CN1211088C - 大黄素类似物emd－31在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及已知结构的大黄素类似物EMD-31在肿瘤治疗中的应用，该化合物化学名为9(10)蒽酮，本身毒性低，体外实验显示了它与化疗药物长春新碱或阿霉素抑制肿瘤细胞增殖的协同作用，体内实验用于治疗小鼠移植性肝癌，EMD-31与化疗药物阿霉素或长春新碱的合用组显示出比同等剂量的化疗药物阿霉素、长春新碱或EMD-31组更强的肿瘤生长抑制作用，因此，EMD-31有望成为一个有特点的具有开发前景的抗肿瘤化合物。
Description
技术领域：
本发明涉及将大黄素类似物与化疗药物阿霉素(ADM)或长春新碱(VCR)联合使用产生抗肿瘤协同作用，以期用于临床肿瘤的治疗。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的常见病。目前临床应用的抗肿瘤药物的毒性是困扰肿瘤化疗的问题，很多药物因其毒性而在用药的剂量上受到限制。寻找自身低毒、能协同现有抗肿瘤药物的抗肿瘤作用、降低现有抗肿瘤药物毒性的药物即生化调节剂的研究，已成为肿瘤化疗研究的一大课题。本发明涉及的化合物EMD-31(图1-IV)是以大黄素(图1-I)、大黄酸(图1-II)等天然存在的蒽醌类衍生物为先导化合物通过化学合成得到的蒽酮类化合物，其化学名为9(10H)蒽酮，英文化学名为9(10H)-anthracenone。大黄蒽醌类衍生物已发现具有抗菌、抗炎、抗病毒、清除氧自由基、调节免疫功能等活性。在抗肿瘤作用方面，早在20世纪六十年代就发现大黄素、大黄酸能抑制小鼠移植性肿瘤的生长(药学学报，1966，13<5>：363)，八十年代之后人们更从细胞和分子水平对此类化合物的抗肿瘤作用进行了深入研究。从目前的研究结果可以看出，大黄蒽醌类衍生物能够抑制实验动物移植性肿瘤的生长，一定剂量的上述化合物对包括小鼠黑色素瘤、乳腺癌、肉瘤180、肝癌、大鼠瓦克癌W256、小鼠P388白血病以及人神经外胚层肿瘤(IMR5)等都有抑瘤作用。其机理可从抑制肿瘤细胞增殖、大分子生物合成、细胞呼吸、蛋白激酶、核苷转运等方面阐明。本实验室的前期工作证明：微生物代谢产物C3368-B(8-0-甲基大黄素)(图1-III)和大黄素能逆转肿瘤细胞的多药抗药性(药学学报，1994，29<9>：656)、(中国药学杂志，1995，30<增刊>：69、(药学学报，1999，34<3>：164)；大黄素、大黄酸与多种抗肿瘤药合用，具有协同作用(药学学报，1999，34<3>：164)、(药学学报，2000，35<5>：163)；大黄素还能抑制血管生成和肿瘤转移相关活性(癌症2001，20<8>：789)，这进一步提示大黄蒽醌类衍生物可作为一类有前途的化疗药物加以研究。但由于大黄蒽醌类衍生物抗肿瘤作用剂量较大，长期大剂量使用会导致免疫抑制、胃肠道功能紊乱等严重毒副作用，同时还由于价格昂贵来源受限等缺陷，因此除个别敏感肿瘤外，此类化合物单独用于肿瘤化疗的可能性不大。然而作为生化调节剂用于肿瘤联合化疗的前景仍然十分引人关注。而化合物EMD-31本身迄今尚未见有抗肿瘤作用方面的报道。
本发明的目的是将EMD-31与化疗药物阿霉素(ADM)或长春新碱(VCR)合用，以期发挥协同作用，取得更好的疗效。
发明内容：
为了完成本发明，首先制备了所说的化合物EMD-31，然后进行EMD-31的抑瘤活性实验，包括EMD-31与化疗药物VCR或ADM合用，测定其在体外对多种瘤细胞的增殖协同抑制作用；EMD-31与化疗药物VCR或ADM合用，测定其在体内对小鼠移植性肿瘤生长的协同抑制作用。体外实验结果表明，在无细胞毒剂量下的EMD-31即可显著提高VCR和ADM对相关瘤细胞的增殖协同抑制作用；体内实验结果表明，按肿瘤重量和瘤体积计算，EMD-31与化疗药物VCR及ADM合用，对移植性肝癌的生长均有显著的协同抑制作用。
一、EMD-31的制备：
在配有回流冷凝器的圆底烧瓶中加入10.4g(0.05mol)蒽醌、10g锡粒和75ml冰醋酸，混匀。将瓶内物料加热至沸，分批加入浓盐酸25ml，体系反应至蒽醌完全溶解，约需要70分钟。将溶液过滤，并用10ml水冲洗，滤液冷却至10℃蒽酮结晶析出。滤出结晶，以水冲洗，抽滤，干燥后重8g，产率为82.5％，用苯和石油醚(3∶1)混和溶剂重结晶，得熔点为154--155℃的EMD-316g。
二、MD-31协同抑瘤活性实验：
1.EMD-31与化疗药物VCR或ADM合用在体外对多种肿瘤细胞的增殖的协同抑制作用
使用蓝四唑法进行检测，观察的细胞系包括：人口腔鳞癌KB细胞、多药抗药性的KB细胞(KBv200细胞)、人乳腺癌MCF-7细胞和多药抗药性的MCF-7细胞(MCF-7/ADM细胞)。将处于对数生长期的细胞消化，计数，铺96孔板，24h后加入不同浓度的药物，继续培养72h，加入蓝四唑盐，37℃孵育4h，加入二甲基亚砜以充分溶解蓝紫色颗粒，在酶标仪上测定560nm处吸光值，以判断药物活性并计算两药相互作用指数CDI(CDI＝AB/(A×B)。其中AB为两药联合作用组的T/C比值(T：给药组吸光值-空白组吸光值，C：阴性对照组吸光值-空白组吸光值)，A、B是药物单独作用组的T/C比值。理论上当CDI＜1时两药有协同作用。本研究设定：当CDI≤0.85时存在协同作用，CDI＜0.70时协同作用非常显著)。结果表明，在无细胞毒剂量下的EMD-31即能显著提高ADM(表1)，(图2)，(图3)，(图4)，(图5)和VCR(表2)，(图6)，(图7)，(图8)，(图9)对人口腔鳞癌KB细胞、多药抗药性的KB细胞(KBv200细胞)、人乳腺癌MCF-7细胞和多药抗药性的MCF-7细胞(MCF-7/ADM细胞)的增殖抑制作用，CDI小于0.8。且等剂量的EMD-31对敏感和抗药细胞都具有同等明显的增效作用，显示出EMD-31在今后用于抗药性肿瘤治疗中的前景。
表1 阿霉素(ADM)单用及与EMD-31合用对肿瘤细胞的增殖抑制作用
ADM IC50(μM)
药物
KB KBv200 MCF-7 MCF-7/ADM
ADM 0.075 3.00 0.25 35.40
ADM+EMD-31 20μM 0.027 0.70 0.05 9.87
ADM+EMD-31 50μM 0.023 0.21 0.02 5.24
表2长春新碱(VCR)单用及与EMD-31合用对肿瘤细胞的增殖抑制作用
VCR IC50(μM)
药物
KB KBv200 MCF-7 MCF-7/ADM
VCR 0.010 1.60 0.10 5.45
VCR+EMD-31 20μM 0.0030 0.22 0.013 2.23
VCR+EMD-31 50μM 0.0015 0.016 0.0023 0.79
2.EMD-31与化疗药物VCR或ADM合用在体内对小鼠移植性肿瘤生长的协同抑制作用
在昆明种小鼠腋部皮下接种小鼠肝癌22，每只动物接种1.5×106细胞，24h后腹腔给药，每天一次，连续给药10天。隔天称体重，量瘤体积。接种肿瘤21天后处死动物，称瘤重。以公式1/2ab2(a：长径，b：短径)计算瘤体积。以公式(1-T/C)×100(T：给药组瘤重，C：对照组瘤重)计算抑瘤率。
实验结果表明：1)按肿瘤重量(表3)和瘤体积(图10)计算，EMD-31与ADM合用对皮下移植的肝癌22的生长有显著的协同抑制作用。在EMD-31(50mg/kg)组对肿瘤生长无明显抑制的情况下，1.5mg/kgADM单用组抑制率为45.3％，与EMD-31合用组的抑制率为65.3％，CDI＝0.5。2.0mg/kg ADM单用组抑制率为64.7％，与EMD-31合用组的抑制率为81.3％，CDI＝0.5。对照组、EMD-31组、ADM给药组及其与EMD-31合并用药组无动物死亡，且小鼠的体重均有增加，表明上述用药在体内无明显毒性。
表3.EMD-31与ADM合用对小鼠移植肝癌22的生长抑制作用
动物数 剂量 体重变化 抑瘤率
药物 瘤重(g)
开始 结束 (mg/kg) (g)△ (％)
对照 10 10 +5.3 15.0±4.6 0
EMD-31 10 10 50 +7..4 16.0±3.7 0
ADM 10 10 1.5 +5.5 8.2±2.4 45.3*
ADM 10 10 2.0 +13.4 5.3±1.3 64.7*
EMD-31 50
10 10 +6.9 5.2±1.6 65.3*#
+ADM +1.5
EMD-31 50
10 10 +12.4 2.8±1.1 81.3*##
+ADM +2.0
皮下接种肿瘤，第2天起每日腹腔注射给药一次，共10次，
*P＜0.01与对照组比较，#CDI＝0.6，##CDI＝0.5，△：体重减去瘤重。
2)按肿瘤重量(表4)和瘤体积(图11)计算，EMD-31与VCR合用对皮下移植的肝癌22的生长有显著的协同抑制作用。在EMD-31(50mg/kg)组对肿瘤生长无明显抑制的情况下，0.2mg/kg VCR单用组抑制率为34.7％，与EMD-31合用组的抑制率为37.3％，CDI＝0.9。0.3mg/kg VCR单用组抑制率为40.0％，与EMD-31合用组抑制率为62.0％，CDI＝0.6。对照组、EMD-31组、VCR给药组及合并用药组均无动物死亡，且小鼠的体重均有增加，表明上述用药在体内无明显毒性。
表4.EMD-31与VCR合用对小鼠移植肝癌22的生长抑制作用
动物数 剂量 体重变化 抑瘤率
药物 瘤重(g)
开始 结束 (mg/kg) (g)△ (％)
对照 10 10 +5.3 15.0±4.6 0
EMD-31 10 10 50 +7.4 16.0±3.7 0
VCR 10 10 0.2 +5.9 9.8±2.7 34.7*
VCR 10 10 0.3 +3.0 9.0±1.4 40.0*
EMD-31 50
10 10 +7.7 9.4±3.8 37.3*#
+VCR +0.2
EMD-31 50
10 10 +13.3 5.7±1.2 62.0*##
+VCR +0.3
皮下接种肿瘤，24h后腹腔注射给药，每天一次，共10次，
*P＜0.01与对照组比较，#CDI＝0.9，##CDI＝0.6，△：体重减去瘤重。
发明效果：
本发明的优点与积极效果是：开拓了大黄素类似物EMD-31作为抗肿瘤药物的新用途，该化合物毒性低，它与化疗药物阿霉素(ADM)和长春新碱(VCR)联合有协同抗肿瘤作用，是有开发应用前景的抗肿瘤化合物。
附图说明：
图1-I.大黄素、II.大黄酸、III.C-3368B和IV.EMD-31的化学结构示意图
图2-MTT法检测EMD-31与阿霉素(ADM)合用对人口腔鳞癌KB细胞的增殖抑制作用
其中-◆-：ADM
-■-：ADM+EMD-31 20μM
-▲-：ADM+EMD-31 50μM
*CDI＜0.75，**CDI＜0.8
图3-MTT法检测EMD-31与阿霉素(ADM)合用对多药抗药性的人口腔鳞癌KB细胞(KBv200细胞)的增殖抑制作用
其中-◆-：ADM
-■-：ADM+EMD-31 20μM
-▲-：ADM+EMD-31 50μM
*CDI＜0.75，**CDI＜0.8
图4-MTT法检测EMD-31与阿霉素(ADM)合用对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用
其中-◆-：ADM
-■-：ADM+EMD-31 20μM
-▲-：ADM+EMD-31 50μM
*CDI＜0.75，**CDI＜0.8
图5-MTT法检测EMD-31与阿霉素(ADM)合用对多药抗药性的人乳腺癌MCF-7细胞(MCF-7/ADM细胞)的增殖抑制作用
其中-◆-：ADM
-■-：ADM+EMD-31 20μM
-▲-：ADM+EMD-31 50μM
*CDI＜0.75，**CDI＜0.8
图6-MTT法检测EMD-31与长春新碱(VCR)合用对人口腔鳞癌KB细胞的增殖抑制作用
其中-◆-：VCR
-■-：VCR+EMD-31 20μM
-▲-：VCR+EMD-31 50μM
*CDI＜0.75，**CDI＜0.8
图7-MTT法检测EMD-31与长春新碱(VCR)合用对多药抗药性的人口腔鳞癌KB细胞(KBv200细胞)的增殖抑制作用
其中-◆-：VCR
-■-：VCR+EMD-31 20μM
-▲-：VCR+EMD-31 50μM
*CDI＜0.75，**CDI＜0.8
图8-MTT法检测EMD-31与长春新碱(VCR)合用对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用
其中-◆-：VCR
-■-：VCR+EMD-31 20μM
-▲-：VCR+EMD-31 50μM
*CDI＜0.75，**CDI＜0.8
图9-MTT法检测EMD-31与长春新碱(VCR)合用对多药抗药性的人乳腺癌MCF-7细胞(MCF-7/ADM细胞)的增殖抑制作用
其中-◆-：VCR
-■-：VCR+EMD-31 20μM
-▲-：VCR+EMD-31 50μM
*CDI＜0.75，**CDI＜0.8
图10-EMD-31(50mg/kg)与阿霉素(ADM)(1.5mg/kg)合用对小鼠移植肝癌22的生长抑制作用
其中-◆-：对照
-■-：EMD-31(50mg/kg)
-▲-：ADM(1.5mg/kg)
-×-：ADM(1.5mg/kg)+EMD-31(50mg/kg)
*CDI＜0.75
图11-EMD-31(50mg/kg)与长春新碱(VCR)(0.3mg/kg)合用对小鼠移植肝癌22生长抑制作用
其中-◆-：对照
-■-：EMD-31(50mg/kg)
-▲-：VCR(0.3mg/kg)
-×-：VCR(0.3mg/kg)+EMD-31(50mg/kg)
*CDI＜0.75
Claims (1)
1、9(10H)蒽酮与阿霉素或长春新碱组合在制备抗肿瘤药物中的应用。
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