌エナメル芽細胞の外観を記述することができる。

本開示の第２の態様では、培地が提供されうる。本開示の一実施形態によれば、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である基礎培地、Ｎ２サプリメント、レチノイン酸、およびＢＭＰ−４を含みうる。一実施形態では、培地は、約１ｗｔ．％のＮ２サプリメント、１μＭのレチノイン酸、および約２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４を含みうる。本発明者らは意外にも、上記に引用した培地を有効に使用して、上皮様細胞への幹細胞の分化を誘導することができることを見出す。上皮様細胞を動物の体内にさらに移植して、歯様構造物を形成することができる。

本開示の第３の態様では、上皮様細胞を調製するための方法が提供されうる。本開示の一実施形態によれば、本方法は、上述した培地を使用して、幹細胞を培養して幹細胞の上皮様細胞への分化を誘導するステップを含むことができ、幹細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である。本発明者らは意外にも、方法は、上記に引用した培地を使用し、次いで本方法を有効に使用して、上皮様細胞への幹細胞の分化を誘導することができることを見出す。上皮様細胞は、動物の体内にさらに移植されて、歯様構造物を形成することができる。本開示の一実施形態によれば、人工多能性幹細胞は、ヒト細胞から産生される。本開示の一実施形態によれば、ヒト細胞は、尿細胞、皮膚線維芽細胞、および歯周靱帯幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種である。当業者は、２つの異なるシステム：１）ｐＭＸベースレトロウイルスシステム（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ、Ａｄｄｇｅｎｅ）；２）ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡエピソームベクター（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２ ＳＶ４０ＬＴ、Ｋｌｆ４、およびｍｉＲ３０２／３６７）を用いた電気穿孔によってヒト尿細胞から「ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）」を得ることができる。当業者は、ｐＭＸベースレトロウイルスシステム（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ、Ａｄｄｇｅｎｅ）によってヒト皮膚線維芽細胞および歯周靱帯から「ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）」を得ることができる（参照により本明細書に組み込まれている、Ｅｓｔｅｂａｎ，Ｍ．Ａ．ら、Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．、２０１０：６、７１〜９；Ｃａｉ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２０１０：２８５、１１２２７〜３４）。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培養条件下で、ｈｉＰＳＣは、細胞モルフォロジー、増殖特性、表面マーカー発現、奇形腫形成、および多系列ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化においてｈＥＳＣと非常に類似している。

一実施形態では、本明細書に記載の「ヒト尿細胞」は、好ましくは、適切な滅菌された容器（最大５００ｍｌまで）内に１５０〜２００ｍｌで中間尿のみから収集される細胞である。一実施形態では、ヒト尿細胞は、以下の手順によって得ることができる。尿試料を４００ｇで室温にて１０分間遠心分離し、次いでアンホテリシンＢおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＰＢＳ中に再懸濁させた。ＰＢＳで洗浄した後、尿試料に由来する細胞ペレットを、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ １：１（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０ｗｔ．％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＰＡＡ）、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ Ｋｉｔ ＣＣ−４１２７ ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ）、アンホテリシンＢ、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有する一次培地中で培養する。培地を、最初の２日の間、少量で保持する。翌日に、培地をＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ Ｋｉｔ ＣＣ−４１２７ ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ）を含有するＲＥＢＭ（Ｒｅｎａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｂａｓａｌ ２ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｏｎｚａ）培地に変更した。目に見える細胞／コロニーは、平均で１試料当たり一般に３〜５個、３〜６日後にごく普通に出現した。最初の完全な培地変更は、最初の細胞／コロニーが見られた後に行った。次いで、培養物が増殖してコンフルエントになったとき、細胞を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．２５％トリプシンによって補助されたより大きい表面上に分割した。ＲＰＴＥＣを生検から得、尿細胞培地中で維持した。

一実施形態では、本明細書に記載の「皮膚線維芽細胞」は、好ましくは、ヒト皮膚組織の小片から収集される細胞である。一実施形態では、皮膚線維芽細胞は、以下の手順によって得ることができる。皮膚組織を刻んで小組織キューブにし、次いで１０ｗｔ．％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００単位／ｍＬのペニシリンストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＤＭＥＭ中に蒔いた。皮膚ケラチノサイトが皮膚組織の小片周囲に最初に出現する。皮膚線維芽細胞がその後産生された。Ｐ３〜Ｐ５世代の細胞を使用することができる。

一実施形態では、本明細書に記載の「歯周靱帯幹細胞」は、好ましくは、歯根表面の３分割の中央から分離されたヒト歯周靱帯（ＰＤＬ）組織から収集される細胞である。一実施形態では、歯周靱帯幹細胞は、以下の手順によって得ることができる。ＰＤＬ組織を刻んで小組織キューブ（およそ１ｍｍ^３）にし、α−最小必須培地（α−ＭＥＭ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｒｏａｄ Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）中で、４ｍｇ／ｍＬディスパーゼを含む３ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（タイプＩ）（ともにＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ製）の溶液で、勢いよく振盪させて３７℃で１５分間消化した。次いで組織外植片を、１０ｗｔ．％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．２９２ｍｇ／ｍＬのグルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００単位／ｍＬのペニシリンストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、および１００μｍ／Ｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したα−ＭＥＭ中に蒔き、培養した。単細胞由来コロニー培養物を、限界希釈技法を使用して得、０代（Ｐ０）細胞を培養した。長期の培養に伴う細胞挙動の変化を回避するために、Ｐ３〜Ｐ５世代の細胞を使用することができる。

一実施形態では、本明細書に記載の「胚性幹細胞」は、好ましくは、ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ ＩＮ ＵＳＡから購入したＨ１ ＥＳＣ株であり、これらは、マトリゲルコートプレート上で、ｍＴｅｓＲ１培地中で、３〜５日毎の継代でその多能性を維持される。

本開示の第４の態様では、エナメル芽細胞を調製するためのキットを提供することができ、キットは、上述した培地である第１の培地、ＦＢＳ、非必須アミノ酸、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地である第２の培地を含み得、第１の培地および第２の培地は、それぞれ異なる容器で提供される。本発明者らは意外にも、キットをエナメル芽細胞を調製するのに使用することができることを見出す。本開示の一実施形態によれば、キットは、第３の培地をさらに含み得、これは、ｍＴｅＳＲ１（商標）培地、Ｅ８培地、およびＫＳＲ馴化培地から選択される少なくとも１種である。本開示の一実施形態によれば、第２の培地は、約１０ｗｔ．％のＦＢＳ、約２ｍＭのグルタミン、約０．１ｍＭの非必須アミノ酸、約１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを含む。

一実施形態では、上皮様細胞は、上皮シートを形成しうる。一実施形態では、分化細胞は、分化中の７日目（Ｄ７）およびＤ１４に無傷の上皮シートとして回収することができる。上皮シートの小片は、分化中のＤ２１に得ることができる。一実施形態では、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの両方に由来する分化上皮細胞は、多能性細胞マーカーＯｃｔ４、上皮マーカーＫ１８、ｐ６３、Ｋ１９、ＣＤ２９、およびＫ１４の発現で同定することができ、電子顕微鏡（ＥＭ）下で観察されうる。

本開示に記載されるように、幹細胞に由来する無傷の上皮シートは、歯の間葉を用いた組換えによってさらに誘導されて歯様構造物を形成することができる。

本開示の第５の態様では、エナメル芽細胞を調製するための方法を提供することができ、本開示の一実施形態によれば、本方法は、上述した方法によって上皮様細胞を調製するステップと、第１の動物の歯の間葉で上皮様細胞を組み換えて組換え標本を得るステップと、得られた組換え標本を培養して再構成された外植片を得るステップと、所定時間にわたって第２の動物内に再構成された外植片を移植してエナメル芽細胞を形成するステップとを含みうる。

図１は、本開示の一例におけるｈＥＳＣ、および尿細胞由来ｈｉＰＳＣからの歯生成の手順の略図を示す。ｈＥＳＣ、およびヒト尿細胞由来ｉＰＳＣから歯を再生するためにキメラ培養系が展開される。簡単に言えば、図１を参照すると、ｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣを誘導して、再構成プロセスでＥ１４．５マウス歯上皮を取り替えることができる上皮シートを生成することができる。次いで再構成された外植片を１〜２日間ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、３週間（２週間以上）にわたってマウス腎被膜下（ｓｕｂｒｅｎａｌ ｃａｐｓｕｌｅ）に移植し、歯を再生させることができる（図１）。

本開示の一実施形態によれば、幹細胞は、上述した培地を使用して、約５〜１０日間、好ましくは約７日間培養される。本開示の一実施形態によれば、第１の動物および第２の動物は、それぞれマウス、ラット、ブタ、イヌ、およびサルからなる群から独立して選択される。本開示の一実施形態によれば、第２の動物は、好ましくは免疫不全のものであり、それは、動物にある用量のシクロスポリンＡを投与することによって引き起こすことができる。本開示の一実施形態によれば、第１の動物は、胎児マウスであり、第２の動物は、ヌードマウスである。本開示の一実施形態によれば、歯の間葉は、歯胚から機械的に分離され、歯胚は、分離の前にプロテアーゼを使用して消化される。本開示の一実施形態によれば、プロテアーゼは、約０．７５ｍｇ／ｍｌのディスパーゼである。本開示の一実施形態によれば、得られた組換え標本は、ＦＢＳ、非必須アミノ酸、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充されたＤＭＥＭ培地を使用して培養される。本開示の一実施形態によれば、組換え組織は、ヌードマウスの腎臓被膜の下の空間に移植される。本開示の一実施形態によれば、所定時間は、約２〜４週間である。本開示の一実施形態によれば、所定時間は、約３週間である。本開示の一実施形態によれば、幹細胞は、上皮様細胞を調製する前に、ｍＴｅＳＲ１（商標）培地、Ｅ８培地、およびＫＳＲ馴化培地から選択される少なくとも１種を使用して培養され、培地は、培養された幹細胞が約６０〜８０％のコンフルエンスに到達するとき、上皮様細胞を得るために上述した培地と取り替えられる。上述した方法を有効に使用してエナメル芽細胞を産生することができることが本発明者らによって意外にも見出された。エナメル芽細胞は、歯様構造物中に含有されうる。組織診断検査、その後の脱灰を用いて、本発明者らは、歯様構造物が歯髄、象牙質、エナメルスペース、およびエナメル器を含有することを見出す。ラマン分光法およびナノインデンテーション法を用いて、本発明者らは、歯様構造物がエナメル質および象牙質の両方において成人の歯と類似の組成を有することを見出す。胚性幹細胞から形成される再生歯様構造物中のエナメル質の硬度は、成人の歯のものの８分の１に到達する場合があり、ｉＰＳＣから形成される再生歯様構造物中のエナメル質の硬度は、成人の歯のものの４分の１〜３分の１に到達しうる。本開示の実施例で得られた歯様構造物は、物理的性質、例えば、ナノインデンテーションによる弾性係数および硬度、ならびにラマン分光法による構成要素などによって確認された。

ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）は、多くの細胞型、例えば、ケラチノサイト、神経幹細胞、脂肪幹細胞、髄膜由来の細胞（ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｙｔｅ）、骨膜（ｐｅｒｉｏｓｔｅａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、および胚外組織などから効率的に再プログラムされうることが公知であった。本発明者らは、興味深いことに、腎臓が、その全表面が皮膚より大きい、細管の広範なネットワークを含有することを見出す。正常な生理機能の一部として、この管状システムおよび尿路の下流部（尿管、膀胱、および尿道）からおよそ２０００〜７０００細胞が脱離し、毎日尿中に排泄される。尿細胞と以下で呼ばれるこれらの細胞は、損傷していないだけでなく、完全に機能的であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で使用されうる。加えて、これらは、医学的支援を伴うことなくどこでも収集することができ、容易に増やされる。

当業者は、任意の公知の方法によって尿中に存在する尿細管細胞（ヒト尿細胞（ｈＵ）とも呼ばれる）からヒトｉＰＳＣを生成することができる。例えば、当業者は、再プログラム化因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃのレトロウイルスベクターを使用してｉＰＳＣを生成することができる。より重要なことに、尿から生じるｉＰＳＣは、分化する優れた能力を示し、尿がｉＰＳＣを生成するための好適な源でありうることを示唆する。当業者は、電気穿孔を通じて、再プログラム化因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＳＶ４０ＬＴ、Ｋｌｆ４、およびｍｉＲ３０２／３６７の組合せを保持するｏｒｉＰ／ＥＢＮＡエピソームベクターによってヒト尿細胞（ｈＵ）から遺伝子挿入のないヒト尿人工多能性幹細胞（ｉｆｈＵ−ｉＰＳＣ）を得ることもできる（Ｙｕ，Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｅｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９：３２４、７９７〜８０１；Ｌｉａｏ，Ｂ．ら、ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｃｌｕｓｔｅｒ ３０２−３６７ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｂｙ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ａ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｔｏ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１１：２８６、１７３５９〜１７３６４。両方の論文は、参照により本明細書に組み込まれている）。したがって本発明は、ヒト人工多能性幹細胞およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からの歯様構造物の生成を記載する。

本開示の実施形態の追加の態様および利点は、以下の記載で部分的に与えられ、以下の記載から部分的に明らかとなり、本開示の実施形態を実行して習得されることになる。

本発明の上述の特徴および利点、ならびにその追加の特徴および利点は、図面と併せて解釈される場合、好適な実施形態の詳細な説明の結果として以下でより明らかに理解されることになる。

本開示の一例におけるｈＥＳＣ、および尿細胞由来ｈｉＰＳＣからの歯生成の手順の略図を示す図である。 本開示の一例におけるｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来上皮系列の性質を示す図である。 本開示の一例における、３週間でＨ１ ＥＳＣ株およびｈｉＰＳＣ株から形成された歯様構造物を示す図である。

本開示を、以下の実施例を参照して詳細に記載する。本発明者らの標準的な研究室業務を、本発明のモードを例証するのに使用される以下の実施例において例示する。本発明の範囲は、これらの実施例に限定されると解釈されないものとする。本明細書に開示されるもの、および当業者の一般的なレベルによって、以下の実施例は、例示のためだけであり、本発明の射程から逸脱することなく、様々な変更、改変、および変化に付されうることが理解されるものとする。別段の記載のない限り、関係するすべての技術は、当業者によって周知である発生学、幹細胞生物学、分子生物学、組織生理学、免疫学、組織診断、エンジニアリング、または他の分野における慣例的な技術である。

一般的な手順
細胞培養：
ヒト尿細胞を、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ １：１（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０ｗｔ．％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＰＡＡ）、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ Ｋｉｔ ＣＣ−４１２７ ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ）、アンホテリシンＢ、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有する一次培地中で２日間培養し、次いで、翌日中にＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ Ｋｉｔ ＣＣ−４１２７ ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ）を含有するＲＥＢＭ（Ｒｅｎａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｂａｓａｌ ２ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｏｎｚａ）培地（尿細胞培地と呼ばれる）に変更した。ｈＥＳＣは、ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ ＩＮ ＵＳＡから購入した。レトロウイルスベクターまたはｏｒｉＰ／ＥＢＮＡエピソームベクター（遺伝子挿入のない）によって生成されるｉＰＳＣは、中国のＳｏｕｔｈ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから得た。ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣはともに、マトリゲルコートプレート上で、ｍＴｅｓＲ１培地中で培養した。

歯生成：
図１は、本開示の一例におけるｈＥＳＣ、および尿細胞由来ｈｉＰＳＣからの歯生成の手順の略図を示す。ｈＥＳＣ、およびヒト尿細胞由来ｉＰＳＣから歯を再生するためにキメラ培養系が展開される。簡単に言えば、図１を参照すると、ｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣを誘導して、再構成プロセスでＥ１４．５マウス歯上皮を取り替えることができる上皮シートを生成することができる。次いで再構成された外植片を１〜２日間ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、３週間（２週間以上）にわたってマウス腎被膜下に移植し、歯を再生させることができる（図１）。

［実施例１］
ｈＥＳＣおよび遺伝子挿入のないヒト尿細胞由来ｉＰＳＣ（ｉｆｈＵ−ｉＰＳＣ）からの上皮シートの生成
本発明者らは、ｈＥＳＣまたはｉｆｈＵ−ｉＰＳＣから歯上皮を得る方法を最初に発明し、約１ｗｔ．％のＮ２サプリメント、約１μＭのレチノイン酸、および約２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４を含むＮ２培地中のＲＡおよびＢＭＰ４に基づく段階特異的手法を決定した。この目的を達成するために、本発明者らは、Ｄ７でケラチノサイト様モルフォロジーを有する上皮細胞を得た（図２ａ）。次いで本発明者らは、継代することなく上皮シートとして細胞を増殖させ、これらは、Ｄ１４でより高密度になり、Ｄ２１でいくつかの細胞死を伴ってわずかに脱離した（図２ａ）。Ｄ７、１４、２１の分化細胞を回収し、ｑＰＣＲおよびウエスタンブロットによって多能性およびケラチノサイト前駆細胞のマーカーの発現について調査した。上皮分化中に、Ｈ１−ＥＳＣおよびｉｆｈＵ−ｉＰＳＣは、ＲＮＡレベルで検査したマーカー（Ｏｃｔ４、Ｋ１８、ｐ６３、Ｋ１９、ＣＤ２９、およびＫ１４）で示したように、同様に挙動し、上皮マーカーの上方制御された発現、および多能性マーカーＯｃｔ４の下方制御を示した（図２ｂ）。類似の傾向がタンパク質発現についても観察された（Ｏｃｔ４、Ｋ１８、およびｐ６３、図２ｃ）。さらに、ｐ６３およびＫ１４の発現を免疫蛍光によって検証した。ｐ６３は、Ｄ７でより早期に検出され、Ｄ２１で連続的に発現され、一方、Ｋ１４発現は、Ｄ２１で後に検出された（図２ｄ）。結果として、本発明者らは、Ｄ７でｈＥＳＣおよびｉｆｈＵ−ｉＰＳＣの両方からシートとしての上皮細胞の均質層を得た（図２ｄ）。Ｄ７で回収したこれらのシートは、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって観察した場合、粘着性で柔軟であり、頂端側において平滑な表面を示した（図２ｅ）。シートは、Ｄ１４に顕著な核で凸凹になった（図２ｅ）。透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）下で、Ｄ７およびＤ１４の両方において、上皮細胞間でデスモソームを明らかに観察することができた（図２ｅ）。まとめると、これらの結果は、ｈＥＳＣまたはｉｆｈＵ−ｉＰＳＣからＤ７で生成された上皮シートが、歯の再生のために誘導されるのに所望の性質を有することを示唆する。

詳細には、図２は、本開示の一例におけるｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来上皮系列の性質を示す。

図２では、（ａ）は、７日間のＮ２培地中のＲＡおよびＢＭＰ４の補充、次いでさらなる分化のためのＤＳＦＭへの変更によるｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣの上皮分化プロセスを示す。スケールバーは、２００μｍに対応する。

（ｂ）は、ＥＳＣ特異的転写因子（Ｏｃｔ４）の下方制御、および角化上皮マーカー（Ｋ１８、ｐ６３、Ｋ１９、ＣＤ２９、Ｋ１４）の上方制御を示す代表的な実験のｑＰＣＲを示す。

（ｃ）は、Ｈ１またはｉｆｈＵ１−ｉＰＳＣ由来上皮細胞からの溶解産物のＯｃｔ４、ｐ６３、およびＫ１８についてのウエスタンブロッティングを示す。ＧＡＰＤＨは、負荷対照である。

（ｄ）は、Ｄ７およびＤ２１におけるＨ１およびｉｆｈＵ１−ｉＰＳＣに由来する上皮シートの位相差キャプチャー（Ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｃａｐｔｕｒｅ）および免疫蛍光染色［ＩＦ：ｐ６３（赤色）、Ｋ１４（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）］を示す。スケールバーは、それぞれ２０００および２００μｍに対応する。

（ｅ）は、Ｄ７およびＤ１４におけるＨ１−ＥＳＣおよびｉｆｈＵ１−ｉＰＳＣ由来上皮シートの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）および透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像を示す。白色の矢じりは、シートの上皮細胞間のデスモソームを示す。ＳＥＭおよびＴＥＭ中のスケールバーは、それぞれ２０および０．５μｍに対応する。

［実施例２］
ｈＥＳＣおよびｉｆｈＵ−ｉＰＳＣに由来する上皮シートからの歯様構造物の生成
本発明者らは、Ｄ７上皮シートを回収し、ｍＴｅＳＲ１（商標）培地、Ｅ８培地、またはＫＳＲ馴化培地（培地は、約１０ｗｔ．％のＦＢＳ、約２ｍＭのグルタミン、約０．１ｍＭの非必須アミノ酸、約１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを含む）中で、マウス歯の間葉でこれらを組み換えた後、マウス腎被膜下に移植した（図１）。３週間後、本発明者らは、腎臓中で歯様構造物を観察した（図３ａ）。本発明者らは、個々の歯様構造物を、腎被膜下および周囲の骨からこれらを取り出すことによって単離した（図３ａ、左列）。組換え体は、歯髄、象牙質、エナメルスペース、およびエナメル器を有する無傷の歯様構造物を示した（図３ａ、中央列）。エナメル器は、波状縁様構造および乳頭層を伴った細長いエナメル芽細胞を有する（図３ａ、中央列）。本発明者らは、エナメル芽細胞の層およびその乳頭層内に位置したアメロブラスチン（Ａｍｅｌ）の発現も観察した（図３ａ）。本発明者らは、組換え歯の断面内でヒト起源の上皮成分を確認した後、ヒト白血球抗原−Ｉ（ＨＬＡ−Ｉ）およびヒト核抗原（ｈＮＡ）に対するヒト特異的抗体で免疫染色することによって単離した（図３ｂ）。両抗体は、マウス歯の間葉から発達した歯髄、軟骨、周囲の骨様構造内で陰性に染色した（図３ｂ）。予期されたように、両ヒト特異的抗体は、エナメル芽細胞（図３ｂ１）、乳頭層（図３ｂ２）、および嚢胞内の扁平上皮細胞について陽性に染色した（図３ｂ３）。さらに、陽性ＨＬＡ−Ｉ染色は、細胞質内で局在しており、一方、ｈＮＡは、核内で相補的に局在していた（図３ｂ４、ｂ５）。対照として、ｈＥＳＣまたはｉｆｈＵ−ｉＰＳＣ由来上皮シートで組み換えないと、同一条件下で移植されたマウス歯の間葉は、骨細胞で埋まった骨様構造全体中の骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）の陽性染色によって確認されるように、代わりに骨様構造を形成した（ｎ＝１０／１０）（図３ｃ）。

［実施例３］
歯様構造物の物理的性質の特徴付けおよび歯様構造物生成の比率
本発明者らは、ナノインデンテーションによってヒト成人の歯（ヒト群）、腎臓被膜下で歯胚から発達した３週間のマウスの歯（マウスＷＴ群）、ならびにＨ１−ＥＳＣおよびｉｆｈＵ−ｉＰＳＣ群からの再生歯の硬度および弾性係数を分析した（図３ｄ）。５つの群における象牙質およびエナメル質の硬度および弾性係数は、同様の性質を示した（図３ｄ）。エナメル質の場合では、Ｈ１−ＥＳＣおよび２つのｉｆｈＵ−ｉＰＳＣの群の硬度および弾性係数は、ヒトおよびマウスＷＴの群のものより低かった（図３ｄ、右のグラフ）。興味深いことに、ｉｆｈＵ５−ｉＰＳＣ群の硬度は、Ｈ１−ＥＳＣ群のものより約４倍高かった（図３ｄ、右のグラフ）。印象深いことに、ｉｆｈＵ５−ｉＰＳＣ群の硬度は、ヒト群のものとの比較によって１／３に到達した（図３ｄ、右のグラフ）。本発明者らは、ラマン分光法によって歯の物理的性質をさらに分析した。本発明者らは、これらがすべて、同等の強度で同様のスペクトルを有することを示した（図３ｅ）。検査した５つの群では、歯のエナメル質は、高度に石灰化しており、スペクトルは、ヒドロキシアパタイト［Ｃａ_５（ＰＯ_４）_３ＯＨ、歯における主要なミネラル］とほとんど同じスペクトルを示した（図３ｅ）。これらの歯様構造物はまた、ヒトの歯と比較して、ヒドロキシアパタイトピークを含む、象牙質におけるラマンピークを伴って同様のタンパク質の徴候を示した（図３ｅ）。これらの結果は、Ｈ１−ＥＳＣおよび２つのｉｆｈＵ−ｉＰＳＣの群の両方に由来する再生歯が、ヒトおよびマウスの歯と同様の成分を有することを示した。本発明者らは、歯再生について３人の尿ドナー（Ｕ１、５、７）からの８つのｈｉＰＳＣ株のすべてを分析し、成功率は最大３０％であった（図３ｆ）。

詳細では、図３は、本開示の一例における、３週間でＨ１ ＥＳＣ株およびｈｉＰＳＣ株から形成された歯様構造物を示す。

図３では、（ａ）左の２列は、Ｈ１−ＥＳＣおよびｉｆｈＵ１−ｉＰＳＣの群に由来する、周囲の骨から単離した後および単離する前の歯様構造物の位相差キャプチャーを示し（歯は点線によって輪郭が描かれている）、右の３列は、関連する歯切片（Ｈ１−ＥＳＣ：矢状断面；ｉｆｈＵ１−ｉＰＳＣ：断面）のヘマトキシリン−エオシン染色（ＨＥ）および免疫組織学染色（ＩＨＣ：アメロブラスチン、Ａｍｅｌ）を示し、両群における歯髄（ｄｐ）、象牙質（ｄ）、エナメルスペース（ｅｓ）、およびエナメル芽細胞の層（Ａｍ）を含有する歯様構造物を示す。細長いエナメル芽細胞を青色ボックス内に高拡大率で示した。陽性Ａｍｅｌ発現は、乳頭層（黒色矢印）を伴ったこれらのエナメル芽細胞内で特異的に局在していた。乳頭層は、緑色ボックス内に高拡大率で黒色矢じりによってさらに指摘した。スケールバー：同じ列内の上および下の図は、左から右に順に５００、５００、４００、１００、１００μｍと同じスケールバーを共有する。

（ｂ）は、ｉｆｈＵ１−ｉＰＳＣ由来歯の断面における免疫組織学染色および免疫蛍光染色を示す：上、ＨＬＡ−Ｉ発現は、エナメル芽細胞層（ｂ１およびｂ２中の黒色矢じり）ならびに上皮由来嚢胞（ｂ３中の黒色矢印）を含むヒトｉＰＳＣ由来細胞および組織の細胞質内に特異的に局在していた；下、エナメル芽細胞（白色矢じり）および嚢胞上皮細胞（白色矢印）内の同じ領域の核内のｈＮＡの相補的な発現（緑色）。^＊は嚢胞を示した。ＤＡＰＩは、青色で示されている。より高い拡大率のエナメル芽細胞内のｈＮＡおよびＤＡＰＩ（白色矢じり）を、それぞれｂ４およびｂ５に示した。スケールバーは、２００μｍに対応する。

（ｃ）は、陽性ＢＳＰ発現を伴って３週間にわたって腎臓被膜下に移植されたＥ１４．５マウス歯の間葉から検出された骨の片の画像を示す。スケールバー：順に１０００、１００、１００μｍ。

（ｄ）は、ナノインデンテーション分析を示す。左：成人の歯の群（ヒト）、Ｅ１４．５歯胚からの３週間のマウスの歯の群（マウス−ＷＴ）、Ｈ１−ＥＳＣおよびｉｆｈＵ−ｉＰＳＣに由来する再生歯群における砕いたエナメル質および象牙質の表面の代表的な画像；右：上記群におけるエナメル質および象牙質の硬度および弾性係数（各群：ｎ＝３）。

（ｅ）は、ヒト、マウス、ｈＥＳＣ、およびｉｆｈＵ−ｉＰＳＣに由来するエナメル質および象牙質のラマン分光分析により、エナメル質および象牙質の両方における、９６１ｃｍ^−１（ヒドロキシアパタイト）、ならびに象牙質における１６６９ｃｍ^−１（Ｃ＝Ｏ伸縮振動）、２８８５ｃｍ^−１、および２９４１ｃｍ^−１（Ｃ−Ｈ伸縮振動）を含むラマンピークに対して、すべての群について大きな類似性が示されたことを示す。

（ｆ）は、Ｈ１ ＥＳＣ株および８つのｉＰＳＣ株についての歯様構造物の効率を示す。

［実施例４］
本実施例では、ヒト胚性幹細胞（Ｈ１−ＥＳＣ）、および尿細胞に由来するｉＰＳＣの８つの異なる株を使用して、上記実施例と同様にしてそれぞれエナメル芽細胞を調製する。エナメル芽細胞を得るそれぞれの効率をこれらの幹細胞の中で比較し、結果を以下の表Ｉに示す。

上記表において、ｖＵＣ１−ｉＰＳＣ−Ｃ１は、レトロウイルスシステムを使用して得られるｉＰＳＣクローン株を表し、他の７つの株は、電気穿孔によって得られるｉＰＳＣクローン株を表す。

表Ｉによって示したように、ヒト胚性幹細胞およびｉＰＳＣはともに、エナメル芽細胞を含有する歯様構造物を形成することができ、ヒト胚性幹細胞（Ｈ１−ＥＳＣ）の効率は、３０％に到達する場合があり、それはｉＰＳＣのものより高い。上記に列挙したｉＰＳＣの８つの株のすべては、尿細胞に由来し、これらは互いに異なる効率を有しうる。そして本発明者らは、ヒト胚性幹細胞およびｉＰＳＣはともに、相対的により高い効率でエナメル芽細胞を調製するのに使用されうるという結論を出すことができる。

説明的な実施形態を示し、記載してきたが、請求の範囲およびこれらの均等物の射程内にすべて入る変更、代替案、および改変は、本開示の趣旨および原理から逸脱することなく、実施形態中に行なわれうることが当業者によって理解されるはずである。

Claims (26)

1. 歯様構造物の調製における幹細胞の使用。
2. 前記歯様構造物が、異種移植によって哺乳動物内で生成される、請求項１記載の使用。
3. 前記哺乳動物が、マウス、ラット、ブタ、イヌ、およびサルからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１記載の使用。
4. 前記幹細胞が、前記異種移植の前に上皮様細胞を形成するように誘導される、請求項１記載の使用。
5. 前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項１記載の使用。
6. 前記人工多能性幹細胞が、ヒト細胞から産生され、該ヒト細胞が、尿細胞、皮膚線維芽細胞、および歯周靱帯幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１記載の使用。
7. 前記歯様構造物が、エナメル芽細胞を含有する、請求項１記載の使用。
8. ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である基礎培地、
   Ｎ２サプリメント、
   レチノイン酸、および
   ＢＭＰ−４
   を含む培地。
9. 約１ｗｔ．％のＮ２サプリメント、約１μＭのレチノイン酸、および約２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４を含む、請求項８記載の培地。
10. 上皮様細胞を調製するための方法であって、請求項８または９記載の培地を使用して幹細胞を培養して、該幹細胞の該上皮様細胞への分化を誘導するステップを含み、
    該幹細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である
    方法。
11. 前記人工多能性幹細胞が、ヒト細胞から産生される、請求項１０記載の方法。
12. 前記ヒト細胞が、尿細胞、皮膚線維芽細胞、および歯周靱帯幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１０記載の方法。
13. エナメル芽細胞を調製するためのキットであって、
    請求項８または９記載の培地である第１の培地、
    ＦＢＳ、非必須アミノ酸、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充されたＤＭＥＭ培地である第２の培地
    を含み、
    該第１の培地および該第２の培地は、それぞれ異なる容器で提供される
    キット。
14. ｍＴｅＳＲ１（商標）培地、Ｅ８培地、およびＫＳＲ馴化培地から選択される少なくとも１種である第３の培地をさらに含む、請求項１３記載のキット。
15. 前記第２の培地が、約１０ｗｔ．％のＦＢＳ、約２ｍＭのグルタミン、約０．１ｍＭの非必須アミノ酸、約１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを含む、請求項１３記載のキット。
16. エナメル芽細胞を調製するための方法であって、
    請求項１０から１２のいずれか一項記載の方法によって上皮様細胞を調製するステップと、
    第１の動物の歯の間葉で該上皮様細胞を組み換えて、組換え標本を得るステップと、
    該得られた組換え標本を培養して、再構成された外植片を得るステップと、
    所定時間の間、第２の動物内に該再構成された外植片を移植して、該エナメル芽細胞を形成するステップと
    を含む、方法。
17. 前記幹細胞が、請求項８または９記載の培地を使用して、約５〜１０日間、好ましくは約７日間培養される、請求項１６記載の方法。
18. 前記第１の動物および前記第２の動物が、それぞれマウス、ラット、ブタ、イヌ、およびサルからなる群から独立して選択される、請求項１６記載の方法。
19. 前記第１の動物が胎児マウスであり、前記第２の動物がヌードマウスである、請求項１７記載の方法。
20. 前記歯の間葉が、歯胚から機械的に分離され、該歯胚が、該分離の前にプロテアーゼを使用して消化される、請求項１９記載の方法。
21. 前記プロテアーゼが、約０．７５ｍｇ／ｍｌのディスパーゼである、請求項２０記載の方法。
22. 前記得られた組換え標本が、ＦＢＳ、非必須アミノ酸、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充されたＤＭＥＭ培地を使用して培養される、請求項１６記載の方法。
23. 組換え組織が、ヌードマウスの腎臓被膜の下の空間に移植される、請求項１９記載の方法。
24. 前記所定時間が約２〜４週間である、請求項１６記載の方法。
25. 前記所定時間が約３週間である、請求項１６記載の方法。
26. 前記幹細胞が、前記上皮様細胞を調製する前に、ｍＴｅＳＲ１（商標）培地、Ｅ８培地、およびＫＳＲ馴化培地から選択される少なくとも１種を使用して培養され、
    該培地が、該培養された幹細胞が約６０〜８０％のコンフルエンスに到達したとき、前記上皮様細胞を得るために請求項８または９記載の培地と取り替えられる
    請求項１６記載の方法。

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