CN1883709A - 导向双功能抗肿瘤多肽及其应用 - Google Patents

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王新昌
王文刚
陈钧辉
曾名嘉
聂永军
李俊
张冬梅
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Abstract

本发明属于多肽制药技术领域。本发明利用一个载体分子聚乙二醇(polyethylene glycol，简称PEG)把两个不同功能的多肽连接在一起，其中一个多肽为细胞粘附肽，序列为Glu－Ile－Leu－Asp－Val；另一个为抗肿瘤寡肽，序列为Tyr－X－Glu－Pro－Gly－Pro－Y－Ala，其中X为Leu或Ile，Y为Thr或Ser，合成的杂合分子称导向双功能抗肿瘤多肽。它具有抑制肿瘤细胞生长和转移的功能，可在制备治疗肿瘤药物中应用。

Description

导向双功能抗肿瘤多肽及其应用
一、技术领域：
本发明属于多肽制药技术领域。
二、背景技术：
蛋白质、肽类药物虽然具有专一性强，时效高的优点，但在体内很快被清除，特别是小分子多肽很快通过肾脏过滤出去，加上被体内众多的蛋白水解酶迅速水解，从而一般半衰期很短。在这神种情况下，如何能延长这些药物在体内的半衰期变为近年来蛋白质和肽类药物研究的热点，特别是用聚乙二醇(polyethylene glycol，简称PEG)来修饰的γ-干扰素成为长效药物用于治疗丙种肝炎上市后，带动了一大批已经在临床上应用的蛋白质、肽类药物纷纷采用PEG来获得长效药物。然而在众多的研究中还没有一个研究与本申请相关，因此通过本发明可以把两种不同功能的多肽杂合在一起，并具有导向和长效功能，特别在肿瘤的治疗上，将具有重要意义。
三、发明内容
细胞粘附肽(简称M)是一个五肽，序列为Glu-Ile-Leu-Asp-Val(J.Biol.Chem.1991，Aug.15：266(23)15075-15079，Komoriya A.等)，它是由纤粘连蛋白IIICS衍生而来，它是各种细胞粘着的主要识别位点。抗肿瘤寡肽(AOP，简称O)是一个人工合成的抗肿瘤八肽，包括抗肿瘤寡肽-1(AOP-1)、抗肿瘤寡肽-2(AOP-2)、抗肿瘤寡肽-3(AOP-3)、抗肿瘤寡肽-4(AOP-4)。AOP-1序列为Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala；AOP-2序列为Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala；AOP-3序列为Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala；AOP-4序列为Tyr-Ile-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala。(抗肿瘤寡肽及其制备方法和应用，中国发明专利，专利申请号为2006100768577，2006年，陈钧辉、张冬梅、王新昌等)，它对小鼠Lewis肺癌和小鼠S180肉瘤的生长有明显的抑制作用，且具有剂效关系。可用来制备抗肿瘤药物，用于治疗肿瘤。本发明需要解决的问题是研制一种通过载体分子PEG把两个不同功能多肽结合在一起的方法，制备导向双功能抗肿瘤多肽(PMO)，包括PMO-1、PMO-2、PMO-3、PMO-4，并研究其抗肿瘤活性和抑制肿瘤细胞转移的功能。
本发明的技术方案为：
1、导向双功能抗肿瘤多肽(PMO)的制备
(1)细胞粘附肽M的制备：采用液相合成法和活化酯逐个增长法加以合成。
(2)抗肿瘤寡肽(AOP)的制备：采用液相合成法或固相合成法合成(详见中国发明专利申请号2006100768577，2006年，陈钧辉、张冬梅、王新昌等)
(3)PEG：对PEG的分子量没有严格的限定，一般选用分子量为4000～10000，我们选用的是PEG6000。
(4)PEG的活化：先把PEG与丁二酸酐反应生成聚乙二醇二酸(PEG-DA)，然后再与N-羟基丁二酰亚胺形成聚乙二醇二酸活化酯(PEG-DA-NHS)。
(5)PEG-DA-NHS与粘附M肽、AOP肽反应，生成PMO
2、PMO的鉴定
分子量的测定通过HPLC凝胶层析(TSK-3000柱)，氨基酸组成分析通过氨基酸自动分析仪。
3、PMO抗肿瘤活性测定
(1)体外活性测定
采用细胞计数的方法，测定PMO对人白血病细胞U937生长和增殖的抑制作用。当细胞生长成单层后，用含1％小牛血清的RPMI1640培养液制成细胞悬液，按每孔1ml接种到24孔培养板上，对照组和实验组均设三个重复孔37℃、5％CO2培养箱中培养4h后，对照组加入20μl的PBS，试验组加入不同剂量的AOP肽、PEG-AOP肽和PMO，继续培养72小时后，在倒置显微镜下用血球计数板计数。
(2)体内活性测定：
将已接种Lewis肺癌细胞的荷瘤小鼠处死，无菌操作抽取其腹水，按1∶3比例稀释，配制成细胞悬液，于每只实验用小鼠的右前肢腋窝皮下注射0.2ml瘤细胞悬液，瘤细胞不少于105，植瘤24hr后，给药组分别以不同剂量进行静脉注射，以生理盐水作为阴性对照组，CTX为阳性对照组，AOP肽连续注射10天，PEG-AOP肽和PMO每隔3天注射一次，共4次。于停药4天时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。
(3)抗实验性肿瘤转移的测定
取对数生长期的B16细胞，消化后用无血清培养液配制成2.5×104的细胞悬液，生理盐水组每只小鼠尾静脉注射0.2ml(5×104cell/只)，样品组动物左尾静脉先注射样品液0.5ml，右尾静脉再注射细胞悬液0.2ml(5×104cell/只)。接种后28日脱颈处死动物，称体重，解剖取肺脏，用生理盐水漂洗后计数肺部黑色集落数，计算每组抑制率。
本发明与现有技术相比所具有的效果
利用本发明的技术合成的PMO突破了传统的抗肿瘤药物的概念，将两种不同功能的多肽分子通过一个载体连接形成一个杂合分子，不仅具有原来的两个多肽分子的功能，即抑制肿瘤细胞的生长和抑制肿瘤细胞转移的双重功能，而且具有将药物导向肿瘤细胞和长效的功能。实验结果表明POM不论其体外活性，还是体内的抑瘤效果均高于AOP肽和PEG-AOP。在相同摩尔浓度的基础上，其体外活性是AOP肽的3倍，是PEG-AOP的1.2倍。其体内抑瘤活性是AOP肽的8倍，是PEG-AOP的2倍。由于PMO具有长效功能，不需每天注射，这不仅方便了患者，而且可以减轻患者的经济负担。本发明所述PMO可作为制备抗肿瘤药物。
四、具体实施方式
实施例1：聚乙二醇二酸(PEG-DA)和聚乙二醇二酸活化酯(PEG-DA-NHS)的制备
30g PEG6000与2.5g丁二酸，溶于100ml氯仿，回流48小时后，抽去有机溶剂，加乙醚沉淀，真空干燥，得27.5gPEG-DA。
15.5g PEG-DA溶于50ml二氯甲烷，加入1.04g二环已基碳二亚胺(DCC)和0.602gN-羟基丁二酰亚胺的50ml四氢呋喃溶液，室温反应24小时后，过滤，滤液加乙醚沉淀，真空干燥，得14.9g PEG-DA-NHS。
实施例2：PMO-1的制备半或全部为雄鼠。将已接种Lewis肺癌细胞的荷瘤小鼠处死，无菌操作抽取其腹水，按1∶3比例稀释，配制成细胞悬液，于每只实验用小鼠的右前肢腋窝皮下注射0.2ml瘤细胞悬液，瘤细胞不少于105，植瘤24hr后，给药组分别以不同剂量进行静脉注射，以生理盐水作为阴性对照组，CTX为阳性对照组，AOP-1肽连续注射10天，PEG-AOP-1肽和PMO-1肽每隔3天注射一次，共4次。于停药4天时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。结果如表2所示。
Figure A20061008239800071
表2  PMO-1对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
  组别   剂量(μmol/kg)   给药方案       动物数   抑瘤率％
  始   终
  生理盐水CTXAOP-1肽PEG-AOP-1肽PMO-1肽   25ml/kg30mg/kg1231.5   iv×10ip×7iv×10iv×4(q3d)iv×4(q3d)   1010101010   1010101010 94.1779.4974.8980.72
实施例6：PMO-1的体内抗实验性肿瘤转移的测定
将小鼠随机分为3组，每组6只，分别为：
1)PMO-18μmol/kg组(样品和细胞悬液左右尾静脉分开注射)
2)PMO-116μmol/kg(样品和细胞悬液左右尾静脉分开注射)
3)生理盐水对照组
取对数生长期的B16细胞，消化后用无血清培养液配制成2.5×104的细胞悬液，生理盐水组每只小鼠尾静脉注射0.2ml(5×104cell/只)，1)、2)组动物左尾静脉先注射样品液0.5ml，右尾静脉再注射细胞悬液0.2ml(5×104cell/只)。接种后28日脱颈处死动物，称体重，解剖取肺脏，用生理盐水漂洗后计数肺部黑色集落数，计算每组抑制率。
称取720mg PEG-DA-NHS，溶于10ml二甲基甲酰胺(DMF)，加入含M肽105.84mg和AOP-1肽152.28mg的120ml pH8.5、0.5mol/L硼酸缓冲液，在室温反应3小时，然后放入截留分子量为1000的透析袋中充分透析，透析液经冻干得产品781.3mg，得率87.6％。
实施例3：PMO-1的鉴定
用TSK-3000凝胶柱在HPLC上进行分子量测定，用氨基酸自动分析仪对PMO-1的氨基酸进行测定，再用紫外法对PMO-1中M肽、AOP-1肽的含量进行测定。
实施例4：PMO-1的体外活性测定
采用细胞培养和细胞计数的方法，人白血病细胞U937以RPMI1640为培养基，视不同情况加入10％左右的小牛血清，用T-25培养瓶在37℃，5％CO2培养箱中单层培养。
当细胞生长成单层后，用含1％小牛血清的培养液制成细胞悬液，按每孔1ml接种到24孔培养板上，对照组和实验组均设三个重复孔37℃、5％CO2培养箱中培养4h后，对照组加入20μl的PBS，试验组加入不同剂量的AOP-1肽、PEG-AOP-1肽和PMO-1，继续培养72小时后，在倒置显微镜下用血球计数板计数，结果如表1所示。
表1  PMO-1对U937细胞增殖的抑制作用
  剂量(μmol/L)   AOP-1抑制率(％)   PEG-AOP-1抑制率(％)   PMO-1抑制率(％)
  0.0150.0300.0600.120 32.8757.5393.24   35.6667.1293.31   43.8582.23100.0
实施例5：PMO-1的体内抗肿瘤活性测定
50只健康昆明种小白鼠，体重20±2克，平均分五组，每组10只，雌雄各
表3  PMO-1一次静脉给药对小鼠B16黑色素瘤肺转移的疗效
  组别   剂量(μmol/kg)   给药方案      动物数   抑制率％
  始   终
  生理盐水PMO-1肽PMO-1肽   25ml/kg816   iv×1iv×1iv×1   666   666 46.7176.42
实施例7：PMO-2的制备
同实施例2，不同之处仅在于AOP-2替代AOP-1。
实施例8：PMO-2的鉴定
用TSK-3000凝胶柱在HPLC上进行分子量测定，用氨基酸自动分析仪对PMO-2的氨基酸进行测定，再用紫外法对PMO-2中M肽、AOP-2肽的含量进行测定。
实施例9：PMO-2的体外活性测定
测定方法同实施例4，其结果如表4。
表4  PMO-2对U937细胞增殖的抑制作用
  剂量(μmol/L)  AOP-2抑制率(％)  PEG-AOP-2抑制率(％)  PMO-2抑制率(％)
  0.0150.0300.0600.120 33.1455.2389.47  34.5165.0491.37  41.2380.1497.89
实施例10：PMO-2的体内抗肿瘤活性测定
方法同实施例5，其结果如表5。
表5  PMO-2对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
 组别   剂量(μmol/kg)   给药方案       动物数   抑瘤率％
  始   终
 生理盐水CTXAOP-2肽PEG-AOP-2肽PMO-2肽   25ml/kg30mg/kg1231.5   iv×10ip×7iv×10iv×4(q3d)iv×4(q3d)   1010101010   1010101010 90.3276.2772.6877.32
实施例11：PMO-2的体内抗实验性肿瘤转移的测定
方法同实施例6，其结果如表6所示。
表6  PMO-2一次静脉给药对小鼠B16黑色素瘤肺转移的疗效
  组别   剂量(μmol/kg)   给药方案      动物数   抑制率％
  始   终
  生理盐水PMO-2肽PMO-2肽   25ml/kg816   iv×1iv×1iv×1   666   666 43.2873.35
实施例12：PMO-3的制备
同实施例2，不同之处仅在于AOP-3替代AOP-1。
实施例13：PMO-3的鉴定
用TSK-3000凝胶柱在HPLC上进行分子量测定，用氨基酸自动分析仪对PMO-3的氨基酸进行测定，再用紫外法对PMO-3中M肽、AOP-3肽的含量进行测定。
实施例14：PMO-3的体外抗肿瘤活性的测定
方法同实施例4，其结果如表7所示。
表7  PMO-3对U937细胞增殖的抑制作用
  剂量(μmol/L)  AOP-3抑制率(％)  PEG-AOP-3抑制率(％)  PMO-3抑制率(％)
  0.0150.0300.0600.120 31.2456.1892.03  32.4166.0792.48  42.3181.2598.17
实施例15：PMO-3的体内抗肿瘤活性测定
方法同实施例5，其结果如表8。
表8  PMO-3对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
 组别   剂量(μmol/kg)   给药方案      动物数   抑瘤率％
  始   终
 生理盐水CTXAOP-3肽PEG-AOP-3肽PMO-3肽   25ml/kg30mg/kg1231.5   iv×10ip×7iv×10iv×4(q3d)iv×4(q3d)   1010101010   1010101010 91.8978.5872.7178.39
实施例16：PMO-3的体内抗实验性肿瘤转移的测定
方法同实施例6，其结果如表9所示。
表9  PMO-3一次静脉给药对小鼠B16黑色素瘤肺转移的疗效
  组别   剂量(μmol/kg)   给药方案     动物数   抑制率％
  始   终
  生理盐水PMO-3肽PMO-3肽   25ml/kg816   iv×1iv×1iv×1   666   666 43.8772.89
实施例17：PMO-4的制备
同实施例2，不同之处在于AOP-4替代AOP-1。
实施例18：PMO-4的鉴定
用TSK-3000凝胶柱在HPLC上进行分子量测定，用氨基酸自动分析仪对PMO-4的氨基酸进行测定，再用紫外法对PMO-4中M肽、AOP-4肽的含量进行测定
实施例19：PMO-4的体外抗肿瘤活性的测定
测定方法同实施例4，其结果如表10。
表10  PMO-4对U937细胞增殖的抑制作用
  剂量(μmol/L)  AOP-4抑制率(％)  PEG-AOP-4抑制率(％)  PMO-4抑制率(％)
  0.0150.0300.0600.120 30.1353.4288.17  29.8561.0290.18  43,6781.3489.28
实施例20：PMO-4的体内抗肿瘤活性的测定
方法同实施例5，其结果如表11。
表11  PMO-4对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
 组别   剂量(μmol/kg)   给药方案      动物数   抑瘤率％
  始   终
 生理盐水CTXAOP-4肽PEG-AOP-4肽PMO-4肽   25ml/kg30mg/kg1231.5   iv×10ip×7iv×10iv×4(q3d)iv×4(q3d)   1010101010   1010101010 93.3271.1170.5773.69
实施例21：PMO-4的体内抗实验性肿瘤转移的测定
方法同实施例6，其结果如表12所示。
表12  PMO-4一次静脉给药对小鼠B16黑色素瘤肺转移的疗效
  组别   剂量(μmol/kg)   给药方案      动物数   抑制率％
  始   终
  生理盐水PMO-4肽PMO-4肽   25ml/kg816   iv×1iv×1iv×1   666   666 40.1871.23

Claims (3)

1、一种导向双功能抗肿瘤多肽，其特征在于利用一个载体分子聚乙二醇把两个不同功能的多肽连接在一起，其中一个多肽为细胞粘附肽，序列为
Glu-Ile-Leu-Asp-Val；另一个为抗肿瘤寡肽，序列为
Tyr-X-Glu-Pro-Gly-Pro-Y-Ala，其中X为Leu或Ile，Y为Thr或Ser，形成一个共价连接的杂合分子即导向双功能抗肿瘤多肽。
2、根据权利要求1所述导向双功能抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于由以下几个步骤构成：
(1)制备细胞粘附肽；
(2)制备抗肿瘤寡肽；
(3)聚乙二醇活化形成聚乙二醇二酸活化酯PEG-DA-NHS；
(4)PEG-DA-NHS与粘附肽、抗肿瘤寡肽反应，生成导向双功能抗肿瘤多肽。
3.根据权利要求1所述导向双功能抗肿瘤多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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