DE19912120A1 - Verfahren zur Isolierung von Erythrozyten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Isolierung interessierender Bestandteile aus biologischen Proben. Dabei werden die interessierenden Bestandteile an Makromolekülen reversibel gebunden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Erythrozyten aus einer Probe so­ wie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Ver­ fahrens.

Bei der PCR-Analyse erweisen sich Erythrozyten als Inhibitoren der Kettenverlängerung. Im Rahmen der Probenvorbereitung von DNA-gestützten Diagnosesy­ stemen unter Verwendung von PCR-Verfahren ist es daher notwendig, die Erythrozyten vom Plasma, den weißen Blutkörperchen und weiteren gegebenenfalls interessierenden Zellen, Organismen oder Substanzen abzutrennen. Die Abtrennung der Erythrozyten aus Humanblut wird gegenwärtig im allgemeinen mittels Zentrifugation durchgeführt. Die Zentrifugation stellt jedoch einen labortechnisch aufwendigen Pro­ zeß dar.

Bekannt ist es auch, in einem zweistufigen Trenn­ prozeß Filtrationsverfahren einzusetzen, bei denen zunächst die größeren Leukozyten durch eine Ober­ flächenfiltration und im zweiten Schritt die Erythrozyten durch eine Tiefenfiltration abgetrennt werden. Die Leukozyten müssen dann in einem weite­ ren Schritt für die nachgeschaltete Analyse von der Matrix abgetrennt werden. Dabei erfolgt die Ausle­ gung der Tiefenfilter meist empirisch auf der Grundlage von Laborversuchen.

Bei der Tiefenfiltration kommen den elektrokineti­ schen Wechselwirkungen zwischen Filtermaterial und Partikeln eine große Bedeutung zu. Dennoch sind ge­ rade zu diesen unter den auf die Partikel einwir­ kenden Kräften die Aussagen am wenigsten fundiert (Leibnitz, Rüdiger; Untersuchungen zum Einfluß un­ terschiedlicher Filterschicht- und Prozeßparameter bei der Tiefenfiltration von Suspensionen in einem Netzwerkmodell, Dissertation, Universität Dresden 1994). So wurde festgestellt, daß die für die Dia­ gnose relevanten Bakterien ebenfalls zurückgehalten werden.

Eine weitere Möglichkeit, Erythrozyten spezifisch zu binden und dadurch abzutrennen, besteht in einer Blutgruppen-Antikörperbindung. Die Antikörper sind dabei auf magnetischen Kügelchen aufgebracht, wo­ durch die Erythrozyten mit Hilfe eines Magnetfelds abgetrennt werden können. Die Bindung der Erythro­ zyten an die Antikörper ist irreversibel. Die Syn­ these der Antikörper stellt einen labortechnisch aufwendigen und damit teuren Prozeß dar (US-Patent 5,466,609).

Der Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, ein kostengünstiges und einfach durchzu­ führendes Verfahren bereitzustellen, das spezifisch Erythrozyten aus einer Probe zu isolieren vermag und dabei eine reversible Bindung der Erythrozyten einsetzt.

Die Erfindung löst das ihr zugrundeliegende Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Iso­ lierung von Erythrozyten aus einer Probe, wobei die erythrozytenhaltige Probe mit mindestens einer ag­ gregationsfördernden Substanz, insbesondere einem Makromolekül wie Dextran in Kontakt gebracht wird, die aggregationsfördernde Substanz die Bildung von Erythrozytenaggregaten stimuliert und die so gebil­ deten Aggregate von der Probe abgetrennt werden. Die Abtrennung kann mittels geeigneter Trennverfah­ ren erfolgen, zum Beispiel mittels Filtration, Chromatographie, Zentrifugation, elektrophoreti­ scher Verfahren, oder, bei Einsatz magnetischer Kü­ gelchen als Träger für die aggregationsfördernde Substanz, auch mittels eines Magnetfelds.

Die Erfindung macht sich den Effekt zu Nutze, daß, insbesondere in physiologischer Umgebung, Erythro­ zyten unter Einsatz von mindestens einer aggregati­ onsfördernden Substanz, insbesondere bei geeigne­ ten, für die jeweilige Isolieraufgabe angepaßten Konzentrationen, Aggregate, sogenannte Rouleaux, das heißt geldrollenartige Zusammenballungen ein­ zelner Erythrozyten zu einer größeren Einheit, bil­ den. Die aggregationsfördernde Substanz wirkt inso­ fern als Stimulans oder Anreger für die Bildung dieser Rouleaux, indem sie die Erythrozyten unter­ einander reversibel bindet. Die Aggregate oder Rou­ leaux stellen also über die aggregationsfördernde Substanz miteinander verbundene geldrollenartige Einheiten dar. Durch die Rouleauxbildung und die damit verbundenen Eigenschaftsänderungen, wie Volu­ menvergrößerung, ist es möglich, Erythrozyten in Form ihrer Aggregate von der restlichen Probe, ins­ besondere von den Leukozyten, zu trennen. Die Ag­ gregate können beispielsweise mittels Membranen oder Filtern spezifisch von den restlichen Bestand­ teilen der Probe abgetrennt werden. Die Erfindung bringt auch den Vorteil mit sich, daß keine unspe­ zifische Bindung von Zellen, insbesondere von Leu­ kozyten, Viren oder Bakterien an die aggregations­ fördernde Substanz stattfindet.

Es konnte auch gezeigt werden, daß diese unspezifi­ schen Bindungspartner, insbesondere Leukozyten, nicht innerhalb der Aggregate eingeschlossen wer­ den. Zudem werden die Erythrozyten reversibel ge­ bunden und es tritt keine Hämolyse auf. Schließlich ist das Verfahren kostengünstig und, da es sich um ein Einschrittverfahren handelt, einfach und schnell durchzuführen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Probe jedwede Erythrozyten-haltige wäß­ rige Lösung, wäßrige Suspension, Kulturmedium, Kör­ perflüssigkeit, Mischung oder ähnliches verstanden, insbesondere eine physiologische Lösung, Kulturme­ dium oder Suspension. In besonders bevorzugter Aus­ führungsform wird als Probe Blut, insbesondere Hu­ manblut, eingesetzt. Die Probe kann direkt einem, vorzugsweise menschlichen, Organismus, entnommen sein, sie kann aber auch im wesentlichen syntheti­ schen Ursprungs sein oder vor der erfindungsgemäßen Behandlung einer beliebigen Vorbehandlung unterzo­ gen worden sein.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer aggregationsfördernden Substanz eine Substanz verstanden, die in der Lage ist, die Bil­ dung von Erythrozytenaggregaten oder Rouleaux aus einzelnen Erythrozyten zu induzieren und/oder zu fördern. In bevorzugter Ausführungsform ist die ag­ gregationsfördernde Substanz ein Makromolekül, ins­ besondere Dextran, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Fi­ brinogen, Phytohämagglutinin (Lektin), Gelatine, Globulin, Pectin, Hydroxyethylstärke, Albumin, Po­ lylysin oder Gemische dieser Substanzen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter Dextran ein schleimartiges hochmolekulares neutrales Biopolysaccharid verstanden. In dem Poly­ saccharid treten neben 1,6- auch 1,3-Verknüpfungen zwischen den Glucosemonomeren auf. Erfindungsgemäß kann sowohl natives als auch partial oder vollstän­ dig aufgereinigtes Dextran eingesetzt werden. Das eingesetzte Dextran kann natürlichen oder syntheti­ schen Ursprungs sein. Selbstverständlich werden er­ findungsgemäß unter dem Begriff Dextran auch Dex­ tranbruchstücke oder Dextranderivate, wie Dextran­ modifikationen oder, zum Beispiel mit Halohydrinen, vernetzte Dextrane verstanden, sofern sie dazu ge­ eignet sind, Erythrozyten zur Aggregatbildung anzu­ regen. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist Dex­ tran mit einem Molekulargewicht von 0,5.10⁴ bis 2 .10⁸ Dalton, insbesondere 1,5.10⁴ bis 5.10⁷ Dalton, insbesondere 6,9.10⁴ bis 2,0.10⁵ Dal­ ton.

Die aggregationsfördernde Substanz, insbesondere das Dextran, kann in beliebiger Form eingesetzt werden, beispielsweise immobilisiert auf geeigneten Trägern, wie einem Filter, einer Membran, einem Vlies, Schäumen, porösen Träger, Kügelchen, oder einem Teststreifen, vorzugsweise aus Nylon. Der er­ findungsgemäß eingesetzte Träger kann aus Nylon, Polyurethan, Silikon, Zellulose, Polyvinylidendi­ fluorid, Polycarbonat, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polystyrol, Polyethylenterephtalat, Polytetrafluorethylen, Fluorpolymeren, Polysulfo­ nen, Glas, Silikat, Aluminosilikat, Silizium- oder Aluminiumoxiden, Zeolithen, Kohlenstoff oder Gemi­ schen zweier oder mehrerer dieser Substanzen beste­ hen oder diese in wesentlichen Teilen enthalten. Selbstverständlich ist es auch möglich, Träger, insbesondere Membranen, aus anderen Substanzen oder in anderen Formen einzusetzen, sofern sie mit den erfindungsgemäß eingesetzten aggregationsfördernden Substanzen funktionalisiert werden können. Erfin­ dungsgemäß kann auch vorgesehen sein, chemisch inerte oder reaktionsträge Materialien mittels ei­ ner initialen Plasmafunktionalisierung zu aktivie­ ren, das heißt durch einen Plasmaprozeß chemische Gruppen als Ankerstellen für weitere chemische Mo­ difikationen einzuführen. (U. Vohrer, Plasmabehand­ lung zur Veredelung technischer Textilien - Eine innovative Technologie mit steigendem Marktpotenti­ al, TECHTEXTIL-Symposium 1997, Band Plasma- Veredelung; 5.1 heutige Möglichkeiten und Verfah­ ren, Nr. 511 Frankfurt; M. Müller, Plasma- Pfropfung: Technik zur maßgeschneiderten Modifizie­ rung der Oberflächen von technischen Membranen, Vliesen und Folien, TECHTEXTIL-Symposium 1997, Band Plasma-Veredelung; 5.2 Innovative Produkte, Nr. 521, Frankfurt; U. Vohrer, M. Müller, Ch. Oehr, Glow-discharge Treatment for the Modification of Textiles, Surface and Coatings Technology, 98 (1998) 1128-1131.)

Der mit der aggregationsfördernden Substanz be­ schichtete Träger, insbesondere der dextranbe­ schichtete Träger, wird in die Probe gegeben, so daß die aggregationsfördernde Substanz, insbesonde­ re das Dextran, in Kontakt zu den Erythrozyten ge­ langen kann. Die aggregationsfördernde Substanz, insbesondere Dextran, kann aber auch in freier Form als wäßrige Lösung, Aufschwemmung, Suspension oder in getrockneter Form mit der Probe in Kontakt ge­ bracht werden, beispielsweise durch Mischen oder einfaches Hinzugeben, wobei eine anschließende In­ kubationszeit von 1 bis 10 min, insbesondere 3 min, bevorzugt wird, bevor die Rouleaux von der Lösung und den restlichen Bestandteilen der Probe abgetrennt werden.

Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen, zwei oder mehr verschiedene aggregationsfördernde Substanzen mit der Probe in Kontakt zu bringen, zum Beispiel eine immobilisierte und eine freie aggregationsför­ dernde Substanz oder zwei verschiedene immobili­ sierte aggregationsfördernde Substanzen.

Wird das Dextran in freier Form, das heißt nicht immobilisiert, eingesetzt, sind je nach eingesetz­ tem Dextrantyp, also Molekulargewicht des Dextran, Unter- und Obergrenzen für die Dextrankonzentration in der Lösung bevorzugt. Diese Grenzen können durch einfache Routineexperimente ermittelt werden, indem die Rouleauxbildung, das heißt die Erythrozytenag­ gregation, in Abhängigkeit von der Dextrankonzen­ tration bei einem bestimmten Dextrantyp beobachtet wird. Unterhalb der Untergrenze kommt es zu keiner Rouleauxbildung, während sich oberhalb der Ober­ grenze die in den Rouleaux gebundenen Erythrozyten wieder vereinzeln. Für Dextran 70 liegt der erfin­ dungsgemäß bevorzugte Konzentrationsbereich bei 3 bis 7 Gew.-% Dextran in physiologischer Lösung oder PBS (Phosphat-gepufferte, physiologische Kochsalz­ lösung). Bei höheren Molekulargewichten des Dex­ trans werden vergleichsweise geringere Dextrankon­ zentrationen bevorzugt, zum Beispiel bei Dextran 200 in Bereichen von 1 bis 5 Gew.-% Dextran in phy­ siologischer Lösung oder PBS.

Die Erfindung sieht also in einer Ausführungsform vor, die aggregationsfördernde Substanz, insbeson­ dere das Dextran, in freier, nicht an einem Träger immobilisierter Form mit der Probe in Kontakt zu bringen, das heißt die aggregationsfördernde Sub­ stanz, insbesondere das Dextran, vorzugsweise unter Durchmischen, in die Probe zu geben, wobei sich an­ schließend an die aggregationsfördernde Substanz gebundene, vorzugsweise Dextran-gebundene, Erythro­ zytenaggregate bilden, die dann beispielsweise mit­ tels Filtration abgetrennt werden können. Nach Ab­ trennung des Aggregats können die Erythrozyten wie­ der vereinzelt werden, beispielsweise mittels Ein­ satzes von Scherkräften, hervorgerufen durch zum Beispiel Druckfiltration oder von entsprechenden Strömungsverhältnissen oder durch Einsatz von er­ höhten Dextrankonzentrationen beziehungsweise Kon­ zentrationen an aggregationsfördernder Substanz in einer den Träger umgebenden Lösung, also Konzentra­ tion, die eine Dextranablösung beziehungsweise Ab­ lösung der aggregationsfördernden Substanz von den Erythrozyten bewirken.

Die Erfindung sieht in einer besonders bevorzugten Ausführungsform vor, die aggregationsfördernde Sub­ stanz, insbesondere das Dextran, in immobilisierter Form mit der Probe in Kontakt zu bringen, wobei In­ kubationszeiten von 1 bis 10 min, insbesondere 3 min, bevorzugt werden, bevor die Abtrennung der restlichen Bestandteile der Probe und der Lösung von den am Träger gebundenen Rouleaux erfolgt. Als Träger für die immobilisierte aggregationsfördernde Substanz, insbesondere das immobilisierte Dextran, kommen beliebige geeignete Materialien in Betracht, zum Beispiel Kügelchen oder Beads, die auch als ma­ gnetische Kügelchen ausgeführt sein können, um so erfindungsgemäß eine magnetische Abtrennung der an die aggregationsfördernde Substanz gebundenen, ins­ besondere der Dextran gebundenen, Aggregate aus der Probe zu ermöglichen. In besonders vorteilhafter Form wird an einer Membran oder einem Filter immo­ bilisierte aggregationsfördernde Substanz, insbe­ sondere Dextran, eingesetzt. In bevorzugter Weise werden Nylonmembranen oder -filter verwendet, wobei die aggregationsfördernde Substanz, insbesondere das Dextran, über naßchemische Verfahren an diese Membran oder Filter kovalent gebunden werden kann.

Die Dextranpropfdichte auf dem Träger hängt von der Dichte der durch zum Beispiel Formaldehyd aktivier­ ten N-Methylol-Gruppen der Nylonmembran und der In­ kubationszeit in der für die Beladung eingesetzten Dextranlösung ab, die zum Beispiel 10 bis 60 min betragen kann. Erfindungsgemäß bevorzugte Dextran­ propfdichten liegen in Bereichen von 0,02 mg/cm² bis 2,4 mg/cm². Erythrozyten und Erythrozytenaggre­ gate, also Rouleaux, werden an die dextranimmobili­ sierte Membran beziehungsweise die die aggregati­ onsfördernde Substanz aufweisende Membran reversi­ bel gebunden. Die Bindungsstärke an die Dextranmo­ leküle ist abhängig von dem Molekulargewicht des verwendeten Dextrans sowie der Dextrandichte auf der Membran.

Erfindungsgemäß werden nur Erythrozyten und Erythrozytenaggregate an die mit der aggregations­ fördernden Substanz versehene Membran oder Filter, insbesondere an die dextranimmobilisierte Membran oder den Filter, gebunden. Auf diese Weise kann die Abtrennung der Erythrozyten beziehungsweise der Rouleaux in einem einstufigen sehr spezifischen Verfahren von der Probe bewerkstelligt werden. Die Erythrozyten können anschließend unter Einsatz von Scherkräften in der Größenordnung der Bindungskräf­ te wieder vereinzelt beziehungsweise von dem Träger gelöst und vereinzelt werden. Diese Scherkräfte können durch Einsatz beispielsweise von Druckfil­ tration oder Einsatzes entsprechender Strömungsver­ hältnisse erzeugt werden.

Eine Abtrennung kann auch erfolgen, indem eine er­ höhte Dextrankonzentration zu den dextran­ gebundenen Erythrozyten gegeben wird, also eine Konzentration, die die Dextranablösung von den Erythrozyten bewirkt. Durch elektrostatische Wech­ selwirkung kommt es nämlich ab einer für jeden Ein­ zelfall zu ermittelnden Dextrankonzentration zu ei­ ner Ablösung der Erythrozyten vom Dextran, so daß die Rouleaux und Erythrozyten von dem Träger gelöst werden und sich auch die Erythrozyten wieder ver­ einzeln. Die dafür notwendige Dextrankonzentration hängt unter anderem vom Molekulargewicht des Dex­ trantyps ab, und liegt zum Beispiel bei Dextran 70 bei mindestens 8 Gew.-% Dextran in physiologischer Lösung oder PBS und bei Dextran 200 bei mindestens 6 Gew.-% Dextran in physiologischer Lösung oder PBS. Selbstverständlich lassen sich mittels dieser Verfahren auch nicht an einem Träger immobilisierte Erythrozyten vereinzeln. Bei Verwendung anderer ag­ gregationsfördernder Substanzen kann eine Ablösung durch Erhöhung der Konzentration der jeweiligen ag­ gregationsfördernden Substanz erzielt werden.

Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß möglich und auch bevorzugt, das aggregationsfördernde Ma­ kromolekül in freier und gleichzeitig auch in an einem Träger immobilisierter Form zur spezifischen Isolierung und Abtrennung von Erythrozyten einzu­ setzen.

Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Isolierung von Erythrozyten oder Erythrozytenaggre­ gaten aus einer Probe, umfassend eine an einem Trä­ ger, insbesondere einer Membran, Kügelchen, einem Vlies, einem Schaum, einem porösen Träger oder ei­ nem Filter, vorzugsweise kovalent, gebundene aggre­ gationsfördernde Substanz, insbesondere Dextran. Eine solche Vorrichtung kann als Teststreifen aus­ geführt sein, der gegebenenfalls für nachgeschalte­ te Analysen Verwendung finden kann.

Der Träger kann erfindungsgemäß aus Nylon, Polyu­ rethan, Silikon, Zellulose, Polyvinylidendifluorid, Polycarbonat, Polypropylen, Polyethylen, Polybuty­ len, Polystyrol, Polyethylenterephtalat, Poly­ tetrafluorethylen, Fluorpolymer, Polysulfonen, Glä­ sern, Silikat, Aluminosilikat, Silizium- oder Alu­ miniumoxiden, Kohlenstoff, Zeolith oder Gemischen zweier oder mehrerer dieser Substanzen bestehen oder diese enthalten.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von an einem Träger immobilisierter aggregationsfördernder Substanz, insbesondere immobilisiertem Dextran, zur Stimulation der Aggregatbildung von Erythrozyten, insbesondere menschlicher Erythrozyten, insbesonde­ re die Verwendung von an einem Träger immobilisier­ ter aggregationsfördernder Substanz, insbesondere immobilisierten Dextran, zur Förderung der rever­ siblen Bindung von Erythrozyten untereinander, so daß sich Aggregate oder Rouleaux bilden. Die Erfin­ dung betrifft auch die Verwendung von an einem Trä­ ger immobilisierter aggregationsfördernder Sub­ stanz, insbesondere immobilisiertem Dextran, zur Förderung der reversiblen Bindung von Erythrozyten und/oder Erythrozytenaggregaten an den die immobi­ lisierte aggregationsfördernde Substanz aufweisen­ den Träger, insbesondere den Dextranträger, das heißt beispielsweise eine Membran, Kügelchen oder einen Filter.

Die vorliegende Erfindung kann sowohl dazu dienen, störende Erythrozyten aus einer weiter zu analysie­ renden Probe zu entfernen als auch weiter zu analy­ sierende Erythrozyten aus einer ansonsten nicht in­ teressierenden Probe zu isolieren und aufzureini­ gen.

Die Erfindung wird anhand der Beispiele und der da­ zugehörigen Figuren näher erläutert.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 die durch Dextran hervorgerufene Aggre­ gatbildung von Erythrozyten untereinan­ der,

Fig. 2 die Abtrennung von Erythrozytenaggrega­ ten aus einer Probe mittels eines Fil­ ters,

Fig. 3 die Bindung und Abtrennung von an immobi­ lisiertem Dextran gebundenen Erythrozyten und Erythrozytenaggregaten aus einer bio­ logischen Probe mittels einer Membran,

Fig. 4 eine Graphik zur Abtrennung von Erythro­ zyten an (A) (unbehandelten Membran), (B) (Dextran 70-behandelten Membran) und (C) (Dextran 200-behandelten Membran) und

Fig. 5 Eichgeraden für die Dichtebestimmung von Dextran 70 und 200.

Für die nachfolgend beschriebenen Experimente wurde stets frisches venöses Vollblut eines Menschen ver­ wendet. Das Blut wurde mit K-EDTA ungerinnbar ge­ macht. Für die Verdünnung des Blutes wurde eine PBS-Lösung mit einem pH-Wert von 7,4 verwendet.

Es wurden 250 µl Vollblut in 5 ml PBS beziehungs­ weise 5 ml 4% (Gew.-% in PBS) Dextran 70-Lösung (Verdünnung 1 : 20) bei Raumtemperatur angesetzt.

Beispiel 1 Abtrennung von Erythrozyten aus Human­ blut mittels freiem Dextran

Das eingesetzte Dextran war Dextran T70 der Firma Pharmacia und Dextran 200 der Firma Serva. Das Mo­ lekulargewicht des Dextran 70 betrug 69 000 Dalton, bestimmt mit Hilfe von Gelfiltration. Das Moleku­ largewicht des Dextran 200 betrug 200 000 bis 300 000 Dalton.

Für den Filtrationsprozeß wurden Nylonmembranen 03-10/2 der Firma Sefar verwendet. Es handelte sich dabei um Polyamid (6.6)-Gewebe mit einer Maschen­ weite von 9-11 µm. Die Gewebedicke betrug 45 µm und die offene Siebfläche 2%. Das Flächengewicht des verwendeten Membrangewebes betrug 40 g/m². Der Bubble-Point wurde zu 540-660 mmWS und die Luft­ durchlässigkeit zu 100-200 I_N/m² s bestimmt.

Es wurde eine 4%ige (Gew.-%) Dextran 70-Lösung in PBS hergestellt. Diese Lösung wurde zu der Blutpro­ be gegeben und 3 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Dabei bildeten sich Aggregate, sogenannte Rouleaux, also reversibel miteinander über Dextranmoleküle verbundene Erythrozyten (siehe Fig. 1). Diese Rou­ leaux können an einer Membran, deren Porendurchmes­ ser größer ist als der eines einzelnen Erythrozyten oder Leukozyten, abgetrennt werden (siehe Fig. 2). Dadurch wird erreicht, daß ausschließlich die durch Dextran gebundenen Erythrozyten zurückgehalten wer­ den, während sämtliche anderen, im Blut vorhandenen Bestandteile entfernt werden.

Beispiel 2 Abtrennung von Erythrozyten aus Human­ blut mittels immobilisiertem Dextran

In einem weiteren Ausführungsbeispiel wurden die als Nylonmembranen ausgeführten Träger mit Dextran beschichtet. Dadurch wurde deren Oberfläche dahin­ gehend verändert, daß Erythrozyten nach demselben Mechanismus wie bei der in Beispiel 1 beschriebenen Rouleauxbildung über das Dextran an die Membran ge­ bunden wurden. Die verwendeten Nylonmembranen ent­ sprachen denen des Beispiels 1, wobei diese wie folgt mit Dextran bedeckt wurden.

Die Bedeckung der PA6.6-Membranen erfolgt naßche­ misch. Dabei werden die Amino-Gruppen des Nylons zunächst durch Formaldehyd aktiviert, an die das Dextran dann kovalent gebunden wird. Der Reaktions­ ablauf der Dextranimmobilisierung auf der Nylonmem­ bran erfolgt nach Erkenntnissen von Beeskow et al. [Beskow, T.; Kroner, K. H.; Anspach, F. B.: Nylon­ based affinity membranes: impacts of surface modi­ fication on protein adsorption. J. Colloid Inter­ face Sci. 196(2), (1997), S. 278-291.]:

Die Membran (Fa. Sefar 03-10/2), D = 47 mm, wird in 20 ml Formalin (37%) und 0,2 ml Phosphorsäure (85%) bei 60°C 7 h inkubiert. Es folgt ein Spülen der Membran mit Wasser einer Temperatur von 50°C. Die Membran wird in 5 ml 20%iger Dextran 70-Lösung (pH 2) beziehungsweise 20%iger Dextran 200-Lösung (pH 2) bei Raumtemperatur 30 min. geschüttelt. Die Mem­ bran wird dann auf eine Nutsche gelegt und Dextran­ lösung abgesaugt. Anschließend wird die Membran 45 min im Ofen bei 90°C getrocknet. Die Membran wird dann über Nacht in 0,1 M NaOH geschüttelt, um nicht kovalent gebundenes Dextran abzuscheiden. Anschlie­ ßend wird 3 mal für je 2 h in 0,1 M NaOH geschüttelt und mit Wasser mehrere Male gespült bis die Spüllö­ sung neutral ist.

Dextranpropfdichtebestimmung

Die Dextranpropfdichte hängt von der Dichte der durch das Formaldehyd aktivierten N-Methylol- Gruppen der Nylonmembran ab. Die Dextranpropfdichte ist abhängig von der Inkubationszeit in der Dex­ tranlösung. Je größer das Molekulargewicht des Dex­ trans, desto höher ist die absolute Masse des kova­ lent gebundenen Dextrans. Die Anzahl der gebundenen Moleküle sinkt jedoch gleichzeitig in der gleichen Größenordnung ab. Die Dextranpropfdichte läßt sich nach Angaben von Beeskow [a. a. O.] folgendermaßen bestimmen:

Die Membran wird in 10 ml 2 M HCI bei 90°C für 4 h inkubiert. Dadurch wird das Dextran hydrolysiert, es bilden sich Glucosemonomere. Anschließend wird mit 21 ml 1 M NaOH neutralisiert und zu 0,5 ml die­ ser Lösung 1 ml BCA-Reagenz (Fa. Sigma) zugeben und bei 37°C 30 min inkubiert. (BCA-Reagenz (bicinchoninic acid assay (Proteinbestimmung)): Nachweis von Cu(I), das Glucosemonomer reduziert dabei Cu(II) zu Cu(I)). Es folgt eine Absorptions­ messung bei 562 nm (Vgl. Fig. 5).

Durch die Ausgleichsgeraden y_Dx70 = 1,066.x und y_Dx200 = 0,8956.x kann die Konzentration [mg/ml] des hydrolysierten Dextrans berechnet werden, und so die Dextranpropfdichte auf der Membran bestimmt werden. Die Dextranpropfdichtebestimmung ergab für die Dx70-membran (D = 47 mm) eine Propfdichte von 0,372 mg/Membran ( = 0,021 mg/cm²) und für die Dx200-Membran (D = 47 mm) eine Propfdichte von 0,651 mg/Membran ( = 0,038 mg/cm²).

Auf den so belegten Membranen fand die Rouleauxbil­ dung nach einer etwa 3 minütigen Inkubation der Blutprobe bei Raumtemperatur statt. Anschließend wurde durch die Nylonmembran filtriert.

Aus der Fig. 3 geht hervor, daß an einer Membran immobilisiertes Dextran Erythrozyten und Rouleaux bindet, während die restlichen Blutbestandteile, wie zum Beispiel Leukozyten, von der Membran nicht zurückgehalten werden.

Der Fig. 4 kann die Anzahl zurückgehaltener roter Blutkörperchen an einer unbehandelten Membran (A), einer Dextran 70-behandelten Membran (B) und einer Dextran 200-behandelten Membran (C) entnommen wer­ den. Dabei zeigt sich, daß die Dextran-behandelten Membranen (ausgefüllte Balken) eine erheblich höhe­ re Abscheiderate für Erythrozyten als unbehandelte Membranen (weiße Balken) aufweisen. Es zeigt sich auch, daß das Molekulargewicht des Dextrans Einfluß auf die Abscheiderate hat. Das Dextran mit dem hö­ heren Molekulargewicht von 200 000 wies eine höhere Abscheiderate für Erythrozyten als das Dextran mit einem Molekulargewicht von 70 000 auf.

Der Fig. 4 kann auch entnommen werden, daß die Zu­ gabe von Dextran 70-Lösung anstelle der als Kon­ trolle verwendeten PBS-Lösung zu einer Blutprobe auch dann zu einer Erythrozytenabtrennung von der restlichen Probe führt, wenn unbehandelte Membranen eingesetzt werden. Dies liegt, wie aus der Fig. 1 und 2 ersichtlich, daran, daß auch das nicht immo­ bilisierte Dextran die Rouleauxbildung der Erythro­ zyten anregt und somit eine Größenfiltration an ei­ ner Membran ermöglicht wird.

Quantifizierung der Erythrozytenaggregation

Eine Quantifizierung der Erythrozytenaggregation kann mittels verschiedener Verfahren durchgeführt werden, die auch zum Beispiel der Bestimmung der Konzentrationen an aggregationsfördernde Substanz dienen, bei denen eine erfindungsgemäßer Rou­ leauxbildung erfolgt.

Bestimmung des MAI (Microscopic Aggregation Index):

Rote Blutzellen sind in isotonischer Salzlösung (PBS-Lösung) monodispers. Für die Quantifizierung der Aggregation in Abhängigkeit der Dextrankonzen­ tration wird Blut in aufsteigend konzentrierten Dx70-Lösungen suspendiert, so daß sich ein Hämato­ krit von 1% einstellt. Danach wird die Anzahl der Zelleinheiten in einem bestimmten Raumvolumen unter dem Mikroskop ausgezählt. Dabei besteht eine Zel­ leinheit entweder aus einer monodispersen Zelle oder aus einem Aggregat. Die Zelleinheiten in dex­ tranfreier PBS-Lösung werden durch die Anzahl der Zelleinheiten in der Dextranlösung geteilt. Der MAI ist definiert durch:
MAI = N_S/N_D
N_D: Anzahl der Zelleinheiten in Dextranlösung
N_S: Anzahl der Zelleinheiten in dextranfreier PBS- Lösung

Diese Bestimmungsmethode ist in Rampling, M., W.; Whittingstall, P.: A comparison of five methods for estimating red cell aggregation. Klin. Wschr. 64, (1986), S. 1084-1088 detaillierter beschrieben. Ein weiteres Verfahren zur Quantifizierung der Erythrozytenaggregation ist die Bestimmung des RAI (Reflectometric Aggregation Index):
Dabei gilt: RAI = 1-R_I/R₂₀₀; Es wird die Lichtreflexi­ on bei einer gegebenen Schergeschwindigkeit von beispielsweise i = 0.5 1/s verglichen mit der Re­ flexion bei einer Schergeschwindigkeit von 200 1/s. Die Methode basiert auf der Annahme, daß Zellen bei 200 1/s monodispers vorliegen.

Weitere Quantifizierungsverfahren wie die Messung der relativen Viskosität bei niedrigen Scherge­ schwindigkeiten (low shear rate viscometry), und der Einsatz eines Myrenne erythrocyte aggregometer, eines Paar Oscillating Capillary Rheometers (POCR) oder die Bestimmung der Erythrozytensedimentations­ rate (ESR) sind in Rampling, a.a.O. offenbart, wo­ bei dies Dokument hinsichtlich der offenbarten Be­ stimmungsverfahren in den vorliegenden Offenba­ rungsgehalt mit einbezogen ist.

Claims (14)

1. Verfahren zur Isolierung von Erythrozyten aus einer Probe, wobei die erythrozytenhaltige Probe mit mindestens einer aggregationsfördernden Sub­ stanz in Kontakt gebracht wird, die Erythrozyten Aggregate bilden und die Aggregate von der Probe abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die aggregati­ onsfördernde Substanz ein Makromolekül, insbesonde­ re Dextran, Polyvinylpyrrolidon, Fibrinogen, Phyto­ hämagglutinin, Gelatine, Globulin, Pectin, Hydroxy­ ethylstärke, Albumin und/oder Polylysin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Ag­ gregate mittels einer Membran oder eines Filters von der Probe abgetrennt werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, wobei die aggregationsfördernde Substanz an einem Träger immobilisiert ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, wobei der Träger eine Membran, ein Vlies, ein Schaum, ein poröser Träger, Kügelchen oder ein Fil­ ter ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, wobei der Träger aus Nylon, Polyurethan, Sili­ kon, Zellulose, Polyvinylidendifluorid, Polycarbo­ nat, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Poly­ styrol, Polyethylenterephtalat, Polytetrafluorethy­ len, Fluorpolymer, Polysulfonen, Gläsern, Silikat, Aluminosilikat, Silizium- oder Aluminiumoxiden, Kohlenstoff, Zeolith oder einem Gemisch zweier oder mehrerer Substanzen besteht oder diese enthält.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, wobei die Probe Blut, insbesondere menschli­ ches Blut, ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che, wobei die aggregationsfördernde Substanz gleichzeitig sowohl in freier als auch in an einem Träger immobilisierter Form mit der erythrozyten­ haltigen Probe in Kontakt gebracht wird.

9. Vorrichtung zur Isolierung von Erythrozyten aus einer Probe, umfassend mindestens eine an einem Träger gebundene aggregationsfördernde Substanz.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei die aggrega­ tionsfördernde Substanz ein Makromolekül, insbeson­ dere Dextran, Polyvinylpyrrolidon, Fibrinogen, Phytohämagglutinin, Gelatine, Globulin, Pectin, Hydroxyethylstärke, Albumin und/oder Polylysin ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Träger eine Membran, ein Vlies, ein Schaum, ein po­ röser Träger, Kügelchen oder ein Filter ist.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei der Träger aus Nylon, Polyurethan, Silikon, Zellulose, Polyvinylidendifluorid, Polycarbonat, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polystyrol, Polyethylenterephtalat, Polytetrafluorethylen, Flu­ orpolymer, Polysulfonen, Gläsern, Silikat, Alumino­ silikat, Silizium- oder Aluminiumoxiden, Kohlen­ stoff, Zeolith oder einem Gemisch zweier oder meh­ rerer Substanzen besteht oder diese enthält.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Vorrichtung ein Dextran aufweisender Teststreifen ist.

14. Verwendung von einer an einem Träger immobili­ sierten aggregationsfördernden Substanz, insbeson­ dere Dextran, zur Stimulation der Aggregatbildung von Erythrozyten, insbesondere menschlichen Erythrozyten.