CN101028509A - 人造药用蛇胆 - Google Patents

Abstract

本发明涉及提供了一种人造药用蛇胆，至少含有三种结合胆汁酸：牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和牛磺去氧胆酸，其质量比为15－20∶2－3∶1，其中牛磺胆酸(TCA)含量最高，占总胆汁酸量的80％以上，占固形物总量的30％以上；本品还可含有少量的粘蛋白、胆甾醇、卵磷脂、游离胆汁酸、胆色素、多种氨基酸及微量元素和宏量元素，还可含有微量的牛磺胆汁酸－3－硫酸酯及其－3.7－双硫酸酯，该人造药用蛇胆具有与优质天然蛇胆极为相似的化学组成和药理效应，具有显著的镇咳、祛痰、平喘、抗炎等作用，无明显毒副作用，可以代替天然蛇胆制备各种复方制剂。

Description

人造药用蛇胆

技术领域

本发明涉及中药材及其制备方法，特别涉及人工制备的中药材，尤其涉及蛇胆及其制备方法。

背景技术

蛇胆是我国沿用上千年的一种名贵的传统药材，是生产各种蛇胆复方制剂的主要原料。蛇胆及其制剂具有显著的镇咳、祛痰、平喘和抗炎等功效，主要用于治疗呼吸系统、中枢神经系统及运动系统的疾病。长期的临床应用表明，蛇胆是集多种药理作用于一体的、具有中国特色的一味良药，疗效确切，且无毒副作用，是任何一种西药难以代替的药物，久用不衰。尤其自上世纪八十年代以来，成了发展中成药生产的热门品种之一，制剂新品种不断涌现，产量日益增加。而蛇类的野生资源却日趋枯竭，蛇胆供应严重短缺。由于经济利益的驱使，野生蛇被大肆捕杀，濒临灭种。为了保护物种和维护生态平衡，世界各国都严禁捕杀蛇类动物，尤其我国政府除禁止捕杀之外，还禁止养殖和销售蛇类动物，其执法力度之大达到前所未有的程度。由此给我国制药工业带来一个严重问题——蛇胆制剂的生产面临“无米之炊”。为了保住或延续这味良药的品种生产，当务之急就是要寻找或发明药用蛇胆代用品。

发明内容

本发明应用人工模拟方法解决药用蛇胆的来源问题。发明者根据现代中医药理论——药效主要取决于有效成分和合理配方。我们在弄清天然药用蛇胆汁化学组成和药理作用的基础上，选用某些非蛇类动物胆汁(如牛、羊及家禽等胆汁)为原料，采用现代生化技术进行提炼(提取或半合成)，将所得的有效组分(或组分群)按适当比例组成配方，进行人工模拟——从化学组成和药效两个方面与天然药用蛇胆进行对比，筛选出科学合理的、可工业化生产的配方，制成符合临床使用的蛇胆代用品——人造药用蛇胆或简称“人工蛇胆”。

蛇胆是我国沿用上千年的一种名贵的传统药材，是生产各种蛇胆复方制剂的主要原料。蛇胆及其制剂具有显著的镇咳、祛痰、平喘和抗炎等功效，主要用于治疗呼吸系统、中枢神经系统及运动系统的疾病。长期的临床应用表明，蛇胆是集多种药理作用于一体的、具有中国特色的一味良药，疗效确切，且无毒副作用，是任何一种西药难以代替的药物，久用不衰。尤其自上世纪八十年代以来，成了发展中成药生产的热门品种之一，制剂新品种不断涌现，产量日益增加。而蛇类的野生资源却日趋枯竭，蛇胆供应严重短缺。由于经济利益的驱使，野生蛇被大肆捕杀，濒临灭种。为了保护物种和维护生态平衡，世界各国都严禁捕杀蛇类动物，尤其我国政府除禁止捕杀之外，还禁止养殖和销售蛇类动物，其执法力度之大达到前所未有的程度。由此给我国制药工业带来一个严重问题——蛇胆制剂的生产面临“无米之炊”。为了保住或延续这味良药的品种生产，当务之急就是要寻找或发明药用蛇胆代用品。

为此，本发明提供了一种人造药用蛇胆粉，该人造药用蛇胆粉含有牛磺胆酸或其钠盐、牛磺去氧胆酸或其钠盐和牛磺鹅去氧胆酸或其钠盐，这三种组分在优质品中的质量比为15～20∶2～3∶1，其中牛磺胆酸或其钠盐占总固体30％以上，占总胆汁酸80％以上。该人造药用蛇胆粉还可以含有下列物质中的一种或数种或全部：

牛磺胆酸硫酸酯TSCA

胆酸CA

胆甾醇CS

粘蛋白MC

卵磷酯PC

牛磺酸TA

胆绿素BV

硫酸锌ZnSO₄、7H₂O

硫酸酮CuSO₄·5H₂O

硫酸镁MgSO₄·7H₂O

葡萄糖酸钙C₁₂H₂₂CaO₁₄·H₂O

碳酸氢钠NaHCO₃

前述各物质在人造药用蛇胆粉中的重量配比为：

牛磺胆酸                     30～34重量份

牛磺鹅去氧胆酸               4.5～5.5重量份

牛磺去氧胆酸                 1.5～4.5重量份

牛磺胆酸硫酸酯(TSCA)         0～1重量份

胆酸(CA)                     0.5～1.5重量份

胆甾醇(CS)                   4～6重量份

粘蛋白(MC)                   5～7重量份

卵磷酯(PC)                   1～3重量份

牛磺酸(TA)                   0.5重量份

胆绿素(BV)                   0.5～1.5重量份

硫酸锌(ZnSO₄、7H₂O)       4.3×10^-2重量份

硫酸酮(CuSO₄·5H₂O)              3.0×10^-2重量份

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)              0.32重量份

葡萄糖酸钙(C₁₂H₂₂CaO₁₄·H₂O)   9.5～10.5重量份

碳酸氢钠(NaHCO₃)                  12重量份

本发明提供的这种人造药用蛇胆粉为固态粉末状混合物。

将本发明提供的这种人造药用蛇胆粉溶于25％至50％的乙醇溶液中，可以制成人造药用蛇胆液。

据国内外文献报道，世界上有3000多种蛇，国内有1700多种蛇。按我国药典规定或认可的药用蛇胆，主流品种是眼镜蛇、金坏蛇、灰鼠蛇、三索蛇、乌梢蛇等的胆汁，并视这些品种的蛇胆为上品或优质品。为了人造药用蛇胆，我们对这些蛇的胆汁进行了化学成分分析，结果见表1。

                    表1  五种优质药用蛇胆成分分析结果

注：①同一品种的蛇，由于产地不同，捕捉季节不同、处死时饥饿程度不同及个体差异，其胆汁的化学组成及含量有明显差异。

②本分析样品是由广西梧州市蛇仓提供的活蛇，饿一周(只给水)后处死所取得的胆汁。

③分析方法主要采用HPLC法(分析卯磷脂、总胆酸和粘蛋白用比色法或分光光度法。)

④还测定了各种蛇胆的微量元素及各种氨基酸含量，未列入表中。

从表1结果看出：(1)所测的五种优质蛇胆汁，其牛磺胆酸含量一般不低于30mg/ml；(2)牛磺鹅去氧胆酸含量略高于牛磺去氧胆酸，两者之和约为4～9mg/ml范围内；(3)胆甾醇含量普遍较高，大体上在100～200mg/ml范围内；(4)卵磷脂、胆红素的含量普遍很低，而胆绿素约为胆红素的5～6倍；(5)总胆酸含量(糠醛比色法结果)一般在40mg/ml以上；(6)蛇胆汁中TCA、TCDCA和TDCA三种组分的质量比约为15～20∶2～3∶1，无严格的比例关系。

根据五种优质蛇胆的上述化学组成的主要特征，我们设计了五个模拟配方，其中三个用纯组分组方，见表2；另外2个用鸡胆或兔胆浸膏粉与半合成的主成分组方，见表3，制成的样品经药效学试验证实，见表6～表9，上述五个均为有效配方。

在配方设计中，突出TCA为主要成分的地位，为君药，而TCDCA和TDCA的配比基本参照乌梢蛇胆和灰鼠蛇胆两者的平均数值。这些配方中的组方成分质量比为：牛磺胆酸29～34g/L，牛磺鹅去氧胆酸4.5～5.5g/L，牛磺去氧胆酸1.5～4.5g/L，胆甾醇4.0～6.0g/L，粘蛋白5.0～7.0g/L，卵磷脂1.0～3.0g/L，胆绿素0.5～1.5g/L，牛磺酸0.0～0.5g/L，无机盐(ZnSO₄、CuSO₄、MgSO₄)合计0.49g/L，另外还加有葡萄糖钙9.50～10.5g/L及碳酸氢钠0.0～12g/L。配方IV和V配成胆粉，1公斤胆粉配成13升溶液，其质量与配方I～III相当，所不同的是用了鸡胆浸膏粉或兔胆浸膏粉代替配方I～III中全部或部分的TCDCA、TDCA、BV，使配方得到简化，本质上是相同的，更符合中药配方的惯例。

                表2  三个“人工蛇胆液”模拟配方的组成及配比

组方物质	来源	纯度	配制1升药液折合纯品所加克数
						配方I	配方II	配方III
			牛磺胆酸(TCA)牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)牛磺去氧胆酸(TDCA)牛磺胆酸硫酸酯(TSCA)胆酸(CA)胆甾醇(CS)粘蛋白(MC)卵磷酯(PC)牛磺酸(TA)胆绿素(BV)硫酸锌(ZnSO4、7H2O)硫酸酮(CuSO4·5H2O硫酸镁(MgSO4·7H2O)葡萄糖酸钙(C12H22CaO14·H2O)碳酸氢钠(NaHCO3)	半合成半合成半合成半合成市售品市售品市售品市售品市售品提取物市售品市售品市售品市售品市售品	95％95％95％93％98％98％98％95％98％78％99％99％99％99％99％				30.005.504.501.000.506.005.003.000.500.504.3×10-23.0×10-20.329.5012.00	32.005.003.000.501.005.006.002.000.501.004.3×10-23.0×10-20.3210.0012.00	34.004.501.5001.504.007.001.000.501.504.3×10-23.0×10-20.3210.5012.00

注：表2三个配方中的胆汁酸也可用它们相当量的钠盐配制，PH值控制在8.0～8.5。

表3  加有鸡胆或兔胆浸膏粉的二个“人造蛇胆粉”配方组成与配比

组方物质	来源	配制1kg药粉加入的物质克数
				配方IV*	配方V*
		牛磺胆酸	半合成			380.00	400.00

牛磺去氧胆酸鸡胆汁干浸膏兔胆干浸膏胆甾醇粘蛋白硫酸锌(ZnSO4·7H2O)葡萄糖酸钙碳酸氢钠牛磺酸

半合成自制自制市售市售市售市售市售市售

12.00210.00040.0096.001.00148.00108.005.00

0162.0048.0040.0096.001.00128.00120.005.00

*若将1kg固态混合物配成13升溶液，其质量与前面三个配方基本相当。

配方用主要单味药制备

(1)牛磺胆酸的合成：

综合国外文献报道，以胆酸为起始原料合成牛磺胆酸或其钠盐，主要有四种方法，即邦迪(Bondi)法[Cortese F.The synthesis of conjugated bile acids.IV.The Bondi and Muellerprocedure[J].J Am Chem Soc，1937，59：2532.、柯特斯(Cortese)法[Cortese F.The synthesis ofConjugated bile acids[J].J Biol Chem，1936，119：177.]、诺曼(Norman)法[3]Norman A.Preparation of conjugated bile acids using mixed carboxylic acid anhydrides[J].Ark Kemi，1955，8：331]和利昂·勒克(Leon Lack)法[Leon lack，et al.Synthesis of conjugated bile acids bymeans of a peptide coupling reagent[J].J Lipid Res，1973，14：367]，或称EEDQ法。发明者根据各条合成路线的技术难易程度、原料及试剂供应情况及设备条件和对环境污染等情况，选择了诺曼法合成TCA，并用此法合成TCDCA和TDCA。实际应用时对该法作了某些修正或改进。诺曼法合成牛磺胆酸，采取“一锅煮”的办法，先将胆酸(原料)与三正丁胺在二氧六环中成盐，再与氯甲酸乙酯反应生成胆酸基甲酰酐乙酯，在碱性水溶液中与牛磺酸偶合，得到目标化合物。后处理方法和精制，主要采用浓缩和重复结晶等方法，所得产品纯度不高(≤90％)，消耗大量多种溶剂，生产周期很长。我们为使该法适用于工业化生产，做了多方面改进。现将改进后的工艺操作叙述如下：

牛磺胆酸的合成：

称取3.2kg纯胆酸投入30升反应罐中，加入2升三正丁胺和10升四氢呋喃，在室温下搅拌使固体物料至全溶。向反应罐夹层中通入冰水，使内温降至8～9℃后，加入1.0升氯甲酸乙酯，搅拌至反应罐中的白烟消失后，在剧烈搅拌下缓缓加入由1.2kg牛磺酸溶于1.5MNaOH溶液配成的6升溶液，控制加入速度，并让其在10℃左右和PH值在8～9下反应50-60min。减压浓缩，回收四氢呋喃。将浓缩液转移到20升的分液器中，静置片刻，分出下层水溶液(上层为三正丁胺，处理后重复使用)。下层水溶液用硫酸中和并酸化到PH3.0-3.5，冷冻后过滤，收集滤液，中和至近于中性将其喷雾干燥，得白色固体，研成细粉，称重。置于反应罐中，加入甲醇和浓硫酸(按每100g干粉，加300ml无水甲醇和4ml浓硫酸计)在室温下搅拌8h以上，放置过夜后抽滤或压滤，收集滤液，加粉状碳酸氢钠中和至PH值8左右，减压浓缩至干。加25升无水乙醇搅拌回流1h，待冷却至室温后抽滤，收集滤液，浓缩至原体积的

时加入乙酸乙酸，直至恰好析出白色沉淀为止。密闭后置于冰箱或冰库中冷冻24h，抽滤，收集沉淀，用冷的乙醇-乙醚混合液(1∶1，V/V)洗涤、抽干；再用90％乙醇-乙醚混合液反复重结晶，得成品约3.8kg，纯度≥90％。必要时再进行硅胶柱层层析或其他方法纯化，可提高纯度达94％～95％。

(2)牛磺去氧胆酸的合成：

称取34.2g去氧胆酸于500ml三颈烧瓶中，加入22ml三正丁胺和180ml四氢呋喃，在室温下搅拌使溶，降温到8°～9℃时加入9ml氯甲酸乙酯，搅拌反应20min，缓缓加入由12g牛磺酸溶于120ml 1.0mol/L NaOH配成的冷溶液，加完后继续搅拌反应1h，加NaOH调节反应液的PH值8～9，升温至50℃左右减压浓缩至糖浆状。向浓缩物中加入600ml无水乙醇，搅拌回流30min，过滤除去不溶物，收集滤液，减压浓缩至呈现浑浊为止，加入适量乙醚后置0℃～4℃冰箱中冷冻过夜。抽滤，收集沉淀，用少量冷的乙醇-乙醚(1∶1，V/V)及乙醚依次洗涤、抽干。用干燥空气吹干，置真空干燥箱中在45℃左右减压干燥6h，得粗品约31g，mp169°～174℃，用乙醇重结晶，mp可达172°～175℃。最后用90％乙醇配成饱和溶液，向其中加入乙醚，加至出现明显浑浊为止，密封后置0℃冰箱中冷冻24h，过滤，收集结晶，用冷乙醇-乙醚混合液(1∶2，V/V)洗涤，置于盛有P₂O₅的真空干燥器中减压干燥3～4d，再移至70℃恒温箱中干燥至近于恒重。如果纯度偏低，可用硅胶柱层层析法或其他方法进一步纯化。

(3)牛磺鹅去氧胆酸的合成：

以纯粹的鹅去氧胆酸投料，使用的各种溶剂、试剂的种类和配比与牛磺去氧胆酸的合成相同，反应的温度、反应时间和操作也相同。仅后处理做些改变：先将所得浓缩物用适量1.0mol/NaOH溶液溶解，转移到分液漏斗中加两倍体积的乙醚萃取其中的三正丁胺，被萃取后的母液用稀盐酸调节PH值3-4，用等体积正丁醇萃取2-3次，合并萃液，加

体积水，滴加2M NaOH溶液使其PH值达8～9，转移到分液漏斗中，加入

体积乙酸乙酯，充分摇荡，静置片刻分出水层。加入二倍体积的乙酸乙酯-乙醚混合液(1∶1，V/V)，混合后密闭，置于0℃冰箱中冷冻过夜。抽滤，收集沉淀(其余操作与牛磺去氧胆酸合成相同)。

(4)鸡胆和兔胆浸膏粉的制备：

分别取新鲜的肉鸡胆和兔胆，洗净后划破胆衣放出胆汁，各称取1kg胆汁分别置于2升的分液漏斗中，滴加6M盐酸酸化至PH值2-3，加入等体积乙酸乙酯萃取其中的胆色素(主要是胆绿素)，萃取3～4次，合并绿色萃液，减压浓缩(T＜50°)至粘稠状；另向母液中加入4倍乙醇，在室温下放置48h后抽滤，收集滤液，并将其减压蒸干(温度≤70℃)，再将绿色粘稠液加入其中，在50℃下减压蒸干，移至真空干燥箱中真空干燥(温度≤50℃)2d，取出研成粉末，即为“胆汁浸膏粉”，进行质量分析(称重计算浸膏收率，测定总胆酸、牛磺胆酸和牛磺鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、胆绿素及各种氨基酸和无机元素含量)。

(5)牛磺胆汁酸硫酸酯的合成：

最近我们发现蛇胆汁中存在着3～4种未被人们认识的微量成分，通过提取分离和结构鉴定，证实为牛磺胆汁酸硫酸酯类化合物，含量较高的为牛磺胆酸-3-硫酸酯(Taurocholicacid-3-sulfate，TSCA)和牛磺去氧胆酸-3-硫酸酯(Taurodexoycholic acid-3-sulfate，TSDCA)，含量很低的为牛磺石胆酸-3-硫酸酯(Taurolithocholic acid-3-sulfate，TSLCA)和牛磺胆酸-3，7-双硫酸酯(Taurocholic acid-3，7-bisulfates，TSSCA)。它们都是蛇胆中牛磺胆汁酸的二重结合物——牛磺胆汁酸分子中的一个或两个羟基被硫酸酯化的产物。国外虽有这类化合物的结构和合成牛磺石胆酸-3-硫酸酯的报道[Tserng，K-y，and P.D.Klein.[J]Synthesis of sulfateesters of Lithocholic acid and taurolithocholic acid with sulfur trioxide-triethylamine.J.Lipid Res.18：491(1977)]，但没有和蛇胆成分“挂钩”，也未见其它几种硫酸酯合成方法的报道。我们为全面模拟蛇胆成分，所以设计合成了这些“未知化合物”。现将其合成方法叙述如下：

称取某种游离胆汁酸(如胆酸、去氧胆酸或鹅去氧胆酸等)5m mol，溶于10ml二甲基甲酰胺(DMF)中，加入酯化试剂——三氧化硫·三乙胺复合物5m mol，在室温下搅拌30min，升温至40℃再反应1h，待冷至室温后加入125ml乙醚混合，置冰箱中冷冻4～5h，过滤，收集结晶，用少量乙醚洗涤、干燥，得三乙胺胆酸盐，加0.1mol/L NaOH甲醇溶液120ml溶解，过滤除去不溶物，收集滤液，加入100ml乙醚即析出沉淀，过滤收集沉淀，用乙醇-乙醚混合液(1∶3，V/V)洗涤，真空干燥，得胆汁酸-3-硫酸酯钠。称取3.5m mol，溶于5ml二氧六环中，再加3.5m mol三正丁胺搅拌，再在13℃～15℃下加入3.5m mol氯甲酸乙酯，搅拌反应30min，滴加4ml牛磺酸钠冷溶液(由0.5g牛磺酸溶于4ml1MNaOH溶液配成，预冷至5℃以下后加入)，搅拌反应15min，减压浓缩至干，得浓缩物，将其溶于25ml的沸腾状态的无水乙醇中，过滤除去不溶物，收集滤液，向其中加入无水乙醚，直加至析出沉淀为止，密封后置0℃～4℃冰箱中冷冻48h，过滤，收集结晶，用无水乙醚洗涤、真空干燥，得牛磺胆汁酸-3-硫酸酯钠粗品，用硅胶G干柱层析纯化(以乙酸乙酯-正丁醇-冰醋酸-水(8∶6∶3∶3，V/V)为展开剂)，得单点物(纯品)。我们已证实，与从蛇胆中分离出的4种未知物相对应，它们的结构式表示如下：

        X＝Y＝H时，为牛磺石胆酸-3-硫酸酯(TSLCA)

        X＝H，Y＝OH时，为牛磺去氧胆酸-3-硫酸酯(TSDCA)

        X＝Y＝OH时，为牛磺胆酸-3-硫酸酯(TSCA)

        X＝OSO₃Na，Y＝OH时，为牛磺胆酸-3，-二硫酸酯(TSSCA)

它们在S₁和S₂展开系统中的R_f值列入表4中。

S₁展开系统：乙酸乙酯-正丁醇-冰醋酸-水(8∶6∶3∶3，V/V)

S₂展开系统：氯仿-甲醇-醋酸-水(65∶24∶15∶9，V/V)

           表4  4种合成物在不同展开系统中的R_f值

合成物名称：	TSLCA	TSDCA	TSCA	TSSCA
					在S1系统中Rf值：在S2系统中Rf值：	0.320.34	0.240.26	0.160.19	0.070.08

                      表5  各合成物样品质谱(MS)测试结果

合成物名称	分子式	分子量	主碎片质荷比	M+(m/z)
					TSLCATSDCATSCATSSCA	C26H43O8NS2Na2C26H43O9NS2Na2C26H43O10NS2Na2C26H42O13NS3Na3	607623639741	M+-Na＝584.4M+-Na＝600.4M+-Na＝616.4M+-3Na+2H＝674.1	607.4623.4639.4741.1

结果表明，合成物的分子离子峰M⁺的质荷比与目标化合物的分子量一致。

本发明的配制工艺及其质量控制

(1)液态产品的配制及其质量控制：

人造蛇胆若以溶液的形式作为上市产品，可选择25％以上浓度的乙醇作溶剂(如果样品是用于动物试验则用水或生理盐水为溶剂，适当加入羟甲基纤维素钠配成溶液)。从物质的溶解度看，配方所用的物质大多是水溶性的，仅有少数几种是脂溶性的(如胆甾醇、卵磷脂等)。根据我国药典规定，“商品蛇胆”是蛇胆囊保存在1∶1的50％以上的白酒中，临用时从浸泡液中将胆囊取出，划破胆衣放出胆汁，并与等量的浸泡液混合，实际的乙醇浓度约为25％或略大于25％。所以人造药用蛇胆液用≥25％药用乙醇配制。具体操作方法如下：先将胆甾醇、卵磷脂等脂溶性物质按配方规定的量，用200ml乙醇溶解；另将TCA、TDCA、CA、鸡胆浸膏粉、无机盐和碳酸氢钠等水溶性物质混合物，加750ml蒸馏水(或去离子水)溶解，并转移到1升的容量瓶中。然后将乙醇配成的溶液加入其中，充分混合，并追加无水乙醇至容量瓶刻度，密闭后在温度约为15℃下静置48h，过滤除去少量不溶物，即得。该液态产品的质量指标主要是：①棕黄色或棕色透明液体；②TCA含量不低于29mg/ml；③总胆汁酸含量≥60mg/ml；④TLC图谱(挥去溶剂后的干品用甲醇配成每1ml含1mg的样品液，点样10μL于硅胶G板，用氯仿-甲醇-水混合液(65∶28∶4，V/V/V)为展开剂，10％磷钼酸乙醇液为显色剂，80℃显色5min)，与相同条件下的灰鼠蛇胆或乌梢蛇胆的TLC图谱基本一致(见附图1)；(5)IR图谱(干样品与KBr压片)，红外扫描图谱与灰鼠蛇胆粉或乌梢蛇胆粉基本一致。

(2)固态产品的配制及其质量控制：

若人造蛇胆以固态(即粉末)形式为上市产品，配制1kg产品可按配方I～III的量13倍或按配方IV或V全量制成，操作方法如下：按配方分别称取各物质的重量，并分别研成细粉(卵磷脂除外)，过40目药筛；另将卵磷脂用200ml无水酒精溶解，置于混合器中与过筛后的其他药粉一起混合均匀，减压挥去酒精，再置于真空干燥箱中于60℃、0.1m mHg的真空度下干燥5h，球磨、过60目药筛，在干燥室内用食料袋分装(每1kg为一袋)密封，再装入木质盒外包装，密封后置于干燥室中保存。其产品质量控制主要指标与前面的液体产品基本相同，只是外观不同，为浅棕色或黄绿色粉末。干品中TCA含量在38％～41％范围内。

红外吸收光谱特征及解析：

五个配方的人工蛇胆红外吸收光谱叠加图谱(见图3-图7)与天然蛇胆(见图2)极为相似，均显示以牛磺胆汁酸为主成分的特征吸收，只是由于人工蛇胆中其他成分含量差异和相互影响不完全相同，使某些峰位和峰形略有改变。它们的主要特征吸收(波数，cm^-1)和归属列举如下：

天然蛇胆(图2)：3395(V_OH+V_NH)，2933

2867(

CH₃+CH₂)，1643(V_C＝O，仲酰胺普带I)，1551(

仲胺普带II)，1448(

CH₃)，1377(

CH₃)，1218(V_CN+V_S＝O，R-SO₂-OH)，1047(V_C-O，7β-OH)，912(V_OH，7α-OH)，590(V_OH，3α-OH)，528(V_OH，7β-OH)。

人工蛇胆配方I(图3)：3396(V_OH+V_NH)，2930

2867(

CH₃+CH₂)，1643(V_C＝O，仲酰胺谱带I)，1562( 仲酰胺谱带II)，1446(

CH₃)，1377( CH₃)，1214(V_CN+V_S＝O，R-SO₂-OH)，1047(V_C-O，7β-OH)，618，581(V_OH，3α-OH)，529(V_OH，7β-OH)。

人工蛇胆配方II(图4)：3361(V_OH+V_NH)，2986

2867(

CH₃+CH₂)，1643(V_C＝O，仲酰胺谱带I)，1562(

仲酰胺谱带II)，1377(

CH₃)，1214(V_CN+V_S＝O，R-SO₂-OH)，1047(V_C-O，7β-OH)等等。

人工蛇胆配方III(图5)：3419-3311(V_OH+V_NH)，2936

2868(

CH₃+CH₂)，1641(V_C＝O，仲酰胺谱带I)，1565(

仲酰胺谱带II)，1375(

1206(V_CN+V_S＝O，R-SO₂-OH)，1051(V_C-O，仲醇7β-OH)等等。

人工蛇胆配方IV(图6)：3311(V_OH+V_NH)，2931 2860( CH₃+CH₂)，1637(V_C＝O，仲酰胺谱带I)，1547(

仲酰胺谱带II)，1450(

CH₃)，1376( CH₃)，1213(V_CN+V_S＝O，R-SO₂-OH)，1047(V_C-O，7β-OH)980，809，737，590，531等。人工蛇胆配方V(图7)：3326(V_OH＝V_NH)，2935

2866(

CH₃+CH₂)，1637(V_C＝O，仲酰胺谱带I)，1552，(

仲酰胺谱带II)，1447(

CH₃)，1377(

CH₃)，1214-1078(V_CN+V_S＝O，R-SO₂-OH)，1047(V_C-O，7β-OH)，980，809，737，590，531等。

上述各图谱中几乎都有1250，1080，1047，980，920，610及530或其附近出现吸收峰，这7个峰是5-β构型胆甾烷核上(C₃、C₇、C₁₂位C-O与α-OH伸缩振动的特征吸收峰。另外，各图谱中都看不见明显的1710cm^-1V_C＝O(-COOH)吸收峰，提示样品基本上不含游离胆汁酸，即使有，其含量极低。

本发明提供的人造药用蛇胆的主要药效学实验结果

本品加适量的羟甲基纤维素钠蒸馏水配成各配方所述的样品液，以牛磺胆酸为剂量指标给药，以合格的昆明纯种同批小鼠、豚鼠和大鼠为实验动物，按文献所载的经典方法(模型)进行镇咳、祛痰、平喘和抗炎等实验，结果见表6-表9。

              表6  各配方制备的人造药用蛇胆液镇咳实验结果

组别	动物数(只)	3分钟内减咳率( X±SD，％)	与空白比较P值	与天然品相比较P值
					空白(生理盐水)乌梢蛇胆汁(天然品)配方I样品液配方II样品液配方III样品液	1212121212	1.30±0.5028.4±5.2027.8±4.8030.0±5.9032.4±10.20	＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01	＞0.05＞0.05＞0.05

配方IV样品液配方V样品液

1212

30.8±6.8031.5±6.70

＜0.01＜0.01

＞0.05＞0.05

*以TCA为剂量指标，按400mg/kg剂量给药；以下各实验亦同此。

              表7  各配方制备的人造药用蛇胆液祛痰作用实验结果

组别	动物数(只)	酚红排泌量( X±SD)μg/ml	与空白比较P值	与天然品相比较P值
					空白对照(生理盐水)天然品样品液配方I样品液配方II样品液配方III样品液配方IV样品液配方V样品液	10101010101010	0.20±0.101.65±0.221.60±0.301.59±0.421.68±0.651.68±0.741.72±0.68	＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01	＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

           表8  各配方制备的人造药用蛇胆液平喘实验结果

组别	动物数(只)	解痉率( X±SD)％	与空白比较P值	与天然品相比较P值
					空白(生理盐水)天然品(乌梢蛇胆汁)配方I样品液配方II样品液配方III样品液配方IV样品液配方V样品液	10101010101010	083.0±18.285.8±20.386.4±19.288.6±17.091.6±12.492.1±12.8	＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001	＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

               表9  各配方人工药液抗炎作用——对角叉菜胶致大鼠足肿胀抑制率实验结果

组别	动物数(只)	剂量(mg/kg)	给药后不同时间的抑制率(％)				与天然品相比较P值
								1h	2h	3h	4h
			天然品(乌梢蛇胆)配方I样品液配方II样品液配方III样品液配方IV样品液配方V样品液	888888	167167167167167167	33.3521.0526.3231.5828.4029.30						15.9324.1420.6934.4823.9225.80	47.5231.9136.6846.8240.0244.61	60.8260.0060.5062.8658.4061.32	＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

以上药效学实验结果表明，人工蛇胆五个配方样品都是有效的，与天然蛇胆没有显著性差异。

人工蛇胆新旧配方及工艺比较

本专利申请人于1995年申请了人工蛇胆发明专利[申请号：95112441.2；专利号：ZL95112441.2]，随着对本项发明的进一步研究，发现原专利虽然构思正确，但配方和工艺有不完善之处，尤其是工业化生产的可行性较差，生产成本较高，较难把此新药开发出来；另一方面在后继的研究中有新的发现和改进，原专利无法概括，为了阐明本专利申请的新颖性、创造性和实用性，现将本专利申请提供的技术方案与上述原专利技术进行对比如下：

(1)人工蛇胆新旧配方的对比：(见表10)

                 表10  人工蛇胆新旧配方比较

NO	组方物质名称及形式(I或II)	来源	新配方组成及配比(即本专利申请提供的技术方案)		原配方组成及配比(原专利技术)
							1升药液中克数	1kg药粉中克数	1升药液中克数	1kg药粉中克数
			12345678910111213141516	TCA(I)/TCNa(II)TCDCA(I)/TCDCNa(II)TDCA(I)/TDCNa(II)鸡胆粉(I)/兔胆粉(II)CA(I)/CANa(II)CSMCPCBVTSCA(I)/TSDCA(II)ZnSO4(I)/ZnCl2(II)CuSO4(I)/CuCl2(II)MgSO4(I)/MgCl2(II)葡萄糖酸钙(I)/氯化钙(II)牛磺酸NaHCO3	半合成半合成半合成提炼市售市售市售市售提取半合成市售市售市售市售市售市售	(I)30～34(I)3.5-5.5(I)1.5-4.5(I)12-17(I)0.5-1.54-65-71-30.5-1.5(I)0.5～10(I)4.3×10-2(I)3×10-2(I)0.42(I)9.5-10.50.506-12.0					(I)380-4000※(I)0-12(I)162-210(II)0-4804078-96000(I)1.0000(I)1405.0120	(II)40-80不明确(II)250(II)3.04.33.000.800(II)5×10-3(II)3×10-3(II)0.40(II)0.3500	(II)8100(II)2500(II)39.05526010.00(II)5.2(II)3.0(II)5.2(II)4.500

※由于加入的鸡胆粉中有这些成分，所以未另外加入。

(2)说明及解析：

①根据我们对天然蛇胆成分的最新分析结果，其主要药用成分除牛磺胆酸和牛磺去氧胆酸之外，牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)也是其中的一种，而且较之于牛磺去氧胆酸(TDCA)更为重要(含量较高，药效较强)的有效成分，而原配方未将其列入。另外还发现各种蛇胆中普遍含有微量的牛磺胆酸硫酸酯(TSCA或TSDCA)这类成分，据文献报道有抑制癌细胞活性和抗艾滋病毒的作用。新配方中加入了这类物质，原配方没有。这样也解释了天然蛇胆TLC图谱下部出现所谓“杂质斑点”，意味着对蛇胆成分认识的深入。

②在新配方中首次把鸡胆汁或兔胆汁浸膏粉作为“人工蛇胆”的一味重要的组方药物(实际上是有效组分群)。它代替了原配方中的胆绿素、牛磺鹅去氧胆酸及牛磺去氧胆酸，微量元素等有效成分，而且是纯天然的。用胆汁浸膏配方符合中医中药观点和习惯，它有国家标准或地方标准，而单一组分如胆绿素尚无国家标准。何况，近期研究发现鸡胆汁与蛇胆汁的化学成分和药理作用最为相似。鸡胆汁主含牛磺鹅去氧胆酸和胆绿素等；兔胆汁主含牛磺去氧胆酸和胆绿色等。它们都有镇咳、祛痰等作用。原配方中虽然意识到鸡胆汁药用，但只把其中的胆绿素作为一种着色剂，而没有考虑到鸡胆汁在配方中的妙用。相反地，原配方把去毒鱼胆汁作为一种配方药物，而“鱼胆去毒”技术的难度很大，易导致安全性问题，本专利申请提供的技术方案没有使用鱼胆汁，使人造药用蛇胆从根本上消除了安全隐患。

③在配方中的几种胆汁酸作为组方成分，不仅要考虑它们的合理配比，而且还考虑到入药成分的形式对产品稳定性、工艺过程的影响。实践表明，它们的钠盐易吸湿、稳定性较差，包装、贮藏、运输都存在问题，现改用它们的酸型就较好地解决了这些问题，所以新配方以它们的酸型入药，并强调以固态粉末作为上市产品为好，原配方未曾有此考虑。

④配方中的主成分(牛磺胆汁酸)无论是通过半合成或提取分离等手段获得，成本较高，几乎由它决定了人工蛇胆的产品价位。原配方中这些主要成分的配方量是新配方的二倍，所以按原配方生产成本较高，而药效几乎没有明显差别，甚至不及新配方产品的药效。

⑤新配方中加入的无机盐都是国内市场可购到药用品，而原配方中有的是不能口服的化工产品，如ZnCI₂等各种氯化物，国内大多不作药用品，而它的硫酸盐才作药用品。

(3)实施新、旧配方工业化生产的工艺比较：

                     表11  实施新、旧配方的工艺比较

主要工艺项目	新配方生产	原配方生产
			1.主要单味药合成(TCA、TDCA)2.精制工艺3.配制工艺4.工业化生产的可行性	采用我们改进的诺曼法，一步合成，收率≥79％，纯度≥90％，生产成本低，生产周期短(约4天)。简便，消耗有机溶剂量小，周期短，最高纯度可达95％。较简单，配方物质较稳定，也不需要特殊方法防潮。良好	采用柯特斯法，合成路线冗长，收率≤57％，纯度≤80％，生产成本高，生产周期长(约9天)。麻烦，消耗有机溶剂量大，周期长，最高纯度只能达到88％。较简便，但要采取特殊措施防潮，否则质量不易控制。较差

根据五种优质蛇胆的上述化学组成的主要特征，本发明提供了五个人造药用蛇胆模拟配方，其中三个用纯组分组方，见表2；另外2个用鸡胆或兔胆浸膏粉与半合成的主成分组方，见表3，经药效学试验证实，本发明人造药用蛇胆与天然蛇胆等效，见表6-表9，能够替代天然蛇胆作药用原料。本发明提供的人造药用蛇胆的这些配方中的组分及组分质量比为：牛磺胆酸29-34g/L，牛磺鹅去氧胆酸4.5-5.5g/L，牛磺去氧胆酸1.5-4.5g/L，胆甾醇4.0-6.0g/L，粘蛋白5.0-7.0g/L，卵磷脂1.0-3.0g/L，胆绿素0.5-1.5g/L，牛磺酸0.0-0.5g/L，无机盐(ZnSO₄、CuSO₄、MgSO₄)合计0.49g/L，另外还可加有葡萄糖钙9.50-10.5g/L及碳酸氢钠0.0-12g/L。配方IV和V配成胆粉，1公斤胆粉配成13升溶液，其质量与配方I-III相当，所不同的是用了鸡胆浸膏粉或兔胆浸膏粉代替配方I-III中全部或部分的TCDCA、TDCA、BV，使配方得到简化，本质上是相同的，更符合中药配方的惯例。

附图说明

图1为天然蛇胆汁与配方I人工品的TLC图谱；

图2为天然蛇胆粉IR图谱；

图3为配方I人工品IR图谱；

图4为配方II人工品IR图谱；

图5为配方III人工品IR图谱；

图6为配方IV人工品IR图谱；

图7为配方V人工品IR图谱。

具体实施方式：

实施例1

制备人造药用蛇胆粉

取牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸牛磺鹅去氧胆酸，按重量配比为15∶2∶1的比例混合，制成固态粉末状的人造药用蛇胆粉。实验证实其药效与天然蛇胆相同，具有与天然蛇胆粉相似的IR图谱。

实施例2

制备人造药用蛇胆粉

取牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸牛磺鹅去氧胆酸，按重量配比为20∶3∶1的比例混合，制成固态粉末状的人造药用蛇胆粉。实验证实其药效与天然蛇胆粉相同，具有与天然蛇胆粉相似的IR图谱。

实施例3

制备人造药用蛇胆粉

按下列组分和重量配比选取原料，配制成固态粉末状混合物即得本发明提供的人造药用蛇胆粉：

牛磺胆酸                               34重量份

牛磺鹅去氧胆酸                         5.5重量份

牛磺去氧胆酸                           4.5重量份

牛磺胆酸硫酸酯(TSCA)                      1重量份

胆酸(CA)                                  1.5重量份

胆甾醇(CS)                                6重量份

粘蛋白(MC)                                7重量份

卵磷酯(PC)                                3重量份

牛磺酸(TA)                                0.5重量份

胆绿素(BV)                                1.5重量份

硫酸锌(ZnSO₄、7H₂O)                     4.3×10^-2重量份

硫酸酮(CuSO₄·5H₂O)                     3.0×10^-2重量份

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)                     0.32重量份

葡萄糖酸钙(C₁₂H₂₂CaO₁₄·H₂O)          0.5重量份

碳酸氢钠(NaHCO₃)                         12重量份

实施例4

制备人造药用蛇胆粉

按下列组分和重量配比选取原料，配制成固态粉末状混合物即得本发明提供的人造药用蛇胆粉：

牛磺胆酸                          30重量份

牛磺鹅去氧胆酸                    4.5重量份

牛磺去氧胆酸                      1.5重量份

胆酸(CA)                          0.5重量份

胆甾醇(CS)                        4重量份

粘蛋白(MC)                        5重量份

卵磷酯(PC)                        1重量份

牛磺酸(TA)                        0.5重量份

胆绿素(BV)                        0.5重量份

硫酸锌(ZnSO₄、7H₂O)             4.3×10^-2重量份

硫酸酮(CuSO₄·5H₂O)             3.0×10^-2重量份

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)             0.32重量份

葡萄糖酸钙(C₁₂H₂₂CaO₁₄·H₂O)  9.5重量份

碳酸氢钠(NaHCO₃)                 12重量份

实施例5

制备人造药用蛇胆液

取实施例1至4中任一项所制备的人造药用蛇胆粉溶于浓度为25％的乙醇溶液中即得本发明人造药用蛇胆液。

实施例6

牛磺胆汁酸硫酸酯的合成

称取胆酸、去氧胆酸或鹅去氧胆酸等游离胆汁酸5m mol，溶于10ml二甲基甲酰胺DMF中，加入酯化试剂三氧化硫·三乙胺复合物5m mol，在室温下搅拌30min，升温至40℃再反应1h，待冷至室温后加入125ml乙醚混合，置冰箱中冷冻4至5h，过滤，收集结晶，用少量乙醚洗涤、干燥，得三乙胺胆酸盐，加0.1mol/L NaOH甲醇溶液120ml溶解，过滤除去不溶物，收集滤液，加入100ml乙醚即析出沉淀，过滤收集沉淀，用体积比为1∶3的乙醇-乙醚混合液洗涤，真空干燥，得胆汁酸-3-硫酸酯钠，称取3.5m mol，溶于5ml二氧六环中，再加3.5m mol三正丁胺搅拌，再在13℃~15℃下加入3.5m mol氯甲酸乙酯，搅拌反应30min，滴加4ml牛磺酸钠冷溶液，由0.5g牛磺酸溶于4ml 1MNaOH溶液配成，预冷至5℃以下后加入，搅拌反应15min，减压浓缩至干，得浓缩物，将其溶于25ml的沸腾状态的无水乙醇中，过滤除去不溶物，收集滤液，向其中加入无水乙醚，直加至析出沉淀为止，密封后置0℃~4℃冰箱中冷冻48h，过滤，收集结晶，用无水乙醚洗涤、真空干燥，得牛磺胆汁酸-3-硫酸酯钠粗品，用硅胶G干柱层析纯化，以体积比为8∶6∶3∶3的乙酸乙酯-正丁醇-冰醋酸-水的混合液为展开剂，得牛磺胆汁酸硫酸酯产物。

实施例7

牛磺胆酸的合成

称取3.2kg纯胆酸投入30升反应罐中，加入2升三正丁胺和10升四氢呋喃，在室温下搅拌使固体物料至全溶。向反应罐夹层中通入冰水，使内温降至8~9℃后，加入1.0升氯甲酸乙酯，搅拌至反应罐中的白烟消失后，在剧烈搅拌下缓缓加入由1.2kg牛磺酸溶于1.5MNaOH溶液配成的6升溶液，控制加入速度，并让其在10℃左右和PH值在8~9下反应50-60min；减压浓缩，回收四氢呋喃。将浓缩液转移到20升的分液器中，静置片刻，分出下层水溶液，下层水溶液用硫酸中和并酸化到PH3.0-3.5，冷冻后过滤，收集滤液，中和至近于中性将其喷雾干燥，得白色固体，研成细粉，称重，置于反应罐中，加入甲醇和浓硫酸，按每100g干粉，加300ml无水甲醇和4ml浓硫酸计，在室温下搅拌8h以上，放置过夜后抽滤或压滤，收集滤液，加粉状碳酸氢钠中和至PH值8左右，减压浓缩至干，加25升无水乙醇搅拌回流1h，待冷却至室温后抽滤，收集滤液，浓缩至原体积的 时加入乙酸乙酸，直至恰好析出白色沉淀为止，密闭后置于冰箱或冰库中冷冻24h，抽滤，收集沉淀，用冷的体积比为1∶1的乙醇-乙醚混合液洗涤、抽干；再用90％乙醇-乙醚混合液反复重结晶，得纯度≥90％的牛磺胆酸成品约3.8kg。

Claims (8)

1.一种人造药用蛇胆粉，含有牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸或它们的钠盐，其特征在于它还含有牛磺鹅去氧胆酸或其钠盐，这三种组分在优质品中的质量比为15～20∶2～3∶1。

2.根据权利要求1所述的人造药用蛇胆粉，其特征在于其中牛磺胆酸或其钠盐占总固体30％以上，占总胆汁酸80％以上。

3.根据权利要求1或2所述的人造药用蛇胆粉，其特征在于它还含有下列组分中的一种或数种或全部：

牛磺胆酸硫酸酯TSCA

胆酸CA

胆甾醇CS

粘蛋白MC

卵磷酯PC

牛磺酸TA

胆绿素BV

硫酸锌Z_nSO₄、7H₂O

硫酸酮CuSO₄·5H₂O

硫酸镁MgSO₄·7H₂O

葡萄糖酸钙C₁₂H₂₂CaO₁₄·H₂O

碳酸氢钠NaHCO₃

各组分在人造药用蛇胆粉中的重量配比为：

牛磺胆酸                           30～34重量份

牛磺鹅去氧胆酸                     4.5～5.5重量份

牛磺去氧胆酸                       1.5～4.5重量份

牛磺胆酸硫酸酯(TSCA)               0～1重量份

胆酸(CA)                           0.5～1.5重量份

胆甾醇(CS)                         4～6重量份

粘蛋白(MC)                         5～7重量份

卵磷酯(PC)                         1～3重量份

牛磺酸(TA)                         0.5重量份

胆绿素(BV)                         0.5～1.5重量份

硫酸锌(Z_nSO₄、7H₂O)             4.3×10^-2重量份

硫酸酮(CuSO₄·5H₂O)              3.0×10^-2重量份

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)                    0.32重量份

葡萄糖酸钙(C₁₂H₂₂CaO₁₄·H₂O)         9.5～10.5重量份

碳酸氢钠(NaHCO₃)                        12重量份

4.一种人造药用蛇胆液，其特征在于它是将权利要求1至3中任一项所述的人造药用蛇胆粉溶于浓度为25％至50％的乙醇溶液中所得的溶液。

5.一种人造药用蛇胆粉的制备方法，其特征在于按照权利要求1至3中任一项所述的组分和配比选取原料配制成固态粉末状混合物。

6.一种人造药用蛇胆液的制备方法，其特征在于将按照权利要求5所制得的人造药用蛇胆粉溶于浓度为25％至50％的乙醇溶液中。

7.牛磺胆汁酸硫酸酯的合成方法，其步骤如下：

称取胆酸、去氧胆酸或鹅去氧胆酸等游离胆汁酸5mmol，溶于10ml二甲基甲酰胺DMF中，加入酯化试剂三氧化硫·三乙胺复合物5mmol，在室温下搅拌30min，升温至40℃再反应1h，待冷至室温后加入125ml乙醚混合，置冰箱中冷冻4～5h，过滤，收集结晶，用少量乙醚洗涤、干燥，得三乙胺胆酸盐，加0.1mol/L NaOH甲醇溶液120ml溶解，过滤除去不溶物，收集滤液，加入100ml乙醚即析出沉淀，过滤收集沉淀，用体积比为1∶3的乙醇-乙醚混合液洗涤，真空干燥，得胆汁酸-3-硫酸酯钠，称取3.5mmol，溶于5ml二氧六环中，再加3.5mmol三正丁胺搅拌，再在13℃～15℃下加入3.5mmol氯甲酸乙酯，搅拌反应30min，滴加4ml牛磺酸钠冷溶液，由0.5g牛磺酸溶于4ml1MNaOH溶液配成，预冷至5℃以下后加入，搅拌反应15min，减压浓缩至干，得浓缩物，将其溶于25ml的沸腾状态的无水乙醇中，过滤除去不溶物，收集滤液，向其中加入无水乙醚，直加至析出沉淀为止，密封后置0℃～4℃冰箱中冷冻48h，过滤，收集结晶，用无水乙醚洗涤、真空干燥，得牛磺胆汁酸-3-硫酸酯钠粗品，用硅胶G干柱层析纯化，以体积比为8∶6∶3∶3的乙酸乙酯-正丁醇-冰醋酸-水的混合液为展开剂，得牛磺胆汁酸硫酸酯产物。

8.牛磺胆酸的合成方法，其步骤如下：

称取3.2kg纯胆酸投入30升反应罐中，加入2升三正丁胺和10升四氢呋喃，在室温下搅拌使固体物料至全溶。向反应罐夹层中通入冰水，使内温降至8～9℃后，加入1.0升氯甲酸乙酯，搅拌至反应罐中的白烟消失后，在剧烈搅拌下缓缓加入由1.2kg牛磺酸溶于1.5MNaOH溶液配成的6升溶液，控制加入速度，并让其在10℃左右和PH值在8～9下反应50-60min；减压浓缩，回收四氢呋喃。将浓缩液转移到20升的分液器中，静置片刻，分出下层水溶液，下层水溶液用硫酸中和并酸化到PH3.0-3.5，冷冻后过滤，收集滤液，中和至近于中性将其喷雾干燥，得白色固体，研成细粉，称重，置于反应罐中，加入甲醇和浓硫酸，按每100g干粉，加300ml无水甲醇和4ml浓硫酸计，在室温下搅拌8h以上，放置过夜后抽滤或压滤，收集滤液，加粉状碳酸氢钠中和至PH值8左右，减压浓缩至干，加25升无水乙醇搅拌回流1h，待冷却至室温后抽滤，收集滤液，浓缩至原体积的

时加入乙酸乙酸，直至恰好析出白色沉淀为止，密闭后置于冰箱或冰库中冷冻24h，抽滤，收集沉淀，用冷的体积比为1∶1的乙醇-乙醚混合液洗涤、抽干；再用90％乙醇-乙醚混合液反复重结晶，得纯度≥90％的牛磺胆酸成品约3.8kg。

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