CN100344325C - 一种治疗宫颈癌的药物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗宫颈癌的药物及其制备方法与应用。该药物由肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ与聚合物载体组成，肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ通过光固定法偶联固定在聚合物载体上。肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ的质量比为1∶0.5～2。本发明利用肿瘤坏死因子与干扰素的协同作用，并通过载体增加了药物与病变部位的结合，提高药效。本发明的药物用量少，局部用药，针对性强，无毒副作用，不会给患者带来任何痛苦；另外，本发明药物使用方便，只需在医生帮助下，把产品戴在宫颈上，就可长时间起到治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，具体的说涉及一种治疗宫颈癌的药物及其制备方法与应用。
背景技术
宫颈癌是发生于子宫颈的上皮恶性肿瘤，是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，发病率居女性恶性肿瘤的第二位。在全球范围内，每年约有20多万妇女死于子宫颈癌，是仅次于乳腺癌位居第二的恶性肿瘤。在我国它一直居妇科恶性肿瘤首位。有资料表明，我国每年新发现的病例为13.15万，农村发病人数多于城市，山区多于平原。占女性生殖系统恶性肿瘤发病率的73～93％。全世界每年有50万新发病例，中国就占了1/4。
宫颈癌的潜在发病几率很大。在已婚女性的妇检中，50％至60％有不同程度的阴道炎和宫颈炎，如果不及时诊断治疗，由宫颈炎发生为宫颈癌的几率是正常人的7倍。特别值得注意的是，由于环境污染加上生活中的不良卫生习惯，使原本多发于50岁左右的女性宫颈癌，如今也盯上了年轻女性。
在临床上常见的宫颈癌治疗方法有手术治疗，药物治疗和物理治疗。化学药物和放射药物的选择性不高，既能抑制和杀伤肿瘤细胞，也可损伤体内正常组织和细胞，在治疗中出现明显的毒副作用；而物理疗法，如激光、冷冻、电灼等治疗较多出现活动性渗血，造成下腹隐痛不适，出现阴道流液甚至感染等副作用，给病人带来极大的生理上和心理上的痛苦。随着生物工程技术的发展，发现一些多肽，蛋白药物具有明显的抑癌治癌效果，但在体内半衰期短且不易透过生物膜。因此，对抗肿瘤药物的长效缓释、控释制剂，尤其是靶向制剂研究，降低化学和放射药物对正常组织的毒性，延缓机体耐药性的产生，提高生物工程药物的稳定性和疗效，是癌症药物治疗研究的主要目标。
首创放化疗手术的欧美西方国家已“开始废除这种错误的做法”，兴起“不用手术、放化疗治疗癌症。”加拿大、英国一批医生提出：“放化疗已经过时，不宜再用。”美国卫生部的临床统计报告：“经放化疗比不经放化疗的患者，癌细胞转移和扩散高出八倍……”。但我们至今仍视此为正规疗法，使国家和人民生命财产造成巨大损失，使数以万计的癌症患者死于这种所谓的正规疗法。所以，专家呼吁不要轻易的做西医治疗。
发明内容
本发明的目的是克服现有宫颈癌治疗上存在的问题，提供一种用于治疗宫颈癌的药物。
本发明的另一个目的是提供上述药物的制备方法。
本发明的进一步目的是提供上述药物在制备用于治疗宫颈癌的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种治疗宫颈癌的药物，由肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ与聚合物载体组成，肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ通过光固定法偶联固定在聚合物载体上。
上述肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ的质量比为1∶0.5～2。
上述肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ的最佳质量比为1∶1。
上述肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ的用量均为10ng。
本发明采用光固定法将肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ固定到聚合物载体上，具体包括如下步骤：①制备光活性溶液：在冰浴搅拌下，将IFN-γ加入N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，4℃，48h反应得到光活性IFN-γ溶液；在冰浴搅拌下，将TNF-α加入N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，4℃，48h反应得到光活性TNF-α溶液；②固定：将光活性IFN-γ溶液和光活性TNF-α溶液混合，加入到聚合物载体基板上，然后用紫外灯照射5～10分钟；③洗涤：用PBS(-)溶液反复洗涤聚合物载体基板，直至漏出PBS(-)溶液紫外吸收为零。
本发明所用到的聚合物载体是各种生物医用高分子材料表面，不具有免疫原性，具有丰富的链结构，以及链结构的可设计性、修饰性、生物相容性。利用光化学固定法可以将各种多肽、酶、生长因子、蛋白质等接枝到聚合物载体材料表面，制备出具有各种活性、各种用途的的生物材料。它是指利用紫外或可见区域(300-800nm)光线，将具有特定性质的组分或生物分子偶联到材料表面的方法。其原理是用带有热活性基团和光活性基团的化学连接组分将各种类型化合物的分子偶联到材料表面达到改性表面的目的。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，干扰素-γ(IFN-γ)均是有着广泛生物学作用的蛋白质性的细胞因子。其中，肿瘤坏死因子-α是由激活的单核细胞和巨噬细胞产生的，是直接杀伤肿瘤的最强生物因子之一，体内外实验均显示野生型TNF-α能杀伤多种肿瘤细胞，但全身给药的副毒作用严重，降低给药量又很难在局部达到有效的治疗浓度，从而影响其抗肿瘤效果。因此，如何降低TNF-α用药剂量，减少副作用，增强抗肿瘤疗效成为人们研究的焦点。IFN-γ是由淋巴细胞分泌的一种糖蛋白，它可增强TNF诱导的细胞凋亡，有协同促进TNF-α杀伤肿瘤细胞的功能，可在一定程度上减轻TNF的副毒反应。
采用用于生物医用高分子材料表面改性的光化学固定法将TNF-α与IFN-γ共同偶联具有良好生物相容性的聚苯乙烯(PSt)等几种高分子材料上，制备杀伤宫颈癌细胞的载体药物。TNF-α通过光固定化修饰，其杀伤肿瘤细胞的活性可因固定化而明显增强，且只需很小的剂量(可降低毒副作用)。IFN-γ的共固定化，与TNF-α产生协同杀伤作用，可进一步增强对宫颈癌细胞的杀伤力。
经固定有TNF-α与IFN-γ的生物材料，可以研制一种具有抗肿瘤活性的宫颈帽，戴在人类子宫颈上，直接与宫颈癌细胞表面接触发挥药效。这类载体药物经临床应用后，可望成为一种理想的治疗宫颈癌的载体药物。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
1.独特的设计思路，利用肿瘤坏死因子与干扰素的协同作用，并通过载体增加了药物与病变部位的结合，提高药效。
2.用量少，本产品属局部用药，针对性强。
3.无毒副作用，不会给患者带来任何痛苦。
4.使用方便，只需在医生帮助下，把本产品戴在宫颈上，就可长时间起到治疗作用。
5.治疗的连续性，本产品采用特殊的设计，使治疗不受经期及其他外因的影响，在戴上之后，可持续起治疗作用。
6.价格便宜，患者无经济负担，可广泛推广应用。宫颈癌在经济落后地区患病率最高，全球宫颈癌患病率最高的国家是南非，其次是亚洲国家。我国患病最多是西部的农村地区。由于本产品药量少、药效高，所以患者容易接受，无任何经济负担。
7.在市场竞争力方面，本产品与目前市场上的同类产品相比，以其显著的独特性和优越性，比同类产品本产品更容易使患者接受。
附图说明
图1为观察PSt膜平面及接枝的TNF-α的电镜图；
图2为观察PSt膜平面及接枝的TNF-α的原子力显微镜图；
图3为空白、共固定化细胞因子、游离细胞因子处理Hela细胞48hr后的细胞存活数；
图4为IFN-γ、TNF-a、IFN-γ+TNF-a对Hela细胞的抑制率(DNA直方图)；
图5为正常Hela细胞透射电镜形态；
图6为坏死Hela细胞透射电镜形态；
图7为凋亡Hela细胞透射电镜形态。
其中，图3中，1空白对照组；2共固定TNF-α+IFN-γ组(20ng)；3游离TNF-α+IFN-γ组(20ng/well)；图4中，(a)空白对照组；(b)固定TNF-α组；(c)固定IFN-γ组；(d)共固定TNF-α+IFN-γ组；图7中，(a)早期凋亡(b)晚期凋亡。
具体实施方式
实施例1制备治疗宫颈癌的载体药物
在冰浴搅拌下，将TNF-α(50μg)加入N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺(7.65μg)的二甲基甲酰胺/PBS(二甲基甲酰胺/PBS混合溶液体积为5ml，二甲基甲酰胺与PBS的体积比为4∶1，pH7.4，)溶液中，4℃，反应48h，得到光活性TNF-α溶液。在冰浴搅拌下，将IFN-γ(50μg)加入N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺(7.65μg)的二甲基甲酰胺/PBS(二甲基甲酰胺/PBS混合溶液体积为5ml，二甲基甲酰胺与PBS的体积比为4∶1，pH7.4，)溶液中，4℃，反应48h，得到光活性IFN-γ溶液。将光活性的TNF-α溶液与光活性的IFN-γ溶液混合，加入24孔组织培养聚苯乙烯(PSt)基板上。冰冻干燥后，在紫外灯(15w)下2cm处照射5min，利用叠氮基十分活泼的特点，将TNF-α与IFN-γ固定在PSt材料上。光固定化后用PBS(-)溶液、(PH7.4)反复洗涤基板，直至漏出PBS(-)溶液紫外吸收为零。即可得到治疗宫颈癌的载体药物。用电镜观察PSt膜平面及接枝的TNF-α，如图1。用原子力显微镜观察PSt膜平面及接枝的TNF-α，如图2。紫外光辐射光化学反应如式(I)。
实施例2载体药物抑制癌细胞实验
1.材料与方法
1.1主要试剂和仪器
重组人肿瘤坏死因子(TNF-α)、重组人干扰素(IFN-γ)、N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀亚酰胺、DMF；78-1磁力搅拌器、HY-5调速多用振荡器、超速冷冻离心机(Mikro22R)、紫外光谱仪(SHIMADZU UV2450)、冷冻干燥仪(25SL)、KYKY-1000B型扫描电子显微镜、M1730傅立叶变红外光谱仪、透射电镜、流式细胞仪。
1.2光活性细胞因子的合成与检测
在冰浴搅拌下，将TNF-α(50μg)加入N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺(7.65μg)的二甲基甲酰胺/PBS(二甲基甲酰胺/PBS混合溶液体积为5ml，二甲基甲酰胺与PBS的体积比为4∶1，pH7.4，)溶液中，4℃，反应48h，得到光活性TNF-α溶液。在冰浴搅拌下，将IFN-γ(50μg)加入N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺(7.65μg)的二甲基甲酰胺/PBS(二甲基甲酰胺/PBS混合溶液体积为5ml，二甲基甲酰胺与PBS的体积比为4∶1，pH7.4，)溶液中，4℃，反应48h，得到光活性IFN-γ溶液。合成结束后，用超过滤膜(Milipore Molecut II，5kDa)纯化叠氮苯基衍生的两种细胞因子，冷冻干燥。光合IFN-γ和IFN-γ(对照)KBr压片，在3000cm-1-1000cm-1区间作IR扫描。
1.3光固定化
光固定化反应同前文。先将IFN-γ以各种浓度(5～50ng/well)加入6块(A～F)24孔组织培养聚苯乙烯(PSt)基板上。其中A、B板在固定了TNF-α的基础上再固定相同浓度的IFN-γ，每种浓度6个平行孔；C、D、E和F板单固定化TNF-α和IFN-γ，固定浓度依次为10～100ng/well，每种浓度6个平行孔，并做6个平行孔为空白对照；以上各板低温干燥，在紫外灯(4W)下2cm处照射15分钟，利用叠氮基十分活泼的特点将IFN-γ固定在PSt材料上。光固定化后用PBS(-)(pH7.4)溶液反复洗涤基板，直至漏出PBS(-)溶液紫外吸收为零，把基板置于冰箱里自然干燥。
1.4人宫颈癌细胞的继代培养
人宫颈癌细胞Hela系由中山医科大学动物实验中心提供。用RPMI-1640培养液(含10％小牛血清、青霉素0.03mg/ml、链霉素0.05mg/ml，pH7.0～7.4)对人宫颈癌细胞进行继代培养。
去掉原来的培养液，用含有胰蛋白酶0.25％(w/v)和EDTA 0.02％(w/v)的PBS(-)来消化人宫颈癌细胞，用血清培养基洗涤细胞，把细胞接入15ml培养瓶中，37℃，5％CO2培养箱中培养。传代至旺盛生长后转入24孔聚苯乙烯基板上培养。
1.5光固定TNF-α、IFN-γ和游离TNF-α、IFN-γ对人宫颈癌细胞生长的抑制实验
用70％(v/v)乙醇溶液对固定有各种浓度(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/well)细胞因子的24孔聚苯乙烯培养板灭菌，再用灭菌水洗涤留在基板上的乙醇，晾干后每孔加入1ml无血清培养基。
取生长旺盛的Hela细胞，倒去原来的血清培养液，用上述方法消化细胞后加入无血清培养基悬浮细胞并计数，使细胞浓度在10×105/ml，然后将细胞接入24孔培养板中，每孔加入0.1ml，同时细胞也在纯粹的无血清培养基中培养做为对照。细胞在37℃，5％CO2培养箱中培养48个小时后用血球计数板计数，用透射电镜、流式细胞术等进行体外抗人子宫颈癌Hela细胞增值和诱导细胞凋亡机制的研究。
取另外一块24孔培养板标号为G，加入100ng游离的IFN-γ、TNF-α、IFN-γ+TNF-α，每个样品6个平行孔。每个孔如上述方法一样加入1ml无血清培养基和0.1ml细胞悬液。细胞在37℃，5％CO2培养箱中培养48个小时后用血球计数板计数，用投射电镜、流式细胞术等进行体外抗人子宫颈癌Hela细胞增值和诱导细胞凋亡机制的研究。
1.6细胞术检测细胞周期分布与鉴定细胞凋亡
分别取经IFN-γ、TNF-α、IFN-γ+TNF-a(10～100ng/well)作用48小时以及对照组的Hela细胞，用胰酶消化，用PBS漂洗，收集于离心管内，1500r/min离心5min，弃上清，将细胞沉淀轻轻悬起，加90％冷乙醇，用吸管将细胞分散均匀置冰箱内固定12小时以上。测定前离心除去乙醇，用PBS再洗一次后，离心去除上清液，加1500μg PI-碘化丙碇作用15min以上，用200目尼龙网过滤，以保证样品呈单细胞悬液状态，上机检测。在流式细胞仪上作DNA细胞周期和凋亡分析。
1.7Hela细胞透射电镜标本制作
取经IFN-γ+TNF-a(10～100ng/well)作用48小时的Hela细胞，取呈悬浮状的细胞，1500r/min离心5min，PBS漂洗1次，弃上清，沉淀细胞用0.25％中性戊二醛固定，用于透射电镜切片，同时做正常细胞对照。正常细胞用0.25％胰酶消化后，离心固定。
1.8统计学方法
采用SPSS12.0软件包，行单因素方差分析。
2.结果与分析
2.1固定化IFN-γ和共固定(IFN-γ+TNF-α)的协同对Hela细胞生长曲线的影响
表1单固定IFN-γ对Hela细胞生长的影响 表2共固定IFN-γ+TNF-a对Hela细胞生长的影响
| IFN-γ浓度(ng/well) | 细胞数(×104)x±s | 抑制率(％) |
| 0(对照组)102030405060708090100 | 3.76±0.843.13±0.672.69±0.872.75±0.712.63±0.252.54±0.741.58±0.54*2.00±0.822.25±0.952.75±0.502.42±0.69 | 17292730325847402736 |
| IFN-γ+TNF-α浓度(ng/well) | 细胞数(×104)x±s | 抑制率(％) |
| 0(对照组)102030405060708090100 | 3.76±0.582.75±0.560.67±0.29**2.08±0.613.25±0.431.42±0.29*1.00±0.25*2.25±0.641.99±0.351.75±0.731.83±0.83 | 27824514627340475351 |
与对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01 与对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01
人宫颈癌细胞在共固定(TNF-α+IFN-γ)和单独固定有IFN-γ的24孔聚苯乙烯培养板上培养48小时后，发现随着时间的延长，培养孔中很多细胞脱壁，变为圆形且细胞内出现空泡。和对照组比较，发现固定有药物的培养孔中，克隆细胞团较小；而在空白对照的培养孔中，细胞满壁，克隆团大，单个圆形的细胞较少。
从单固定IFN-γ对Hela细胞生长的抑制作用来看，IFN-γ在低浓度时对Hela细胞的抑制作用不明显，在20ng/well时对Hela细胞的抑制率只有29％；随着浓度的升高，抑制作用逐渐升高，在60ng/well时对Hela的抑制率达58％(见表1)。
TNF-α+IFN-γ的共固定，在20ng/well时，显示出对Hela细胞有较好的抑制作用，抑制率82％，推测共固定浓度为20ng/well时对Hela细胞起主要抑制作用的是TNF-α；在60ng/well时，对Hela细胞也有较好的抑制作用，抑制率73％(见表2)，推测共固定浓度为60ng/well时，对Hela细胞起抑制作用的主要因子是IFN-γ。
可见，TNF-α+IFN-γ的共固定对Hela细胞的抑制率可达到82％，比单固定IFN-γ的抑制率58％大得多。
2.2固定与天然的TNF-α和IFN-γ对人宫颈癌细胞抑制率比较
如图3所示，固定化TNF-a+IFN-γ(20ng)对Hela细胞的抑制率约为82％(如2)，天然TNF-a+IFN-γ(20ng)对Hela细胞的抑制率比固定化TNF-a+IFN-γ(20ng)的抑制率低(如3)；这与研究发现固定化胰岛素，上皮细胞生长因子及肿瘤坏死因子比溶液形态的具有更显著的活性，并且很少量就足够起作用的结果相一致。
固定化细胞因子不但具有较高的抑制活性，而且药效缓慢持久，相信随着时间的延长，固定化细胞因子的抑制活性将远远超过游离因子。
2.3 IFN-γ、TNF-α和IFN-γ+TNF-α对Hela细胞凋亡峰及细胞周期的影响
由图4可见，经IFN-γ、TNF-a、IFN-γ+TNF-a处理后，在直方图上出现典型的凋亡细胞峰(亚峰)；A为空白对照，从A图可看出细胞凋亡峰很小，但比理论偏高，可能是取了过多的悬浮细胞，这些细胞很多都已经凋亡，影响了实验结果；图B、图C、图D分别为TNF-α、IIFN-γ、TNF-α+IIFN-γ影响下的细胞凋亡峰，可以看出，共固定(TNF-α+IIFN-γ)的凋亡峰最高，所以其引起细胞凋亡的作用是最强的。
2.4正常细胞、坏死细胞及IFN-γ+TNF-α作用后Hela细胞的透射电镜形态
正常的Hela细胞细胞膜及细胞核膜完整，可见双层单位膜，细胞器形态完整，线粒体嵴完整。胞浆内有大量粗面内质网及核糖体，细胞核常染色质白色较多，异染色质呈散在斑点状，核浆比例1∶1(见图5)；坏死细胞的染色质呈不规则的团块状，但不象凋亡细胞那样集中于核周边。细胞膜、核膜和细胞器的结构破坏，线粒体空泡变，细胞崩解，胞浆及其内容物外泄(见图6)。
透射电镜下凋亡的Hela细胞体积缩小为正常细胞的1/2。胞膜、核膜、各细胞器膜均完整，核浆比例增加，核物质致密，核内异染色质增多，染色质浓缩成斑块状，或呈新月形边集于核膜。可见出泡现象及凋亡小体的出现(见图7)。
3.结论
本论文研究结果显示：天然的IFN-γ、TNF-a、IFN-γ+TNF-a对Hela细胞的抑制作用比固定化的IFN-γ、TNF-a、IFN-γ+TNF-a弱；单固定IFN-γ对Hela细胞的抑制作用比共固定IFN-γ+TNF-a弱；共固定的IFN-γ在一定浓度时可协同TNF-a增强杀伤Hela细胞的效果。IFN-γ、TNF-a、IFN-γ+TNF-a对细胞周期的影响是通过抑制细胞从S到G2/M期的转化来抑制Hela细胞增殖，诱导细胞发生凋亡的。在流式细胞仪分析图上出现典型的凋亡峰(亚峰)；透射电镜下观察到凋亡细胞异染色质增多，并且边集于核膜。共固定化IFN-γ和TNF-a的协同作用研究提示抗肿瘤、抗病毒间的内在联系，由这两种细胞因子制成的治疗妇科宫颈癌的载体药物具有潜在的应用价值。
Claims (7)
1、一种治疗宫颈癌的药物，其特征在于由肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ与聚合物载体组成；所述肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ固定在聚合物载体上。
2、根据权利要求1所述的药物，其特征在于所述肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ的质量比为1∶0.5～2。
3、根据权利要求2所述的药物，其特征在于所述肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ的质量比为1∶1。
4、根据权利要求3所述的药物，其特征在于所述肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ的用量均为10ng。
5、一种权利要求1所述的药物的制备方法，其特征在于采用光固定法将肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ固定到聚合物载体上。
6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述采用光固定法将肿瘤坏死因子-α与干扰素-γ固定到聚合物载体上包括如下步骤：①制备光活性溶液：在冰浴搅拌下，将IFN-γ加入到N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺的二甲基甲酰胺/PBS溶液中，4℃，反应48h得到光活性IFN-γ溶液；在冰浴搅拌下，将TNF-α加入到N-(4-叠氮苯甲酸基)琥珀酰亚胺的二甲基甲酰胺DMF/PBS溶液中，4℃，反应48h得到光活性TNF-α溶液；②固定：将光活性IFN-γ溶液和光活性TNF-α溶液混合，加入到聚合物载体基板上，然后用紫外灯照射5～10分钟；③洗涤：用PBS(-)溶液反复洗涤聚合物载体基板。
7、权利要求1所述药物在制备用于治疗宫颈癌的药物中的应用。
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- 2005-10-17 CN CNB2005101003046A patent/CN100344325C/zh not_active Expired - Fee Related
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 共固定化TFN-A和IFN-Y的抗宫颈癌作用 关燕清等，功能高分子学报，第18卷第2期 2005 * |
Also Published As
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