CN1680290A - 姜酚肟及其合成与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然产物的制取、改性与应用领域，具体地涉及一种姜酚衍生物——姜酚肟，以及其合成方法与应用。所述的姜酚肟，是将姜酚粗提物或提纯的姜酚通过肟化反应得到的姜酚衍生物。本发明以鲜姜或生姜半成品(如干姜、姜油树脂等)为原料，获得粗姜酚，或者利用纯姜酚，再通过肟化反应、分离纯化获得结晶状态的姜酚肟，并测定其抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、杀虫等生物活性，从而使姜酚肟应用于上述领域。姜酚肟可以替代姜酚使用，并可用于新型药品、食品添加剂、绿色农药等新产品的开发。

Description

姜酚肟及其合成与应用

技术领域

本发明属于天然产物的制取、改性与应用领域，具体地说是利用生姜中提取的粗姜酚或纯姜酚，通过肟化反应制取姜酚肟，并测定姜酚肟的抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、杀虫等生物活性。

背景技术

20世纪80年代，国外的药理试验已经证实，自生姜中分离出的、或者是化学合成的粗姜酚能刺激粘膜，促进胃液分泌，在肠道中能抑制异常发酵，促进气体排放，对大脑皮质和血管运动中枢有兴奋作用，能增进血液循环。最新的药理实验和临床观察证实：姜酚有强心、降血脂、防治心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、止呕、止晕、抑制前列腺素合成、防腐杀虫、驱虫、护肤美容等多方面的生物活性。

然而，自生姜中获得的天然粗姜酚稳定性差、难以分离纯化，不易获得，不便保存；另外，目前也没有工业化化学合成姜酚的报道。总之，由于没有可供工业使用的姜酚，目前无法获得大量的姜酚用以开发以姜酚为原料的食品、保健食品、药品、化妆品、绿色农药等等。因此，为充分利用、开发姜酚的生物活性，并解决目前无姜酚可供利用的实际困难，开发出化学结构、生物活性、功能性质等与姜酚相似的姜酚衍生物，如姜酚肟等以代替姜酚，可以取得巨大经济效益和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种姜酚衍生物——姜酚肟，可以取代目前天然提取的姜酚，开发出类似于姜酚生物活性的药品、食品、农药、试剂标样等产品。

本发明所述的姜酚肟，是将姜酚粗提物或纯姜酚通过肟化反应得到的姜酚衍生物，具有如下的通式结构：

其中：n＝4，为6-姜酚肟；n＝6，为8-姜酚肟；n＝8，为10-姜酚肟；n＝10，为12-姜酚肟。

本发明提供了姜酚肟的合成方法，以及其应用。

本发明以鲜姜或生姜半成品(如干姜、姜油树脂等)为原料，获得粗姜酚，或者利用纯姜酚，再通过肟化反应、分离纯化获得结晶状态的姜酚肟，并测定其抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、杀虫等生物活性，从而使姜酚肟应用于上述领域。

本发明所述的姜酚肟的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)肟化反应：以姜酚粗提物或提纯的姜酚为原料，加入摩尔数1～3倍于姜酚的盐酸羟胺，在0～100℃、pH为3.5～5.5的条件下，进行肟化反应，反应时间1～3小时，反应使用的溶剂选自10～100％的甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯中的一种；

B)制取粗姜酚肟：将肟化反应液浓缩至原体积的10～50％，用有机溶剂萃取2～3次；所获有机溶液相先后经过酸洗、盐洗、水洗，重复该过程1～3次；再回收溶剂，得粗姜酚肟；所述的有机溶剂选自乙醚、乙酸乙酯、正己烷；

C)姜酚肟的粗分：用吸附剂作为固定相进行色谱分离，洗脱液经浓缩回收得粗姜酚肟；

步骤C中，所述的吸附剂为硅胶，硅胶色谱分离时，收取正己烷与乙醚体积比为1∶0.5～2的洗脱部分。

步骤C中，所述的吸附剂为聚酰胺，聚酰胺色谱分离时，收取20％～60％甲醇、乙醇或丙酮洗脱部分。

步骤C中，所述的吸附剂为大孔树脂，大孔树脂色谱分离时，收取20％～50％甲醇、乙醇或丙酮洗脱部分。

在步骤C后，将姜酚肟浓缩液于0～40℃下静置结晶，可获得粗结晶姜酚肟。

D)姜酚肟的细分：用葡聚糖凝胶作为固定相，以异丙醇∶氯仿＝1～8∶1，为流动相进行连续洗脱，分别收取异丙醇∶氯仿为1.5∶1到5∶1的洗脱部分，去除流动相后，分别得6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟。

肟化反应的原料——姜酚粗提物来自以下两种制备途径：

(一)所述的姜酚粗提物为天然提取的粗姜酚，是通过以下步骤制备的：

1)原料处理：将鲜姜洗净泥土，切成姜丝或薄姜片，在通风干燥处晒干，然后磨成100目姜粉，待用，或直接将自然干燥所获的干姜片粉碎成100目姜粉，待用；

2)获得姜酚萃取液：用40％～100％有机溶剂萃取干姜粉，浸泡期间采用溶剂循环或渗漉等措施，以提高姜酚的萃取率，浸泡时间不少于12小时；每批干姜粉萃取3～5次；将所用萃取液收集在一起供下一步用；所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯的一种；

所述的步骤2中，可采用渗漉法获得姜酚萃取液，即将姜粉装柱，使40％～100％有机溶剂缓慢的通过姜粉柱，获得姜酚萃取液；所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷的一种。

3)回收溶剂：在40～70℃下，蒸馏或分馏步骤2所得的姜酚萃取液，回收溶剂，得姜酚粗提物；

4)萃取分离姜酚粗提物：在姜酚粗提物中加入0.5～1份体积的正己烷，萃取姜酚，连续萃取2～5次；合并正己烷提取液后，回收75～90％正己烷，残余物再用等体积的乙醚萃取姜酚，连续萃取2～3次，回收乙醚后得粗姜酚。

(二)所述的姜酚粗提物为各种类型的姜油树脂，是通过以下步骤制备的：用20～80％的含水有机溶剂进行萃取姜油树脂，分馏出姜精油，得姜酚粗提物；所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、乙醚。

本发明的有益效果在于：

(1)开发出一种姜酚衍生物——姜酚肟，是一种化学结构、生物活性、功能性质等与姜酚相似的姜酚衍生物，可以充分利用、开发姜酚的生物活性，取代目前天然提取的姜酚，开发出类似于姜酚生物活性的药品、食品、农药、试剂标样等产品，解决目前无姜酚可供利用的实际困难，有望取得巨大经济效益和社会效益。

(2)提供了可行的、得率高的姜酚肟合成方法，便于推广应用，使姜酚肟的产业应用前景广阔。

(3)本发明将目前难以获得的姜酚制成改性易得、生物活性类似的姜酚肟，为其他难以获得的天然产物提供了一种可行的解决思路。

本发明还提供了姜酚肟用于制备抗呼吸道合庖病毒药物、抗肿瘤药物的用途，以及用于制备抗氧化剂、杀虫剂的用途。

本发明所述的应用是基于以下的姜酚肟生物活性测定：

(一)以溶血作用评价抗氧化活性：通过姜酚肟抑制细胞膜物质氧化而导致的溶血作用评价其抗氧化能力的大小。

(二)抗脂质过氧化作用的评价：即通过姜酚肟减少脂肪的过氧化物形成的能力评价其抗氧化作用的大小。

(三)杀虫能力的测定：通过测定棉灯虫(Spilosoma boiqua)摄入姜酚肟而导致死亡的效果评价其杀虫作用。

(四)抗呼吸道合胞病毒(RSV)能力的测定：通过姜酚肟抑制感染RSV细胞的活力效果评价其抗RSV的效果。

(五)抗肿瘤活性的测定：通过测定抑制肿瘤细胞的生存能力评价其抗肿瘤活性，测定结果表明其与姜酚相当。

以上指标的测定结果见表1。

表1：姜酚肟的生物活性^-1

生物活性	IC50(μg ml-1)-2	参比物IC50(μg ml-1)-3
			抗呼吸道合胞病毒抗肿瘤活性(K562)抗肿瘤活性(HL-60)抗脂质过氧化抗溶血作用杀虫作用	2512.582250960	12.525.1642701060

注：

1)样品的IC₅₀均以6-姜酚肟计(样品中的6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟含量分别为58％、15％、22％、3％)；

2)IC₅₀表示抑制率为50％时的剂量；

3)参比物为6-姜酚。

上述测定结果表明：与6-姜酚相比，姜酚肟的生物活性与之相当或略小：其抗氧化作用、抗肿瘤和杀虫作用略小于姜酚，但抗RSV作用高于姜酚。

附图说明

图1为结晶姜酚肟的制备工艺流程图。

图2为结晶姜酚肟的紫外可见扫描光谱图，测定条件：甲醇；仪器：UnicamUV504，英国Thermo Spectronic公司生产。

图3为结晶姜酚肟的红外光谱图，德国Bruker公司Equinox 55型傅立叶变换红外光谱仪，KBr压片。

图4为6-姜酚肟的质谱图，Finnigan MAT TSQ-70质谱仪。

图5为8-姜酚肟的质谱图，Finnigan MAT TSQ-70质谱仪。

图6为10-姜酚肟的质谱图，Finnigan MAT TSQ-70质谱仪。

图7为12-姜酚肟的质谱图，Finnigan MAT TSQ-70质谱仪。

具体实施方式

实施例一：

第一步、制取姜酚粗提物：按照图1所示，称取1公斤鲜姜，用自来水浸泡半小时，取出泥土等杂质，淋干水分，晾干，切成2～4毫米的薄片，在阳光下晒干。置粉碎机中粉碎，过100目筛。按照姜粉∶40％酒精＝1∶3～6(体积/体积)的比例，将姜粉加入到酒精中，浸泡24小时，浸泡期间，每隔2小时搅拌一次；重复浸泡三次，合并酒精浸泡液。在65℃下浓缩回收乙醇。残余物用等体积的正己烷萃取三次，回收约3/4体积的正己烷后，残余物再用1∶1乙醚萃取姜酚，连续萃取三次，回收乙醚后得粗姜酚提取物60克。

第二步、肟化反应：将粗姜酚提取物10克(含姜酚约14％)，溶于适量10％乙醇溶液中，加入1.5克盐酸羟胺，调节pH值5.5，在100℃下搅拌反应1小时。

第三步、肟化反应液的处理：反应完毕后，蒸去90％乙醇，用乙酸乙酯萃取残余物3次，再用1M盐酸、1M食盐水、无离子水洗，重复该过程三次，回收乙酸乙酯；残余物用作下一步的硅胶柱分离。

第四步、硅胶柱粗分：残余物上硅胶柱，收取正己烷与乙醚体积比为1∶0.5～2洗脱部分，即可得姜酚肟粗结晶。姜酚肟粗结晶产物得率为10％(以粗姜酚提取物计)。

第五步、葡聚糖凝胶柱细分：取1克姜酚肟粗结晶，溶于甲醇，上样于葡聚糖凝胶柱，用异丙醇∶氯仿混合溶剂洗脱，收集异丙醇∶氯仿＝1.5～5∶1的洗脱部分，室温静置，分别获得6-姜酚肟(如图4所示，6-姜酚肟的质荷比为309，表明6-姜酚的分子量为309)、8-姜酚肟(如图5所示，8-姜酚肟的质荷比为337，表明8-姜酚的分子量为337)、10-姜酚肟(如图6所示，10-姜酚肟的质荷比为365，表明10-姜酚的分子量为365)、12-姜酚肟(如图7所示，12-姜酚肟的质荷比为393，表明12-姜酚的分子量为393)；它们的紫外吸收光谱如图2所示，227，282吸收峰表明姜酚肟含有苯环。它们的红外吸收光谱如图3所示，3241cm-1羟基(O-H)伸缩振动峰，2934cm-1亚甲基(C-H)伸缩振动峰，1672cm-1羟基(O-H)旋转振动峰，1458cm-1亚甲基(C-H)的剪切振动峰，1606和1515苯环特征吸收峰。其得率分别为：6-姜酚肟53％，8-姜酚肟10％，10-姜酚肟15％，12-姜酚肟3％(以粗姜酚肟计)。

实施例二：

称取300g姜粉，过100目筛。按照姜粉∶丙酮＝1∶1～3(体积/体积)的比例，将姜粉加入到丙酮中，浸泡12～24小时，浸泡期间，每隔2小时搅拌一次；重复浸泡五次，合并丙酮浸泡液。在70℃下真空浓缩回收丙酮。残余物用1/2体积的正己烷萃取五次，回收约80％体积的正己烷后，残余物再用1∶1乙醚萃取姜酚，连续萃取两次，回收乙醚后得粗姜酚提取物80克。

将粗姜酚提取物10克，溶于适量10％甲醇溶液中，加入20克盐酸羟胺，调节pH值3.5，在50℃下搅拌反应2小时。反应完毕后，蒸去适量甲醇，将肟化反应液浓缩至原体积的50％，用乙醚萃取残余物2次，再用1M盐酸、1M食盐水、无离子水洗，重复该过程三次，再进行真空浓缩干燥，回收乙醚后，用10克聚酰胺粉吸附残余物。

姜酚肟的粗分：将吸附姜酚肟的聚酰胺粉上样于聚酰胺色谱柱，用0～100％甲醇(或乙醇、丙酮)洗脱液经浓缩回收，收取20％～60％甲醇、乙醇或丙酮洗脱部分，得粗姜酚肟。将姜酚肟浓缩液放置在40℃下，静置结晶，可获得粗结晶姜酚肟。姜酚肟粗结晶产物得率为15％(以粗姜酚提取物计)。

姜酚肟的细分：取1克姜酚肟粗结晶，溶于甲醇，上样于葡聚糖凝胶柱，用异丙醇∶氯仿＝4∶1体积比的混合溶剂为流动相进行色谱分离，收集异丙醇∶氯仿＝1.5～5∶1的洗脱部分，室温静置，分别获得6-姜酚肟(如图4)，8-姜酚肟(如图5)，10-姜酚肟(如图6)，12-姜酚肟(如图7)；它们的紫外与红外吸收光谱分别如图2和图3所示。其得率分别为：6-姜酚肟54％，8-姜酚肟9％，10-姜酚肟14％，12-姜酚肟5％(以粗姜酚肟计)。

实施例三：

称取干姜200克，置粉碎机中粉碎，过100目筛。按照姜粉∶甲醇＝1∶1～3(体积/体积)的比例，将姜粉加入到甲醇中，浸泡24小时，待浸透后，装入柱子，再用甲醇慢慢渗漉，收集渗漉液约400毫升。在40℃下真空浓缩回收甲醇，残余物用等体积的正己烷萃取三次，回收约90％体积的正己烷后，残余物再用1∶1乙醚萃取姜酚，连续萃取三次，40℃下回收乙醚后得粗姜酚提取物。

本实施例采用渗漉法获得姜酚萃取液，可用乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷替代甲醇进行渗漉，其浓度范围可在40％～100％。

将粗姜酚提取物10克，溶于适量乙醚溶液中，加入3克盐酸羟胺，调节pH值4.5，在70℃下搅拌反应2小时。反应完毕后，蒸去70％乙醚，用正己烷萃取残余物3次，水洗涤脱盐后，回收正己烷，即可得粗姜酚肟结晶。产物得率为94％(以姜酚计)。

姜酚肟的粗分：将吸附姜酚肟的聚酰胺粉上样于大孔树脂色谱柱，用0～100％甲醇(或乙醇、丙酮)洗脱液经浓缩回收，收取20％～60％甲醇、乙醇或丙酮洗脱部分，得粗姜酚肟。将姜酚肟浓缩液放置在0℃下，静置结晶，可获得粗结晶姜酚肟。姜酚肟粗结晶产物得率为18％(以粗姜酚提取物计)。

姜酚肟的细分：取1克姜酚肟粗结晶，溶于10～50％甲醇，上样于聚酰胺柱，用0～95％乙醇连续洗脱，收集20～60％的乙醇洗脱部分，室温静置，分别获得6-姜酚肟(如图4)，8-姜酚肟(如图5)，10-姜酚肟(如图6)，12-姜酚肟(如图7)；它们的紫外与红外吸收光谱分别如图2和图3所示。其得率分别为：6-姜酚肟50％，8-姜酚肟8％，10-姜酚肟15％，12-姜酚肟3％(以粗姜酚肟计)。

实施例四：

称取20克姜油树脂，用80％甲醇萃取姜酚，连续萃取三次，合并萃取液，回收甲醇后得粗姜酚提取物。

将粗姜酚提取物50克，溶于适量90％乙醇溶液中，加入5克盐酸羟胺，调节pH值5，在0℃下搅拌反应3小时。反应完毕后，蒸去乙醇，用乙酸乙酯萃取残余物3次，回收乙酸乙酯后，将残余物上葡聚糖凝胶色谱柱，以异丙醇、氯仿(1～8∶1，V/V)为流动相，收取异丙醇、氯仿(3～5∶1)洗脱部分，去除流动相后，于室温下静置洗脱液，分别得到结晶的6-姜酚肟，8-姜酚肟，10-姜酚肟，12-姜酚肟。6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟的得率分别为11％、5％、9％和1％(以姜油树脂计)。

实施例五：

称取10克姜油树脂，用20％的乙醚连续萃取五次，合并乙醚萃取液，回收乙醚后得粗姜酚提取物。

将粗姜酚提取物50克，溶于适量50％乙酸乙酯溶液中，加入5克盐酸羟胺，调节pH值5，在室温下搅拌反应2小时。反应完毕后，蒸去乙酸乙酯，用乙酸乙酯萃取残余物3次，回收乙酸乙酯后，将残余物上大孔吸附树脂色谱柱，用0～95％乙醇连续洗脱，收集20～50％的乙醇洗脱部分，置0℃冰箱中静置，分别获得6-姜酚肟(如图4)，8-姜酚肟(如图5)，10-姜酚肟(如图6)，12-姜酚肟(如图7)；它们的紫外与红外吸收光谱分别如图2和图3所示。其得率分别为：6-姜酚肟56％，8-姜酚肟10％，10-姜酚肟15％，12-姜酚肟3％(以粗姜酚肟计)。

实施例六：

称取15克姜油树脂，用50％丙酮或乙醇萃取姜酚，连续萃取三次，合并萃取液，回收丙酮或乙醇后得粗姜酚提取物。

将粗姜酚提取物50克，溶于适量50％乙醚溶液中，加入5克盐酸羟胺，调节pH值5，在室温下搅拌反应2小时。反应完毕后，蒸去乙醇，用正己烷萃取残余物3次，回收正己烷后，将残余物上葡聚糖凝胶色谱柱，以异丙醇、氯仿(1～8∶1，V/V)为流动相，收取异丙醇、氯仿(3～5∶1)洗脱部分，去除流动相后，于室温下静置洗脱液，分别得到结晶的6-姜酚肟，8-姜酚肟，10-姜酚肟，12-姜酚肟。6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟的得率分别为11％、5％、9％和1％(以姜油树脂计)。

实施例七：

取购买的纯度为95％的6-姜酚30mg，溶于2ml乙醚，加入0.2ml正己烷羟胺(羟胺含量为50％)溶液，混匀，于室温下反应2小时，分别加2ml1M盐酸洗涤三次，2ml1M食盐水洗涤三次，2ml无离子水洗涤三次，无水硫酸钠脱水后，静置，待乙醚挥发后即可获得结晶状态的6-姜酚肟25mg。

上述实施例所得的姜酚肟的生物活性测定：

主要指标的测定方法如下：

(一)以溶血作用评价抗氧化活性：

取200克BALB/c雄性鼠，处死，迅速取后静脉管血液放入肝素钠处理过的玻璃管中，离心得红细胞，用磷酸缓冲液(PBS)清洗三次，每次用吸管吸去血浆和棕黄色血沉，然后于1000g离心10分钟，弃去上层液体，用PBS重新悬浮，并配制成20％红细胞悬浮液。

溶血评价：分别取0.1ml20％红细胞悬浮液，分别加入0.1mlPBS或含有不同浓度姜酚肟样品的PBS和0.2ml AAPH[2，2′-Azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride]混匀于37℃水浴保温3小时后，再加入8ml PBS(A)，另一支管加入8ml蒸馏水(B)以使红细胞破裂溶血，两种反应物均在1000g下离心10分钟，分别测定其在540nm的吸光度。吸光度越高，说明溶血作用越严重，所用姜酚肟的抗氧化作用越弱。以维生素C作为阳性对照。按照下式计算抑制率：％抑制率＝[(1-A)/B]×100％

以50％抑制率时的姜酚肟浓度作为半有效剂量(IC₅₀)。

(二)脂质过氧化作用的评价：

脑匀浆的制作：取150g雄性BALB/c鼠脑，迅速用20mM 0℃Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)充分洗涤，置Polytron PT 3000匀浆机上均质，再于3000g下离心10分钟，取上清液进行脂质过氧化评价。

脂质过氧化的测定：以丙二醛(MDA)作为脂质过氧化评价的指标，用FeSO4-Vit.C系统诱导脂质过氧化。取0.1ml鼠脑匀浆上清液，0.1ml 10uMFeSO4，0.1ml 0.1mM Vit.C，0.2ml不同浓度姜酚肟样品溶液，混匀，37℃水浴保温1小时后，加入0.5ml 28％三氯乙酸(TCA)停止反应，加0.38ml 2％硫代巴比妥酸(TBA)与鼠脑匀浆脂质过氧化脂质反应产生的MDA于80℃反应20分钟，冷却后，离心10分钟，于532nm下测定上清液中的MDA-TBA反应物的吸光度。用BHA作为阳性对照。按下式计算抑制率：

％抑制率＝[(1-A)/B]×100％

式中：A为样品的吸光度；B为对照的吸光度。以50％抑制率时的姜酚肟浓度作为半有效剂量(IC₅₀)。

(三)杀虫能力的测定：

配制0.2％(WN)结晶姜酚肟乙醇母液：将0.2g姜酚肟结晶溶于10ml20％乙醇中。用时分别用0.01％分子蒸馏单甘酯溶液稀释成10、7、5、3、2、1g/L溶液。将配制好的溶液用等面积的干燥蓖麻叶浸透，以此作为棉灯虫的饲料。对照棉灯虫的饲料用0.01％分子蒸馏单甘酯溶液浸泡等面积的干蓖麻叶。

将三龄幼虫(6～8天)和浸透姜酚肟溶液的蓖麻叶一块放入瓶中，喂养24小时后，再饲喂正常的蓖麻叶。饲喂过程中，每24小时更换饲料，清除粪便等渣滓。统计幼虫的死亡率、异常幼虫率、蛹死亡率等，并按照下式计算出校正抑制率：

％校正生长抑制率＝[(T-C)/100-C]×100

式中：T——处理棉灯蛾总生长抑制量；

      C——对照棉灯蛾总生长抑制量。

以50％抑制率时的姜酚肟浓度作为半有效剂量(IC₅₀)。

(四)抗呼吸道合胞病毒(RSV)能力的测定：

病毒和细胞：RSV，猴肾皮样癌细胞(Hep-2)和狗肾细胞(MDCK)细胞均购自ATCC(American Type Culture Collection)。

细胞生长培养基和维持液：生长培养基：DMEM(Dulbecco’s modifiedEagle’s Medium)。配制生长培养基时，每升添加10％牛血清蛋白，10000U青霉素，2mM庆大霉素，2mM谷酰胺。配制细胞的生长维持液时，只添加1％牛血清蛋白，其它同生长培养基配制。其它试剂均为Sigma公司产品。

抗RSV活性的测定

将姜酚肟样品均用适量的二甲基亚砜(控制其在培养基母液中的含量低于1％)溶解，再用配制好的维持培养基稀释成含样品4-8mg/ml的母液备用。

将含有生长良好Hep-2细胞的生长培养基分装于96孔塑料培养板上，在37℃，含5％二氧化碳的培养箱中培养3天，等细胞生长形成单细胞层后，除去生长培养基，添加0.1毫升含100 TCID50(半数感染病毒量)的RSV悬浮液和0.1毫升含适当浓度样品的维持液。每个样品测定三个浓度，以样品对培养细胞的最大无毒剂量作为最大测试浓度，其他两个浓度为倍比稀释浓度。每个样品浓度重复三次。对照中不添加样品。以病毒唑为阳性对照。将96孔板置37℃，5％CO₂培养箱培养2天后，镜检细胞病变情况，以细胞病变率(CPE)反映样品的活性。利用不同样品浓度下的CPE值求出样品的半有效剂量(IC₅₀)，以比较不同样品的抗RSV效果。

细胞毒测定：为避免高浓度样品毒害培养细胞而导致的正误差，测定样品活性前先测定样品的最大无毒剂量。具体测定操作同前述样品的活性测定。只是利用纯的生长培养基代替病毒悬浮液。测定结果以50％培养细胞出现异常(如细胞变圆、收缩、原生质体形成气泡等)时的样品浓度表示为该样品的最大无毒剂量。

(五)抗肿瘤活性的测定：

细胞：血癌细胞(K562)猴肾细胞(Vero)，白血病肿瘤细胞(HL-60)。

抗病毒活力的测定：取培养好的HL-60和K-562肿瘤细胞，分别接种在96孔板上，每孔接种1×10-4个细胞，再分别加入姜酚肟溶液，使其终浓度为2.5、5、10、20ug/L，再于37℃、5％CO2、95％相对湿度下培养72小时。培养结束后，加入与适量的0.4％Tryphan blue溶液，镜检死细胞与活细胞的数量，据下式计算肿瘤细胞抑制率。

％抑制率＝(1-样品处理活细胞数/对照活细胞数)×100

姜酚肟对细胞毒力的测定：同抗RSV活性的测定。

以上指标的测定结果见表1。

表1：姜酚肟的生物活性^-1

生物活性	IC50(μg ml-1)-2	参比物IC50(μg ml-1)-3
			抗呼吸道合胞病毒抗肿瘤活性(K562)抗肿瘤活性(HL-60)抗脂质过氧化抗溶血作用杀虫作用	2512.582250960	12.525.1642701060

注：

1)样品的IC₅₀均以6-姜酚肟计(样品中的6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟含量分别为58％、15％、22％、3％)；

2)IC₅₀表示抑制率为50％时的剂量；

3)参比物为6-姜酚。

上述测定结果表明：与6-姜酚相比，姜酚肟的生物活性与之相当或略小：其抗氧化作用、抗肿瘤和杀虫作用略小于姜酚，但抗RSV作用高于姜酚。

Claims (10)

1、姜酚肟，其特征在于，是将姜酚粗提物或纯姜酚通过肟化反应得到的姜酚衍生物，具有如下的通式结构：

其中：n＝4，为6-姜酚肟；n＝6，为8-姜酚肟；n＝8，为10-姜酚肟；n＝10，为12-姜酚肟。

2、如权利要求1所述的姜酚肟的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)肟化反应：以姜酚粗提物或提纯的姜酚为原料，加入摩尔数1～3倍于姜酚的盐酸羟胺，在0～100℃、pH为3.5～5.5的条件下，进行肟化反应，反应时间1～3小时，反应使用的溶剂选自10～100％的甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯中的一种；

B)制取粗姜酚肟：将肟化反应液浓缩至原体积的10～50％，用有机溶剂萃取2～3次；所获有机溶液相先后经过酸洗、盐洗、水洗，重复该过程1～3次；再回收溶剂，得粗姜酚肟；所述的有机溶剂选自乙醚、乙酸乙酯、正己烷；

C)姜酚肟的粗分：用吸附剂作为固定相进行色谱分离，洗脱液经浓缩回收得粗姜酚肟；

D)姜酚肟的细分：用葡聚糖凝胶作为固定相，以异丙醇∶氯仿＝1～8∶1，为流动相进行连续洗脱，分别收取异丙醇∶氯仿为1.5∶1到5∶1的洗脱部分，去除流动相后，分别得6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟。

3、根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述的步骤C中，所述的吸附剂为硅胶，硅胶色谱分离时，收取正己烷与乙醚体积比为1∶0.5～2的洗脱部分。

4、根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述步骤C中，所述的吸附剂为聚酰胺，聚酰胺色谱分离时，收取20％～60％甲醇、乙醇或丙酮洗脱部分。

5、根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述的步骤C中，所述的吸附剂为大孔树脂，大孔树脂色谱分离时，收取20％～50％甲醇、乙醇或丙酮洗脱部分。

6、根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：在步骤C后，将姜酚肟浓缩液于0～40℃下静置结晶，可获得粗结晶姜酚肟。

7、根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述的姜酚粗提物为天然提取的粗姜酚，是通过以下步骤制备的：

1)原料处理：将鲜姜洗净泥土，切成姜丝或薄姜片，在通风干燥处晒干，然后磨成100目姜粉，待用，或直接将自然干燥所获的干姜片粉碎成100目姜粉，待用；

2)获得姜酚萃取液：用40％～100％有机溶剂萃取干姜粉，浸泡期间采用溶剂循环或渗漉措施，以提高姜酚的萃取率，浸泡时间不少于12小时；每批干姜粉萃取3～5次；将所用萃取液收集在一起供下一步用；所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯的一种；

3)回收溶剂：在40～70℃下，蒸馏或分馏步骤2所得的姜酚萃取液，回收溶剂，得姜酚粗提物；

4)萃取分离姜酚粗提物：在姜酚粗提物中加入0.5～1份体积的正己烷，萃取姜酚，连续萃取2～5次；合并正己烷提取液后，回收75～90％正己烷，残余物再用等体积的乙醚萃取姜酚，连续萃取2～3次，回收乙醚后得粗姜酚。

8、根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于：所述的步骤2中，采用渗漉法获得姜酚萃取液，即将姜粉装柱，使40％～100％有机溶剂缓慢的通过姜粉柱，获得姜酚萃取液；所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷的一种。

9、根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述的姜酚粗提物为各种类型的姜油树脂，是通过以下步骤制备的：用20～80％的含水有机溶剂进行萃取姜油树脂，分馏出姜精油，得姜酚粗提物；所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、乙醚。

10、如权利要求1所述的姜酚肟用于制备抗呼吸道合庖病毒药物、抗肿瘤药物的用途，以及用于制备抗氧化剂、杀虫剂的用途。

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