CN1301327C - 人肿瘤细胞的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

一种人肿瘤细胞的分离纯化方法。该方法包括以下步骤:(1)制备肿瘤组织细胞悬液;(2)将所得肿瘤组织细胞悬液加入装有人血清的离心管中;(3)静置一预定时间后,从离心管底部取出部分人血清置于另一离心管;(4)离心处理后,沉淀的细胞即为纯化的肿瘤细胞。本发明可快速、简便和有效地分离纯化肿瘤细胞,而且成本较低,对肿瘤细胞没有任何损伤,可大量获得纯化的肿瘤细胞,提高肿瘤细胞原代培养的成功率。为肿瘤遗传学、肿瘤分子生物学、肿瘤免疫学以及抗肿瘤药物等研究提供了非常有用的研究材料。

Description

人肿瘤细胞的分离纯化方法
【所属技术领域】
本发明涉及肿瘤细胞和肿瘤细胞原代培养领域,特别涉及一种人肿瘤细胞的分离纯化方法。
【背景技术】
长期以来,如何在不损伤肿瘤细胞的情况下,从肿瘤组织中分离出大量的高纯化新鲜肿瘤细胞一直是困扰人们的一大难题。由于这一技术难于解决,使得肿瘤细胞体外原代培养的成功率很低(低于20%),而肿瘤细胞原代培养的成功与否常常是有关肿瘤细胞研究的关键,同时大量纯化的肿瘤细胞和原代培养的肿瘤细胞又是肿瘤遗传学,肿瘤分子生物学,肿瘤免疫学以及抗肿瘤药物等学科研究的重要对象。大量实验证明:肿瘤细胞原代培养成功率很低的最主要原因是肿瘤组织中常常混有许多非肿瘤细胞,包括一些淋巴细胞,成纤维细胞,间质细胞和肿瘤坏死细胞,这些细胞严重的干扰了肿瘤细胞的体外生长与增殖。因此,从肿瘤组织中分离纯化出大量新鲜的肿瘤细胞是肿瘤细胞体外原代培养的关键。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种人肿瘤细胞的分离纯化方法。
本发明的目的是这样实现的,该人肿瘤细胞的分离纯化方法包括以下步骤:
(1)制备肿瘤组织细胞悬液;
(2)将所得肿瘤组织细胞悬液加入装有人血清的离心管中;
(3)静置一预定时间后,从离心管底部取出部分人血清置于另一离心管;
(4)离心处理后,沉淀的细胞即为纯化的肿瘤细胞。
本发明用于分离纯化肿瘤细胞的优点是快速、简便、有效,而且成本较低,对肿瘤细胞没有任何损伤,可大量获得纯化的肿瘤细胞,提高了肿瘤细胞原代培养的成功率。为肿瘤遗传学、肿瘤分子生物学、肿瘤免疫学以及抗肿瘤药物等研究提供了非常有用的研究材料。
【附图说明】
图1是纯化前的人卵巢癌细胞;
图2是纯化后的人卵巢癌细胞;
图3是贴壁生长卵巢癌细胞;
图4是纯化前的人肾癌组织细胞;
图5是纯化后的肾癌细胞;
图6是贴壁生长的肾癌细胞;
图7是纯化前的人肺癌组织细胞;
图8是纯化后的人肺癌细胞;
图9是贴壁生长肺癌细胞;
图10是纯化前的人乳腺癌细胞;
图11是纯化后的人乳腺癌细胞;
图12是纯化前的人鼻咽癌组织细胞;
图13是纯化后的人鼻咽癌组织细胞;
图14是纯化前的人小脑髓母细胞瘤细胞;
图15是纯化后的人小脑髓母细胞瘤细胞。
【具体实施方式】
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明的人肿瘤细胞的分离纯化方法包括:
1、肿瘤细胞的纯化前的处理。取手术切除的肿瘤组织(1-2cm3),置于含有RPMI-1640培养液(无血清)的培养瓶内,立即送往实验室。用消毒的眼科剪刀剔除可见的非肿瘤组织和肿瘤坏死组织,用少许含有RPMI-1640培养液(无血清)润湿肿瘤组织并将其尽快的剪碎,将这些剪碎的肿瘤组织置50ml的离心管中,加入10-15ml胶原酶溶液(Sigma公司)(胶原酶4溶解在D-hanks中,终浓度为1mg/ml,过滤灭菌),在37℃水浴箱内温浴1小时。1小时后,取出50ml的离心管,用不含血清的1640培养液稀释一倍,反复吹打,取细胞悬液用消毒过的70目滤网过滤,在1200转/分的转速下,离心8分钟,去上清液,取20ml RPMI-1640培养液(无血清)悬浮这些沉淀的细胞(其含有淋巴细胞,成纤维细胞,间质细胞和肿瘤坏死细胞),并轻轻混匀,得肿瘤组织细胞悬液。
2、肿瘤细胞的分离纯化。取50ml灭活人血清,在转速3000转/分,离心处理20分钟,取上清液置另一个50ml离心管中。取这种人血清(或用胎牛血清代替)20ml置50ml离心管(A管)中,将20ml混匀的肿瘤组织细胞悬液轻轻地从管壁加入到A管中,静置6分钟,从A管底部吸出6ml血清,置50ml离心管中(1号);再将A管静置6分钟,从A管底部吸出6ml血清,置另一支50ml离心管中(2号)。再将A管静置6分钟,从A管底部吸出6ml血清,置另一支50ml离心管中(3号)。将1号,2号和3号离心管离心,在转速1200转/分,离心8分钟。取出上清液可重复使用,沉淀的细胞即为纯化的肿瘤细胞。取5ml 10%人血清,1%双抗的1640培养液混匀1号离心管沉淀的细胞并置6孔板中的一个孔中,在显微镜下观察可见到许多纯化的肿瘤细胞,将纯化的肿瘤细胞培养3-4天即可见肿瘤细胞贴壁生长。2号和3号离心管的细胞中除肿瘤细胞外还含有少量非肿瘤细胞,可重复上术分离纯化过程,即可得到更纯化的肿瘤细胞。
实施例一
人卵巢癌细胞的纯化。
1、制备卵巢癌组织细胞悬液
取手术切除的卵巢癌组织(1-2cm3),置于含有RPMI-1640培养液(无血清)的培养瓶内,立即送往实验室。用消毒的眼科剪刀剔除非肿瘤组织和肿瘤坏死组织,用少许含有RPMI-1640培养液(无血清)润湿肿瘤组织并将其尽快的剪碎,将这些剪碎的肿瘤组织置50ml的离心管中,加入10-15ml胶原酶溶液(Sigma公司)(胶原酶4溶解在D-hanks中,终浓度为1mg/ml,过滤灭菌),在37℃水浴箱内温浴1小时。1小时后,取出50ml的离心管,用不含血清的1640溶液稀释一倍,反复吹打,取细胞悬液用消毒过的70目滤网过滤,离心(1200转/分,8分钟),去上清液,取20ml RPMI-1640培养液(无血清)悬浮这些沉淀的细胞,并轻轻混匀,得卵巢癌组织的细胞悬液。
2、卵巢癌细胞的分离纯化
取50ml灭活人血清,在转速3000转/分下,离心处理20分钟,取上清液移置另一个50ml离心管中,取这种人血清20ml置50ml离心管(A管)中。将20ml卵巢癌组织的细胞悬液(见图1)轻轻的从管壁加入到A管中,静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置50ml离心管中(1号);再将A管静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置另一支50ml离心管中(2号);再将A管静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置另一支50ml离心管中(3号)。将1号,2号和3号离心管离心,在转速1200转/分,离心8分钟,取出上清液可重复使用,沉淀的细胞即为高度纯化的肿瘤细胞。取5ml 10%人血清,1%双抗的1640培养液混匀1号离心管沉淀的细胞并置6孔板中的一个孔中,在显微镜下观察,可见到许多一串一串的卵巢癌细胞(见图2),将纯化的肿瘤细胞培养3-4天即可见肿瘤细胞贴壁生长。2号和3号离心管的细胞中除肿瘤细胞外还含有少量非肿瘤细胞,可重复此分离纯化过程,即可得到更纯化的卵巢癌细胞。
3、原代培养
用含10%人血清和1%双抗的1640培养液混匀纯化的卵巢癌细胞,放在6孔培养板中,在CO2培养箱内培养3-4天即可见卵巢癌细胞贴壁生长(见图3)。
实施例二
人肾癌细胞的纯化。
1、制备肾癌组织细胞悬液
取手术切除的肾癌组织(1-2cm3),置于含有RPMI-1640培养液(无血清)的培养瓶内,立即送往实验室。用消毒的眼科剪刀剔除非肿瘤组织和肿瘤坏死组织,用少许含有RPMI-1640培养液(无血清)润湿肿瘤组织并将其尽快的剪碎,将这些剪碎的肿瘤组织置50ml的离心管中,加入10-15ml胶原酶溶液(Sigma公司)(胶原酶4溶解在D-hanks中,终浓度为1mg/ml,过滤灭菌),在37℃水浴箱内温浴1小时。1小时后,取出50ml的离心管,用不含血清的1640溶液稀释一倍,反复吹打,取细胞悬液用消毒过的70目滤网过滤,离心(1200转/分,8分钟),去上清液,取20ml RPMI-1640培养液(无血清)悬浮这些沉淀的细胞,并轻轻混匀,得肾癌组织的细胞悬液。
2、肾癌细胞的分离纯化
取50ml灭活人血清,在转速3000转/分下,离心处理20分钟,取上清液移置另一个50ml离心管中,取这种人血清20ml置50ml离心管(A管)中。将20ml肾癌组织的细胞悬液(见图4)轻轻的从管壁加入到A管中,静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置50ml离心管中(1号);再将A管静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置另一支50ml离心管中(2号)。再将A管静置6分钟,从A管底部底吸出6ml人血清,置另一支50ml离心管中(3号)。将1号,2号和3号离心管离心,在转速1200转/分,离心8分钟,取出上清液可重复使用,沉淀的细胞即为纯化的肿瘤细胞。取5ml 10%人血清,1%双抗的1640培养液混匀1号离心管沉淀的细胞并置6孔板中的一个孔中,在显微镜下观察,可见到许多一串一串的肾癌细胞(见图5),将纯化的肿瘤细胞培养3-4天即可见肿瘤细胞分裂。2号和3号离心管的细胞中除肿瘤细胞外还含有少量非肿瘤细胞,可重复上术分离纯化过程,即可得到更纯化的肾癌细胞。
3、原代培养
用含10%人血清和1%双抗的1640培养基混匀纯化的肾癌细胞,放在6孔培养板中,在CO2培养箱内培养3-4天即可见肾癌细胞贴壁生长(见图6)。
实施例三
人肺癌细胞的纯化。
1、制备肺癌组织细胞悬液
取手术切除的肺癌组织(1-2cm3),置于含有RPMI-1640培养液(无血清)的培养瓶内,立即送往实验室。用消毒的眼科剪刀剔除非肿瘤组织和肿瘤坏死组织,用少许含有RPMI-1640培养液(无血清)润湿肿瘤组织并将其尽快的剪碎,将这些剪碎的肿瘤组织置50ml的离心管中,加入10-15ml胶原酶溶液(Sigma公司)(胶原酶4溶解在D-hanks中,终浓度为1mg/ml,过滤灭菌),在37℃水浴箱内温浴1小时。1小时后,取出50ml的离心管,用不含血清的1640溶液稀释一倍,反复吹打,取细胞悬液用消毒过的70目滤网过滤,离心(1200转/分,8分钟),去上清液,取20ml RPMI-1640培养液(无血清)悬浮这些沉淀的细胞,并轻轻混匀,得肺癌组织的细胞悬液。
2、肺癌细胞的分离和纯化
取50ml灭活人血清,在转速3000转/分下,离心处理20分钟,取上清液移置另一个50ml离心管中,取这种人血清20ml置50ml离心管(A管)中。将20ml肺癌组织的细胞悬液(见图7)轻轻的从管壁加入到A管中,静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置50ml离心管中(1号);再将A管静置分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置另一支50ml离心管中(2号)。再将A管静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置另一支50ml离心管中(3号)。将1号,2号和3号离心管离心,在转速1200转/分,离心8分钟,取出上清液可重复使用,沉淀的细胞即为纯化的肿瘤细胞。取5ml 10%人血清,1%双抗的1640培养液混匀1号离心管沉淀的细胞并置6孔板中的一个孔中,在显微镜下可见到许多一串一串的肺癌细胞(见图8),将纯化的肺癌细胞培养3-4天即可见肺癌细胞贴壁生长。2号和3号离心管的细胞中除肿瘤细胞外还含有少量非肿瘤细胞,可重复上述分离纯化过程,即可得到更纯化的肺癌细胞。
3、原代培养
用含10%人血清和1%双抗的1640培养液混匀纯化的肺癌细胞,放在6孔培养板中,在CO2培养箱内培养3-4天即可见肺癌细胞贴壁生长(见图9)。
实施例四
人乳腺癌细胞的纯化。
1、制备乳腺癌组织细胞悬液
取手术切除的乳腺癌组织(1-2cm3),置于含有RPMI-1640培养液(无血清)的培养瓶内,立即送往实验室。用消毒的眼科剪刀剔除非肿瘤组织和肿瘤坏死组织,用少许含有RPMI-1640培养液(无血清)润湿肿瘤组织并将其尽快的剪碎,将这些剪碎的肿瘤组织置50ml的离心管中,加入10-15ml胶原酶溶液(Sigma公司)(胶原酶4溶解在D-hanks中,终浓度为1mg/ml,过滤灭菌),在37℃水浴箱内温浴1小时。1小时后,取出50ml的离心管,用不含血清的1640培养液稀释一倍,反复吹打,取细胞悬液用消毒过的70目滤网过滤,离心(1200转/分,8分钟),去上清液,取20ml RPMI-1640培养液(无血清)悬浮这些沉淀的细胞,并轻轻混匀,得乳腺癌组织的细胞悬液。
2、乳腺癌细胞的分离纯化
取50ml灭活人血清,在转速3000转/分下,离心处理20分钟,取上清液移置另一个50ml离心管中,取这种人血清20ml置50ml离心管(A管)中。将20ml乳腺癌组织的细胞悬液(见图10)轻轻的从管壁加入到A管中,静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置50ml离心管中(1号);再将A管静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置另一支50ml离心管中(2号)。再将A管静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置另一支50ml离心管中(3号)。将1号,2号和3号离心管离心,在转速1200转/分,离心8分钟,取出上清液可重复使用,沉淀的细胞即为纯化的肿瘤细胞。取5ml10%人血清,1%双抗的1640培养液混匀1号离心管沉淀的细胞,并置6孔板中的一个孔中,在显微镜下观察,可见到许多一串一串的乳腺癌细胞(见图11),将纯化的乳腺癌细胞培养3-4天即可见乳腺癌细胞贴壁生长。2号和3号离心管的细胞中除肿瘤细胞外还含有少量非肿瘤细胞,可重复上述分离纯化过程,即可得到更纯化的乳腺癌细胞。
实施例五
人鼻咽癌细胞的纯化。
1、制备鼻咽癌组织细胞悬液
取手术切除的鼻咽癌组织(1-2cm3),置于含有RPMI-1640培养液(无血清)的培养瓶内,立即送往实验室。用消毒的眼科剪刀剔除非肿瘤组织和肿瘤坏死组织,用少许含有RPMI-1640培养液(无血清)润湿肿瘤组织并将其尽快的剪碎,将这些剪碎的肿瘤组织置50ml的离心管中,加入10-15ml胶原酶溶液(Sigma公司)(胶原酶4溶解在D-hanks中,终浓度为1mg/ml,过滤灭菌),在37℃水浴箱内温浴1小时。1小时后,取出50ml的离心管,用不含血清的1640培养液稀释一倍,反复吹打,取细胞悬液用消毒过的70目滤网过滤,离心(1200转/分,8分钟),去上清液,取20ml RPMI-1640培养液(无血清)悬浮这些沉淀的细胞,并轻轻混匀,得鼻咽癌组织的细胞悬液。
2、鼻咽癌细胞的分离纯化
取50ml灭活人血清,在转速3000转/分下,离心处理20分钟,取上清液移置另一个50ml离心管中,取这种人血清20ml置50ml离心管(A管)中。将20ml鼻咽癌组织的细胞悬液(见图12)轻轻的从管壁加入到A管中,静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置50ml离心管中(1号);再将A管静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置另一支50ml离心管中(2号)。再将A管静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置另一支50ml离心管中(3号)。将1号,2号和3号离心管离心,在转速1200转/分,离心8分钟,取出上清液可重复使用,沉淀的细胞即为纯化的肿瘤细胞。取5ml10%人血清,1%双抗的1640培养液混匀1号离心管沉淀的细胞并置6孔板中的一个孔中,在显微镜下观察,可见到许多一串一串的鼻咽癌细胞(见图13),将纯化的鼻咽癌细胞培养3-4天即可见鼻咽癌细胞贴壁生长。2号和3号离心管的细胞中除肿瘤细胞外还含有少量非肿瘤细胞,可重复上述分离纯化过程,即可得到更纯化的鼻咽癌细胞。
实施例六
人小脑髓母细胞瘤的分离纯化。
1、制备人小脑髓母细胞瘤组织细胞悬液
取手术切除的人小脑髓母细胞瘤组织(1-2cm3),置于含有RPMI-1640培养液(无血清)的培养瓶内,立即送往实验室。用消毒的眼科剪刀剔除非肿瘤组织和肿瘤坏死组织,用少许含有RPMI-1640培养液(无血清)润湿肿瘤组织并将其尽快的剪碎,将这些剪碎的肿瘤组织置50ml的离心管中,加入10-15ml胶原酶溶液(Sigma公司)(胶原酶4溶解在D-hanks中,终浓度为1mg/ml,过滤灭菌),在37℃水浴箱内温浴1小时。1小时后,取出50ml的离心管,用不含血清的1640培养液稀释一倍,反复吹打,取细胞悬液用消毒过的70目滤网过滤,离心(1200转/分,8分钟),去上清液,取20ml RPMI-1640培养液(无血清)悬浮这些沉淀的细胞,并轻轻混匀,得小脑髓母细胞瘤组织的细胞悬液。
2、人小脑髓母细胞瘤的分离纯化
取50ml灭活人血清,在转速3000转/分下,离心处理20分钟,取上清液移置另一个50ml离心管中,取这种人血清20ml置50ml离心管(A管)中。将20ml人小脑髓母细胞瘤组织的细胞悬液(见图14)轻轻的从管壁加入到A管中,静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置50ml离心管中(1号);再将A管静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置另一支50ml离心管中(2号)。再将A管静置6分钟,从A管底部吸出6ml人血清,置另一支50ml离心管中(3号)。将1号,2号和3号离心管离心,在转速1200转/分,离心8分钟,取出上清液可重复使用,沉淀的细胞即为纯化的肿瘤细胞。取5ml 10%人血清,1%双抗的1640培养液混匀1号离心管沉淀的细胞并置6孔板中的一个孔中,在显微镜下可见到许多一串一串的小脑髓母细胞瘤细胞(见图15),将纯化的小脑髓母细胞瘤细胞培养3-4天即可见乳腺癌细胞贴壁生长。2号和3号离心管的细胞中除肿瘤细胞外还含有少量非肿瘤细胞,可重复上述分离纯化过程,即可得到更纯化的小脑髓母细胞瘤细胞。
本发明能够快速而简便地,在肿瘤细胞没有得到任何损伤的情况下,去掉大量的非肿瘤细胞和坏死的肿瘤细胞,将活的肿瘤细胞从肿瘤组织中分离出来。大量的纯化的肿瘤细胞聚集在一起,由于肿瘤细胞群体效应,为肿瘤细胞的生长和增殖培养提供了良好的条件,促进了肿瘤细胞的生长与增殖。应用这种纯化技术,肿瘤细胞原代培养的成功率可达到85%左右,使肿瘤细胞体外长期培养、传代乃至建系更加容易,为肿瘤遗传学、肿瘤分子生物学、肿瘤免疫学以及抗肿瘤药物等研究奠定了物质基础。
尽管本发明是参照具体实施例来描述,但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描述,所公开的实施例的其他变化,对于本领域技术人员都是可以预料的。因此,这样的变化不会脱离所属权利要求限定的范围及精神。

Claims (7)

1.一种人肿瘤细胞的分离纯化方法,其特征包括如下:
(1)将剪碎的肿瘤组织置于离心管中,并经胶原酶4消化,取细胞悬液经过70目的滤网过滤,用RPMI-1640培养液制备肿瘤组织细胞悬液;
(2)将所得到的肿瘤组织悬液加入到装有灭活的人血清的离心管中;
(3)肿瘤组织细胞悬液和灭活的人血清在离心管中静置6分钟,从离心管的底部取出部分血清置另一离心管;
(4)对离心管进行离心后,沉淀的细胞即为纯化的肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法,其特征在于制备肿瘤组织细胞悬液的步骤为:
(1)取肿瘤组织,用无血清的RPMI-1640培养液润湿并将其剪碎,置于离心管中,加入胶原酶4溶液;
(2)在37℃水浴箱内,消化1小时;
(3)用不含血清的1640溶液稀释一倍,反复吹打,用70目滤网过滤,离心处理,去上清液,用RPMI-1640培养液悬浮沉淀的细胞。
3.根据权利要求2所述的分离纯化方法,其特征在于步骤(1)中的肿瘤组织体积为1~2cm3,离心管容量为50ml,加入的胶原酶溶液的体积为10~15ml,步骤(3)中加入20ml无血清的RPMI-1640培养液。
4.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法,其特征在于肿瘤组织悬液制备和纯化肿瘤细胞过程中的离心处理包括在1200转/分的转速下离心8分钟。
5.根据权利要求1所述的的分离纯化方法,其特征在于人血清的制备方法包括:将灭活人血清在3000转/分的转速下离心20分钟,取上清液。
6.根据权利要求1所述的分离纯化方法,其特征在于步骤(2)中的肿瘤组织细胞悬液与人血清的体积比为1∶1。
7.根据权利要求1所述的的分离纯化方法,其特征在于步骤(1)的肿瘤细胞可为包括人肺癌细胞、人乳腺癌细胞、人卵巢癌细胞、人肾癌细胞、人鼻咽癌细胞、人食道癌细胞、人大肠癌细胞、人恶性神经胶质瘤细胞和人小脑髓母细胞瘤细胞在内的上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞。
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CN1249000A (zh) * 1997-01-24 2000-03-29 旭医学株式会社 细胞分离方法

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