CN105420180A - 一种牙周膜干细胞体外扩增完全培养基及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种牙周膜干细胞体外扩增完全培养基及方法，所述完全培养基包含FBS、L-谷氨酰胺、NEAA和基础培养基，所述基础培养基为高糖DMEM。所述体外扩增方法包括使用微载体和上述的完全培养基扩增牙周膜干细胞的步骤。本发明完全培养基的组分包含NEAA、L-谷氨酰胺、FBS和高糖DMEM，提高了血清含量，且使用高糖培养，添加NEAA，是本发明完全培养基的营养更佳丰富，可以有效克服现有技术中培养基容易耗尽的问题。本发明牙周膜干细胞体外扩增方法使用微载体扩增牙周膜干细胞，增殖速度快，扩增后获得的细胞数量多，而且劳动强度小，不易污染。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养方法，尤其涉及一种牙周膜干细胞体外扩增完全培养基及方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制、自我更新、多向分化潜能的细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞，可从脂肪、骨髓、脐带、胎盘等多种成体组织中分离获得。牙周膜是连接牙骨质和牙槽骨之间的结缔组织，具有支持、感觉和营养等功能。近年的研究显示牙周膜中存在未分化的间充质干细胞，参与牙周组织的再生。
牙周病是人类口腔疾病中的常见病和多发病，常导致牙周支持组织的破坏或缺损。目前，牙周支持组织重建主要依赖机械、药物和引导组织再生技术，随着分子生物学、组织工程学和干细胞技术的飞速发展，牙周组织再生工程技术成为牙周病治疗研究的热点，牙周膜干细胞是牙周组织再生工程的关键种子细胞之一。
目前牙周膜干细胞的体外扩增方法仍以静置培养为主。该培养方式不仅劳动强度大，易造成污染，而且单个平皿的培养面积有限，使扩增后收获的细胞数量有限。马兆峰等采用旋转微重力细胞培养系统(rotarycellculturesystem，RCCS)运用含5％FBS的DMEM培养牙周膜干细胞(马兆峰,李石,牛中英.模拟微重力培养环境下牙周膜干细胞生长状态的研究.广东牙病防治,2011,19(9):451-454)。但悬浮培养过程中，因为细胞在同一体积培养基内的扩增的数量增加，对营养需求增加，培养基容易耗尽；此外该方法扩增得到的牙周膜干细胞的含量仍然较低。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种牙周膜干细胞体外扩增完全培养基及方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种牙周膜干细胞体外扩增完全培养基，包含FBS(胎牛血清)、L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)和基础培养基，所述基础培养基为高糖DMEM。
优选地，所述L-谷氨酰胺的浓度为1-5mM。
优选地，所述FBS的含量为5-20v/v％。
更优选地，所述FBS的含量为10-20v/v％。
优选地，所述NEAA包含甘氨酸(Glycine)、L-丙氨酸(L-Alanine)、L-天冬酰胺(L-Asparagine)、L-天冬氨酸(L-Asparticacid)、L-谷氨酸(L-GlutamicAcid)、L-脯氨酸(L-Proline)和L-丝氨酸(L-Serine)，每种氨基酸的含量为0.5-3mM。
更优选地，所述NEAA中每种氨基酸的含量为1mM，即为1×NEAA。
优选地，所述牙周膜干细胞体外扩增完全培养基由下述含量的下述组分组成：10v/v％FBS、2mML-谷氨酰胺、1×NEAA，余量为高糖DMEM。
一种牙周膜干细胞体外扩增方法，包括使用微载体和本发明完全培养基扩增牙周膜干细胞的步骤。
优选地，上述牙周膜干细胞体外扩增方法包括以下步骤：
向培养袋中注入微载体和完全培养基，平衡培养系统，待培养系统平衡后接种牙周膜干细胞，微载体终浓度为3-10g/L，培养0.5-2小时后调整温度至37℃，继续培养至细胞爬满微载体80％以上；
用滤网分离微载体和培养基，用PBS润洗微载体两次，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化微载体至细胞完全脱落，加入完全培养基终止酶解，用滤网分离微载体和酶解消化液，酶解消化液在200-800g条件下离心5-10min；去除上清，得到牙周膜干细胞。
进一步优选地，所述牙周膜干细胞体外扩增方法包括以下步骤：
向培养袋中注入微载体和本发明完全培养基，培养系统按照以下参数设定进行平衡：通气为95％无菌干燥空气和5％二氧化碳的混合气体，pH为7.00-7.20，温度为35℃，涌动速度为5-20RPM；
培养系统平衡后接种牙周膜干细胞，微载体终浓度为3-10g/L，培养0.5-2小时后调整温度至37℃，连续培养至细胞爬满微载体80％以上；
用70μm的滤网分离微载体和培养基，向微载体中加入3-10倍体积的PBS润洗后，用70μm的滤网分离微载体和PBS，洗两次后，向微载体中加入1-3倍体积的胰蛋白酶-EDTA溶液消化至细胞完全脱落，加入2-5倍体积的本发明完全培养基终止酶解，用70μm的滤网分离微载体和酶解消化液，酶解消化液在200-800g条件下离心5-10min，去除上清，得到牙周膜干细胞；所述胰蛋白酶-EDTA溶液包含0.05-0.5m/v％胰蛋白酶和0.01-0.05m/v％EDTA。
优选地，微载体在使用前进行预处理，预处理方法为：微载体用PBS浸泡过夜后用PBS洗两遍，高压灭菌，去除PBS，加入1-5倍体积的高糖DMEM润洗一遍，后用1-3倍体积的高糖DMEM浸泡置于4℃备用。
优选地，所述培养系统为波浪生物反应器，所述微载体为cytodex3。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明完全培养基的组分包含NEAA、L-谷氨酰胺、FBS和高糖DMEM，提高了血清含量，且使用高糖培养，添加NEAA，使本发明完全培养基的营养更佳丰富，可以有效克服现有技术中培养基容易耗尽的问题。
本发明牙周膜干细胞体外扩增方法使用微载体扩增牙周膜干细胞，增殖速度快，扩增后获得的细胞数量多，而且劳动强度小，不易污染。
附图说明
图1为本发明实施例1中牙周膜干细胞的扩增曲线。
图2为本发明实施例1中本发明样本的流式检测结果图。图2A为实施例1中本发明阴性样本检测结果，图2B为实施例1中本发明样本检测结果.
图3为本发明实施例1中阴性样本的流式检测结果图。图3A为实施例1中对照组阴性样本检测结果，图3B为实施例1中对照组样本检测结果。
图4为本发明实施例2中牙周膜干细胞的扩增曲线。
图5为本发明实施例3中牙周膜干细胞的扩增曲线。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
实施例1
本实施例中牙周膜干细胞体外扩增完全培养基由下述含量的下述组分组成：5v/v％FBS(GIBCO)、2mML-谷氨酰胺、1×NEAA，余量为高糖DMEM(GIBCO)。以马兆峰等人在《模拟微重力培养环境下牙周膜干细胞生长状态的研究》文章中使用的培养基方案为对照组，即对照组的完全培养基为含5％v/vFBS的DMEM，采用使用GE-WAVE系统培养牙周膜间充质干细胞，具体方法如下：
称取cytodex3微载体1.5g两份，分别用50mLPBS浸泡过夜，充分膨胀后，用PBS洗两遍后，高压灭菌。分别用对照组及本发明的完全培养基润洗后，置于4℃下备用。
使用的培养系统为波浪生物反应器(GEReadyToProcessWAVE25)，分别往两个培养袋中注入预处理过的微载体和400mL完全培养基，按以下参数设定系统：通气为95％无菌干燥空气和5％二氧化碳的混合气体，pH为7.00-7.20，温度为35℃，涌动速度为5RPM。
取P3代牙周膜干细胞，用胰酶消化离心后，用完全培养基重悬，调整浓度为1×107cells/L。待培养系统平衡稳定后，将细胞悬液分别注到对照组和本发明的培养袋中，每袋10mL，用90mL润洗离心管和注射器，注到培养袋中，微载体终浓度为3g/L。培养2小时后，将温度调整为37℃，继续培养，至第7天细胞爬满微载体80％以上。本发明先用较低温度(35℃)平衡培养系统，接种后仍用同样的温度进行培养，可以使细胞在培养基和微载体中分散均匀，之后再使用最适宜的温度(37℃)培养，使细胞贴服在微载体上，快速增殖。
在培养过程中，根据细胞生长情况换液，每天取样计数，结果如表1和图1所示。
表1本实施例中计数结果表单位为×108cells
由表1和图1可知，使用本发明完全培养基和扩增方法获得的细胞数量明显优于对照组，在对数生长期增长更快，平台期时细胞数量更多且时间更长，对照组在第6天细胞数量已经开始下降，而本发明实施例1在第7天细胞生长依然呈上升趋势。
培养七天后，收集本发明和对照组所培养的细胞，做流式细胞表面抗原的检测，结果如图2和图3所示，本发明与对照组的流式检测结果基本相同，细胞低表达HLA-DR和CD45，高表达CD59和CD90，符合间充质干细胞的特性。
实施例2
本实施例中以含不同浓度的FBS的本发明完全培养基为培养基，使用微载体培养牙周膜间充质干细胞。各组完全培养基组成如下：
实验组1的完全培养基由下述含量的下述组分组成：5v/v％FBS、2mML-谷氨酰胺、1×NEAA，余量为高糖DMEM；
实验组2的完全培养基由下述含量的下述组分组成：10v/v％FBS、2mML-谷氨酰胺、1×NEAA，余量为高糖DMEM；
实验组3的完全培养基由下述含量的下述组分组成：15v/v％FBS、2mML-谷氨酰胺、1×NEAA，余量为高糖DMEM；
实验组4的完全培养基由下述含量的下述组分组成：20v/v％FBS、2mML-谷氨酰胺、1×NEAA，余量为高糖DMEM。
每组称取cytodex3微载体5g，用100mLPBS浸泡过夜，充分膨胀后，用PBS洗两遍后，高压灭菌，用各实验组的完全培养基润洗后，置于4℃下备用。
往每个培养袋中注入预处理过的微载体和400mL完全培养基，按以下参数设定系统：通气为95％无菌干燥空气和5％二氧化碳的混合气体，pH为7.00～7.20，温度为35℃，涌动速度为12RPM。
取P2代的牙周膜干细胞，用胰酶消化离心后，用完全培养基重悬，调整浓度为1×107cells/L。待系统平衡稳定后，将10mL细胞悬液注到培养袋中，用90mL润洗离心管和注射器，注到培养袋中，此时微载体的终浓度为10g/L。培养1小时后将温度设定为37℃，继续培养，培养至第7天细胞爬满微载体80％以上。培养过程中根据细胞生长情况换液，每天取样计数，细胞增殖情况如图4所示。
由图4可知，细胞在前三天处于潜伏期，细胞增殖较慢，实验组1-4的细胞总数差别不大；在3-6天进入指数增长期，细胞生长迅速，实验组1-4组间差异增大，随血清用量的增大，细胞扩增倍数明显提高。因此，增大血清用量，可以明显提高细胞的扩增倍数。
实施例3
本实施例中完全培养基由下述含量的下述组分组成：10v/v％FBS、2mML-谷氨酰胺、1×NEAA，余量为高糖DMEM；使用微载体培养牙周膜间充质干细胞。具体方法如下：
称取cytodex3微载体2g，用100mLPBS浸泡过夜，充分膨胀后，用PBS洗两遍后，高压灭菌，用本实施例中的完全培养基润洗后，置于4℃下备用。
往培养袋中注入预处理过的微载体和400mL完全培养基，按以下参数设定系统：通气为95％无菌干燥空气和5％二氧化碳的混合气体，pH为7.00-7.20，温度为35℃，涌动速度为8RPM。
取P2代牙周膜干细胞，用胰酶消化离心后，用完全培养基重悬，调整浓度为2×107cells/L。待培养系统平衡稳定后，注5mL细胞悬液到培养袋中，用95mL润洗离心管和注射器，注到培养袋中，此时微载体终浓度为4g/L。系统涌动2小时后，温度设定为37℃，继续培养，培养至第7天细胞爬满微载体80％以上。培养过程中根据细胞生长情况换液，每天取样计数，细胞增殖情况如图5所示。由图5可知，细胞在前三天处于潜伏期，细胞增殖较慢，在3-6天进入指数增长期，细胞生长迅速，之后增殖速度减缓，进入平台期，连续培养7天，细胞数量扩增了接近三十倍。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种牙周膜干细胞体外扩增完全培养基，其特征在于，包含FBS、L-谷氨酰胺、NEAA和基础培养基，所述基础培养基为高糖DMEM。
2.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞体外扩增完全培养基，其特征在于，所述L-谷氨酰胺的浓度为1-5mM，所述FBS的含量为5-20v/v％。
3.根据权利要求2所述的牙周膜干细胞体外扩增完全培养基，其特征在于，所述FBS的含量为10-20v/v％。
4.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞体外扩增完全培养基，其特征在于，所述NEAA包含甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸，每种氨基酸的含量为0.5-3mM。
5.根据权利要求4所述的牙周膜干细胞体外扩增完全培养基，其特征在于，所述牙周膜干细胞体外扩增完全培养基由下述含量的下述组分组成：10v/v％FBS、2mML-谷氨酰胺，NEAA中每种氨基酸的含量为1mM，余量为高糖DMEM。
6.一种牙周膜干细胞体外扩增方法，包括使用微载体和权利要求1-5任一项所述的完全培养基扩增牙周膜干细胞的步骤。
7.根据权利要求6所述的牙周膜干细胞体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
向培养袋中注入微载体和完全培养基，平衡培养系统，待培养系统平衡后接种牙周膜干细胞，微载体终浓度为3-10g/L，培养0.5-2小时后调整温度至37℃，继续培养至细胞爬满微载体80％以上；
用滤网分离微载体和培养基，用PBS润洗微载体两次，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化微载体至细胞完全脱落，加入完全培养基终止酶解，用滤网分离微载体和酶解消化液，酶解消化液在200-800g条件下离心5-10min；去除上清，得到牙周膜干细胞。
8.根据权利要求7所述的牙周膜干细胞体外扩增方法，其特征在于，
培养系统按照以下参数设定进行平衡：通气为95％无菌干燥空气和5％二氧化碳的混合气体，pH为7.00-7.20，温度为35℃，涌动速度为5-20RPM；培养系统平衡后接种牙周膜干细胞，培养0.5-2小时后调整温度至37℃，继续培养至细胞爬满微载体80％以上；
用70μm的滤网分离微载体和培养基，向微载体中加入3-10倍体积的PBS润洗后，用70μm的滤网分离微载体和PBS，洗两次后，向微载体中加入1-3倍体积的胰蛋白酶-EDTA溶液消化至细胞完全脱落，加入2-5倍体积的完全培养基终止酶解，用70μm的滤网分离微载体和酶解消化液，酶解消化液在200-800g条件下离心5-10min；去除上清，得到牙周膜干细胞；所述胰蛋白酶-EDTA溶液包含0.05-0.5m/v％胰蛋白酶和0.01-0.05m/v％EDTA。
9.根据权利要求6-8任一项所述的牙周膜干细胞体外扩增方法，其特征在于，微载体在使用前进行预处理，预处理方法为：微载体用PBS浸泡过夜后用PBS洗两遍，高压灭菌，去除PBS，加入1-5倍体积的高糖DMEM润洗一遍，用1-3倍体积的高糖DMEM浸泡置于4℃备用。
10.根据权利要求7或8所述的牙周膜干细胞体外扩增方法，其特征在于，所述培养系统为波浪生物反应器，所述微载体为cytodex3。
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