CN1249000A - 细胞分离方法 - Google Patents

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Abstract

一种细胞分离方法,它包含以下步骤:将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入细胞俘获装置中,该装置能充分俘获欲回收细胞,并充分允许欲去除细胞从其通过;将所得含有欲去除细胞的液体从该细胞俘获装置中除去;然后将粘度不超过500MPa·s且不小于5MPa·s的液体加入该细胞俘获装置中,以从中回收已被该细胞俘获装置俘获的欲回收细胞。

Description

细胞分离方法
技术领域
本发明涉及从含有不同细胞的混合物的液体中仅分离并回收需要的细胞的方法。由此得到的细胞可用于治疗各种疾病，如造血干细胞移植术，还可用于诸如免疫学和细胞生物学等基础科学。
背景技术
日本专利JP-A-54-119012公开了一种回收淋巴细胞的技术，是从体液如含有白细胞(粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)和红细胞的血液中将白细胞俘获于滤器上。
在造血干细胞移植术中，脐带血干细胞作为造血干细胞的来源，不会对供血者造成任何侵害，它们的临床应用主要是在欧洲和美洲国家进行了有力的尝试。不象其他的造血干细胞移植(即骨髓移植术和外周血干细胞移植术)那样，由于从供血者采集来的脐带血干细胞很少在采集后立即移植给病人，因此它们在采集后需要保藏，留在以后使用。这样的保藏常常是需要的，尤其是在无关的环境下。在对脐带血进行深低温保藏前，有必要将有核细胞分离出来并除去红细胞，以防止融化后红细胞裂解的副作用，并减少深低温保藏过程中的体积。目前，在多数情况下，脐带血在分离后进行保藏(“外周血干细胞移植术”第173页，NANKODO公司)。JP-B-8-69公开了用菲可-海帕克(Ficoll-Hypaque)法分离脐带血的方案细节，这是一种使用具有调整过的比重的液体的离心方法，下文中称之为“菲可法”。但是，菲可法也有不足，表现在它仅在实验室水平上可行，并需要十分麻烦和费时的操作。国际申请公开第WO96/17514号公开了一种袋系统，和通过使用羟乙基淀粉进行凝集和沉淀，以得到浓缩的有核细胞悬液，从而分离脐带血中的红细胞的方法，以及用该方法得到的细胞悬液。此方法稍优于常规方法-菲可法，因为这种方法涉及较少的麻烦操作，但由于需要进行两次离心，因而也是一种费时的方法。
另一方面，也报道了一些分离造血干细胞的方法，用来取代菲可法以及红细胞的凝集与去除。JP-A-8-104643公开了一种回收造血干细胞的方法，它是通过将造血干细胞捕获于可渗透红细胞的滤器上，然后使一液体以与第一液体流向相反的方向流动。但是，该方法仅使用Hanks平衡盐溶液(HBSS)作为回收用液体。
葡聚糖是一种由葡萄糖单元作为单体单元而组成的多糖，这些单体单元主要由α-1，6键连接。葡聚糖很早就被用作分离白细胞的试剂。但是，运用葡聚糖分离白细胞，利用了葡聚糖作为血凝剂的作用。当试管中的红细胞凝集并沉淀后，如果需要，可进行离心，然后用滴液管回收上清液中的白细胞(Shiro Miwa，Rinsho Kensa GijutsuZensho，第3卷，“Ketsueki Kensa”第425页)。此作用不仅仅是葡聚糖的特性，因为羟乙基淀粉等具有与葡聚糖相同的血凝作用。
其次，下文描述了分离造血干细胞的系统。JP-A-7-184991公开了一种采集脐带血的装置，特别是除去脐带血中的诸如聚集体(如微聚集体)、组织颗粒、骨颗粒、脂瘤等污染物的滤器，该滤器在血液收集用容器之前提供。但是，该滤器不是用来俘获应回收的细胞，而是为了清除污染物。即使偶尔在滤器中使用了能俘获造血干细胞的材料，本参考资料也根本未描述被俘获的造血干细胞的回收。
JP-A-8-52206公开了一种用作采集脐带血的、包含膜类型血浆分离器的装置，用于从所采集的脐带血中分离造血干细胞。本参考文献也公开了另外一种使用密度梯度分离装置进行分离的方法，即用菲可法进行分离。
本发明旨在提供一种方法，通过简单而快捷的过程，将期望回收的细胞(下文称作“欲回收细胞”或“所需细胞”)从所需细胞和非所需细胞(下文称作“欲去除细胞”)的混合物中分离出来。该过程包含一种细胞分离方法，即利用诸如过滤含有细胞混合物的液体等俘获方式俘获所需细胞，然后以高回收率回收被俘获细胞。本发明还提供了将本方法具体实施于临床而得到的管线系统。本发明还提供了用于所述系统的回收液，以及使用该方法而得到的含细胞的液体。
为了解决现有技术中存在的问题，本发明人注意到了从细胞俘获装置回收细胞的液体的性能，并认真地研究了这些性能，得出结论认为：当使用具有特定粘度的回收液回收细胞时，可以获得高回收率。对各种回收液组成进行认真研究后，结果本发明人发现了这样一种惊人的效果，即用含有葡聚糖的生理溶液回收细胞时，可获得非常高的回收率。这样，就实现了本发明的目的。
本发明的公开
本发明的一个方面涉及一种细胞分离方法，它包含以下步骤：将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入一个能充分俘获欲回收细胞而充分允许欲去除细胞从其通过的细胞俘获装置。然后，将所得含有欲去除细胞的液体从该细胞俘获装置中除去。接着，将粘度不超过500mPa·s且不低于5mPa·s的液体加入该细胞俘获装置中，以从中回收那些已被该细胞俘获装置俘获的欲回收细胞。
本发明的另一方面涉及一种细胞分离和保藏方法，它包含以下步骤：将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入一个能充分俘获欲回收细胞而充分允许欲去除细胞从其通过的细胞俘获装置。将所得含有欲去除细胞的液体从该细胞俘获装置中除去，并将粘度不超过500mPa·s且不低于5mPa·s的液体加入该细胞俘获装置中，以从中回收那些已被该细胞俘获装置俘获的欲回收细胞。然后将所回收的细胞予以保藏。
本发明的另一方面涉及一种细胞分离和保藏方法，它包含以下步骤：将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入一个能充分俘获欲回收细胞而充分允许欲去除细胞从其通过的细胞俘获装置。将所得含有欲去除细胞的液体从该细胞俘获装置中除去，并将粘度不超过500mPa·s且不低于5mPa·s的液体加入该细胞俘获装置中，以从中回收那些已被该细胞俘获装置俘获的欲回收细胞。然后，所回收的细胞进行深低温保藏和融化。
本发明还有一个方面涉及一种细胞分离系统，它包含一个能充分俘获欲回收细胞并充分允许欲去除细胞从其通过的细胞俘获装置，该装置至少有一个入口和一个出口。一根用于将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入该细胞俘获装置的管线连接于该细胞俘获装置入口的上游。一根用于将液体加入该细胞俘获装置的管线连接于该细胞俘获装置出口的下游。一根用于从该细胞俘获装置的入口侧回收细胞的管线连接于该细胞俘获装置入口的上游。
本发明还有一个方面涉及一种细胞分离方法，它包含以下步骤：通过连接于该细胞俘获装置入口上游的管线，将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入细胞俘获装置中，该装置能充分俘获欲回收细胞，并充分允许欲去除细胞从其通过。将所得含有欲去除细胞的液体通过该细胞俘获装置的出口除去，然后通过连接于该细胞俘获装置出口下游的管线，将粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的液体加入该细胞俘获装置中，以通过连接于该细胞俘获装置入口上游的管线，回收已被该细胞俘获装置俘获的欲回收细胞。
本发明的另一方面涉及一种含有造血干细胞的液体，它基本上不合红细胞和/或血小板，其粘度为不高于500mPa·s且不低于5mPa·s。
本发明的另一方面涉及一种含有欲回收细胞且基本上不含欲去除细胞的液体，它是通过一种细胞分离方法得到的，该方法包含以下步骤：将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入一种细胞俘获装置中，该装置能充分俘获欲回收细胞，并充分允许欲去除细胞从其通过。将所得含有欲去除细胞的液体从该细胞俘获装置中除去，然后将粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的液体加入该细胞俘获装置中，以从中回收已被该细胞俘获装置俘获的欲回收细胞。
本发明的另一方面涉及一种用于从细胞俘获装置回收被俘获细胞的液体，其粘度不超过500mPa·s且不低于5mPa·s。
                     附图简述
图1为本发明细胞分离系统的一个实施方案。
图2为实施例1中所用细胞分离系统的示意图。
图3为实施例4中所用细胞分离系统的示意图。
               本发明的最佳实施方式
在本说明书中，“欲回收细胞”是指自其分离和回收后可用于某些目的的细胞。“欲去除细胞”是指上述目的所不需要的细胞，或者是应该明确去除的细胞，因为它们是例如致病性细胞，它们对欲回收细胞的污染会带来麻烦。
含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体可以是，但不限于：外周血、骨髓、脐带血(包括从脐带血管和胎盘血管采集的血液)、淋巴液以及对上述液体进行诸如离心等处理而得到的液体，以及将从任何各种器官或组织提取的细胞再悬浮于某些液体中而得到的悬液。
术语“有核细胞”是指其中有核的细胞。有核细胞包括诸如白细胞、粒细胞、嗜中性白细胞、嗜碱细胞、嗜酸性粒细胞、髓细胞、成红细胞、淋巴细胞、T淋巴细胞、辅助T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、抑制性T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、破骨细胞、成骨细胞、骨细胞、造血干细胞、成纤维细胞和成软骨细胞。
“含有造血干细胞的单核细胞级分”是指含有造血干细胞和/或造血祖细胞(下文中将它们统称为“造血干细胞”)的单核细胞群。“单核细胞”是其中具有一个核的细胞的统称，具体的例子包括淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)、单核细胞、造血干细胞、髓细胞、母细胞等。
单核细胞群中造血干细胞的含量通常为0.01％至99％，并根据起始细胞群的种类以及是否对细胞进行了处理而不相同。例如，对于一个正常人而言，造血干细胞的含量，在外周血中通常为约0.01％，在脐带血中通常为0.05％至1.0％，在骨髓中通常为0.5％至2％。在给予了粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的外周血中，不同的个体之间的造血干细胞含量显著不同，从0.1％至百分之几不等。当使用单克隆抗体进行细胞分离时，特别是使用流式细胞术进行细胞分离时，在某些情况下，造血干细胞的含量可达99％。不管在何种情形下，术语“含有造血干细胞的单核细胞级分”都丝毫未具体指定造血干细胞的含量。
本说明书中所提到的无核细胞包括，例如，红细胞和血小板。
本说明书中所说的“欲去除细胞与欲回收细胞有不同的表面标志”，意思是欲回收细胞和欲去除细胞同样都是有核细胞，但其表面标志不同(欲回收细胞和欲去除细胞分属不同的亚群)。例如，欲回收细胞是辅助T淋巴细胞(具有抗CD4抗原为表面标志)，而欲去除细胞是抑制性T淋巴细胞(具有抗CD8抗原为表面标志)。
当欲回收细胞是有核细胞、欲去除细胞是无核细胞时，它们的组合及其用途的实例如下所述，但不限于这些：
1、欲回收细胞：白细胞；欲去除细胞：红细胞；用途：干扰素制备。
2、欲回收细胞：淋巴细胞；欲去除细胞：红细胞和血小板；用途：过继免疫治疗。
3、欲回收细胞：含有造血干细胞的单核细胞级分；欲去除细胞：红细胞和血小板；用途：造血干细胞移植术。
当欲回收细胞是有核细胞、欲去除细胞是具有不同于欲回收细胞的表面标志的有核细胞时，它们的组合及其用途的实例如下所述，但并不限于这些：
1、欲回收细胞：CD34阳性有核细胞；欲去除细胞：CD34阴性有核细胞；用途：CD34阳性细胞移植术。
2、欲回收细胞：CD8阳性T淋巴细胞；欲去除细胞：CD8阴性T淋巴细胞；用途：过继免疫治疗。
当欲回收细胞为有核细胞、欲去除细胞为无核细胞和具有不同于欲回收细胞的表面标志的有核细胞时，它们的组合及其用途的实例如下所述，但不限于这些：
1、欲回收细胞：CD34阳性有核细胞；欲去除细胞：红细胞、血小板和CD34阴性有核细胞；用途：CD34阳性细胞移植术。
2、欲回收细胞：CD8阳性T淋巴细胞；欲去除细胞：红细胞、血小板和CD8阴性T淋巴细胞；用途：过继免疫治疗。
在本发明中，能至少俘获欲回收细胞、并充分允许欲去除细胞从其通过的细胞俘获装置，可以包含一个容器，该容器有一个液体入口和一个液体出口，并装满了能俘获欲回收细胞而充分允许欲去除细胞从其通过的物质，和一个模制容器，该模制容器在其内表面有俘获细胞的表层。能俘获欲回收细胞并能充分允许欲去除细胞从其通过的物质，可以是任何常规的细胞俘获物质，只要它能选择性地俘获欲回收细胞即可。例如，下列物质由于其良好的可塑性、可消毒性和低细胞毒性而成为优选的物质：合成聚合物，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、丙烯酸树脂、尼龙、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚氨酯等；天然聚合物，如琼脂糖、纤维素、乙酸纤维素、壳多糖、脱乙酰壳多糖、藻酸盐等；无机物，如羟磷灰石、玻璃、矾土、二氧化钛等；以及金属，如不锈钢、钛、铝等。
这些俘获物质可以就原样使用，或对其表面进行必要的修饰以选择性地通过或俘获细胞后再使用。例如，为了提高血小板的通透性，在国际申请公开WO87/05812上记载了一种方法，用具有非离子性的亲水基和碱性含氮官能团的聚合物进行涂覆。作为一种可选择性地俘获细胞的方法，可以使用对特定细胞具有亲和力的配体，诸如氨基酸、肽、糖或糖蛋白(包括诸如抗体和粘附分子的生物配体)进行固定的方法，例如，JP-A-2-261833中所提出的卤代乙酰胺法。
俘获物质的形状可以是颗粒、纤维团、纺织织物、非纺织织物、海绵结构、平板等。颗粒、纤维团、纺织织物、非纺织织物和海绵结构是优选的，因为它们的单位体积具有较大的表面积。从便于加工的观点出发，多孔结构，如纤维团、纺织织物、非纺织织物和海绵结构更为优选，其中，从细胞悬浮液的可流动性和生产率角度出发，非纺织织物和海绵结构是最为优选的。
当使用非纺织织物时，若织物表面上未固定所谓的能与特定细胞特异性结合的生物配体，如抗CD34单克隆抗体，则其纤维直径一般不超过30μm并不小于1.0μm。优选为不超过20μm并不小于1.0μm，更优选为不超过10μm并不少于1.5μm。当纤维直径小于1.0μm时，欲回收细胞易被紧紧俘获而变得难以回收，这是我们所不期望的。当纤维直径大于30μm时，欲回收细胞极易通过非纺织物质，而不被纤维俘获。这两种结果都不理想，因为都将降低回收率。
当使用海绵结构时，其孔大小一般不超过25μm并不低于2.0μm，优选为不超过20μm并不低于3.0μm，更优选为不超过15μm并不低于4.0μm。当孔的大小小于2.0μm时，流动性会很低，由此使得经过该海绵结构的液体难以从其通过。当孔的大小超过25μm时，欲回收细胞的俘获率不期望地下降，导致回收率降低。
装满了能俘获欲回收细胞而充分允许欲去除细胞从其通过的物质的容器，优选但不限于使用下列具有良好可塑性、可消毒性和低细胞毒性的材料：合成聚合物，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、丙烯酸树脂、尼龙、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酰胺、聚氨酯、聚氯乙烯等；无机物，如羟磷灰石、玻璃、矾土、二氧化钛等；以及金属，如不锈钢、钛、铝等。
在其内表面上具有细胞俘获表面的模制容器，即装满了细胞俘获物质的容器以外的细胞俘获装置的例子，可以是瓶、皿、锥形管、注射管、血袋等。
在本说明书中，“充分俘获欲回收细胞”是指俘获了含细胞液体中的60％以上欲回收细胞。“充分允许欲去除细胞从其通过”是指含细胞液体中的60％以上欲去除细胞能够通过。
在本发明中，已被细胞俘获装置俘获的欲回收细胞，通过使用具有特定粘度的液体(下文中也称作“回收液”或“回收用液体”)进行回收。此液体的粘度应该不超过500mPa·s且不低于5mPa·s，优选为不超过100mPa·s且不低于5mPa·s，更优选为不超过50mPa·s且不低于7mPa·s。当粘度低于5mPa·s时，回收率低，当粘度高于500mPa·s时，液体很难从细胞俘获装置通过，即使是使用泵也很难，从而导致工作效率很低。并且，会导致压力升高，使得管线中管之间连接处易发生渗漏。因此，这些粘度值都不是所期望的。测定粘度的优选方法是使用旋转粘度计，因为它最简便，并具有较高的精密度。
任何液体都可用作回收液，只要其对细胞没有什么不期望的影响即可。例如，可以使用合成聚合物溶液，如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等的溶液；天然聚合物溶液，如甲基纤维素、明胶、羟乙基淀粉、葡聚糖、壳多糖衍生物、胶原蛋白、纤连蛋白、白蛋白、球蛋白等的溶液；有机物溶液，如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、山梨糖醇、甘油、二甲基亚砜、硅油等的溶液；以及它们的混合物。根据本发明人的研究结果，发现使用葡聚糖可以获得特别高的回收率。因此，下文详述葡聚糖的使用。
本文中的葡聚糖是指葡萄糖聚合物，其中多数葡萄糖单元由α-1，6键连接。葡聚糖包括其部分水解产物及其衍生物，如硫酸酯。尽管对葡聚糖的分子量没有限制，但从其可溶性、可获得性等考虑，其平均分子量优选为1,000-10,000,000，更优选为5,000-5,000,000，最优选为10,000-1,000,000。由于粘度即使在相同浓度时仍取决于分子量，因此浓度的分子量应当适当调整，使得粘度不超过500mPa·s且不低于5mPa·s。无菌葡聚糖40注射液(分子量为约40,000的葡聚糖在生理盐水中的10w/v％溶液)是一种上市的、已获得批准的药品，因而可以适当地使用。为了将粘度调整为不超过500mPa·s且不低于5mPa·s，葡聚糖可以单独使用或者与其他物质混合使用。这些物质的实例是合成聚合物，如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等；天然聚合物，如甲基纤维素、明胶、羟乙基淀粉、葡聚糖、壳多糖衍生物、胶原蛋白、纤连蛋白、白蛋白、球蛋白等；有机物，如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、山梨糖醇、甘油、二甲基亚砜等。尽管目前仍不知道使用葡聚糖可以较高回收率回收细胞的机理，本发明人推测葡聚糖有降低细胞对俘获物质的粘附性的性能。
在配制粘度不超过500mPa·s且不低于5mPa·s的液体时，用于溶解溶质的溶剂可以是生理盐水，缓冲溶液，如Dulbecco磷酸盐缓冲溶液(D-PBS)、Hank’s平衡盐溶液(HBSS)等，以及诸如RPMI1640等培养基。如有必要，为了提供营养物、保护细胞膜或是提供抗凝效果等，可以在该液体中掺入葡聚糖、羟乙基淀粉、白蛋白、球蛋白、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、球蛋白、柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖(CPD)、酸-柠檬酸盐-葡萄糖(ACD)、EDTA、肝素等。
按照本发明的具有特定粘度的液体优选为能用于欲回收细胞的深低温保藏或者以液态保藏细胞的液体。如上所述，对于造血干细胞移植术，特别是用脐带血进行造血干细胞移植术时，要对用菲可法或类似方法分离的不含红细胞的细胞群进行洗涤(因为菲可溶液是有毒的)，并向其中加入冷冻保护剂或类似物，以制备细胞悬液，接着在液氮或冰箱中进行深低温保藏，直到需要使用时。在本发明中，在完成细胞分离后配制拟保藏的细胞悬液时无需麻烦的操作，只需使用一种具有特定粘度的液体，该液体不仅适于保藏，特别是深低温保藏，而且适合于回收。适于深低温保藏并作为冷冻保护剂的回收用液体的具体实例是营养物或细胞膜保护组分等。冷冻保护剂根据作用机制分为两类：1)胞外冷冻保护剂，和2)胞内冷冻保护剂。在第一类中，一般使用水溶性聚合物，如羟乙基淀粉、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等。在第二类中，一般使用低分子量有机化合物，如二甲基亚砜、甘油等。营养物包括糖类，如葡萄糖等，以及各种细胞培养基。细胞膜保护组分一般使用白蛋白。在有些情形下使用血浆作为营养物和细胞膜保护组分的混合物。如上所述，这些组分优选单独使用，或与具有本发明特定粘度的回收用液体结合使用。上述组分可以在细胞回收后进行深低温保藏时加入。
通常使用两种冷冻方法，即使用-80℃下的深度冷冻机的单一方法，或包括在程控冰箱中缓慢冷却并在液氮中保藏等步骤的方法。在对进行了深低温保藏的细胞进行融化时，一般是在37℃的温浴中进行快速融化。
将本说明书中所提到的含细胞液体加入细胞俘获装置的方法，可以采用下列两种之一：一是通过管子连接上含有含细胞液体的袋子或瓶子，然后利用其落差、滚柱泵或挤压袋子使该液体流动，从而加入该液体；二是将含有含细胞液体的注射器与其相连，通过手动或使用诸如注射器泵等设备推动该注射器的活塞而加入该液体。用手推动的特点是简单方便，而使用设备的特点是便于控制回收液加入时的流速。因此，应根据不同目的而选择合适的方法。
当将含细胞液体加入细胞俘获装置时，欲回收细胞会被俘获，而欲去除细胞会流走，但在某些情形下，容器中仍会剩余少数欲去除细胞。因此，优选清洗细胞俘获装置，以洗去少量剩余的欲去除细胞。可以使用任何清洗剂，只要它是生理溶液即可。其例子有生理盐水、缓冲溶液如Dulbecco磷酸盐缓冲液(D-PBS)、Hank’s平衡盐溶液(HBSS)等，以及诸如RPMI1640等培养基。如有必要，可以向上述生理溶液中加入葡聚糖、羟乙基淀粉、白蛋白、球蛋白、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、球蛋白、柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖(CPD)、酸-柠檬酸盐-葡萄糖(ACD)、EDTA或肝素等，为的是提供营养物，保护细胞膜或是提供抗凝效果等。
加入清洗剂有两种方向，即与含细胞液体加入方向相同的方向，和与其相反的方向。这二者中，相同的方向是优选的。在相反方向的情形中，已被俘获的欲回收细胞易因清洗而漏走。清洗剂的粘度优选小于5mPa·s。当粘度为5mPa·s或更高时，已被俘获的欲回收细胞易漏出。
在本发明中，可以采用两种方法将粘度不超过500mPa·s且不低于5mPa·s的液体加入上述细胞俘获装置，一种是通过管子将含有该液体的袋子或瓶子与该细胞俘获装置相连，利用其落差、滚泵、通过挤压袋子而将该液体加入。另一种是将含有该液体的注射器与其相连，通过用手或使用诸如注射器泵之类的设备推动注射器的活塞而将该液体加入细胞俘获装置。在这种情形下，该液体有两种加入方向，即与含细胞液体加入方向相同的方向，和与其相反的方向。这二者中，后者通常是优选的，因为有更高的细胞回收率。回收液的流速优选比较快，因为这将提高回收率。流速除以过滤截面积所得的线速率通常为0.5厘米/分钟或以上，优选为5厘米/分钟或以上，更优选为10厘米/分钟或以上。
通过在加入回收液后再加入另一种液体，也有可能回收残留在细胞俘获装置中的少量细胞(或其组分)。通过这种回收，可以在细胞分离过程的同时采集用于HLA分型的样品，这种HLA分型在例如造血干细胞移植术中是必需的。残留在细胞俘获装置中的少量细胞(或其组分)可用于HLA分型以外的多种目的，如对造血干细胞的离体膨胀的研究、基因诊断，或与第一次回收所得细胞一起用于细胞移植术中。下文进一步简要解释HLA分型。
HLA分型是利用有核细胞的核中存在的DNA进行的。因此，回收DNA比回收细胞本身更为优选，因为这样比较省力。相应地，优选用能裂解或破裂细胞的液体作为回收液。这种液体包括例如低渗溶液，如表面活性剂溶液(例如十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠和曲通X-100)、蒸馏水、离子交换水等。利用这种液体回收的DNA可通过众所周知的酚·氯仿法或类似方法进行纯化，然后用于HLA分型。
在本发明中，所回收的细胞可以保藏到使用。保藏的方法有两种，一种是以液态保藏，一种是深低温保藏。通常采用深低温保藏，因为液态保藏的时间有限，以造血干细胞为例，最多能保藏2至3天。
接下来解释一下本发明的细胞分离系统。在本说明书中提到的管线，即连接于细胞俘获装置入口上游、用于将含细胞液体加入细胞俘获装置的管线，是一根能与例如储备含细胞液体的容器相连接的管线，或是一根能与活体组织相连的管线，该活体组织中存在含细胞液体。前者的具体实例有：当储备含细胞液体的容器是血袋时，可合适地选用配备有刺突(spike)的管子或配备有路厄接头(外接头或内接头)的管子；当用无菌连接管连接(下文称之为“SCD连接”)时，可合适地选用一纯粹的管子。另外，当储备含细胞液体的容器是配备有针头的注射器时，可合适地选用带有隔膜的可刺入针的管子作为管线；或者，当该容器是带有路厄口而非针头的注射器时，可合适地选用路厄接头(内接头)作为管线。后者的具体实例如下：例如，当使用脐带血、前述活体组织为脐带和/或胎盘时，可作为管线的是配备有可刺入脐带或胎盘的金属针头的管子。当使用管子时，可以在其两端之间装配一个用于开闭该管线的夹子，用于调节流速的滚夹，用于去除聚集体的筛网室，用于提供流速的注射器(包括改变流路的装置)，等等。当使用注射器时，它可以不经管子而直接与细胞俘获装置的入口相连。
本说明书中所提到的另一种管线，即连接于前述细胞俘获装置出口下游、用于将液体加入前述细胞俘获装置的管线，包括按照下述方法划分的各类管线。这些管线的划分方法是：含有拟加入细胞俘获装置的液体的容器是否事先已连接好，还是可随后再连接的，以及用于加入该液体的装置是怎样的。也就是说，当含有拟加入细胞俘获装置的液体的容器是以前就连接好的，这些管线包括诸如配备有袋子的管子以及注射器。在使用袋子的情况下，将液体加入细胞俘获装置的方法包括利用该液体落差的方法、挤压袋子的方法、使用滚泵的方法等。当含有拟加入细胞俘获装置的液体的容器是后面连接的，则选用下列管子：当用注射器时，管线包括可与该注射器相连的带有隔膜的可刺入针的管子、配备有路厄接头(内接头)的管子、配备有三路活塞的管子等。当使用袋子时，可合适地选用可与该袋子相连的管线，即配备有刺突的管子，或配备有路厄接头(外接头或内接头)的管子作为前述管线。当进行SCD连接时，可合适地选用一纯粹的管子作为前述管线。当使用注射器时，它可以不经管子而直接与细胞俘获装置的出口相连接。
本说明书中所提到的另一种管线，即连接于前述细胞俘获装置入口上游、用于从前述细胞俘获装置的入口侧回收细胞的管线，包括下列按照用于回收从细胞俘获装置流出的细胞的容器进行划分的管线。也就是说，当将细胞回收到袋子里时，可合适地选用与袋子相连或可与其相连的管线，即配备有刺突的管子或配备有路厄接头(外接头或内接头)的管子作为前述管线。当进行SCD连接时，可合适地选用一纯粹的管子作为前述管线。当将细胞采集到锥形管中时，可以使用任何末端开口的管线。当使用带有路厄口的注射器采集细胞时，可以使用路厄接头(内接头)、三路活塞等。当使用注射器时，它可以不经管子而直接与细胞俘获装置的入口相连。
除了这些管线外，例如，用于回收从细胞俘获装置流出的细胞的容器最好能经得住冰冻和融化，如是冰冻袋，因为这样可以省略将细胞转移到冰冻袋的过程。深低温保藏袋的例子有冰冻袋，如Baxter生产的“Cryocyte”，Charter Med生产的“细胞冰冻袋”，NPBI生产的“血液冰冻袋”等。
在回收已被细胞俘获装置俘获的细胞之前，为了清洗掉细胞俘获装置中残留的少量欲去除细胞，可以将一根管线加到本发明的细胞分离系统上，用于将液体加入该细胞俘获装置中。这类管线包括按照以下方法划分的管线。划分的方法是：含有液体的容器是否事先已连接好，还是可随后再连接的，以及用于加入该液体的装置是怎样的。也就是说，当含有液体的容器是事先就连接好的时，这些管线包括例如配备有袋子的管子以及注射器。当含有液体的容器是后面连接的，则选用以下类型的管子：当用注射器时，管线包括可与该注射器相连的带有隔膜的可刺入针的管子，和配备有路厄接头(内接头)的管子。当使用袋子时，可合适地选用可与该袋子相连的管线，即配备有刺突的管子，或配备有路厄接头(外接头或内接头)的管子作为该管线。当进行SCD连接时，可合适地选用一纯粹的管子作为所述管线。当使用注射器时，它可以不经管子而直接与细胞俘获装置的出口相连接。尽管所述管线可以连接到细胞俘获装置的入口侧或出口侧，但从易于操作的角度出发，优选连接到入口一侧。
本细胞分离系统中可以增加一根管线，用于在回收完欲回收细胞后再进一步加入一种液体，从而收集细胞俘获装置中残留的细胞(或其组分)。当回收的细胞与第一次回收的细胞具有不同使用目的时，例如，当使用能裂解或破裂细胞的溶液来收集细胞俘获装置中残留的细胞(或其组分)以用于HLA分型时，该管线应当包含一个用于改变流路的装置，和众多分支，以使后来收集的细胞(或其组分)不与前面回收的细胞相混。改变流路的装置可以包括夹子、刺突等。
利用上述管线系统进行细胞分离的方法包括以下步骤：通过连接于上游的管线，将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入一个能充分俘获欲回收细胞并充分允许欲去除细胞从其通过的细胞俘获装置中。将所得含有欲去除细胞的液体通过该细胞俘获装置的出口除去，然后，通过连接于细胞俘获装置出口下游的管线，将粘度不超过500mPa·s且不低于5mPa·s的液体加入该细胞俘获装置中，以回收细胞。保藏回收后的细胞时，将连接于细胞俘获装置入口上游并含有所回收细胞的管线(如冰冻袋)封闭并分离开。例如，可如下所述进行密封和分离：用热封机或类似装置通过热熔合将管线封闭，然后将其切断，或是将通过路厄接头连接的管子从主体上卸下来，然后用热封机或类似装置进行热熔合。在任何情形下，术语“封闭与分离”丝毫未指定操作的顺序(如密封后再分离)。
本发明还提供了一种含有造血干细胞的液体，其中基本不含红细胞和/或血小板，且粘度不超过500mPa·s、不低于5mPa·s。这里所说的“基本不含”是指该含细胞液体是从一含细胞的起始液体中去除了60％以上的红细胞和/或血小板后制得的。虽然脐带血除含有造血干细胞外，还含有红细胞，但通过应用本发明的细胞分离方法就可获得基本不含红细胞的造血干细胞悬液。此外，该含细胞液体中可以含有深低温保藏剂。
本发明还提供了一种含有欲回收细胞且基本不含欲去除细胞的液体，该液体可以用包括以下步骤的细胞分离方法获得：将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入一个能充分俘获所述欲回收细胞而充分允许所述欲去除细胞从其通过的细胞俘获装置中。将所得含有欲去除细胞的液体从该细胞俘获装置中除去，然后向该细胞俘获装置中加入粘度不超过500mPa·s且不低于5mPa·s的液体，以回收已被该细胞俘获装置俘获的细胞。当本发明的分离方法用于含有欲回收细胞和欲去除细胞的悬液时，就有可能有效地提供一种基本含有欲回收细胞的悬液。
本发明还提供了一种粘度不超过500mPa·s且不低于5mPa·s的液体作为从细胞俘获装置回收被俘获细胞用的液体。该液体优选是也可用作细胞保护剂的一种液体。进行液态保藏时，保护剂的具体实例有糖类(如葡萄糖)、营养物(如各种细胞培养基)、细胞膜保护组分(如白蛋白)、以及营养物与细胞膜保护组分的混合物(如血浆)。进行深低温保藏时，除了上述实例外，保护剂还包括冷冻保护剂。根据作用机制，冷冻保护剂可分为两类：1)胞外冷冻保护剂，2)胞内冷冻保护剂。在第一类中，一般使用水溶性聚合物，如羟乙基淀粉、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮等。在第二类中，一般使用低分子量的有机化合物，如二甲基亚砜、甘油等。
下面参照附图，解释按照本发明细胞分离系统的一个实施方案，该方案不应理解为是对本发明范围的限制。
图1显示了本发明细胞分离系统的一个实施方案。在该系统中，以下所有连接都是用刺突完成的：起始细胞袋(内装含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体)与本发明系统主体的连接；用于回收从细胞俘获装置出口流出的液体的袋子与本发明系统主体的连接；用于从细胞俘获装置的出口侧回收细胞的袋子与本发明系统主体的连接。在该系统中有一个三路活塞，用来连接带有外路厄开口的注射器，以用于将液体加入细胞俘获装置中。
在图1中，数字1表示能充分俘获欲回收细胞并充分允许欲去除细胞从其通过的细胞俘获装置。数字2表示用于将含细胞液体从起始细胞袋加入细胞俘获装置中的管线，它包含刺突2-1，夹子2-2和管子2-3。数字3表示用于将从细胞俘获装置1的出口流出的液体排出去的管线，它包含刺突3-1和管子3-2。数字4表示用于将液体从细胞俘获装置1的出口侧加入该细胞俘获装置的管线，它与管线3共用管道，并有与注射器相连的三路活塞4-1。数字5表示用于从细胞俘获装置的入口侧回收细胞的管线，它包含刺突5-1，夹子5-2，管子5-3和管子2-3的一部分。该管线从细胞俘获装置1的入口到管子5-3与管子2-3分岔的那一点之间与管线2共用管子2-3。
下面解释细胞俘获装置的使用方法。最初，关闭夹子2-2，仅在与注射器相连的方向上关闭三路活塞4-1，并关闭夹子5-2。然后，将刺突2-1刺入起始细胞袋中，将刺突3-1刺入一个空袋中。打开夹子2-2时，含细胞液体就通过管线2的管子2-3流入细胞俘获装置1中。欲回收细胞被俘获，而欲去除细胞流出，然后通过管线3的管子3-2收集到空袋中。在完成了对含细胞液体的处理后，关闭夹子2-2，从起始细胞袋中抽出刺突2-1，并刺入商业上可获得的生理盐水瓶中。打开夹子2-2时，生理盐水即清洗细胞俘获装置1，并通过管线3收集到已收集了欲去除细胞的袋子里。清洗完成后，关闭夹子2-2和管子3-2。随后，将含有粘度不超过500mPa·s且不低于5mPa·s的液体的注射器与三路活塞4-1相连，将刺突5-1刺入细胞回收袋中。转动三路活塞，使注射器仅与细胞俘获装置1相通。打开夹子5-2后，推动注射器的活塞以将液体从细胞俘获装置1的出口侧加入其中，这样，被细胞俘获装置俘获的细胞就通过管线5回收到细胞回收袋中。
下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但不应理解为是对本发明范围的限制。实施例1
本工作实施例显示了一个分离细胞的例子，其中含细胞液体为脐带血，欲回收细胞是含有造血干细胞的单核细胞级分，欲去除细胞是红细胞和血小板。
①细胞分离器
外部尺寸(长×宽×厚度)为41×41×18mm的聚碳酸酯容器在对角线上有一个液体出口和一个液体入口，在其入口侧填充了12块平均纤维直径为2.3μm的聚酯非纺织织物，在其出口侧填充了25块平均纤维直径为12μm的聚酯非纺织织物，填充密度为0.24g/cm3，有效过滤面积为9cm2，有效过滤长度为12.4mm。为了使血小板能够渗过所得滤器，用亲水聚合物进行涂层。具体而言，从该滤器的入口侧让甲基丙烯酸羟乙酯·甲基丙烯酸二甲胺基乙酯共聚物(甲基丙烯酸羟乙酯与甲基丙烯酸二甲胺基乙酯的摩尔比为97∶3)的1％乙醇溶液通过该滤器，然后导入氮气使滤器干燥。
②回收液的制备
将商业上可获得的葡聚糖40的生理盐水溶液(可从绿十字公司购得，商品名为葡聚糖40 Injection-Midori)与人血清白蛋白混合，制成含有4％人血清白蛋白的液体，作为回收液A。该回收液A用生理盐水分别稀释1.2倍或1.3倍，以获得回收液B和回收液C。这些回收液的粘度分别为：回收液A 10.5mPa·s，回收液B 8.0mPa·s，回收液C 5.3mPa·s。
③细胞分离过程和管线系统
分娩后，从胎盘和脐带中采集200ml脐带血，这些血含有15vol％CPD，将其分成四份。利用所分成的相同血样，在四种回收液粘度值(包括对比例1中的值)下进行实验。
如图2所示，一血袋与上述①中制得的细胞分离器6的入口侧相连，相连是通过一根管子实现的，在这根管子的两端之间有一个三路活塞9、一个筛网室8、和一个配备了将与清洗用生理盐水瓶连接的刺突13的管子的分叉点，有一个用于回收细胞的袋子10与三路活塞9相连。引流袋12与细胞分离器6的出口侧通过一根管子相连，该管子在其两端之间有一个用于连接回收用注射器的三路活塞11。
将起始血袋7中的含有有核细胞的液体以约60cm的落差加入细胞分离器中，将从细胞分离器6流出的含有红细胞和血小板的液体排出到引流袋12中。然后，将刺突13刺入生理盐水瓶中，打开夹子14，用约20ml生理盐水冲洗滤器的内部，以洗掉滤器中残留的少量红细胞和血小板。随后，将含有25ml每种回收液的30ml一次性注射器与三路活塞11相连，并调整三路活塞11的方向，使注射器只与细胞分离器相通。将三路活塞9的方向调整为细胞分离器6仅与细胞回收袋10相通。然后，推动注射器的活塞，将细胞分离器中俘获的细胞回收到细胞回收袋10中。
④分析
用自动血细胞计数器测定有核细胞的数量、单核细胞的数量、红细胞的数量和血小板的数量。按照包含显示SSC-FITC的流式细胞计量术，利用FITC标记的抗CD34抗体，测量基于有核细胞总数的CD34阳性细胞的百分率(Miyazaki等人，“Nichijo Shinryo toKetsueki(实用血液学)”第5卷，第2期，第21-24页，1995年)。
回收与去除率是用下列公式计算的：
回收率(％)＝100×(回收细胞数/起始细胞群中的细胞数)
去除率(％)＝100-100×(回收细胞数/起始细胞群中的细胞数)
⑤结果
完成推压注射器活塞所需时间为3秒。线速率计算为55.6厘米/分钟。表1总结了结果。从中可以看出，有核细胞、单核细胞和CD34-阳性细胞可以较高百分率回收到回收后的细胞悬液中，而红细胞和血小板以较高百分率被去除。表1
 回收液(mPa·s) 回收率(％) 去除率(％)
有核细胞 单核细胞 CD34阳性细胞 红细胞 血小板
A(10.5) 75.2 90.2 97.0 99.0 88.0
B(8.0) 74.0 90.0 96.6 99.0 88.0
C(5.3) 73.0 89.6 95.5 99.0 88.0
按照由Kyokuto制药工业有限公司生产的冷冻保护剂“CP-1”的用户说明中描述的方案，对利用回收液回收的细胞进行深低温冷藏。具体而言，在回收的细胞悬液中加入二甲基亚砜，将其终浓度调节到5％，将所得混合物在-80℃的深度冷冻机中进行深低温保藏。深低温保藏30天后，将该混合物在37℃的温浴中迅速融化，用传统的台盼蓝排除法测定细胞活力，发现其保持了较高值，为90.4％。对比例1
在本对比例中，将利用低粘度的、不含葡聚糖的回收液得到的结果与实施例1中得到的结果进行比较。与实施例1中相同，本对比便中含细胞液体为脐带血，欲回收细胞是含有造血干细胞的单核细胞级分，欲去除细胞是红细胞和血小板。
①细胞分离器
与实施例1中所用的细胞分离器相同。
②细胞分离过程和管线系统
将实施例1中得到的脐带血的一部分用作起始脐带血。重复实施例1的步骤，唯一不同的是用25ml生理盐水作为回收液。使用与实施例1相同的管线系统，回收液的粘度为1.0mPa·s。
③分析
进行和实施例1相同的分析。
④结果
完成推压注射器活塞所需时间为3秒，表2总结了结果。回收的细胞悬液中有核细胞、单核细胞和CD34阳性细胞的回收百分率比实施例1中的低。
表2
回收液(mPa·s) 回收率(％) 去除率(％)
有核细胞 单核细胞 CD34阳性细胞 红细胞 血小板
生理盐水(1.0) 31.0 40.0 45.0 99.0 89.7
实施例2
本工作实施例显示了一个细胞分离的例子，其中含细胞液体是外周血，欲回收细胞是白细胞，欲去除细胞是红细胞和血小板。
①细胞分离器
外部尺寸(长×宽×厚度)为41×41×18mm的聚碳酸酯容器在对角线上有一个液体出口和一个液体入口，在其入口侧填充了25块平均纤维直径为12μm的聚酯非纺织织物，在其出口侧填充了12块平均纤维直径为2.3μm的聚酯非纺织织物，填充密度为0.24g/cm3，有效过滤面积为9cm2，有效过滤长度为12.4mm。为了使血小板滤过所得滤器，用亲水性聚合物进行涂层。从该滤器的入口侧让甲基丙烯酸羟乙酯·甲基丙烯酸二甲胺基乙酯共聚物(甲基丙烯酸羟乙酯与甲基丙烯酸二甲胺基乙酯的摩尔比为97∶3)的1％乙醇溶液通过该滤器，然后向其中导入氮气使滤器干燥。
②细胞分离过程
利用落差(约60cm；流速约为5毫升/分钟)将一健康人的50ml全外周血(含15vol％CPD)通过液体入口加入所得细胞分离器中。然后，借助落差(约60cm)使30ml生理盐水通过该细胞分离器，以清洗掉残留在细胞分离器中的红细胞和血小板。然后，利用泵将聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量：360,000)的3.5％生理盐水溶液30ml以100毫升/分钟的速度通过液体出口加入细胞分离器中，并通过液体入口回收细胞。该回收液的粘度为20.3mPa·s。
③分析
用自动血细胞计数器测定白细胞的数量、红细胞的数量和血小板的数量。
④结果
表3中总结了结果。白细胞以较高百分率回收于回收的细胞悬液中，而红细胞和血小板以较高百分率被去除。线性速率计算为11.1厘米/分钟。
表3
回收率(％) 去除率(％)
白细胞 红细胞 血小板
75.0 99.1 90.3
实施例3
本工作实施例显示了一个细胞分离的例子，其中含细胞液体是脐带血，欲回收细胞是造血干细胞(CD34阳性细胞)，欲去除细胞是红细胞和血小板。
①细胞分离器
外部尺寸(长×宽×厚度)为41×41×18mm的聚碳酸酯容器在对角线上有一个液体出口和一个液体入口，在其入口侧填充了12块平均纤维直径为12μm的聚酯非纺织织物，在其出口侧填充了25块平均纤维直径为2.3μm、带有固定其上的抗人CD34单克隆小鼠抗体(克隆名：Immu133，可从Coulter公司获得；下文简称为“CD34抗体”)的聚苯乙烯非纺织织物，所得滤器的填充密度为0.2g/cm3。抗人CD34单克隆小鼠抗体是利用JP-A-2-261833中提出的有名的卤代乙酰胺方法固定到聚苯乙烯上的。具体而言，将聚苯乙烯非纺织织物(事先剪成上述大小)浸入一处理液中，在室温下反应5小时以活化该聚苯乙烯非纺织织物，该处理液是通过将3.6g羟基甲基碘乙酰胺和25g三氟甲磺酸加入165ml四氢噻吩砜中而制得的。由此活化的非纺织织物用D-PBS洗涤，之后，为了将抗体固定其上，将其浸入已用D-PBS将浓度调节到20μg/ml的10ml CD34抗体溶液中这2小时。随后，用D-PBS洗涤并冷冻干燥，由此得到有抗体固定其上的非纺织织物。
②回收液的配制
将商业上可获得的葡聚糖40的生理盐水溶液(可从绿十字公司购得，商品名为葡聚糖40 Injection-Midori)与人血清白蛋白混合，制成含有4％人血清白蛋白的液体，作为回收液。该回收液的粘度为9.8mPa·s。
③细胞分离方法
将含有50ml新鲜人脐带血(含15vol％的抗凝剂CPD)的血袋通过一根管子与上述①中制得的细胞分离器的入口侧相连，该管子在其两端之间有分别向生理盐水袋和细胞回收袋分叉的岔口。引流血袋通过一根在其两端之间有三路活塞的管子与细胞分离器的出口侧相连。利用其落差(约60cm)将50ml新鲜脐带血加入细胞分离器中。已流出滤器的含有红细胞的液体(也含CD34阴性细胞和血小板)回收到引流袋中。然后，让30ml生理盐水通过该滤器，以清洗掉残留在滤器中的红细胞、血小板和CD34阴性细胞。
随后，将含有30ml在上述②中配制的回收液的注射器与在细胞分离器出口侧的管子的三路活塞相连。推动注射器的活塞，将回收液加入细胞分离器中，以将俘获的细胞回收到与入口侧相连的袋子中。
④分析
进行与实施例1相同的分析。
⑤结果
完成推压注射器活塞所需时间为3秒，线性速率计算为55.6厘米/分钟。表4总结了结果。从中可以看出，CD34阳性细胞能以较高百分率回收于回收的细胞悬液中，而红细胞、血小板和CD34阴性细胞以较高百分率去除。
表4
回收率(％) 去除率(％)
CD34阳性细胞 红细胞 血小板 CD34阴性细胞
78 99.2 90.4 90
实施例4
本工作实施例显示了一个细胞分离的例子，其中含细胞液体是脐带血，欲回收细胞是含有造血干细胞的单核细胞级分，欲去除细胞是红细胞和血小板，并且同时采集用于HLA分型的DNA。
①细胞分离器
与实施例1中所使用的细胞分离器相同。
②回收液的配制
将商业上可获得的葡聚糖40的生理盐水溶液(可从绿十字公司购得，商品名为葡聚糖40 Injection-Midori)与人血清白蛋白混合，制成含有4％人血清白蛋白的液体，作为第一回收液(用于细胞回收)。注射用蒸馏水和低渗溶液用作补充回收液(用于回收细胞组分)。第一回收液的粘度为10.5mPa·s。
③管线系统
图3显示的细胞分离系统可通过将上述①中所描述的细胞分离器接入到管线中而得到。在该系统中，含细胞液体的袋子与本发明系统主体的连接、用于回收从细胞俘获装置出口流出的液体的袋子与本发明系统主体的连接，都是利用刺突实现的。用于从细胞俘获装置的入口侧回收细胞的管线装配了一个用于转移细胞的回收细胞用冷冻袋，和一根末端带有刺突的管子，以用于将HLA分型用的DNA回收到锥形管中。在该管线系统中，可利用夹子来改变流路。
④细胞分离过程
利用图3所示的管线系统完成细胞分离过程。
起初，关闭夹子21，三路活塞25只关闭与注射器相通的方向，关闭夹子27和28。
将刺突20刺入含有50ml新鲜人脐带血(含15vol％的抗凝剂CPD)的血袋，将刺突23刺入一个空袋。打开夹子21时，含细胞液体通过管线16的管子22流入细胞俘获装置中，含有造血干细胞的单核细胞级分被俘获，而红细胞和血小板通过管线17的管子24排入空袋中。
在完成对所述含细胞液体的处理后，关闭夹子21并抽出刺突20，然后刺入商业上可获得的100ml生理盐水瓶。打开夹子21时，生理盐水清洗掉残留在细胞俘获装置15中的少量红细胞和血小板，生理盐水通过管线17排出。然后，关闭夹子21。接下来，将含有25ml上述②中配制的回收液的30ml注射器与三路活塞25相连。然后将三路活塞25的方向调整为注射器只通过管线18与细胞俘获装置15相通，打开夹子27。推动注射器的活塞，以通过管线19将细胞回收到冷冻袋29中。随后，从三路活塞25上卸下该注射器，在三路活塞25上连接另一个含有25ml注射用蒸馏水的注射器。关闭夹子27，打开夹子28，夹子28连结在能通过Y型管26与管线19的管子32相通的管子31上。在刺突30下放置一个锥形管，然后通过推动注射器的活塞将注射用蒸馏水加入细胞俘获装置中，以裂解所俘获的细胞，并将这些细胞中的粗DNA回收到锥形管中。所回收的粗DNA用常规方法进行纯化，包括使用蛋白酶K进行脱蛋白作用和酚·氯仿法。
⑤分析
用实施例1中所述的相同方法测定细胞数量。用常规方法测定纯DNA的量，包括利用分光光度计测量260nm处的吸光度(Nakayama等人，细胞工艺学，附刊“生物实验说明”①分子生物实验基础，1995年)。
⑥结果
完成推压注射器活塞所需时间为3秒，线性速率计算为55.6厘米/分钟。表5总结了结果。从中可以看出，真核细胞、单核细胞和CD34阳性细胞能以较高百分率回收于回收的细胞悬液中，而红细胞和血小板以较高百分率去除。同时还可以看出，所得DNA的量约为10μm，足以用于HLA分型。
表5
回收率(％) 去除率(％) 纯化DNA量(μg)
有核细胞 单核细胞 CD34阳性细胞 红细胞 血小板
75.0 90.4 97.2 98.9 88.3 9.8
实施例5
本工作实施例显示了一个细胞分离的例子，其中含细胞液体为骨髓，欲回收细胞是含有造血干细胞的单核细胞级分，欲去除细胞是红细胞和血小板。
①细胞分离器
使用与实施例1中相同的细胞分离器。
②回收液的配制
将商业上可获得的葡聚糖40的生理盐水溶液(可从绿十字公司购得，商品名为葡聚糖40 Injection-Midori)与人血清白蛋白混合，制成含有4％人血清白蛋白的液体，作为回收液。该回收液的粘度为10.1mPa·s。
③细胞分离过程和管线系统
如图2所示，含有30ml骨髓(含15单位/ml抗凝剂肝素)的血袋与①中所述的细胞分离器6的入口侧通过一根管子相连，在该管子的两端之间有一个三路活塞9、筛网室8和一个向将与清洗用生理盐水瓶连接的带有刺突13的管子的分叉点，有一个用于回收细胞的袋子10与三路活塞9相连。引流袋12与细胞分离器6的出口侧通过一根管子相连，该管子在其两端之间有一个用于连接回收用注射器的三路活塞11。将起始血袋7中的含有有核细胞的液体以约60cm的落差加入细胞分离器中，将从细胞分离器6流出的含有红细胞的液体排出到引流袋12中。然后，将刺突13刺入生理盐水瓶，打开夹子14，用约20ml生理盐水冲洗滤器的内部，以洗掉滤器中残留的少量红细胞和血小板。随后，将含有25ml回收液的30ml一次性注射器与三路活塞11相连，并调整三路活塞11的方向，使注射器只与细胞分离器相通。将三路活塞9的方向调整为细胞分离器6仅与细胞回收袋10相通。然后，推动注射器的活塞，将细胞分离器中俘获的细胞回收到细胞回收袋10中。
④分析
用自动血细胞计数器测定有核细胞的数量、单核细胞的数量、红细胞的数量和血小板的数量。按照包含在SSC-FITC上显影的流式细胞计量术，利用FITC标记的抗CD34抗体，测量基于有核细胞总数的CD34阳性细胞的百分率(Miyazaki等人，“Nichijo Shinryo toKetsueki(常规诊断与治疗，以及血液)”第5卷，第2期，第21-24页，1995年)。
回收与去除率是用下列公式计算的：
回收率(％)＝100×(回收细胞数/起始细胞群中的细胞数)
去除率(％)＝100-100×(回收细胞数/起始细胞群中的细胞数)
⑤结果
完成推压注射器活塞所需时间为3秒，线性速率计算为55.6厘米/分钟。表6中总结了结果。从中可以看出，有核细胞、单核细胞和CD34阳性细胞能以较高百分率回收于回收的细胞悬液中，而红细胞和血小板以较高百分率去除。
表6
回收率(％) 去除率(％)
有核细胞 单核细胞 CD34阳性细胞 红细胞 血小板
74.3 91.2 97.6 99.0 88.0
工业实用性
如上所述，按照本发明，可以用一种简单而快速的方法，高回收率地回收造血干细胞等有用细胞，而由此得到的含细胞液体无需随后麻烦的细胞悬液制备过程，就可以进行深低温保藏，因此可以作为一种省力的细胞加工方法，可应用于与医疗保健相关的产业，如造血干细胞移植术领域、过继免疫治疗领域等。

Claims (41)

1、一种细胞分离方法，它包含以下步骤：将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入细胞俘获装置中，该装置能充分俘获所述欲回收细胞，并充分允许所述欲去除细胞从其通过；将所得含有欲去除细胞的液体从所述细胞俘获装置中除去；然后将粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的液体加入所述细胞俘获装置中，以从中回收已被所述细胞俘获装置俘获的所述欲回收细胞。
2、按照权利要求1所述的细胞分离方法，其中所述欲回收细胞是有核细胞。
3、按照权利要求2所述的细胞分离方法，其中有核细胞是含有造血干细胞的单核细胞级分。
4、按照权利要求2所述的细胞分离方法，其中有核细胞是造血干细胞。
5、按照权利要求1的细胞分离方法，其中所述欲去除细胞是无核细胞。
6、按照权利要求5所述的细胞分离方法，其中无核细胞至少是红细胞和血小板中的一种。
7、按照权利要求1所述的细胞分离方法，其中所述欲去除细胞是具有不同于欲回收细胞的表面标志的细胞。
8、按照权利要求1所述的细胞分离方法，其中含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体是脐带血。
9、按照权利要求1所述的细胞分离方法，其中含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体是骨髓。
10、按照权利要求1所述的细胞分离方法，其中含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体是外周血。
11、按照权利要求1所述的细胞分离方法，其中细胞俘获装置是通过将一种多孔结构填充到具有液体入口和液体出口的容器中而得到的。
12、按照权利要求11所述的细胞分离方法，其中所述多孔结构包含非纺织织物和海绵结构中的一种。
13、按照权利要求1所述的细胞分离方法，其中所述细胞俘获装置包含一个具有抗体固定于其中的细胞分离器，该抗体与存在于欲回收细胞上、而欲去除细胞上并不存在的抗原能够反应。
14、一种细胞分离和保藏方法，它包含以下步骤：将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入细胞俘获装置中，该装置能充分俘获所述欲回收细胞，并充分允许所述欲去除细胞从其通过；将所得含有欲去除细胞的液体从所述细胞俘获装置中除去；将粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的液体加入所述细胞俘获装置中，以从中回收已被所述细胞俘获装置俘获的所述欲回收细胞；然后保藏这些回收的细胞。
15、按照权利要求14的细胞分离和保藏方法，其中保藏是深低温保藏。
16、一种细胞分离和保藏方法，它包含以下步骤：将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入细胞俘获装置中，该装置能充分俘获所述欲回收细胞，并充分允许所述欲去除细胞从其通过；将所得含有欲去除细胞的液体从所述细胞俘获装置中除去；将粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的液体加入所述细胞俘获装置中，以从中回收已被所述细胞俘获装置俘获的所述欲回收细胞；将这些回收后的细胞进行深低温保藏；然后将进行了深温度保藏的细胞融化。
17、按照权利要求1、14和16中任一项所述的方法，其中粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的所述液体是一种能用作欲回收细胞的保藏剂的液体。
18、按照权利要求1、14和16中任一项所述的方法，其中粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的所述液体是一种含有葡聚糖的溶液。
19、按照权利要求1、14和16中任一项所述的方法，它还包含以下步骤：在将粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的所述液体加入细胞俘获装置之前，先加入一种粘度小于5mPa·s的液体。
20、按照权利要求1所述的细胞分离方法，其中在通过加入粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的液体而将欲回收细胞回收后，再向该细胞俘获装置中加入另一种液体，以收集所述细胞俘获装置中的剩余细胞或细胞组分。
21、按照权利要求20的细胞分离方法，其中在加入粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的液体之后再加入的液体是能溶解被俘获细胞或使其破裂的溶液。
22、按照权利要求21所述的细胞分离方法，其中能溶解细胞或使其破裂的溶液是表面活性剂或低渗溶液。
23、按照权利要求1、14和16中任一项所述的方法，其中粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的液体的加入方向与含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体的加入方向相反。
24、一种细胞分离系统，它包含一个细胞俘获装置，该装置能充分俘获欲回收细胞，而充分允许欲去除细胞从其通过，并具有至少一个入口和一个出口；一根用于将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入该细胞俘获装置中的管线，其连接于所述细胞俘获装置入口的上游；一根用于将液体加入所述细胞俘获装置的管线，其连接于所述细胞俘获装置出口的下游；和一根用于从所述细胞俘获装置的入口侧回收细胞的管线，其连接于所述细胞俘获装置入口的上游。
25、按照权利要求24的细胞分离系统，其中连接于所述细胞俘获装置入口的上游、用于从该细胞俘获装置的入口侧回收细胞的管线是用能经得起冰冻和融化的材料制成的。
26、按照权利要求25的细胞分离系统，其中用于回收细胞的管线是一种包含冰冻袋的管线。
27、按照权利要求24的细胞分离系统，它还包含一根用于将液体加入所述细胞俘获装置的管线，其连接于该细胞俘获装置入口的上游，或连接于该细胞俘获装置出口的下游。
28、按照权利要求24的细胞分离系统，其中连接于所述细胞俘获装置入口的上游、用于从该细胞俘获装置的入口侧回收细胞的管线是一种具有流路变换装置和大量支管的管线。
29、一种细胞分离方法，它包含以下步骤：通过连接于细胞俘获装置入口上游的管线，将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入所述细胞俘获装置中，该装置能充分俘获所述欲回收细胞，并充分允许所述欲去除细胞从其通过；将所得含有欲去除细胞的液体通过所述细胞俘获装置的出口除去；通过连接于所述细胞俘获装置出口下游的管线，将粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的液体加入所述细胞俘获装置中；由此通过连接于所述细胞俘获装置入口上游的管线，回收已被所述细胞俘获装置俘获的欲回收细胞。
30、按照权利要求29的细胞分离方法，它包含以下步骤：通过连接于细胞俘获装置入口上游的管线回收细胞，然后封闭并分离所述管线。
31、一种含有造血干细胞的液体，它基本不含红细胞和血小板，粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s。
32、按照权利要求31的含细胞液体，它含有至少一种深低温保藏剂。
33、按照权利要求32的含细胞液体，其中所述深低温保藏剂是胞外冷冻保护剂和胞内冷冻保护剂中的一种。
34、按照权利要求31的含细胞液体，其中含有葡聚糖。
35、一种含有欲回收细胞、且基本不含欲去除细胞的液体，它是通过一种细胞分离方法得到的，该方法包含以下步骤：将含有欲回收细胞和欲去除细胞的含细胞液体加入细胞俘获装置中，该装置能充分俘获所述欲回收细胞，并充分允许所述欲去除细胞从其通过；将所得含有欲去除细胞的液体从所述细胞俘获装置中除去；然后将粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s的液体加入所述细胞俘获装置中，以从中回收已被所述细胞俘获装置俘获的所述欲回收细胞。
36、一种用于从细胞俘获装置中回收被俘获细胞的液体，它的粘度不超过500mPa·s且不小于5mPa·s。
37、按照权利要求36所述的回收用液体，它也可用作这些细胞的保藏剂。
38、按照权利要求37所述的回收用液体，其中细胞的保藏是深低温保藏。
39、按照权利要求36到38中任一项所述的回收用液体，它是一种含有葡聚糖的溶液。
40、按照权利要求36所述的回收用液体，其中所述细胞是含有造血干细胞的单核细胞级分。
41、按照权利要求36所述的回收用液体，其中所述细胞是造血干细胞。
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