CN101054382A

CN101054382A - 藤黄酸衍生物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN101054382A
Application number: CN 200610025597
Authority: CN
Inventors: 段文虎; 周云隆; 丁健
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2006-04-11
Filing date: 2006-04-11
Publication date: 2007-10-17

Abstract

本发明公开了一种藤黄酸衍生物及它的制备方法，该类衍生物包括多种氨基酸残基以及衍生物与酸、碱制成的盐，经生物试验证明其具有抗肿瘤活性使其开发成肿瘤药物以及将该类衍生物作为寻找抗肿瘤药物的先导化合物为抗肿瘤药物开辟途径。

Description

藤黄酸衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及提高抗肿瘤活性的新型藤黄酸衍生物及其作为抗肿瘤疾病药物的应用。本发明还涉及该藤黄酸衍生物的制备方法。

背景技术

藤黄为藤黄科植物藤黄树(Garcinia banburyi)的树干被割伤后流出的胶状树脂。主产柬埔寨、泰国和越南，我国广东省和海南省有栽培。藤黄为树脂70％-80％，树胶15％-25％等的混和物。其中含藤黄酸(Gambogicacid)22.75％-36.59％，新藤黄酸(neoGambogic acid)、别藤黄酸(alloGambogic acid)等成分(中国野生植物资源.22(1)：1，2003)。近20年来，国内外特别是我国学者对藤黄及其活性成分藤黄酸等做了大量的研究工作，发现藤黄及藤黄酸等用于治疗肿瘤疗效显著，毒副作用小，活性成分性质稳定，已引起泛注意。近年有报道藤黄制成注射液后，临床治疗恶性肿瘤有一定疗效(天津医药肿瘤学附刊8：230，1981；Tetrahdron 21：1453，1965；江西医学院学报2：1，1980)。1984年、1986年丘相寰等研究了藤黄酸对Hela细胞以及小鼠腹水型肝癌细胞周期移行的影响，结果表明1.8μg/ml，3μg/ml剂量的藤黄到对Hela细胞生长有明显的抑制作用。董成等以5μg/ml的藤黄酸作用24hr即可有效的杀伤肝癌细胞，具抗癌作用与药物浓度及作用时间呈正相关(中国肿瘤临床，21：464，1994)。与传统抗癌药相比，藤黄的毒性较小。临床结果显示其对骨髓无明显抑制，对神经系统和心、肝、肾等功能方面无损害，且不损伤免疫系统功能性淋巴细胞、浆细胞，故被认为是一种比较安全，且可长期连续使用的抗癌药物。目前藤黄酸已经在国内进入临床研究。

藤黄酸的作用机制尚未完全弄清，但现阶段的研究显示藤黄酸可能是通过激活参与细胞凋亡的重要的酶-Caspase，从而诱导肿瘤细胞凋亡。

另外作为一种常见中药藤黄的有效成分，藤黄酸在自然界还有着丰富的来源，这些因素使得藤黄酸在抗肿瘤治疗方面的应用有着极大的前景。

发明内容

本发明的目的在于设计与合成新型的具有良好抗肿瘤活性的藤黄酸衍生物，从而为寻找抗肿瘤药物研究的先导化合物或抗肿瘤药物开辟途径。本发明的另一目的在于提供制备该类衍生物的方法。

本发明所述藤黄酸衍生物具体结构如下：

其中R为包括甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸在内的氨基酸残基，所有的具有手性的氨基酸残基包含了其L型氨基酸残基、R型氨基酸残基及外消旋型氨基酸残基，且氨基酸残基R以氨基与藤黄酸的C1位通过酰胺键结合。

本发明化合物，还包括本发明衍生物与各种酸或碱所形成的盐，其中酸包括有机或无机酸，例如：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、醋酸、枸椽酸、扁桃酸、乳酸、马来酸、富马酸、苯甲酸、酒石酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、草酸和酸性氨基酸等；碱包括有机或无机碱，如：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、三羟甲基甲氨及碱性氨基酸、碱性含氮杂环等。

藤黄酸的结构如下：

1藤黄酸

本发明中所用的藤黄酸的制备方法皆可参照《江西医学院学报》1980(2)：1，将藤黄树脂100克(购自本地药材公司)，碾碎加丙酮500ml，回流半小时，重复三次后合并提取液，浓缩至干，得到以含藤黄酸及新藤黄酸为主的混合物，即总藤黄酸。将总藤黄酸经柱层析，洗脱剂为氯仿∶甲醇∶二乙胺＝15∶1∶1，取橙色带即为藤黄酸。

本发明通过下列步骤实施：

首先将藤黄酸与HOBT(氮-羟基苯并三氮唑)缩合制成活性酯(2)。反应所用催化剂包括DCC(二环己基碳二亚胺)、EDCI(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride)；反应所用溶剂氯仿、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷等，优选为二氯甲烷；反应温度为0-50℃，优选为10-20℃。

本发明的第二步是将活性酯(2)与相应的氨基酸进行反应得到相应的目标化合物。反应的溶剂为二甲亚砜、二甲亚砜-水、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈、乙腈-水，优选乙腈-水的双溶剂系统。反应的pH优选为7-9之间，可以用碳酸氢钠、醋酸钠，更优选为使用磷酸氢二钾以稳定pH在7-9之间。反应温度为0-50℃，优选为10-20℃。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

实施例1

藤黄酸活性酯

于一干燥的5ml三颈瓶中加入藤黄酸(0.5g)、DCC(280mg)、HOBT(200mg)，以二氯甲烷2ml溶解，室温下搅拌反应4小时原料消失。抽滤除去大部分DCU后，经硅胶柱层析得藤黄酸活性酯301mg MS-EI：745[M+]。

实施例2

将藤黄酸活性酯(50mg)溶于2ml乙腈中，剧烈搅拌下加入蒸馏水直到得到一个黄色透明的体系，加入甘氨酸(15mg)磷酸氢二钾10mg，搅拌或用超声波使溶解。室温下搅拌反应4小时结束。以乙酸乙酯(10ml*3)提取反应液，合并乙酸乙酯层，以无水硫酸镁干燥，抽滤后浓缩除去乙酸乙酯，经硅胶柱层析后得到黄色泡沫状目标物GA03 42mg，MS-EI：685[M+]。

实施例3

将藤黄酸活性酯(60mg)溶于2ml乙腈中，剧烈搅拌下加入蒸馏水直到得到一个黄色透明的体系，加入(DL)-甲硫氨酸(36mg)磷酸氢二钾10mg，搅拌或用超声波使溶解。室温下搅拌反应4小时结束。以乙酸乙酯(10ml*3)提取反应液，合并乙酸乙酯层，以无水硫酸镁干燥，抽滤后浓缩除去乙酸乙酯，经硅胶柱层析后得到黄色泡沫状目标物GA02 44mg，MS-EI：759[M+]。

实施例4

将藤黄酸活性酯(60mg)溶于2ml乙腈中，剧烈搅拌下加入蒸馏水直到得到一个黄色透明的体系，加入L-丙氨酸(22mg)磷酸氢二钾10mg，搅拌或用超声波使溶解。室温下搅拌反应4小时结束。以乙酸乙酯(10ml*3)提取反应液，合并乙酸乙酯层，以无水硫酸镁干燥，抽滤后浓缩除去乙酸乙酯，经硅胶柱层析后得到黄色泡沫状目标物GA01 44mg，MS-EI：699[M+]。

实施例5

将藤黄酸活性酯60mg溶于2ml乙腈中，剧烈搅拌下加入蒸馏水直到得到一个黄色透明的体系，加入缬氨酸(24mg)磷酸氢二钾10mg，搅拌或用超声波使溶解。室温下搅拌反应4小时结束。以乙酸乙酯(10ml*3)提取反应液，合并乙酸乙酯层，以无水硫酸镁干燥，抽滤后浓缩除去乙酸乙酯，经硅胶柱层析后得到黄色泡沫状目标物GA04 44mg MS-EI：727[M+]。

实施例6

将藤黄酸活性酯(60mg)溶于2ml乙腈中，剧烈搅拌下加入蒸馏水直到得到一个黄色透明的体系，加入脯氨酸(26mg)磷酸氢二钾10mg，搅拌或用超声波使溶解。室温下搅拌反应4小时结束。以乙酸乙酯(10ml*3)提取反应液，合并乙酸乙酯层，以无水硫酸镁干燥，抽滤后浓缩除去乙酸乙酯，经硅胶柱层析后得到黄色泡沫状GA05 40mg MS-EI：725[M+]。

实施例7

将藤黄酸活性酯60mg溶于2ml乙腈中，剧烈搅拌下加入蒸馏水直到得到一个黄色透明的体系，加入谷氨酸(24mg)及磷酸氢二钾10mg 以使反应液的pH值保持在7-9之间，搅拌或用超声波使谷氨酸溶解。室温下搅拌反应4小时结束。以乙酸乙酯(10ml*3)提取反应液，合并乙酸乙酯层，以无水硫酸镁干燥，抽滤后浓缩除去乙酸乙酯，经硅胶柱层析后得到黄色泡沫状目标物GA0740mg MS-EI：757[M+]。

实施例8

将藤黄酸活性酯60mg溶于2ml乙腈中，剧烈搅拌下加入蒸馏水直到得到一个黄色透明的体系，加入苯丙氨酸(26mg)及磷酸氢二钾10mg以使反应液的pH值保持在7-9之间，搅拌或用超声波使苯丙氨酸溶解。室温下搅拌反应4小时结束。以乙酸乙酯(10ml*3)提取反应液，合并乙酸乙酯层，以无水硫酸镁干燥，抽滤后浓缩除去乙酸乙酯，经硅胶柱层析后得到黄色泡沫状GA06 40mgMS-EI：775[M+]。

实施例9

抗肿瘤活性试验

分别用磺酰罗丹明B蛋白染色法(sulforhodamine B，SRB)和四氮唑盐(microculture tetrozolium，MTT)还原法对本发明合成的化合物进行抗肿瘤活性的研究(Cancer Res.1988，48(3)，589)。

1、利用SRB蛋白染色法测定本发明化合物对人肺癌细胞A-549的抑制作用：

SRB是一种蛋白结合染料，可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的光密度(OD)读数与细胞数成良好的线性关系，故可用作细胞数的定量。

1.1、试验材料与仪器

人肺癌细胞A-549(美国典型培养物保藏中心)

含10％小牛血清的RPMI-1640培养液(Gibco公司)

SRB液(sigma corporation)

藤黄酸

可调波长式微孔板酶标仪(VERSAmaxTM，Molecular Device Corporation，Sunnyvale CA，USA)

待测化合物：实施例2-9所制备的化合物

待测化合物和阳性对照物藤黄酸以二甲亚砜稀释，浓度梯度为10^-4M、10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M

1.2试验方法

人肺癌细胞A-549用含10％小牛血清的RPMI-1640培养，测定时将对数生长期的细胞配成细胞悬液，接种于96孔培养板上。实验组每孔分别加入10μl不同浓度的待测化合物，空白对照组加等体积含最高浓度溶剂(即10^-4M的二甲亚砜)的RPMI-1640培养液，在37℃，5％二氧化碳条件下培养72小时后，用三氯乙酸固定，每孔加入100μlSRB液，洗去未结合的SRB，用自动分光光度平板读数计测定515nm处的OD值。以不加药物的肿瘤细胞组为空白对照，计算药物对该肿瘤细胞的生长抑制率。

抑制率＝[(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值]×100％

结果评定：无效：10^-5mol/L＜85％；

弱效：

强效：

1.3试验结果

待测化合物对A-549肿瘤细胞生长的抑制实验结果见下表

作用时间：72h

样品编号	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7	10^-8	评价	备注
样品编号	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7	10^-8	评价	备注	藤黄酸GA01GA05GA06GA07GA02GA03	100100100100100100100	100100991000100100	0000015.698.7	0000000	0000000
GA04	100	100	6.5	0	0			藤黄酸GA01GA05GA06GA07GA02GA03	100100100100100100100	100100991000100100	0000015.698.7	0000000	0000000

Claims

1.一类具有如下结构的藤黄酸衍生物及其生理可接受的盐，

其中R为包括甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸的氨基酸残基，所有的具有手性的氨基酸残基包含了其L型氨基酸残基、R型氨基酸残基或外消旋型氨基酸残基，且氨基酸残基R以氨基与藤黄酸的C1位通过酰胺键结合。

2.根据权利要求1所述的藤黄酸衍生物及其生理可接受的盐，其特征在于具有手性氨基酸残基包含L型、R型氨基酸残基或外消旋型氨基酸残基。

3.根据权利要求1所述的藤黄酸衍生物及其生理可接受的盐，其特征在于与酸或碱所形成的盐，包括盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、枸椽酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、乳酸盐及酸性氨基酸盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、碱性氨基酸盐、碱性含氮杂环的盐。

4.如权利要求1所述的藤黄酸衍生物的制备方法，包括如下步骤：

藤黄酸与氮-羟基苯并三氮唑在催化剂存在下，在惰性溶剂下进行缩合反应得活性酯(2)；

上述所得活性酯(2)在有机溶剂中与相应的氨基酸进行反应得目标化合物。

5.根据权利要求4所述的藤黄酸衍生物的制备方法，其特征在于步骤a的缩合催化剂为DCC、EDCI及反应溶剂为二氯甲烷、氯仿、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃。

6.根据权利要求4所述的藤黄酸衍生物的制备方法，其特征在于步骤b的反应溶剂为反应的溶剂为二甲亚砜、二甲亚砜-水、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈以及乙腈——水的双溶剂系统。

7.根据权利要求4所述的藤黄酸衍生物的制备方法，其特征在于所得的中间体活性酯化合物为

8.如权利要求1所述的藤黄酸衍生物及其生理可接受的盐的用途，其特征在于用于制备抗肿瘤药物。