具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制,可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
实施例1,该复方蒜氨酸粉针剂,其含有蒜氨酸和蒜酶,并且蒜氨酸与蒜酶的重量配比为2.5比1.0,其还含有抑制剂,该抑制剂的含量为蒜氨酸和蒜酶总重量的0.6%或1.0%或1.5%,该抑制剂为氯化钠;经实验测定该复方蒜氨酸粉针剂的蒜氨酸转化率为76.2。
实施例2,该复方蒜氨酸粉针剂,其含有蒜氨酸和蒜酶,并且蒜氨酸与蒜酶的重量配比为2.0比1.0,其还含有抑制剂,该抑制剂的含量为蒜氨酸和蒜酶总重量的0.6%或1.0%或1.5%,该抑制剂为氯化钠;经实验测定该复方蒜氨酸粉针剂的蒜氨酸转化率为92.8。
实施例3,该复方蒜氨酸粉针剂,其含有蒜氨酸和蒜酶,并且蒜氨酸与蒜酶的重量配比为0.9比1.0,其还含有抑制剂,该抑制剂的含量为蒜氨酸和蒜酶总重量的0.6%或1.0%或1.5%,该抑制剂为氯化钠;经实验测定该复方蒜氨酸粉针剂的蒜氨酸转化率为95.1。
实施例4,该复方蒜氨酸粉针剂,其含有蒜氨酸和蒜酶,并且蒜氨酸与蒜酶的重量配比为0.7比1.0,其还含有抑制剂,该抑制剂的含量为蒜氨酸和蒜酶总重量的0.6%或1.0%或1.5%,该抑制剂为氯化钠;经实验测定该复方蒜氨酸粉针剂的蒜氨酸转化率为97.4。
在实施例1至4中所述的复方蒜氨酸粉针剂的蒜氨酸转化率实验测定方法为:首先将复方蒜氨酸粉针剂中的蒜氨酸和蒜酶与适量水混合,超声30秒、在35℃水浴保温15分种;其次吸取反应2毫升,并加甲醇3毫升,混匀;然后用微孔滤膜(0.45μm)过滤,滤液HPLC进样得到色谱图,计算出蒜氨酸减少量,从而计算出蒜氨酸转化率。
本发明复方蒜氨酸粉针剂经过稳定性加速试验证明:该复方蒜氨酸粉针剂对湿度和温度敏感,在包装条件下干燥、4℃以下可保存24个月,蒜氨酸含量、蒜酶活力及大蒜辣素释放量的变化均小于10%。
将上述实施例的复方蒜氨酸粉针剂加水溶解制成1‰溶液,35℃水浴反应5min。吸取2.00ml,加3.00ml甲醇,混匀。0.45μm微孔滤膜过滤。色谱条件:Agilent1100-LC/MSD系统,NoVa-PaKC18 4.6mm×150mm,4μm柱;柱温:35℃;流动相:甲醇-水(2∶3),流率:0.5ml/min,检测:UV-214nm。进样5μl。质谱条件:离子化方式ESI(+)及ESI(-),扫描范围50-250m/z,干燥N2流速:10L/min,温度:350℃,雾化气压:2.07×105Pa,毛细管电压:3000V,碎裂器电压:60V。色谱图(图1)及质谱总离子流(MS-TIC)色谱图(图2)。两种色谱峰都得到三个强峰。
tR=3.336min峰:分子量为177的组峰:[M+H]+m/z=178.0及[M+Na]+m/z=200.0(图3),推断为蒜氨酸。
tR=2.436min峰(图4)。分子离子峰分别为:[M-H]+m/z=87,[2M+Na]+m/z=196.9,推断该物质为丙酮酸,分子量为88。
tR=10.308min峰:[M+H]+m/z=163.1,[2M+Na]+m/z=184.9,推断该物质为大蒜辣素分子量为162(图5)。
因此,确认蒜氨酸转化为大蒜辣素(Allicin)及丙酮酸(Pyruvic acid)等化合物。
采用高效液相色谱-质谱连用技术(HPLC)测定蒜氨酸酶解反应产生大蒜辣素(Allicin)及丙酮酸(Pyruvic acid)等化合物。其动力学反应时程曲线(图6)显示:0-5分钟,催化反应呈现一级反应。5-25分钟,反应呈现混合级反应,25分-13小时(hr)接近零级反应。5分钟以内为酶促反应初速度,到25分钟达到最大反应速度。大蒜辣素浓度随时间而增加,15分钟至13小时(hr)浓度达到稳定。因此,本发明复方蒜氨酸粉针剂特别适用于静注或静滴。
本发明复方蒜氨酸粉针剂的药效学试验:
1、抗血栓作用:《中国科学院上海药物研究所国家新药筛选中心化合物生物活性测试报告》筛选模型:血小板聚集测定法。结果:“复方蒜氨酸”浓度25、50、75μg/ml时平均聚集抑制率为12、23、49%。
新疆药物研究所的抗血栓作用试验结果表明:“蒜氨酸”、“蒜酶”及“复方蒜氨酸”经口服或静脉给药,各剂量组(大、中、小剂量分别为:25.0、6.25、1.56mg/Kg)对大鼠体外“血栓形成”均有不同程度抑制作用。抑制率在20.0~55.0%;而且随剂量的增加其抑制作用呈明显增强趋势;同时各剂量组与N.S比较,差异均具统计学意义,P<0.01。其中股静脉注射给药比口服对血栓抑制作用强。蒜酶静脉给药其小剂量血栓形成作用抑制率为54.0%。口服给药其中剂量血栓形成抑制率为54.92%。
2、降血脂作用:新疆药物研究所的抗血栓作用试验结果表明:“蒜氨酸”、“蒜酶”及“复方蒜氨酸”经口服或静脉给药,大中小三个剂量组(分别为:3.12、6.25、12.5mg/Kg)均可以明显降低血清中胆固醇(Cho)、甘油三酯(TRI)的水平。同时各剂量组对高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)也有调节作用。但只有“复方蒜氨酸”各剂量组对大鼠血清HDL水平及其中、小剂量组对大鼠血清LDL水平的影响与高血脂模型组比较差异具统计学意义(P<0.01或P<0.05)。
3、抗肿瘤作用:《中国科学院上海药物研究所国家新药筛选中心化合物测试报告》抗肿瘤生物活性体外筛选试验:供试品:“蒜氨酸”、“蒜酶”及“复方蒜氨酸(蒜氨酸+蒜酶)”。筛选方法:磺酰罗丹明蛋白染色法、四氮唑盐还原法。作用时间:48~72小时。结果显示:“复方蒜氨酸”及“蒜酶”对A-549人腺肺癌细胞及P-388小鼠白血病细胞有体外抗肿瘤作用。而“复方蒜氨酸”对P-388小鼠白血病细胞有强效。
4、抗真菌作用:中国科学院上海药物研究所国家新药筛选中心化合物生物活性(抗真菌)测试报告:微量液体稀释法测定复方蒜氨酸对白色假丝酵母菌的最低抑菌浓度(MIC)≤20μg/ml。判断为有效。
新疆药物研究所:“蒜氨酸”、“蒜酶”及“复方蒜氨酸”体外抗真菌试验结果表明:蒜氨酸具有较明显的抗白色念珠菌作用,其最低抑菌浓度(MIC)、半数抑菌浓度(MIC50)及90%抑菌浓度(MBC90)分别为1000μg/ml、250μg/ml、500μg/ml;复方蒜氨酸对各受试菌株都有不同程度的抑菌、杀菌作用;但蒜酶未见抗真菌作用。
新疆药物研究所:“蒜氨酸”、“蒜酶”及“复方蒜氨酸”体内抗真菌试验结果表明:蒜氨酸具有明显的抗白色念珠菌作用,对该菌感染小鼠的半数有效量(ED50)为31.98mg/Kg;复方蒜氨酸抗白色念珠菌ED50为81.26mg/Kg。
5、抗病毒作用:中国科学院上海药物研究所国家新药筛选中心进行抗病毒药效学研究测试,筛选结果为阳性。
下面描述蒜氨酸和蒜酶的来源:
一、本发明中所用的蒜氨酸可以是市场出售的,也可采用用本专利申请的发明人提出的、专利申请号为00101244.4的、发明名称为“从大蒜中提取蒜氨酸的方法”的发明所得的蒜氨酸,还可采用用本专利申请的发明人发明的、专利申请号为03100420.2的、发明名称为“从鲜蒜中提取蒜氨酸生产工艺”的发明所得的蒜氨酸。
专利申请号为03100420.2的、发明名称为“从鲜蒜中提取蒜氨酸生产工艺”的发明,其技术方案是这样来实现的:
一种从鲜蒜中提取蒜氨酸生产工艺,按以下步骤进行:
第一步进行预处理:将蒜瓣进行微波杀酶处理,使蒜瓣从白色变成半透明状为止;
第二步进行有机物提取:将微波处理后的蒜瓣磨成100至200目的蒜浆,并加入乙醇,用乙醇比重计控制蒜浆乙醇浓度为40%至70%,搅拌2至10小时,分离得到提取液,并减压浓缩提取液;
第三步用阳离子交换树脂吸附浓缩提取液中的蒜氨酸:将浓缩提取液通过阳离子交换树脂吸附柱;
第四步用氨水解吸蒜氨酸:用2.0至0.4摩尔氨水洗脱阳离子交换树脂吸附柱,收集pH值为5.0至9.0范围内的洗脱液;
第五步得到结晶的蒜氨酸:减压浓缩洗脱液,按浓缩洗脱液体积的20%至35%加入乙醇,并用盐酸或氨水调节PH值为5.5至6.5范围内,室温静置24至60小时,析出结晶的蒜氨酸。
在上述预处理中:可将蒜瓣置于微波中2至5分钟。
上述微波频率可为2540±50MHz,输出微波功率可为20KW。
在上述减压浓缩中,减压浓缩可采用多效减压薄膜浓缩方法进行,末端出口温度控制在40℃至60℃范围内或70℃至90℃范围内,浓缩后的液体体积与原料鲜蒜的重量之比控制在0.8至1.2或0.4至0.6或1/45至1/55的范围内。
在浓缩提取液中加入1至6%的澄清剂并搅拌均匀,在温度为-5℃至5℃范围内,放置5至20小时后得到上清液,并对上清液进行减压浓缩后通过阳离子交换树脂吸附柱,其中澄清剂为果汁澄清剂。
在阳离子交换树脂吸附柱饱和后,可先用蒸馏水对吸附柱进行冲洗,并冲洗至流出液呈Molish反应阴性或蒸馏水用量为蒜瓣重量的0.5至1.5倍,然后再用氨水洗脱阳离子交换树脂吸附柱。
将上述结晶的蒜氨酸经过60℃至80℃范围内的减压干燥至含水量低于2.9%后,用氮气或惰性气体进行密闭保存。
上述分离所用设备可采用冷冻密闭式浆渣自分离磨浆机或离心摔干机或低温管式离心分离机;或/和,上述阳离子交换树脂吸附柱可采用苯乙烯基强酸性阳离子交换树脂吸附柱或732型强酸阳离子交换树脂吸附柱或850型强酸阳离子交换树脂吸附柱或800型大孔型强酸阳树脂吸附柱。
上述有关蒜氨酸的发明适宜于以鲜蒜为原料批量化生产药用蒜氨酸。用上述有关蒜氨酸的发明所得产品经熔点测定、与标准对照品作紫外光谱与红外光谱对照,各项指标确认产品为蒜氨酸。经高效液相色谱分析,上述有关蒜氨酸的发明所得蒜氨酸产品收率为1.0‰±10%,含蒜氨酸为91.2±2%。
上述有关蒜氨酸的发明不受下述实施例的限制,可根据上述有关蒜氨酸的发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
上述有关蒜氨酸的发明的实施例,按下述步骤进行:
第一步进行预处理:将蒜瓣进行微波杀酶处理,使蒜瓣从白色变成半透明状为止;最好将蒜瓣置于微波中2分钟或3.5分钟或5分钟,并且微波频率最好为2540±50MHz,输出微波功率最好为20KW。在进行微波杀酶处理之前,最好将蒜瓣脱膜洗净沥干。
第二步进行有机物提取:将微波处理后的蒜瓣磨成100至200目的蒜浆,并加入乙醇或酒精,用乙醇比重计控制蒜浆乙醇浓度为40%至70%,搅拌反应2至10小时,分离得到提取液,并减压浓缩提取液。最好重量复提取3次或5次。减压浓缩最好采用多效减压薄膜浓缩方法进行,末端出口温度控制在40℃至60℃范围内,回收的溶剂即乙醇可重复使用,浓缩后的提取液体积与原料鲜蒜的重量之比控制在0.8至1.2的范围内。在用阳离子交换树脂吸附柱进行吸附之前,最好在浓缩提取液中加入1%或3%或6%的澄清剂并搅拌均匀,在温度为-5℃至5℃范围内,放置5小时或10小时或20小时后得到上清液,并对上清液进行减压浓缩后通过阳离子交换树脂吸附柱进行吸附,其中澄清剂为市场上出售的果汁澄清剂,如:可选用市场上出售的汉杰牌101型果汁澄清剂,上清液进行减压浓缩后的体积与原料鲜蒜的重量之比控制在0.4至0.6的范围内,末端出口温度控制在40℃至60℃范围内,回收的溶剂即乙醇可重复使用。
第三步用阳离子交换树脂吸附浓缩提取液中的蒜氨酸:将浓缩提取液或浓缩上清液通过阳离子交换树脂吸附柱。在阳离子交换树脂吸附柱饱和后,最好先用蒸馏水对吸附柱进行冲洗,并冲洗至流出液呈Molish反应阴性或蒸馏水用量为蒜瓣重量的0.5倍或1.5倍,然后再进行下步即用氨水解吸蒜氨酸。
第四步用氨水解吸蒜氨酸:用2.0至0.4摩尔范围内的氨水洗脱阳离子交换树脂吸附柱,收集pH值为5.0至9.0范围内的洗脱液;
第五步得到结晶的蒜氨酸:减压浓缩洗脱液,其中减压浓缩或/和溶剂回收最好采用多效薄膜浓缩方法进行,末端出口温度控制在70℃或90℃或70至90℃范围内,,浓缩后的液体体积与原料鲜蒜的重量之比控制在1/45至1/55的范围内,回收的溶剂即氨水可重复使用,然后按浓缩洗脱液体积的20%或35%加入乙醇,并用盐酸或氨水调节PH值为5.5至6.5范围内,室温静置24小时或50小时或60小时,析出结晶的蒜氨酸。最好将结晶的蒜氨酸经过60℃至80℃范围内的减压干燥至含水量低于2.9%后,用氮气或惰性气体进行密闭保存。
在上述实施例中:分离所用设备最好采用冷冻密闭式浆渣自分离磨浆机或离心摔干机或低温管式离心分离机;阳离子交换树脂吸附柱可采用苯乙烯基强酸性阳离子交换树脂吸附柱或732型强酸阳离子交换树脂吸附柱或850型强酸阳离子交换树脂吸附柱或800型大孔型强酸阳树脂吸附柱。
下面是对上述实施例所得产品即蒜氨酸的确认:
标准对照品:Alliin-S(Indofine Chemical Company Inc.USA,纯度99.5%,批号:97112003)
1、性状
上述蒜氨酸产品为白色结晶性粉末。极易溶于水。不溶于乙醇、氯仿。显微镜下观察为无色针状结晶。聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳计算等电点为pH=5.7-6.2。与标准对照品相符。
2、熔点
按照中国药典2000版二部附录VI C熔点测定法第一法测定熔点,标准对照品熔点为164-166℃(分解)。上述产品熔点为162-165℃(分解)。上述蒜氨酸产品熔点提前2℃,熔距稍有扩大,显示产品纯度不及标准对照品。
3、紫外吸收光谱确认上述产品为蒜氨酸,估算产品蒜氨酸含量相当标准对照品93.7%
蒜氨酸标准对照品(Alliin-S)以甲醇为溶剂制成42μg/ml的溶液,稀释7倍。用S-50型紫外分光光度计(上海棱光)测得紫外光谱,在226±1nm处有最大吸收。吸收度为0.380,E1% 226±1nm=90.5。上述产品(Alliin-D)以甲醇为溶剂制成40μg/ml溶液,稀释7倍,在同一台仪器同样条件下测定紫外光谱,在226±1nm处有最大吸收。吸收度为0.339。E1% 226±1nm=84.8
两者紫外吸收光谱相同。以E1% 226±1nm(Alliin-D)及E1% 226±1nm(Alliin-S)计算蒜氨酸含量。84.8/90.5×100=93.7,上述产品含蒜氨酸相当标准对照品的93.7%。
4、红外吸收光谱
蒜氨酸标准对照品及上述产品在EQUINOX55,BRUKER红外分光光度计-ATR附件测定红外吸收光谱。上述产品图谱(附图7)与标准对照品图谱(附图8)相一致。但是在1533、1526cm-1等处出现弱小峰。在指纹区的1050-1430cm-1区段有细微差异。说明产品含少量杂质。
5、结论
根据性状考查、熔点测定、紫外吸收光谱及红外吸收光谱分析得到的结果判断并确认实施例所得产品为蒜氨酸。
下面对上述实施例所得产品测定其蒜氨酸的含量:
用高效液相色谱分析(即HPLC)测定本实施例所得产品中蒜氨酸含量。
1、供试液配制
蒜氨酸标准对照品及实施例所得产品分别加内标(乙酰苯胺),用流动相配置成供试液。(含量:蒜氨酸约100.0μg/ml、乙酰苯胺10.0μg/ml)。
2、色谱条件
安捷伦1100高效液相色谱仪,ZORBAX SB-C18柱(4.6×250mm,5.0μm);流动相:甲醇-水(60∶40);流速0.8ml/min;检测波长214nm;柱温:37℃。内标:乙酰苯胺。供试液进样量:10μl。得到色谱图(附图9)、保留时间:蒜氨酸3.07分钟、乙酰苯胺5.12分钟。分离度(R)=14.6,理论塔板数(n)=7.4×103片。
3、线性和回归方程
进样量在0.5-3.0μg范围内,以峰面积对浓度作图得回归方程:
Y=10.3X-9.8,r=0.9993。
日内精密度RSD=1.88%(n=5)。日间精密度RSD=2.65%(n=5)。
4、实施例所得三批产品的含量
实施例所得三批产品(批号:A、B、C),经高效液相色谱分析(即HPLC),三批产品收率为1.0‰±10%,含蒜氨酸91.2±2%。
5、杂质检查
三批产品按照中国药典2000版二部附录氯化物、铁盐、硫酸盐、铵盐低于、水分、灰分检查的方法检验。结果为:氯化物、铁盐、硫酸盐低于0.01%。铵盐低于0.02%。水分:2.2-2.6%。灰分0.07-0.11%。
上述附图7为上述实施例所得产品的红外吸收光谱图;
上述附图8为上述标准对照品的红外吸收光谱图;
上述附图9为上述蒜氨酸高效液相色谱分析(即HPLC)图谱(1-Alliin、2-乙酰苯胺)。
二、本发明中所用的蒜酶可以是市场出售的,也可采用用本专利申请的发明人提出的、专利申请号为03100419.9的、发明名称为“从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺”的发明所得的蒜氨酸。
专利申请号为03100419.9的、发明名称为“从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺”的发明,其技术方案是这样来实现的:一种从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺,按以下步骤进行:
第一步加蒜酶提取液打浆分离出清液:先将蒜瓣温度控制在-5℃至5℃范围内,并控制温度在-5℃至5℃范围内,加入蒜酶提取液并磨成100至200目的蒜浆,蒜酶提取液的加入量为蒜瓣重量的0.8至1.2倍,并进一步分离出第一清液;
第二步分步沉淀得到蒜酶:控制温度在-5℃至5℃范围内,在搅拌下将硫酸铵加入第一清液中,使其全部溶解并用硫酸铵比重计控制硫酸铵浓度在20%至30%重量体积百分比浓度范围内,然后分离出第二清液;在搅拌下将硫酸铵加入第二清液中,使其全部溶解并用硫酸铵比重计控制硫酸铵浓度在40%至50%重量体积百分比浓度范围内,然后分离出第一糊状沉淀物;将第一糊状沉淀物装入聚氨酯袋,于流动的-5℃至5℃范围内的冰水透析槽中透析30小时至50小时,然后用磷酸调节等电点pH到4.9后分离出第二糊状沉淀物即糊状蒜酶。
上述提取液可为含有络合剂、抗氧剂、缓冲剂及丙三醇的水溶液。
上述络合剂可为乙二胺四乙酸二钠;上述抗氧剂可为巯基丙醇;上述缓冲剂可为磷酸盐。
蒜酶提取液可为在磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中加入按缓冲液体积加入0.1%至0.3%的二乙胺四乙酸二钠、0.02%至0.06%的巯基乙醇,0.3%至1.0%的氯化钠、5%至15%的丙三醇。
在上述生产工艺中,可将第二糊状沉淀物放入冷冻干燥机进行干燥,使水分含量低于2.0%,得到冻干蒜酶,然后用氮气或惰性气体进行密闭保存。
上述分离所用设备可采用冷冻密闭式浆渣自分离磨浆机或离心摔干机或低温管式离心分离机。
上述有关蒜酶的发明适宜于以鲜蒜为原料批量化生产药用蒜酶。上述有关蒜酶的发明所得蒜酶产品经过SDS-凝胶电泳证明其具有较高的纯度。依据与标准蛋白(C:分子量14400~97400)比移值计算其蒜酶产品单聚体分子量为67000道尔顿。米氏常数Km为3.6mmol/L。其产品平均活力为:765U/g。
上述有关蒜酶的发明不受下述实施例的限制,可根据上述有关蒜酶的发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
实施例,按下述步骤进行:
第一步加蒜酶提取液打浆分离出清液:先将蒜瓣温度控制在-5℃至5℃范围内,并控制温度在-5℃至5℃范围内,加入蒜酶提取液并磨成100至200目的蒜浆,蒜酶提取液的加入量为蒜瓣重量的0.8倍或1.2倍,并进一步分离出第一清液;
第二步分步沉淀得到蒜酶:控制温度在-5℃至5℃范围内,在搅拌下将硫酸铵加入第一清液中,使其全部溶解并用硫酸铵比重计控制硫酸铵浓度在20%至30%重量体积百分比浓度范围内,然后分离出第二清液;在搅拌下将硫酸铵加入第二清液中,使其全部溶解并用硫酸铵比重计控制硫酸铵浓度在40%至50%重量体积百分比浓度范围内,然后分离出第一糊状沉淀物;将第一糊状沉淀物装入聚氨酯袋,于流动的-5℃至5℃范围内的冰水透析槽中透析30小时至50小时,然后用磷酸调节等电点pH到4.9后分离出第二糊状沉淀物即糊状蒜酶;将第二糊状沉淀物放入冷冻干燥机进行干燥,使水分含量低于2.0%,得到冻干蒜酶,然后用氮气或惰性气体进行密闭保存。
在上述实施例中:提取液为含有络合剂、抗氧剂、缓冲剂及丙三醇的水溶液;络合剂可为乙二胺四乙酸二钠;抗氧剂可为巯基丙醇;缓冲剂可为磷酸盐;蒜酶提取液最好为在磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中加入按缓冲液体积加入0.1%或0.3%的二乙胺四乙酸二钠、0.02%或0.06%的巯基乙醇,0.3%或1.0%的氯化钠、5%或15%的丙三醇。
分离所用设备采用冷冻密闭式浆渣自分离磨浆机或离心摔干机或低温管式离心分离机。
下面是对上述实施例所得产品即蒜酶的确认:
(一)、SDS凝胶电泳测定蒜酶产品纯度及分子量:
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)条件:采用10%分离胶,4.5%浓缩胶制板。点样量20μL。CC型垂直电泳槽,甘油-三羟甲基胺基甲烷-HCl-十二烷基磺酸钠缓冲液。电压20mA电泳展开,考马斯亮蓝染色。结果显示一根条带。依据与标准蛋白(C:分子量14400~97400)比移值得回归方程:Y=-1.7297X+5.6399(r=0.97)。
计算蒜酶样品(批号:A:011105、B:020120)单聚体分子量为67000道尔顿。如附图10所示。
(二)、蒜酶活力效价:
建立HPLC同时测定底物蒜氨酸、产物大蒜辣素及丙酮酸的方法。如附图11所示。蒜酶产品0.100g,纯化水超声30秒使溶解,制成1.00mg/ml供试液。以蒜氨酸(Indofine Chemical Company,Inc.USA含量99.5%。)作标准对照品。Hypersil-BDS-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5um),柱温35℃,流动相:甲醇-水(3∶2),流率:0.8ml/min,214nm检测。进样量10μl测定。以相邻的蒜氨酸和丙酮酸色谱峰计算产品(蒜酶)的活力效价。实施例所得五批蒜酶产品催化活力平均为:765U/g。
1蒜酶活力单位(U)=每分钟裂解1μmol蒜氨酸(底物)需要的酶量(Ω)。五批蒜酶产品平均蒜酶活力为:765U/g。
(三)、酶促反应动力学曲线和参数
蒜酶产品加底物(蒜氨酸)分别配成试液。超声混合30秒,35℃水浴保温。分别于5、15、25min,及1、3、5、7、9、11、13hr吸取反应液适量,加甲醇混匀。过0.45μm滤膜,HPLC进样10μl,得到色谱图。计算蒜氨酸、丙酮酸及大蒜辣素含量。绘制酶促反应曲线,如附图12所示。
显示蒜酶的特性反应曲线:5分钟以内为酶促反应初速度(呈现一级反应:
。其速度方程为:-d[S]/dt=k
1[S]);25分钟达到最大反应速度(呈现混合级反应:
。)。大蒜辣素随时间浓度增加,15分钟至13hr其浓度基本稳定(25分-13hr接近零级反应)。
催化裂解反应符合米氏方程:1/V=0.129/[S]+0.0358。
回归方程:Y=35.78+0.129X(r=0.996)
最大反应速度:Vmax=27.9mol·min-1·mg-1
米氏常数:Km=3.6mmol/L。
上述附图10为蒜酶(A、B)、标准蛋白(C,3mg/mL)电泳图;
上述附图11为底物(蒜氨酸)和反应产物(丙酮酸、大蒜辣素)高效液相色谱分析(即HPLC)色谱图;
上述附图12为蒜酶催化蒜氨酸反应动力学曲线。