CN106609247B - 一种羊肚菌的深层发酵培养方法 - Google Patents

一种羊肚菌的深层发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种羊肚菌的深层发酵培养方法。该方法改进了发酵罐搅拌器并在合适的时机补料，不仅保证了菌体的完好形态、增加了菌丝体的产量，而且实现了商业规模化生产的应用。

Description

一种羊肚菌的深层发酵培养方法
技术领域
本发明属于生物发酵领域，特别涉及一种羊肚菌的深层发酵培养方法。
背景技术
羊肚菌(Morchella)，又名羊肚菜，营养相当丰富，含多种人体必需的氨基酸、维生素、矿物质等，并且味道鲜美，是一种优良的食用菌。此外，羊肚菌还含有丰富的抑制肿瘤的多糖及抗氧化作用的硒，羊肚菌甘寒无毒、有益肠胃，具有化痰理气、增强免疫力等功效，因此，羊肚菌也是一种珍贵的药用菌。目前市场上的羊肚菌大多来自野生，但由于过度采摘，野生的羊肚菌生长数量越来越少；而羊肚菌的人工栽培成本高、技术难且产量不稳定，尚不能实现商业化和规模化。研究表明，在羊肚菌原生境，采用人工菌种的配套的技术措施，能够有效提高羊肚菌的单位产量。
目前国内外的原生境促繁技术主要集中在固体培养技术和液体培养技术。相对于固体培养技术，液体发酵技术具有菌丝体生长良好，培养基利用充分等优点。但现有的液体发酵技术获得的菌丝体单位产量较低(小于1.0％)，仍未达到大规模商业化生产需求，另外由于菌体贴壁生长习性及营养失衡等原因，获得的菌球形态不完整、大小不均匀，严重影响羊肚菌的效用。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术的缺陷从而提供一种能够大规模工业化生产并有效降低成本的深层发酵培养方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种羊肚菌的深层发酵培养方法，包括如下步骤：
(1)本发明所使用的菌株为从四川省广元市青川县青溪镇人工种植分离得到的羊肚菌(Mochella esculenta)Y-3#菌株。将羊肚菌Y-3#的菌丝体接种到试管斜面培养基上，于20～25℃培养5～7天，获得斜面菌种。
(2)将步骤(1)的斜面菌种接种至装有液体培养基的摇瓶中，于20～25℃培养5～7天，获得一级液体菌种；
(3)将步骤(2)获得的一级液体菌种接种至装有液体培养基的15-300L发酵罐中，搅拌器以轴向的搅拌方式不停搅拌；其中，培养温度为20～25℃，通气比值为0.5～1.5，罐压为0.03～0.07Mpa，发酵罐的装液体积比为50～70％，接种体积比为5～10％；
(4)在步骤(3)的基础上，培养90～100h时，以恒定速率同时流加补入碳源溶液和氮源溶液，连续补料至培养结束，培养至144～162h结束；
(5)将步骤(4)得到的液体菌丝体经纱布过滤、清水洗涤和甩干后，置于烘箱中烘干，至质量不再变化时，即可得到羊肚菌的干菌丝体；
其中，步骤(1)所述的所述的斜面培养基为PDA培养基，其配方为(按质量百分比计)：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％，其余为水；
步骤(2)所述的液体培养基配方为(按质量百分比计)：葡萄糖2.5-3.5％、酵母提取物0.5-1.5％、蛋白胨0.5-1.5％，其余为水；
步骤(3)中所述的液体培养基配方为：碳源30～40g/L、氮源15～20g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、七水硫酸镁1.0～2.0g/L、消泡剂0.5～1.0g/L，其余为水。
一些实施例中，本发明所述的方法中，步骤(3)中所述的液体培养基中的碳源，包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和可溶性淀粉的一种或两种。
一些实施例中，本发明所述的方法中，步骤(3)中所述的液体培养基中的氮源包括酵母粉、蛋白胨、黄豆粉和玉米干粉的一种或两种。
一些实施例中，本发明所述的方法中，步骤(3)中所采用的搅拌器为三层轴向流搅拌器，包括KSX型、A315型及MaxFlo型的一种或者两种。
一些实施例中，本发明所述的方法中，步骤(3)中所采用的搅拌器转速为200～400r/min。
一些实施例中，本发明所述的方法中，步骤(4)中所流加补入的碳源溶液质量浓度为30％，包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉的一种或两种。
一些实施例中，本发明所述的方法中，步骤(4)中所流加补入的氮源溶液的质量浓度为20％，包括酵母粉、蛋白胨、黄豆粉和玉米干粉的一种或两种。
一些实施例中，本发明所述的方法中，步骤(4)开始补加碳源和氮源的时间为90～100h。
一些实施例中，本发明所述的方法中，步骤(4)碳源和氮源的流加补入速率为1.0～2.0g/L/h。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)通过采用流加补料的培养工艺大幅度提高了羊肚菌菌丝体的单位产量，达3.7％以上。
(2)通过改进发酵罐搅拌器(将径向流搅拌器改为宽叶轴向流搅拌器)，显著改善了羊肚菌菌丝体下沉与贴壁生长的现象，不仅利于菌丝体生长，还保证了菌体的完好形态，菌球更加完整、均匀。
(3)该工艺已成功应用于300L规模深层发酵培养，能够满足大规模商业化生产需求。
(4)通过该培养工艺获得的菌丝体含有与野生羊肚菌效用相同的有效成分，并且各有效成分含量也与野生羊肚菌相近，其中，氨基氮(主要是氨基酸和蛋白质)含量高于50％，腺苷含量在1％左右，多糖含量高于5％。说明通过该培养方法获得的菌丝体具有与野生羊肚菌相同的营养价值和效用。
附图说明
图1为发酵罐宽叶轴向流搅拌器类型。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不受下述实施例的限定。
实施例1
(1)将羊肚菌Y-3#的菌丝体接种到试管斜面培养基上，于20℃培养5天，获得斜面菌种。所述的斜面培养基为PDA培养基，其配方为(按质量百分比计)：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％，其余为水。
(2)将步骤(1)的斜面菌种接种至装有液体培养基的摇瓶中，于20℃培养5天，获得一级液体菌种；所述的液体培养基配方为(按质量百分比计)：葡萄糖2.5％、酵母提取物1.5％、蛋白胨0.5％，其余为水。
(3)将步骤(2)获得的一级液体菌种接种至装有液体培养基的50L发酵罐中，发酵罐的三层搅拌器类型均为KSX型，发酵罐的装液量为70％，接种量为5％，所述的百分数均为体积比，培养温度为20℃，通气比值为0.5，搅拌转速为200r/min，罐压为0.05Mpa。所述的液体培养基配方为：葡萄糖30g/L、酵母粉20g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁2.0g/L、消泡剂1.0g/L，其余为水。
(4)培养至90h时，以2.0g/L/h的速率同时流加补入葡萄糖溶液(质量浓度为30％)和酵母粉溶液(质量浓度为20％)，连续补料至144h培养结束。
(5)将步骤(4)得到的液体菌丝体经纱布过滤、清水洗涤和甩干后，置于烘箱中烘干，至质量不再变化时，即可得到羊肚菌的干菌丝体。
对干菌丝体进行称重和成分分析后可得到四种参数：干重(％)、腺苷含量(％)、多糖含量(％)和氨基氮含量(主要为氨基酸和蛋白质量，％)，其结果见表1。
实施例2
(1)将羊肚菌Y-3#的菌丝体接种到试管斜面培养基上，于22℃培养6天，获得斜面菌种。所述的斜面培养基为PDA培养基，其配方为(按质量百分比计)：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％，其余为水。
(2)将步骤(1)的斜面菌种接种至装有液体培养基的摇瓶中，于22℃培养6天，获得一级液体菌种；所述的液体培养基配方为(按质量百分比计)：葡萄糖3.5％、酵母提取物0.5％、蛋白胨1.5％，其余为水。
(3)将步骤(2)获得的一级液体菌种接种至装有液体培养基的15L发酵罐中，发酵罐的三层搅拌器类型下层和中层均为KSX型、上层为A315型，发酵罐的装液量为50％，接种量为8％，所述的百分数均为体积比，培养温度为22℃，通气比值为1.0，搅拌转速为300r/min，罐压为0.07Mpa。所述的液体培养基配方为：蔗糖35g/L、酵母粉7.5g/L、黄豆粉7.5g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、七水硫酸镁1.5g/L、消泡剂0.5g/L，其余为水。
(4)培养至95h时，以1.5g/L/h的速率同时流加补入蔗糖溶液(质量浓度为30％)和酵母粉-黄豆粉混合溶液(酵母粉和黄豆粉各含10％)，连续补料至150h培养结束。
(5)将步骤(4)得到的液体菌丝体经纱布过滤、清水洗涤和甩干后，置于烘箱中烘干，至质量不再变化时，即可得到羊肚菌的干菌丝体。
对干菌丝体进行称重和成分分析后可得到四种参数：干重(％)、腺苷含量(％)、多糖含量(％)和氨基氮含量(主要为氨基酸和蛋白质量，％)，其结果见表1。
实施例3
(1)将羊肚菌Y-3#的菌丝体接种到试管斜面培养基上，于20℃培养7天，获得斜面菌种。所述的斜面培养基为PDA培养基，其配方为(按质量百分比计)：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％，其余为水。
(2)将步骤(1)的斜面菌种接种至装有液体培养基的摇瓶中，于20℃培养7天，获得一级液体菌种；所述的液体培养基配方为(按质量百分比计)：葡萄糖3.0％、酵母提取物1.0％、蛋白胨1.0％，其余为水。
(3)将步骤(2)获得的一级液体菌种接种至装有液体培养基的300L发酵罐中，发酵罐的三层搅拌器类型均为MaxFlo型，发酵罐的装液量为60％，接种量为8％，所述的百分数均为体积比，培养温度为20℃，通气比值为1.5，搅拌转速为400r/min，罐压为0.05Mpa。所述的液体培养基配方为：麦芽糖40g/L、蛋白胨9.0g/L、玉米干粉9.0g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、七水硫酸镁2.0g/L、消泡剂0.5g/L，其余为水。
(4)培养至100h时，以1.0g/L/h的速率同时流加补入麦芽糖溶液(质量浓度为30％)和蛋白胨-玉米干粉混合溶液(蛋白胨和玉米干粉各含10％)，连续补料至156h培养结束。
(5)将步骤(4)得到的液体菌丝体经纱布过滤、清水洗涤和甩干后，置于烘箱中烘干，至质量不再变化时，即可得到羊肚菌的干菌丝体。
对干菌丝体进行称重和成分分析后可得到四种参数：干重(％)、腺苷含量(％)、多糖含量(％)和氨基氮含量(主要为氨基酸和蛋白质量，％)，其结果见表1。
实施例4
(1)将羊肚菌Y-3#的菌丝体接种到试管斜面培养基上，于25℃培养6天，获得斜面菌种。所述的斜面培养基为PDA培养基，其配方为(按质量百分比计)：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％，其余为水。
(2)将步骤(1)的斜面菌种接种至装有液体培养基的摇瓶中，于25℃培养6天，获得一级液体菌种；所述的液体培养基配方为(按质量百分比计)：葡萄糖2.5％、酵母提取物1.0％、蛋白胨0.5％，其余为水。
(3)将步骤(2)获得的一级液体菌种接种至装有液体培养基的15L发酵罐中，发酵罐的三层搅拌器类型分别为：下层和中层均为A315型、上层为MaxFlo型，发酵罐的装液量为50％，接种量为10％，所述的百分数均为体积比，培养温度为25℃，通气比值为1.0，搅拌转速为400r/min，罐压为0.03Mpa。所述的液体培养基配方为：可溶性淀粉35g/L、黄豆粉18g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁1.0g/L、消泡剂1.5g/L，其余为水。
(4)培养至95h时，以1.5g/L/h的速率同时流加补入可溶性淀粉溶液(质量浓度为30％)和黄豆粉溶液(质量浓度为20％)，连续补料至156h培养结束。
(5)将步骤(4)得到的液体菌丝体经纱布过滤、清水洗涤和甩干后，置于烘箱中烘干，至质量不再变化时，即可得到羊肚菌的干菌丝体。
对干菌丝体进行称重和成分分析后可得到四种参数：干重(％)、腺苷含量(％)、多糖含量(％)和氨基氮含量(主要为氨基酸和蛋白质量，％)，其结果见表1。
实施例5
(1)将羊肚菌Y-3#的菌丝体接种到试管斜面培养基上，于22℃培养5天，获得斜面菌种。所述的斜面培养基为PDA培养基，其配方为(按质量百分比计)：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％，其余为水。
(2)将步骤(1)的斜面菌种接种至装有液体培养基的摇瓶中，于22℃培养5天，获得一级液体菌种；所述的液体培养基配方为(按质量百分比计)：葡萄糖3.0％、酵母提取物0.5％、蛋白胨1.5％，其余为水。
(3)将步骤(2)获得的一级液体菌种接种至装有液体培养基的300L发酵罐中，发酵罐的三层搅拌器类型分别为：下层和中层均为KSX型、上层为MaxFlo型，发酵罐的装液量为60％，接种量为5％，所述的百分数均为体积比，培养温度为22℃，通气比值为0.5，搅拌转速为300r/min，罐压为0.03Mpa。所述的液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、麦芽糖20g/L、蛋白胨15g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、七水硫酸镁1.5g/L、消泡剂1.5g/L，其余为水。
(4)培养至90h时，以2.0g/L/h的速率同时流加补入葡萄糖-麦芽糖混合溶液(葡萄糖和麦芽糖各含15％)和蛋白胨溶液(质量浓度为20％)，连续补料至162h培养结束。
(5)将步骤(4)得到的液体菌丝体经纱布过滤、清水洗涤和甩干后，置于烘箱中烘干，至质量不再变化时，即可得到羊肚菌的干菌丝体。
对干菌丝体进行称重和成分分析后可得到四种参数：干重(％)、腺苷含量(％)、多糖含量(％)和氨基氮含量(主要为氨基酸和蛋白质量，％)，其结果见表1。
实施例6
(1)将羊肚菌Y-3#的菌丝体接种到试管斜面培养基上，于25℃培养7天，获得斜面菌种。所述的斜面培养基为PDA培养基，其配方为(按质量百分比计)：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％，其余为水。
(2)将步骤(1)的斜面菌种接种至装有液体培养基的摇瓶中，于25℃培养7天，获得一级液体菌种；所述的液体培养基配方为(按质量百分比计)：葡萄糖3.5％、酵母提取物1.5％、蛋白胨1.0％，其余为水。
(3)将步骤(2)获得的一级液体菌种接种至装有液体培养基的50L发酵罐中，发酵罐的三层搅拌器类型均为A315型，发酵罐的装液量为70％，接种量为10％，所述的百分数均为体积比，培养温度为25℃，通气比值为1.5，搅拌转速为200r/min，罐压为0.07Mpa。所述的液体培养基配方为：蔗糖15g/L、可溶性淀粉15g/L、玉米干粉20g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、七水硫酸镁1.0g/L、消泡剂1.0g/L，其余为水。
(4)培养至100h时，以1.0g/L/h的速率同时流加补入蔗糖-可溶性淀粉混合溶液(蔗糖和可溶性淀粉各含15％)和玉米干粉溶液(质量浓度为20％)，连续补料至156h培养结束。
(5)将步骤(4)得到的液体菌丝体经纱布过滤、清水洗涤和甩干后，置于烘箱中烘干，至质量不再变化时，即可得到羊肚菌的干菌丝体。
对干菌丝体进行称重和成分分析后可得到四种参数：干重(％)、腺苷含量(％)、多糖含量(％)和氨基氮含量(主要为氨基酸和蛋白质量，％)，其结果见表1。
表1各实施例所得干菌丝体参数对比

Claims (3)

1.一种羊肚菌的深层发酵培养方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将羊肚菌的菌丝体接种到试管斜面培养基上，于20~25℃培养5~7天，获得斜面菌种；
（2）将步骤（1）的斜面菌种接种至装有液体培养基的摇瓶中，于20~25℃培养5~7天，获得一级液体菌种；
（3）将步骤（2）获得的一级液体菌种接种至装有液体培养基的15~300 L发酵罐中，搅拌器以轴向的搅拌方式不停搅拌；其中，培养温度为20~25℃，通气比值为0.5~1.5，罐压为0.03~0.07 Mpa，发酵罐的装液体积比为50~70%，接种体积比为5~10%；
（4）在步骤（3）的基础上，培养90~100h时以恒定速率同时流加补入碳源溶液和氮源溶液，连续补料至培养结束，培养至144～162h结束；
（5）将步骤（4）得到的液体菌丝体经纱布过滤、清水洗涤和甩干后，置于烘箱中烘干，至质量不再变化时，即可得到羊肚菌的干菌丝体；
其中，步骤（1）所述的斜面培养基为PDA培养基，其配方按质量百分比计为：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%，其余为水；
步骤（2）所述的液体培养基配方按质量百分比计为：葡萄糖2.5-3.5%、酵母提取物0.5-1.5%、蛋白胨0.5-1.5%，其余为水；
步骤（3）中所采用的搅拌器为三层轴向流搅拌器，所述搅拌器为KSX型、A315型、MaxFlo型中的一种或者两种，所述搅拌器的转速为200~400 r/min；
步骤（3）中所述的液体培养基配方为：碳源30～40 g/L、氮源15～20 g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5 g/L、七水硫酸镁1.0～2.0 g/L、消泡剂0.5~1.0 g/L，其余为水；
步骤（4）中所流加补入的碳源溶液质量浓度为30%，包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉的一种或两种；所流加补入的氮源溶液的质量浓度为20%，包括酵母粉、蛋白胨、黄豆粉和玉米干粉的一种或两种；所述碳源和氮源的流加补入速率为1.0~2.0 g/L/h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的液体培养基中的碳源为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和可溶性淀粉中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的液体培养基中的氮源为酵母粉、蛋白胨、黄豆粉和玉米干粉中的一种或两种。
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