CN1507772A - 液体深层发酵制备羊肚菌的方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种液体深层发酵制备羊肚菌的方法及开发羊肚菌营养液和羊肚菌多糖新品种；选用食、药用菌羊肚菌Morchella sp为菌种(编号EF－11)，完善羊肚菌菌丝体多糖的生物发酵、反渗透膜浓缩和超滤分离浓缩等新工艺技术，分离提纯羊肚菌多糖有效成分。经理化和初步构型分析检测，得出羊肚菌多糖为多糖和蛋白质复合物MCSP(羊肚菌多糖)、MCS(脱游离蛋白质的羊肚菌多糖)、MCSC(柱层析纯化的羊肚菌多糖)，经生物活性初筛试验得出该品具有免疫调节、抑制肿瘤、抗过敏、调节心血管功能等多种生物活性。食用安全可靠无毒副作用，因而可按照不同需求向药品发展或应用于保健食品。

Description

液体深层发酵制备羊肚菌的方法及其产品

技术领域：

本发明涉及一种液体深层发酵制备羊肚菌的方法及其产品。

背景技术：

近期生物科学技术的不断进展，已证实真菌多糖成分参与人体重要的生命活动，具有免疫调节、增强抗体形成等生物活性作用，深受医药和营养学界的重视。

目前已知的食、药用菌源中，羊肚菌属菌种(Morchella sp)是天然珍稀菌，是食、药用菌中的精品，不但具有较高营养价值而且具有多种药理活性作用，经济价值较高。但由于至今未能将该菌驯化为人工培植菌，只在近年来有少量培植成功的报道，因此，仅靠有限的天然出品不能满足需要量。有研究资料证实，发酵菌丝体和栽培子实体有效成分和药理作用一致。本发明前期研究的“一种食用菌发酵饮料的制作方法”专利号：85104712.2，“一种蘑菇营养液的制作方法”专利申请号：92112908.4，已发现该品有免疫调节和抗肿瘤作用，并取得较好的社会经济效益。

发明内容：

本发明的目的在于，在上述两项专利的基础上，研制一种液体深层发酵制备羊肚菌的方法及开发羊肚菌营养液和羊肚菌多糖新品种，以弥补其天然出品的不足；完善羊肚菌菌丝体多糖的生物发酵、反渗透膜浓缩和超滤分离浓缩等新工艺技术，分离提纯羊肚菌多糖有效成分。经理化和初步构型分析检测，得出羊肚菌多糖为多糖和蛋白质复合物—MCSP(羊肚菌多糖)、MCS(脱游离蛋白质的羊肚菌多糖)、MCSC(柱层析纯化的羊肚菌多糖)，经生物活性初筛试验得出具有免疫调节和抑制肿瘤等活性作用，为食用真菌中的有效的生物活性成分。

本发明发酵工艺周期短，一个生产周期仅需一周时间，而小量培植方法约需要一年时间，使生产效率提高，且具有易于从发酵物中分离提纯有效成分等优点。

羊肚菌制品毒性试验(亚急性毒性试验和亚慢性毒性试验)结果得出MCSP小鼠口服最大耐受量(MTD)为20g/kg.b.w。根据急性毒性分级，受试物属无毒物，羊肚菌制品食用安全可靠无毒副作用。

羊肚菌制品部分药理试验、保健试验及临床试验，生物活性作用试验结果得出羊肚菌多糖MCSP、MCS具有免疫调节作用，抑制肿瘤、减缓癌症放、化疗毒副作用、抗过敏、调节心血管功能等多种生物活性。因而可按照不同需求向药品发展或应用于保健食品。

本发明的特征在于：

制备羊肚菌的方法为：选用食、药用菌羊肚菌Morchella sp菌种(编号EF-11)，该菌种保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号EF-11，保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.0019。

用4％的大麦、2％葡萄糖为培养液，在摇床震荡400～500次/分钟，培养72～96小时为菌种液；选10％大麦芽、5％大豆为发酵基质，在发酵基质中强化无机锌，添加硫酸锌0.9～1.2％，强化无机硒，添加亚酸纳0.6～0.9％，经过强化微量元素，且经生物发酵作用后，无机元素转换为具有生物活性作用的有机锌和有机硒。通气培养48～72小时，通过生物发酵期，得到发酵羊肚菌；发酵终止指标pH值为4.0～5.3，折光糖度为3.0～3.5，菌丝体得率为0.6％～0.8％(干重)；将菌丝体用水提取，浸提比1∶2，浸提温度85℃，浸提时间3小时，得到羊肚菌提取液；对羊肚菌提取液和发酵液的混合液采用反渗透膜浓缩法或真空浓缩法达到浓缩4倍及折光糖度11.5％。

羊肚菌系列制品—羊肚菌营养液工艺流程，菌丝体浸提工艺参数∶浸提比1∶2(W/V)，温度90～95℃，时间3小时；采用反渗透膜浓缩或真空浓缩方法处理发酵液；发酵液pH值6～7，折光糖度3％左右，液体透明清凉无混浊现象，膜设备操压力40kg/cm²，在室温下浓缩操作；羊肚菌营养液含有菌多糖；有机锌；有机硒；有机锗；核糖核酸等生物活性成分，具有营养保健作用。

羊肚菌系列制品—羊肚菌多糖MCSP(羊肚菌糖蛋白)、MCS(羊肚菌多糖)、MCSC(羊肚菌多糖‘纯化’)的分离提纯工艺流程，发酵：20～25℃、72～96小时；菌丝体浸提：90～95℃水提、3小时、浸提3次；乙醇沉淀：95％，乙醇1∶3(V∶V)，透析：流动水24小时，冷冻干燥：温度-55℃(约)、压力8.0×10^-1～2.2×10^-2mbar，时间42～45小时。羊肚菌多糖MCSP提取率为5.69～5.7g/10L(菌丝体浸提液混合液)，MCS平均0.45g/10L混合液。

羊肚菌多糖分离提纯方法用Sephadex G 100层析柱纯化的多糖MCSP11，在紫外分光光度仪320nm下测吸光度，收集A值一致的液体，用流动水透析后冷冻干燥。

用醋酸纤维膜电泳测定羊肚菌多糖3种构型较为一致，为杂多糖结构；经液相色谱和凝胶色谱测定羊肚菌多糖MCSP平均相对分子量组分I为19万，组分II为50万，组分III为10万。

混合液浓缩方法首先用反渗透膜浓缩至折光糖度15％，再经超滤分离浓缩，按浓缩液3倍量(W∶V)加入95％乙醇，用高速离心机分离多糖沉淀物。

将分离的多糖在低温冷冻干燥机内冷冻干燥，温度不超过-50℃，压力8.0×10^-1～2.2×10^-2mbar。

羊肚菌多糖脱去游离蛋白质的方法，是将多糖分离物制成6％糖液，等量加入(V∶V)5％三氯醋酸溶液，分离蛋白5次后，再用氯仿正丁醇溶液脱蛋白5次后，分离出多糖液。

羊肚菌多糖经红外光谱检测该多糖为多糖和蛋白质复合物，其中多糖含量为64.026～95.621％，蛋白质含量为1.09％～3.32％，多糖由葡萄糖，甘露糖，果糖和海藻糖组成；蛋白质由天冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，甘氨酸，丙氨酸，蛋氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯病氨酸，赖氨酸，组氨酸，精氨酸，r-氨基丁酸，颉氨酸16种氨基酸组成。

附图说明：

请参照附图及实施例对本发明做进一步的阐述：

图1为本发明深层发酵羊肚菌生产工艺流程图；

图2为本发明羊肚菌营养液生产工艺流程图；

图3为本发明羊肚菌多糖提取基料制备工艺流程图；

图4为本发明羊肚菌糖蛋白MCSP制备工艺流程图；

图5为本发明羊肚菌糖蛋白MCS制备工艺流程图；

图6为本发明羊肚菌多糖MCSC制备工艺流程图。

本发明是这样实现的：

采用的原材料及设备为：

原材料：麦芽汁、蜂蜜、豆粉、葡萄糖、黄豆、酶制剂、葡聚糖、透析袋；

主要设备：发酵罐、反渗透膜浓缩设备、小型膜分离设备(超滤)、低温冷冻设备、瞬时灭菌机、高速离心机、电泳仪、无菌过滤机、提取罐、保温罐、摇床、显微镜。

一.深层发酵羊肚菌工艺技术规程，见图1。

1.菌种质量标准：

斜面菌种(EF-11)，在综合PDA培养基斜面上，25℃培养72小时的EF-11菌种，呈灰白色绒毛状，紧贴培养基生长，气生菌丝甚少，菌丝呈白色镜检为多分支细胞，有分隔、多核、无锁状联合。斜面菌种每隔5-6个月转接一次，存放4℃冰箱。

2.I级菌种液，在W.S培养基上，25℃温度下，400～500rpm旋转振荡培养72～96小时，菌丝大多数呈辐射状团聚物，呈菌丝体状，少数呈丝状，布满液体，检验为纯菌，菌丝白色较原菌丝粗壮。

3.II级菌种液，在W.S培养基中，25℃温度下，600rpm旋转振荡培养48～72小时，菌丝大多数呈辐射状团聚物，呈菌丝体状，少数呈丝状，布满液体，菌丝白色较I级菌丝粗壮。检验为纯菌。

4.深层发酵条件

发酵基质：WS

菌丝体生长发酵条件：温度在20-25℃时最好，PH值为6-7，发酵时间为48小时，当发酵终止时，折光糖度3.1％，PH值4.8左右菌丝体干重0.7％左右。

5.主要工艺参数

配料：主要成分：大麦芽30KG，蜂蜜19.8KG，豆粉5.4KG，总量600L

杀菌：配料用瞬时灭菌机135℃，3秒

II级种子液：2-5％接种量，无菌手续介入发酵罐

发酵：25℃，通气量1∶0.5-1∶1.5，48～72小时

6.实施例：

批次	基质总量L	配料主要成分KG			得率
									大麦芽	蜂蜜	豆粉	产量KG	生物效率％	产量L	生物效率％
		1	600	30	19.8	5.4	36	6								564	94
2	3500								175	114.8	31	243.6	7	3256	93

羊肚菌菌丝体和发酵液质量分析结果

项目	菌丝体	发酵液
			总糖g/100ml	10.208	2.934
多糖g/100ml	6.123	0.437
			蛋白质g/100ml	28.20	0.20
维生素VC mg/100ml	13.939	/
			维生素VB1 mg/100ml	0.200	0.20
叶酸mg/100ml	0.250	6.611
			微量元素锌mg/g	155.5	2.36
微量元素硒μg/g	11.8	0.146
			微量元素锗μg/g	1.69	0.081
氨基酸总量g/100ml	164.445	24907
			天门冬氨酸	2808	15.085
苏氨酸	1639	7.880
			丝氨酸	1348	7.560
谷氨酸	3928	16.290
			甘氨酸	1337	7.880
丙氨酸	1759	9.970
			结氨酸	1775	9.57
蛋氨酸	122	1.780
			异亮氨酸	1518	8.860
亮氨酸	2210	10.290
			酪氨酸	689	5.710
苯氨酸	1200	5.820
			组氨酸	1706	12.700
赖氨酸	1768	10.20
			精氨酸	800	11.850
色氨酸	300	23.00

二.羊肚菌(EF-11)营养液工艺技术规程，见图2。

深层发酵羊肚菌，菌丝体和发酵液，都含有多糖、氨基酸、微量元素和维生素等营养物质，其中以菌丝体含量高于发酵液。由于菌丝细胞的细胞壁由几丁质和纤维素聚合物组成，其中有效成分不易溶出，发酵液水分含量大，有效成分较低，为了提高有效成分含量，本发明对菌丝体草用机械粉碎和人水浸提方法，并对发酵液采用浓缩处理工艺。

羊肚菌菌丝体水浸提结果

主要浸出成分
						菌多糖			核糖核酸RNA
菌丝体总含量mg	浸出量mg	浸出率％	菌丝体总含量mg	浸出量mg	浸出率％
						2355.48	1983.75	84.2	285.8	200.25	70

菌丝体浸提工艺参数∶浸提比1∶2(W/V)，温度90～95℃，时间3小时。

发酵液浓缩工艺采用反渗透膜浓缩或真空浓缩方法。

发酵液PH值6～7，折光糖度3％左右，液体透明清亮无混浊现象，膜设备操压力40kg/cm²，在室温下浓缩操作。经浓缩工艺处理前、后的液体有效成分中多糖、氨基酸等质量指标的含量见下表。

	粗蛋白g/100ml	全糖g/100ml	还原糖g/100ml	总酸g/100ml	干物质g/100ml	折光糖度
							浓缩前	0.12	10.8	11.46	0.03	13.24	3％
浓缩后	0.15	22.55	20.78	0.06	25.18	12％
							透过液	0.004	0.02	0.03	0	0.065
PH值	6.9无明显变化
							感官指标	棕红色，液体清亮透明

羊肚菌营养液实施例：

批次	半成品总量L	成品量L	配料主要成分KG			产品包装
									大麦芽	蜂蜜	豆粉	250ml/瓶	70ml/瓶	10ml/瓶
			1	600	140	30	19.8	5.4							560	260	14000
2	3500	780							175	114.8	31	3120	1114	78000

羊肚菌营养液质量分析

项目	指标
		总糖g/100ml	9.06
总酸g/100ml	0.1
		干物质g/100ml	10.52
菌多糖g/100ml	0.657
		维生素VB1 mg/100ml	0.01
维生素VB2 mg/100ml	0.20
		维生素VB6 mg/100ml	2.25
维生素VB12 mg/100ml	0.12
		尼克酸mg/100ml	0.78
叶酸mg/100ml	1.20
		微量元素Ca mg/100ml	7.11
微量元素P mg/100ml	7.46
		微量元素Fe mg/100ml	0.39
微量元素Zn mg/100ml	0.57
		微量元素Se μg/100ml	0.112
微量元素Ge μg/100ml	0.01
		微量元素Cu mg/100ml	0.250
微量元素Mn mg/100ml	0.07
		氨基酸总量mg/100ml	1.6858
天门冬氨酸	0.2364
		苏氨酸	0.0760
丝氨酸	0.0843
		谷氨酸	0.4287
甘氨酸	0.0993
		丙氨酸	0.1562
光氨酸	0.0169
		结氨酸	0.0851
蛋氨酸	0.0169
		异亮氨酸	0.0641
亮氨酸	0.0945
		酪氨酸	0.0280
苯氨酸	0.0598
		组氨酸	0.0294
赖氨酸	0.0691
		精氨酸	0.0296
脯氨酸	0.1115

三.羊肚菌多糖类物质的制作工艺

1.羊肚菌发酵法制备多糖条件

采用固体培养基代替液体基质选定发酵基质、PH值。用直径9cm培养皿，取5mm²的羊肚菌菌丝体块接种平板中心，置25℃培养箱培养，各重复三次，测定菌丝生长量，取平均值，确定PH值为6～7，温度20～25℃。

液体培养基：1.基本培养基PDA；2.PDA综合培养基；3.W.S培养基(大麦芽4％，蜂蜜3.3％，豆粉1％，琼脂2％)；4.G.P培养基(葡萄糖2％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.05％，酵母浸膏0.2％，琼脂2％)。确定W.S为羊肚菌多糖制备培养基。

2.羊肚菌多糖提取基料的制备方法，见图3。

3.羊肚菌多糖分离提纯方法：

发酵以后，经粗滤处理的菌丝体洗涤后，经胶体磨研磨处理，置提取罐中，按鲜重加入3倍去离子水(W∶V)，在90℃下提取三次，第一次3小时，第二次3小时，第三次2小时，合并三次滤液过滤成清液。水提后，再加酶提取，加酶量0.5g/100g菌丝体(湿重)，60℃、2小时后过滤，滤液和水提取后的清液合并为混合提取液。再用反渗透膜浓缩6倍，再用超滤设备分离浓缩至透过液折光糖度在1％以下，浓缩液浓度在6％左右，将浓缩液加入3倍(W∶V)95％乙醇沉淀多糖，置4℃温度10小时左右，用高速离心机分离下层多糖沉淀物，继续用95％乙醇沉淀洗涤两次，用去离子水溶解，调整PH至中性，置透析袋中，用去离子水透析48小时，取出，分装安培瓶，低温冷冻干燥。

4.羊肚菌多糖脱去游离蛋白质处理方法

用SeVag法对MCSP进行脱蛋白处理，由3.制成的乙醇沉淀物，配制成6％糖液(以折光糖计)，等量(V∶V)加入5％三氯醋酸正丁醇溶液(5％TCA)，置分液漏斗充分振荡分离，重复操作5次后，分离出糖液层，按1∶1加入氯仿正丁醇(5∶1)溶液，充分振荡，重复5次，取出糖液。

5.羊肚菌多糖层析分离提纯法

层析柱高20×400mm

吸附剂、硅胶、溶剂0.1％NaCl溶液

将SephaDex G 100 1g加入30m10.1％NaCl溶液中制成混悬液，上柱洗脱液流速0.5ml/min，以分离的多糖MCS用无菌水溶化制成6％浓度上柱，上液流速0.5ml/min，在紫外分光光度仪320nm下测吸光度(A值)，收集液体，每管3.5ml，用α-萘酚硫酸显色，测试为糖液后合并A值一致的液体，用流动水透析8小时后取出透析液分装于安培冷冻干燥。

6.醋酸纤维膜电泳法

用DF-D电泳仪测定MCS、MCSP、MCSC电泳图谱，泳动条件：恒压恒流，电压250～300V，电流3～5mA，醋酸纤维膜2cm×8cm，硼砂缓冲液，甲苯胺蓝染色，漂洗液采用90％乙醇。

7.糖含量分析：液相色谱法，α-萘酚硫酸显色法.

8.氨基酸组成分析：称取20.1mgMCSP溶于5ml 6N Hcl中，110℃封管水解24小时，水解液用滤纸过滤，冷干浓缩，用氨基酸分析仪分析。

羊肚菌多糖类物质(MCSP、MCS、MCSC)制备研究

羊肚菌液体培养生长条件：以豆粉为主要氮源的W.S培养基，以蜂蜜和麦芽汁为碳源，PH值6.6，温度20～25℃为最佳生长条件。

羊肚菌多糖物质主要存在于菌丝细胞中，适宜发酵时间为72小时。

羊肚菌菌丝体多糖的组成

	三糖	二糖	葡萄糖	果糖	多糖
						菌丝体(干重)g/100g	0.408	1.920	1.017	0.740	6.123

羊肚菌多糖分离提纯工艺技术指标

提纯分离条件：用去离子水提取多糖最佳条件：温度90～95℃，PH7.0，浸提比W/V1∶30，90分钟，在此条件下提取的菌丝体中的大部分多糖物质，为水溶性多糖；加入3倍95％乙醇分离提取多糖；多糖提纯物经冷冻处理后，置冷冻干燥机内进行冷冻干燥，平均42小时达到干燥(恒重)，干燥后每安培平均重量为32mg。

羊肚菌多糖MCSP工艺流程，见图4。

工艺参数：发酵27℃，72小时；浸提：按菌丝体鲜重加入3倍去离子水(W∶V)，在90～95℃下3小时后过滤，重复三次，过滤后合并滤液，取菌丝体残渣加3倍去离子水(W∶V)，60℃、2小时后过滤，滤液与水提液合并；

反渗透膜浓缩：混合液浓缩至15％；

超滤：超滤膜分子量1～10万、5万以上、10万以上，超滤至透过液1％(折光糖度计)；

乙醇沉淀：将浓缩液加入3倍(W∶V)95％乙醇沉淀，置4℃下过夜，高速离心分离下层沉淀物；

透析：流动水24小时，透析袋直径49mm，截流分子量8000～10000；

冷冻干燥：温度-55℃，压力8.0×10^-1～2.2×10^-2mbar。

羊肚菌糖蛋白MCS制备工艺流程，见图5。

工艺参数：脱蛋白处理：经乙醇沉淀后的多糖制成6％多糖液，等量加入5％三氯醋酸正丁醇溶液，置分液漏斗中振荡分离，重复5次后，分离出糖液层，按1∶1(V∶V)加入氯仿正丁醇溶液(5∶1)，重复3～5次，分离出糖液层。

羊肚菌多糖MCSC制备工艺流程，见图6。

工艺参数：发酵以后，经粗滤处理的菌丝体洗涤后，经胶体磨研磨处理，置提取罐中，按鲜重加入3倍去离子水(W∶V)，在90℃下提取三次，第一次3小时，第二次3小时，第三次2小时，合并三次滤液过滤成清液。水提后，再加酶提取，加酶量0.5g/100g菌丝体(湿重)，60℃、2小时后过滤，滤液和水提取后的清液合并为混合提取液。再用反渗透膜浓缩6倍，再用超滤设备分离浓缩至透过液折光糖度在1％以下，浓缩液浓度在6％左右，将浓缩液加入3倍(W∶V)95％乙醇沉淀多糖，置4℃，10小时左右，用高速离心机分离下层多糖沉淀物，继续用95％乙醇沉淀洗涤两次，用去离子水溶解，调整PH至中性，置透析袋中，用去离子水透析48小时，取出，分装安培瓶，低温冷冻干燥。

上柱：取吸附剂Sephadex G 100 1g加入30ml 0.1％NaCL溶液，溶解后装入层析柱(20×40mm)，洗脱液流速0.5ml/min；

收集液：在紫外分光光度仪320nm下测吸光度(A值)，用α-萘酚硫酸法测糖液，合并A值一致的收集液进行透析。

羊肚菌多糖制备试验结果

提取率％	项目					提取液
							多糖(MCSP)	组分	I	I-1		0.046
	I-2		0.026
				平均		0.136
	II	II-1								2.054
				II-2		0.961
		平均							1.507
				III						0.066
	MCS多糖(MCS)	组分	I						I-1		0.053
				I-2		0.026
							平均		0.039
				II	II-I					0.047
			II-2				0.017
					平均			0.032
			III				0.066
						多糖(纯化)MCSC		纯化MCSP II-1			柱层析	40.8
	纯化MCSP III			柱层析	34.76

羊肚菌多糖特性和鉴定分析。

1.特性

物理性质：MCSP羊肚菌糖蛋白、MCS羊肚菌多糖、MCSC羊肚菌多糖(纯化)均为灰白色粉末，较难溶于冷水，易溶于热水、生理盐水、稀酸、稀碱溶液，易被高浓度醇和酮等有机溶剂析出。

化学定性反应：MCSP羊肚菌糖蛋白、MCS羊肚菌多糖、MCSC羊肚菌多糖(纯化)与硫酸蒽酮液和硫酸苯酚液均呈阳性反应。

2.鉴别

纯度：羊肚菌菌丝体多糖经水浸提、乙醇沉淀、透析、冷干等工艺程序，获得多糖MCSP，纯度为98.276～58.186％，经层析柱纯化后纯度为67.664～73.964％；MCS纯度为95.621～64.804％。

3.构型分析：

醋酸纤维膜电泳检测

所分离的羊肚菌多糖MCSP、MCS脱去游离蛋白质和纯化羊肚菌多糖MCSC(Sephadex G100层析柱纯化)三种多糖类物质的醋酸纤维膜电泳图谱基本一致，可以说明三种物质构型较一致。

紫外光谱检测：经紫外光谱检测的MCS、MCSP的吸收峰均为280nm。

液相色谱测定糖和蛋白质含量：MCSP中多糖含量平均为73.496，蛋白质含量平均为2.846；MCS中多糖含量平均为75.99％，蛋白质含量平均为2.51％；MCSC中多糖含量为67.664～73.964g/100g。

相对分离量测定：经液相色谱和凝胶色谱测定羊肚菌多糖MCSP平均相对分离量组分19～50万。

MCSP样品经加酸水解后用氨基酸分析仪测定，检测结果见下表：

	名称	指标(mg/100ml)
			1	天门冬氨酸Asp	0.181
2	苏氨酸Thr	0.412
			3	丝氨酸Ser	0.40
4	谷氨酸Glu	0.234
			5	甘氨酸Gly	0.159
6	丙氨酸Ala	0.358
			7	结氨酸Val	0.179
8	蛋氨酸Met	0.007
			9	异亮氨酸ile	0.094
10	亮氨酸Leu	0.079
			11	酪氨酸Tyr	0.034
12	苯丙氨酸Phe	0.050
			13	组氨酸His	0.039
14	赖氨酸Lys	0.065
			15	精氨酸Arg	0.033
16	r-ABA(r-氨基丁)	0.009
			17	氨NH3	0.102
总含量	16种氨基酸	2435mg/100mg

本发明分离提纯的羊肚菌多糖MCSP、MCS、MCSC三种物质，经紫外光谱检测含有蛋白质，红外光谱测出均含有多糖和蛋白质，醋酸纤维膜电泳测定三种多糖构型较为一致，均为多糖和蛋白质复合物，多糖含量平均为73.496-75.99％，蛋白质含量平均为2.51-2.846％。经层析柱纯化多糖MCSC多糖含量为67.664-73.964g/100g。MCSP与MCS比较，前者多糖含量较后者少，而蛋白质含量稍高。多糖由葡萄糖、甘露糖、果糖、海藻糖组成；构型为杂多糖；蛋白质由16种氨基酸组成。

羊肚菌多糖(MCSP、MCS、MCSC)生物活性试验结果和分析

1.免疫调节作用：具有明显的免疫增强作用。

从免疫调节作用测试结果(见下表)得出多糖MCSP(超滤膜分子量1-10万)的淋巴细胞增殖率或抑制率最高为56.3％，其次为多糖MCSP(超滤膜分子量10万以上)柱层析为MCSP44.2％，其他依次排列为多糖MCSP(超滤膜分离量5万以上)为40.4％，多糖MCS(超滤膜分离量5万以上)为39.8％，多糖柱层析为38.4％。MCSP、MCS、MCSC批次免疫调节活性检测均显一定药理活性。

羊肚菌多糖免疫调节作用测试结果

小鼠淋巴细胞增殖率或抑制率％	项目					增强	抑制
								多糖(MCSP)	组分	I	I			40.4
	I		27.3	34.4
					II	柱层析纯化-1-2					44.2
	新技术所纯化-1		36.2
						II				33.2
	II		8.6	4.5
						III	最高			64.1
	MCSC		III	柱层析纯化	38.4							III-2
						38.4	III-5
					新技术				6.7	所纯化	2.2
				多糖(MCS)		组分	I	I				24.3
	I		39.8		23.4
								II	II		26.4	3.6
	II		28.2
							III			40.9

2.羊肚菌多糖具有免疫增强和抑制作用的双向调节作用

由上表得出羊肚菌多糖除具有较明显的免疫增强作用以外，在MCSP、MCSP和MCS组分具有明显的免疫抑制作用，说明本品具有免疫双向调节作用。

3.脱去游离蛋白质对羊肚菌多糖免疫调节作用的影响

经脱蛋白处理后的羊肚菌多糖与相应的未脱蛋白的组分相比，大粪自量组分的免疫增强和抑制作用稍有提高，小分子量组分的免疫增强有所降低。

4.免疫调节作用与分子量的关系

免疫调节作用以MCSP最显著，初步说明小分子量羊肚菌多糖免疫增强作用较好，而大分子量羊肚菌多糖免疫抑制作用较好。

5.免疫调节作用与分离纯度的关系

从柱纯化与未经纯化的样品相比，二者免疫活性作用无明显区别。

羊肚菌多糖抗肿瘤药效试验结果

1.羊肚菌多糖(MCSP)对肝癌H22经口服或腹腔注射给药均有明显抑瘤作用。口服给药25mg/kg组的瘤重抑制率为31.9％～37.6％，50mg/kg组为31.7～36.2％。腹腔注射给药10mg/kg组的瘤重抑制率为31.0～34.6％，20mg/kg组为36.7～40.8％，羊肚菌糖蛋白按同样方法经腹腔注射给药抑制率为35.8～37.8％，亦有明显抑瘤作用。

2.羊肚菌多糖MCSP对大白鼠瓦克癌W²⁵⁶抑瘤试验结果表明，经口服和腹腔注射给药均有明显作用，口服给药25mg/kg组的瘤重抑制率为13.2～30.1％，50mg/kg组为36.3～39.6％，腹腔注射给药10mg/kg组的瘤重抑制率为25.8～35.8％，20mg/kg组的为35.6～39.4％，可以看出口服和腹腔给药效果相差不大，两种瘤种的抑制率区别不大，与分子量大小关系也不明显。

3.羊肚菌多糖MCSP的受体结合实验结果得出MCSP抑制率为51.35％，多糖MCS的抑制率为52.97％，说明本品有抑制体内5-胫色胺、多巴胺2及其受体的相互作用，进而影响相关的生理和病理作用，初步说明MCSP、MCS与精神、神经和心血管方面的作用有关。

4.肥大细胞脱颗粒试验(抗过敏)，MCSPII-1脱颗粒抑制率为61.9％，MCSPIII脱颗粒抑制率为43.7％，具有抗过敏作用。

5.毒性试验-羊肚菌多糖(MCS、MCSP混合型)小鼠口服最大耐受量(MTD)测定。羊肚菌多糖毒性较低，一次灌胃给药测不出LD₅₀，故测定一日内两次给药的口服最大耐受量，得出最大耐受量为20mg/kg。

本发明羊肚菌多糖经鉴定为多糖和蛋白质复合物，是一种新的大分子物质，其生理活性作用优于多糖。羊肚菌多糖3组分MCSP、MCS、MCSC经生物试验检测结果，均具有免疫调节作用，抑制肿瘤，抗过敏，调节心血管功能等多种生物活性作用。本发明得出的制品纯度较高，分离提纯工艺、设备简单，提取率高，成本费用低。经过纯化和未经纯化的制品活性作用都较明显。是一种生产开发前景较好的产品。另外经超滤处理的透过液中含有小分子糖类及其他可溶性物质，可作为添加剂综合利用。

本发明通过完善菌丝体生物发酵技术、水溶性提取分离、超滤分离浓缩、提纯等技术对该珍稀菌种多糖类物质进行研究开发并制成产品，为开发药用真菌多糖类制品增添了新品种。

Claims (9)

1.一种液体深层发酵制备羊肚菌的方法及其产品，其特征在于，制备羊肚菌的方法为：选用食、药用菌羊肚菌Morchella sp为菌种(编号EF-11)，用4％的大麦、2％葡萄糖为培养液，在摇床震荡40C～500次/分钟，培养72～96小时为菌种液；选10％大麦芽、5％大豆为发酵基质，在发酵基质中强化无机锌，添加硫酸锌0.9～1.2％，强化无机硒，添加亚酸纳0.6～0.9％，通气培养48～72小时，通过生物发酵期，得到发酵羊肚菌；发酵终止指标PH值为4.0～5.3，折光糖度为3.0～3.5，菌丝体得率为0.6％～0.8％(干重)；将菌丝体用水提取，浸提比1∶2，浸提温度85℃，浸提时间3小时，得到羊肚菌提取液；对羊肚菌提取液和发酵液的混合液采用反渗透膜浓缩法或真空浓缩法达到浓缩4倍及折光糖度11.5％；

羊肚菌系列制品—羊肚菌营养液工艺流程，菌丝体浸提工艺参数∶浸提比1∶2(W/V)，温度90～95℃，时间3小时；采用反渗透膜浓缩或真空浓缩方法处理发酵液；发酵液PH值6～7，折光糖度3％左右，液体透明清凉无混浊现象，膜设备操压力40kg/cm²，在室温下浓缩操作；

羊肚菌系列制品—羊肚菌多糖MCSP(羊肚菌糖蛋白)、MCS(羊肚菌多糖)、MCSC(羊肚菌多糖‘纯化’)的分离提纯工艺流程，发酵：20～25℃、72～96小时；菌丝体浸提：90～95℃水提、3小时、浸提3次；乙醇沉淀：95％，乙醇1∶3(V∶V)，透析：流动水24小时，冷冻干燥：温度-55℃、压力8.0×10^-1～2.2×10^-2mbar，时间42～45小时。羊肚菌多糖MCSP提取率为5.69～5.7g/10L(菌丝体浸提液混合液)，MCS平均0.45g/10L混合液。

2.根据权利要求1所述的液体深层发酵制备羊肚菌的方法及其产品，其特征在于，经过强化微量元素，且经生物发酵作用后，无机元素转换为具有生物活性作用的有机锌和有机硒。

3.根据权利要求1、2所述的液体深层发酵制备羊肚菌的方法及其产品，其特征在于，所说的羊肚菌营养液含有菌多糖；有机锌；有机硒；有机锗；核糖核酸等生物活性成分，具有营养保健作用。

4.根据权利要求1～3所述的液体深层发酵制备羊肚菌的方法及其产品，其特征在于，所说的羊肚菌多糖分离提纯方法用Sephadex G 100层析柱纯化的多糖MCSP11，在紫外分光光度仪320nm下测吸光度，收集A值一致的液体，用流动水透析后冷冻干燥。

5.根据权利要求1～4所述的液体深层发酵制备羊肚菌的方法及其产品，其特征在于，用醋酸纤维膜电泳测定羊肚菌多糖3种构型较为一致，为杂多糖结构；经液相色谱和凝胶色谱测定羊肚菌多糖MCSP平均相对分子量组分I为19万，组分II为50万，组分III为10万。

6.根据权利要求1～5所述的液体深层发酵制备羊肚菌的方法及其产品，其特征在于，混合液浓缩方法首先用反渗透膜浓缩至折光糖度15％，再经超滤分离浓缩，按浓缩液3倍量(W∶V)加入95％乙醇，用高速离心机分离多糖沉淀物。

7.根据权利要求1～6所述的液体深层发酵制备羊肚菌的方法及其产品，其特征在于，将分离的多糖在低温冷冻干机内冷冻干燥，温度不超过-50度℃，压力8.0×10^-～2.2×10^-mbar。

8.根据权利要求1～7所述的液体深层发酵制备羊肚菌的方法及其产品，其特征在于，羊肚菌多糖脱去游离蛋白质的方法，是将多糖分离物制成6％糖液，等量加入(V∶V)5％三氯醋酸溶液，分离蛋白5次后，再用氯仿正丁醇溶液脱蛋白5次后，分离出多糖液。

9.根据权利要求1～8所述的液体深层发酵制备羊肚菌的方法及其产品，其特征在于，羊肚菌多糖经红外光谱检测该多糖为多糖和蛋白质复合物，其中多糖含量为64.026～95.621％，蛋白质含量为1.09％～3.32％，多糖由葡萄糖，甘露糖，果糖和海藻糖组成；蛋白质由天冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，甘氨酸，丙氨酸，蛋氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯病氨酸，赖氨酸，组氨酸，精氨酸，r-氨基丁酸，颉氨酸16种氨基酸组成。

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