CN103555559A - 从骨髓或脐带血回收的干细胞和祖细胞组合物；用于制备其的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明包括从骨髓或脐带血回收的干细胞和祖细胞组合物，其包含大多数活的CD34+细胞以及基本上消耗的位于原始样品中的红细胞，无需任何异生素添加剂以帮助细胞分离。本发明还包括用于制备组合物的系统和方法。该系统包括袋组和处理设备，所述处理设备利用光学传感器、微控制器、伺服电动机、加速计、测压仪和电池。该系统和方法利用离心，以使细胞分为数层并且随后将干细胞分离且转移到干细胞袋内。处理设备的微控制器接受来自设备的加速计、测压仪和光学传感器的输入，以指导袋组中的计量阀打开且关闭，以允许转移尽可能多的干细胞与尽可能少的红细胞。

Description

从骨髓或脐带血回收的干细胞和祖细胞组合物;用于制备其的系统和方法

本申请为申请号为200780053147.5的分案申请，要求2007年3月28日的优先权。 

与相关申请的交叉参考

根据35U.S.C.§120，本申请是于2002年4月8日提交的共同未决的美国专利申请系列号10/118,291的部分继续申请，并且要求其优先权，所述美国专利申请的完整公开内容引入本文作为参考。根据35U.S.C.§120，本申请还是于2007年3月28日提交的共同未决的美国专利申请系列号11/664,212的部分继续申请，并且要求其优先权，所述美国专利申请是来自于2005年8月16日提交的国际申请系列号PCT/US2005/029288的35U.S.C.§371国家阶段申请，并且要求其优先权，所述国际申请指定美国并根据PCTArticle21（2）于2006年4月13日作为国际申请号WO2006/038993A2以英文公开，并且其依次要求于2004年9月30日提交的美国专利申请系列号10/957,095的优先权，所述美国专利申请于2007年5月1日作为美国专利号7,211,191授权，所述专利的所有公开内容整体引入本文作为参考。 

发明背景

1.发明领域

总的来说，本发明涉及用于从人骨髓或脐带血回收特定细胞群体的方法和装置。具体地，本发明包括用于高效回收（分离且分开）位于骨髓或脐带血中的干细胞和祖细胞，并且取出过量红细胞、嗜中性粒细胞、血小板和血浆的系统和方法，无需借助于通常用于改善干细胞回收效率的异生素添加剂。该系统包括无菌、功能上封闭的袋组（bag set）以及设计为在离心场中操作的微处理器控制的电机械和光学设备，所述设备基于其大小和密度使细胞群体分开，并且随后将这些干细胞和祖细胞以预定最终体积转移至干细胞袋。本发明还包括由人骨髓或脐带血制备的干细胞和祖细胞组合物，其可用于立即使用或 用于贮存和随后使用。 

2.相关技术描述

为了本说明书和权利要求的目的，使用下述定义： 

“自体使用”意指人细胞或组织植入、移植、输注或转移回细胞或组织从其回收的个体内。 

“类晶体”意指用于电解质替换或增加血管内体积的等渗盐和/或葡萄糖溶液，例如盐水溶液、林格氏（Ringer's）乳酸盐溶液或5％葡萄糖水溶液。 

“造血干细胞”是产生许多类型的血细胞包括红细胞（RBCs）、白血球、白细胞（WBCs）和血小板的多能干细胞。 

“白血球”或白细胞是造血谱系中的细胞，其主要包括单核细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞，并且表达细胞表面抗原CD45（CD45+细胞）。 

“淋巴细胞”是如通过Sysmex XE-2100测量的淋巴样谱系细胞，其可以包括成熟淋巴细胞（T细胞、B细胞、NK细胞）以及发育中的淋巴细胞例如淋巴母细胞。 

“最低限度处理的骨髓或脐带血”意指用于干细胞和祖细胞的抗凝（例如用肝素或柠檬酸盐）骨髓或脐带血处理，其不包括添加化学物质（除水，类晶体，或灭菌、防腐或贮存试剂外），并且不改变细胞或组织的相关生物特征。 

“单核细胞”是如通过Sysmex XE-2100测量的髓样谱系细胞，其可以包括成熟单核细胞和发育中的单核细胞例如成单核细胞。 

“单核的细胞”（MNC）是造血谱系中的细胞，其包括单核细胞和淋巴细胞。 

“嗜中性粒细胞”是如通过Sysmex XE-2100测量的髓样谱系细胞，其可以包括多形核嗜中性粒细胞和发育中的嗜中性粒细胞，例如带形、晚幼粒细胞、中幼粒细胞和成粒细胞。 

“血小板”是如通过Sysmex XE-2100测量的巨核细胞系细胞，其可以包括成熟血小板（凝血细胞）。 

“祖细胞”是通过一系列细胞分裂产生不同细胞谱系的干细胞直接后代。 

“红细胞”如通过Sysmex XE-2100测量的红细胞系细胞，其包括成熟RBC而不是具核红细胞。 

“干细胞”是具有3种一般性质的多能细胞：（1）它们能够长期分裂且更新其自身；（2）它们是非特化的；和（3）它们可以产生不同的特化细胞类型。关于干细胞的细胞表面抗原标记是CD34抗原，升高的胞内酶醛脱氢酶（ALDH）浓度也是这样。 

“斯托克斯定律（Stoke’sLaw）”是描述颗粒在重力加速度过程中在粘性液体中的沉降速度的数学公式（V_g=d²（P1-P2）/18μxG），其中： 

·V_g=沉降速度， 

·d=颗粒直径， 

·P1=颗粒密度， 

·P2=液体密度， 

·G=重力加速度，和 

·μ=液体粘度。 

“Sysmex XE-2100”是由Sysmex Corp，Kobe，Japan制造的自动化血液学细胞分析仪，其通过流式细胞术区分且定量造血细胞，发射半导体激光束，并且检测3种光信号：向前散射、侧向散射和侧向荧光。 

“总具核细胞”（TNC）是WBCs和具核RBCs。 

“异生素添加剂”和“异生素试剂”意指并非人体的天然组分的化学物质，其有意加入收集的骨髓或脐带血中用于达到细胞分离过程性能特征中的变化的目的，如果不添加其，所述变化将不发生。 

异生素添加剂的例子是： 

1.沉降试剂（例如，羟乙基淀粉、葡聚糖或明胶）； 

2.密度梯度介质（例如，

）；和 

3.用于细胞表面大分子细胞的亲和分子（例如单克隆抗体、与顺磁珠结合的单克隆抗体）。 

迄今，尽管干细胞的巨大临床潜力，但无干细胞治疗已收到FDA许可用于人使用。证实临床功效和安全性且获得干细胞治疗的管理许可的主要障碍是，用于从骨髓或脐带血分离干细胞群体的现有设备和方法具有一个或多个下述明显局限性：它们是冒微生物污染危险的开 放系统；它们是时间和劳动力密集的；它们需要添加不希望有且昂贵的异生素试剂；它们以平均40-75％的非常低效率回收干细胞；并且它们与用于组织再生的脐带血或骨髓量不相容。 

在干细胞治疗严重和频繁的人疾病的广泛使用可以发生前，所述疾病例如心肌梗死、缺血、糖尿病和皮肤伤口，必须克服3个关键障碍： 

1.临床试验必须证实干细胞治疗的功效和安全性； 

2.必须获得由健康管理机构，特别是食品药品监督管理局（FDA）细胞、组织和基因治疗办公室（Office of Cell，Tissue and Gene Therapy）（OCTGT）的管理许可；和 

3.必须开发用于从最低限度处理的骨髓或脐带血快速和简单回收活的干细胞和祖细胞的实用方法，其不依赖于使用异生素添加剂以取出过量血浆、红细胞和粒细胞。 

除造血干细胞外，目前已知骨髓和脐带血包含具有用于组织再生且增强伤口愈合的潜在治疗价值的其他类型干细胞和祖细胞。先前命名为骨髓基质细胞的间充质干细胞可以产生骨、软骨、脂肪、肌肉和结缔组织，并且是ALDH Br+。位于骨髓中的内皮祖细胞是从造血干细胞传下来的原始细胞，可以进入血流并且到达血管损伤区域以帮助修复损害，可以产生新血管，并且是CD34+。 

干细胞通过各种细胞表面标记进行鉴定，包括CD34+和醛脱氢酶亮细胞（ALDH Br+）。CD34+细胞是表达命名为CD34的抗原的干细胞，所述抗原可以通过使用对于那种特定抗原具有特异性的生色团缀合抗体进行检测。其他研究者基于其表达高水平的醛脱氢酶（ALDH）鉴定成体干细胞。一个公司Aldagen（Durham，NC）开发了利用基质的技术，所述基质通过产生强绿色荧光检测表达高水平ALDH的细胞。这些所谓的ALDH亮细胞（ALDH Br+）可以使用流式细胞术进行检测。ALDH Br+细胞包含不同祖先，其可以产生多种重要细胞系，包括神经和内皮细胞。 

干细胞的生存力可以通过几种方法加以证实，所述方法包括排斥活体染料例如锥虫蓝或7-氨基-放线菌素D（7-AAD）。使用商购可得的试剂盒，通过测量作为关于在骨髓或脐带血中的干细胞替代物的白细胞（CD45+细胞）的生存力常规评估干细胞的生存力。 

大量骨髓或脐带血是难处理的，特别是因为大量红细胞的存在（对于骨髓中的每个CD34+细胞存在约25,000个红细胞，并且对于脐带血中的每个CD34+细胞存在约180,000个红细胞）。这些过量红细胞使得难以使用干细胞和祖细胞，因为它们的存在从根本上稀释了在需要组织再生的伤口部位处的干细胞和祖细胞浓度，并且它们干扰用于干细胞的其他处理步骤，包括用于先体外后体内细胞扩增的培养，基因治疗、或细胞群体的亲和纯化。此外，此种大量红细胞的存在产生其他安全性问题，例如在同种异体移植中的ABO不相容性。在一些情况下，还可能希望使来自体积减少的干细胞浓缩物的嗜中性粒细胞降到最低，这是由于这些细胞与炎症反应的潜在关联，以及在其细胞质中存在可能影响生存力或可塑性或以其他方式改变干细胞功能性的生物学活性酶和细胞因子。 

在固定离心时间段后细胞的运动速率和最终位置随其大小和密度而变，其中它的运动根据斯托克斯定律进行限定。干细胞在其密度方面低于RBCs，并且在密度方面高于血小板，具有更接近于WBCs的那种的密度。因此，通过密度和大小回收干细胞的常规方法一般涉及通过离心使细胞群体分层，且然后在从离心机取出后，尝试从脐带血或骨髓的剩余部分中捕获干细胞。 

从骨髓或脐带血分离WBCs和干细胞的一种手工方法是将全部骨髓或脐带血插入离心机管内，并且使它们在1500-2000xg下在室温下旋转10-15分钟。这使骨髓或脐带血分离成上部血浆层、下部红细胞（RBC）层、和在RBC和血浆之间的界面处的薄WBCs和干细胞和祖细胞层。在分层完成后，一次性塑料转移移液管可以用于下至距离RBCs约1mm抽吸掉血浆（上层）。当取出血浆时，必须非常小心，以免搅乱必须通过相同的移液技术取出的WBC/干细胞和祖细胞层，同时尝试提防干细胞和祖细胞丢失到RBCs内或干细胞被RBCs过度污染。这种在试管中的手工方法的缺点是它是开放系统，这冒着骨髓单位的微生物污染危险；它是劳动力和时间密集的；WBC/干细胞和祖细胞层的红细胞污染量是高度可变的；并且干细胞的丢失是显著且可变的。重要的是避免微生物污染――关于这种方法的主要关注，因为它可以负面影响培养干细胞的能力或冒感染传播给干细胞受体身体的危险。 

从脐带血或骨髓回收WBC/干细胞和祖细胞群体的另一种方法利用细胞处理设备，例如CompomatG4设备（Fresenius KabiAG，Friedberg，德国）和COBE2991血细胞处理器（Blood Cell Processor）（COBE Laboratories，Lakewood，CO）。这种类型的方法的例子呈现于Tsubaki，等人“Concentration of Progenitor Cells Collected from Bone Marrow Fluid Using a Continuous Flow Cell Separator System”， ApheresisandDialysis5（1），46-48，2001中。对于干细胞收获的骨髓或脐带血量依赖于所提议的临床用途。对于组织再生或修复中基于细胞的治疗，一般收集50-150mL骨髓或脐带血。这些血库仪器需要大量骨髓或脐带血（超过200mL）以正确发挥作用，并且完全不适合于一般对于组织再生医学应用收集的低体积（小于200mL）。此外，这些机械化方法的细胞产物的最终体积（50-100mL）基本上大于优选的3-20mL最终体积，这提供对于临床用途合适的干细胞和祖细胞浓度。这些仪器还需要泵以将血液或骨髓从一个容器移动到另一个，并且这些泵可能潜在引起对于细胞的机械损害。 

用于骨髓或脐带血的体积减少和纯化的另一种方法利用梯度介质例如

或

以与骨髓或脐带血组合，并且在离心过程中，使其自身介入细胞群体之间，以减少在回收干细胞的尝试过程中细胞群体的混合。是中性、高分支、高质量、亲水的多糖。

（例如密度1.077）可以用于将血液或骨髓分离成其组分（红细胞、白细胞等）。

正常放置在管的底部，并且用盐水稀释的骨髓或脐带血随后在

上缓慢成层。在离心后，较重的RBCs（密度1.09-1.10）取代在管底部的

并且下述层从顶部到底部在柱中可见：（1）血浆和血小板；（2）单核的细胞（MNC）（密度1.06-1.07）；（3）

和（4）在底部以沉淀形式存在的红细胞和嗜中性粒细胞（密度1.08-1.09）。这种分离允许以MNCs与RBCs共混合的更少机会收获MNCs。一些红细胞俘获（红细胞和嗜中性粒细胞的存在）仍在MNC层中发生。 

用

处理骨髓或脐带血的明显缺点是在将加入骨髓或脐带血的步骤时它是开放系统，从而意味着微生物可以直接进入骨髓或脐带血内，并且从而增加微生物污染的危险。为了减少这种危险，必须使用生物学安全工作橱执行这个步骤，这可能不总是可得到的， 并且是为了可接受的性能必须连续维持且监控的实验室设备的昂贵部分。此外，是异生素，并且在细胞可以安全地施用于人体前必须通过洗涤取出。这个洗涤步骤需要时间和努力，并且进一步增加关于微生物污染和细胞丢失的可能性。干细胞的回收是低的且高度可变的，为20-70％。

用聚乙烯吡咯烷酮包被的胶态二氧化硅，是类似于

的具有其伴随缺点的另一种密度梯度介质。 

关于使用羟乙基淀粉（HES）沉降试剂分离骨髓白细胞的技术已由A.Montuoro等人，“A technique for isolation of bone marrow cells using hydroxyethyl starch（HES）sedimentation agent,”Haematologica76Suppl1：7-9，1991公开。HES在临床上用作血浆扩张剂并且特征在于它的分子量及其取代程度。一般以0.5-2％HES重量与骨髓或脐带血体积的终浓度的HES添加引起红细胞凝集，并且从而基于斯托克斯定律的原理改变其沉降速度。然而，HES是异生素，并且已与静脉内施用时一些患者中的不利事件相关。此外，HES的使用增加成本和对于细胞处理的另外复杂性。葡聚糖聚合物制剂和明胶溶液也已用于相同目的，并且具有与HES相同的缺点。 

最后，还已知可以通过使用免疫方法从骨髓或脐带血分离干细胞和祖细胞，所述免疫方法包括流式细胞术细胞分选（Beckton Dickinson或Coulter）和通过抗体包被的顺磁颗粒细胞分选例如Miltenyi CliniMacs或BaxterIsolex系统。对干细胞抗原例如CD34具有特异性的抗体用作这些分离技术的部分。这些方法具有需要昂贵的异生素试剂、设备和一次性处理用具，并且执行是费时的缺点。虽然最终产物是具有少的红细胞或白细胞污染的更纯的干细胞群体，但这个纯度水平代表相当大的产生的费用，并且可能不是达到预期细胞治疗效果所需要的。此外，抗体和珠对骨髓或脐带血的添加意味着产物在方法过程中不是“最低限度处理的”，因为这些试剂可能引起非故意的不利生物后果，例如干细胞不可逆的分化成谱系定型途径。 

由Minguell，等人“Preparative separation of nucleated cells from human bone marrow”，Experentia35：548-549，1978的研究比较了由于用葡聚糖、葡聚糖加

和血沉棕黄层法处理的体积减少、细胞回收和细胞生存力。该论文证实缺乏用于骨髓的理想制备方法，因为一些方法引起细胞生存力的丧失，并且全部具有68％或更 少淋巴样细胞（单核细胞和淋巴细胞或MNC）的相对低的细胞回收。为了达到所观察到的2.7：1红细胞（RBC）/具核细胞比，命名为血沉棕黄层法的无需沉降辅助的离心法具有低且高度可变的（36-68％）最初存在的这些细胞的淋巴样细胞回收范围。 

发明概述

需要用于从骨髓或脐带血制备干细胞组合物的系统和方法，其选择性回收高百分比的干细胞和非常低百分比的RBCs；快速，非劳动力密集，且易于以一致方式执行；可以在手术室中使用；在无菌、功能上封闭的系统中执行；不需要异生素添加剂；减少骨髓或脐带血样品的原始体积；能够处理一系列骨髓体积；并且允许用户预先选择最终产物的体积。还需要这样的干细胞组合物，其包括来自原始样品的高百分比干细胞且使那些干细胞维持在存活条件下，包含来自原始样品的非常低百分比的RBCs，不包括任何异生素添加剂，并且具有可以由用户选择的最终体积。 

公开了衍生自人骨髓或脐带血的干细胞组合物以及用于其制备的系统和方法。公开的发明具有整合到单一系统内的下述10个属性： 

1.它回收高百分比的干细胞； 

2.它通过取出过量血浆、RBCs、血小板和嗜中性粒细胞而减少骨髓或脐带血样品的原始体积； 

3.它不需要异生素添加剂以完成干细胞回收，同时增强产物的安全性概况，从而消除关于细胞洗涤的需要，且使成本降到最低； 

4.它使干细胞维持在存活条件下； 

5.它快速完成（少于90分钟）； 

6.由于干细胞分离和捕获步骤的自动化，它并非劳动力密集的； 

7.它易于以一致方式执行，从而需要最低限度的操作员训练和专业知识； 

8.它可以在手术室中或邻近手术室使用用于自体或同种异体用途，或在细胞处理实验室中使用。 

9.它在无菌、功能上封闭的系统中分开且分离干细胞和祖细胞，以减少产物的微生物污染危险；和 

10.它能够处理用于组织再生的全范围的骨髓和脐带血。 

在一个方面，本发明包括了包括处理袋组和处理设备的系统。无菌且优选一次性的袋组包括处理袋、RBC浓缩袋、干细胞袋、计量阀和使计量阀与每个袋连接的管路。一旦脐带血或骨髓已转移到处理袋内，就将袋组放置到安装到离心桶（bucket）内的处理设备内。处理设备与袋组相互作用，以在单次离心运行过程中将WBC/干细胞和祖细胞层从骨髓或脐带血转移到干细胞袋内。处理设备包括光学传感器、微控制器、伺服电动机、一个或多个加速计、测压仪（load cell）和电池。微控制器接受且分析来自光学传感器、加速计和测压仪的输入，并且指导伺服电动机以精确的阀运动打开且关闭计量阀，这允许在离心过程中通过密度和大小分层的不同细胞层转移到不同袋内。 

在另一个方面，本发明还包括用于从骨髓或脐带血分离且浓缩干细胞的方法。该方法包括下述步骤。将骨髓或脐带血转移到处理袋内。将装载的袋组放置到处理设备内。袋组在处理设备中以足够的g力和时间离心，以使处理袋中的骨髓或脐带血的细胞基于其密度和大小分为数层。袋组在处理设备中以较低的g力离心，以允许大多数RBCs从处理袋分离且转移到RBC浓缩袋内。袋组可以任选在处理设备中以足够的g力和时间离心，以使处理袋中的细胞基于细胞密度和大小再次分为数层。袋组在处理设备中离心，同时计量阀连续快速打开且关闭多次，以使剩余RBCs部分从处理袋分离到RBC浓缩袋内，而不同时转移WBC/干细胞和祖细胞层。当袋组在离心时，处理设备使空干细胞袋的重量校准为零。袋组在处理设备中离心，同时计量阀连续快速打开且关闭多次，以使小量剩余RBCs、WBC/干细胞和祖细胞层以及一些血浆从处理袋中分离且转移到干细胞袋内。 

在另一个方面，本发明包括通过本发明方法的实施方案制备的衍生自骨髓或脐带血的干细胞和祖细胞组合物。来自骨髓的干细胞和祖细胞组合物具有约1个CD34+细胞与约500个RBCs的比，并且来自脐带血的具有1个CD34+细胞与5,000个RBCs的比。这些干细胞和祖细胞组合物不包含任何异生素添加剂。 

本发明的干细胞组合物解决了无需异生素添加剂的、关于在功能上封闭的袋组中快速制备的干细胞和祖细胞组合物的目前未满足的临床需要，以达到先前难以达到的红细胞与干细胞比。骨髓组合物是有利的，因为它回收高比例的CD34+细胞（约97％）和ALDH Br+ 细胞（约92％），同时消耗约98％的RBCs，并且不包含异生素添加剂。脐带血组合物也是有利的，因为它回收高比例的CD34+细胞（约95％），同时消耗约98％的RBCs，并且不包含异生素添加剂。 

附图简述

图1是本发明袋组的实施方案的二维布置图。 

图2是图1袋组的透视图。 

图3A是显示图1袋组的计量阀的一个流体通道的示意图。 

图3B是显示图3A中所示计量阀的第二个流体通道的示意图。 

图3C是显示图3B中所示计量阀的第三个流体通道的示意图。 

图4A是显示与图3A-3C实施方案不同的计量阀的实施方案的一个流体通道的示意图。 

图4B显示图4A中所示计量阀的第二个流体通道的示意图。 

图5是本发明处理设备的实施方案的透视图。 

图6是图5处理设备的透视图。 

图7是图5处理设备的透视图。 

图8是图5处理设备的透视图。 

图9是图5处理设备的侧视图。 

图10是本发明处理设备的基板的实施方案的透视图，显示组分。 

图11是图5处理设备的分解图。 

图12是图5处理设备中放置的图1袋组的透视图。 

图13是图12袋组和处理设备的透视图。 

图14是图12袋组和处理设备的透视图。 

图15是图12袋组和处理设备的透视图。 

图16是图12袋组和处理设备在离心桶中的透视图。 

图17是显示图16装载的离心桶和离心机的部分分解图。 

图18是图5处理设备的微控制器的输入和输出的方框图。 

图19是显示在分层步骤后的细胞层的图1处理袋的部分横截面侧视图。 

图20是显示在方法的离心步骤过程中随时间而变的在透光率中的变化的曲线图，具体显示在离心过程中随时间而变的在LED和光学传感器之间骨髓或脐带血流体透光率中的变化。 

发明详述

用于从骨髓或脐带血回收干细胞和祖细胞组合物的系统

该系统包括袋组100和处理设备200。 

图1和2显示袋组100的实施方案。袋组100是功能上封闭且优选一次性的。袋组100包括通过管路或管道系统与计量阀连接的3个或更多个袋，具有入口管路、夹、滤器和取样位点。袋组100优选包括3个袋：处理袋102、红细胞（RBC）浓缩袋104和干细胞袋106。 

处理袋102可以由乙烯乙酸乙烯酯（EVA）制成，但还可以由PVC或其他塑料制成。RBC浓缩袋可以由PVC或其他塑料制成。干细胞袋106可以由EVA制成，尽管也可以使用其他塑料。袋102和106可以是吹塑的。RBC浓缩袋可以是RF熔接的，尽管它可以是吹塑的。 

处理袋102是三维袋，其可以具有不对称形状，包括顶部边缘108、弯曲侧面110、垂直侧面112、锥形底部113和底部出口114。顶部边缘108包括入口115和2个洞116。可替代地，处理袋102可以是对称形状的，从而使得它的侧面锥形对称地朝向底部出口114。处理袋102的总体积可以是约240mL，尽管在使用中，它一般充满约50-150mL骨髓或脐带血。处理袋102通过与入口115连接的入口管路118供应。入口管路118包括凹形luer口（female luer）120，其允许袋组100与包含待转移到处理袋102内的骨髓或脐带血的注射器连接。凹形luer口120与凸形luer头（male luer）122连接，所述凸形luer头122与钉124连接，所述钉124由帽126覆盖，所述帽126允许袋组100与包含待转移到处理袋102内的骨髓或脐带血的收集袋连接。入口管路118包括凝块和骨碎片滤器128（约200-300μ网孔）。管路或管道系统夹130位于凝块和骨碎片滤器128与凹形luer口120之间。入口管路118可以任选还包括取样位点132、取样枕134和取样位点136，全部位于凝块和骨碎片滤器128下。取样位点132和136各自包括无针凹形luer口和非放气luer口帽。底部出口114将输出从处理袋102导向计量阀138。 

RBC浓缩袋104可以是扁平袋，具有顶部边缘105、底部边缘107和2个侧面边缘109，并且包括蝶形钉孔（spike port）140，其用于在过程结束时取出RBCs的等分试样，如果需要这样的话。底部边缘107在一个角落处包括入口111。RBC浓缩袋104的体积是约100mL，尽 管在使用中，它一般充满约30-80mL。RBC浓缩袋104在入口111处与供应管路142连接，所述供应管路142在计量阀138的连接头139之一处与计量阀138连接。 

干细胞袋106是形状为矩形的三维袋。干细胞袋106包括顶部边缘117、底部边缘119、大区室144和小区室146，其中区室144和146通过2个通道148连接。顶部边缘117包括入口121和2个钉孔150，其用于在过程结束时取出干细胞。干细胞袋106的体积是约30mL，尽管在使用中，它一般充满约25mL，其中约20mL在大区室144中，并且约5mL在小区室146中。干细胞袋106在入口121处与干细胞袋入口管路152连接，所述干细胞袋入口管路152通过F连接头154与供应管路156连接。供应管路156在计量阀138的连接头139之一处与计量阀138连接。F连接头154使供应管路156和干细胞袋入口管路152与分支管路158连接。分支管路158通过T连接头160与取样管路162和冷冻保护剂供应管路164连接。取样管路162包括管路夹164和取样位点166，并且在取样枕168中终止。冷冻保护剂供应管路164包括取样位点170和管路夹172，并且在无菌滤器174（优选约0.2μ网孔）中终止。取样位点166和170各自包括无针凹形luer口和非放气luer口帽。 

管路118、142、156和162是可以由PVC、EVA或其他材料制成的管道系统。管路152和158是由EVA制成的管道系统。冷冻保护剂供应管路164是在外部用PVC和在内部用EVA制备的共挤压管道系统。因为与冷冻保护剂接触的塑料材料（如果它们浸出到冷冻保护剂内）可以进入干细胞袋106且污染最终产物，所以使用不包含可以浸出到冷冻保护剂内的增塑剂的材料例如EVA用于将与冷冻保护剂接触的管路是有利的。 

计量阀138可以是旋塞阀。在一个实施方案中，计量阀138是三通旋塞阀，因为它具有3个连接头139，从而使得它可以与3个袋连接：处理袋102、RBC浓缩袋104和干细胞袋106。其他类型的计量阀或旋塞阀也将发挥作用，例如具有4个连接头的四通旋塞阀。计量阀138包括具有3个连接头139的外部部分141和内部部分143。外部部分141可以由聚碳酸酯制成。内部部分143包括整体模塑的柄145和桶147，其可以由聚乙烯（polyethelene）制成。桶147在几个位置 之间移动，包括定义为不允许任何流体流过计量阀138的位置的封闭位置，以及定义为允许流体流过计量阀138的位置的2个开放位置。2个开放位置包括允许流体从处理袋102流过计量阀138到RBC浓缩袋104的一个位置，和允许流体从处理袋102流过计量阀138到干细胞袋106的一个位置。在图3A-3C中所示的一个实施方案中，计量阀138的桶147可以配置为包含3个开口，从而允许流体沿着3个可能流体通道流动：如图3A中所示从处理袋102到RBC浓缩袋104的预期通道；如图3B中所示从处理袋102到干细胞袋106的预期通道；和如图3C中所示在RBC浓缩袋104和干细胞袋106之间的非计划暂时通道，这可能在计量阀138在其2个预期位置之间移动时出现。此种暂时流体流动是不希望的，因为它可以允许一些另外的RBCs流入干细胞袋106内，从而减少所得到的干细胞组合物的纯度。为了解决这个担心，在图4A-4B中所示的另一个实施方案中，计量阀138的桶147可以可替代地配置为仅包含2个开口，从而允许流体仅沿着2个可能的流体通道流动；如图4A中所示从处理袋102到RBC浓缩袋104的预期通道；和如图4B中所示从处理袋102到干细胞袋106的预期通道。这种配置将排除在RBC浓缩袋104和干细胞袋106之间任何可能的暂时流体流动。计量阀138应能够经得住在离心过程中发生的高压；例如，评定为约500磅/英寸²（psi）的阀是令人满意的。供应管路142从计量阀138导向RBC浓缩袋104。供应管路156从计量阀138导向F连接头154，所述F连接头154经由干细胞袋入口管路152导向干细胞袋106。管路142、152和156可以各自是热封的且与袋组100分开。 

如果需要更多的袋以使来自骨髓或脐带血的另外组分分开，那么袋组100可以包括另外的袋。如果包括另外的袋，那么计量阀138将具有另外的连接头以供给每个袋，并且袋组将包括另外的供应管路以使计量阀与每个袋连接。例如，如果希望使处理袋102中最后部分的RBCs与转移到RBC浓缩袋104内的那些RBCs分开，那么需要第四个袋。第四个袋通过分开的供应管路与计量阀138连接。在那种情况下，计量阀138将是具有4个连接头的四通旋塞阀，并且将包括允许从处理袋102到其他3个袋中每个的流体流动的桶。 

图5-15显示处理设备200的实施方案。处理设备200是略微圆柱状的，具有顶部202、底部204、前部206、背部208、侧面210和侧面212。前部206包括前门214以及前壁216和217。处理设备200具有机体218、干细胞袋区室220、基板222、支持托架224和处理袋吊架226。机体218和干细胞袋区室220优选由模塑的氨基甲酸乙酯制成，尽管还可以使用其他热塑材料。基板222优选由不锈钢制成。支持托架224优选由铝制成。处理袋吊架226优选由不锈钢制成。依一定尺寸制造处理设备200以配合具有1L最低限度容积的离心桶内，所述离心桶在横截面中可以是圆形或卵圆形的。图16显示处理设备200，包含在离心桶228内部的袋组100。图17显示装载的离心桶228如何安装到在合适位置中已具有另外5个装载的离心桶的离心机内。 

处理设备200的机体218包括主区室230，所述主区室230具有加工为接受处理袋102的尺寸的延长卵圆形形状。主区室230在顶部是开放的，并且由开放前门214接近，所述前门214通过铰链232与处理设备200的前部206附着。主区室230具有符合且支持处理袋102的侧壁234和236以及后壁238，且朝向通道240渐小，所述通道加工为接受处理袋102的锥形底部113的尺寸。侧壁234和236在中部附近宽松地用架支撑处理袋102，并且在锥形底部113处更紧密地用架支撑处理袋102。接近处理袋102锥形底部113的更紧密容限是有利的，以提供关于处理袋102及其内容物在离心的高压过程中的支持，并且使对袋内容物的干扰降到最低。前门214包括在其内部表面上的凹入内部凹进242，所述凹入内部凹进242对应于主区室230的侧壁234和236以及通道240，并且提供连续表面，从而使得当前门214闭合时，它符合且支持处理袋102。 

凹进244位于处理设备200的前部206上，在前壁216和217下，并且配置为支持计量阀138的连接头139。阀门致动器套箍246位于凹进244内，并且按一定尺寸制造且配置为接受计量阀138柄145。阀门致动器套箍246通过螺丝250与伺服电动机248的轴附着。相应凹进252位于前门214内部上，并且按一定尺寸制造且配置为接受计量阀138的伸出末端和连接头139。 

一个或多个光学传感器254通过主区室230的前壁217装配，它们的小孔位于侧壁236上，其中相等数目的LEDs256位于相对侧壁 234上。LED256包括红色LED灯，尽管还可以使用其他类型的LEDs。一个光学传感器254和一个LED256优选位于通道240之上约2cm，从而使得在光学传感器254和LED256水平以及计量阀138水平之间的处理袋102中的体积是约2mL，尽管还可以使用其他距离和相应体积。如果包括另外的光学传感器和LEDs，那么它们可以位于光学传感器254和LED256之上或之下，这依赖于待分离的RBCs所需体积。 

处理设备200的侧面212包括槽口258、贮存腔260、通道262、RBC浓缩袋凹进264、支持架266和钩268。槽口258按一定尺寸制造且配置为接受RBC浓缩袋104的钉孔140。RBC浓缩袋凹进264从槽口258向下延伸至支持架266，并且按一定尺寸制造且配置为接受RBC浓缩袋104。贮存腔260位于槽口258下，并且在RBC浓缩袋凹进264后且与RBC浓缩袋凹进264连续。通道262沿着RBC浓缩袋凹进264的内部边缘延伸，与前门214、顶部202和背部208邻近。支持架266是形成RBC浓缩袋凹进264的底面的水平架。 

干细胞袋区室220是水平、中空的矩形区室，其具有位于前门214的铰链232下的较大侧面270。干细胞袋区室268位于基板232下，并且与测压仪272附着。干细胞袋区室220通过向下打开的铰接门274接近，并且经由在其顶部边缘处位于干细胞袋区室220内部的闩276合到应有位置。铰接门274的内部包含凹进278，所述凹进278按一定尺寸制造且配置为容纳干细胞袋106的钉孔150和入口121。铰接门274的外部包含按一定尺寸制造以容纳干细胞袋入口管路152的槽280和通道282。 

底部通道284向上延伸并且与基板222平行，从在铰链232下的前部206经过侧面210和背部208到侧面212。底部通道284按一定尺寸制造以容纳管路142。 

处理设备200包括在侧面210处延伸超过顶部202的处理袋吊架226。处理袋吊架226具有衔接在处理袋102上的洞116的接片227，使处理袋102维持在处理设备200内部适当位置中。LED窗口229位于侧面210处的顶部202上。 

支持托架224是U型托架，其通过螺丝225与基板222附着，并且定向与处理设备200的侧面210和212平行。 

如图10中所示，基板222优选具有安装到其上的下述组分：印刷电路板286、伺服电动机248、测压仪272和界面接触印刷电路板288。印刷电路板286包含可编程只读存储器忆微控制器290。由于在离心过程中的热产生，微控制器290可能需要温度补偿。测压仪272是补偿温度的应变计测压仪。伺服电动机248是齿轮减速电动机。一个或多个加速计292安装到印刷电路板286上；如果使用2个加速计292，那么一个可以安装到另一个之上。优选地，加速计292包括测量约0-200xg的低g加速计291，和测量约1000-1700xg的高g加速计293。印刷电路板286还包括通过LED窗口229可见的状态LEDs294。一个或多个状态LEDs294可以指示电池296的充电状态以及在方法中正执行的当前步骤，以及其他信息。提供界面接触印刷电路板288以与外部电池充电器连接，并且提供与个人计算机的通讯连接。基板222通过螺丝298与机体218附着。 

图18是显示微控制器290的输入和输出的方框图。光学传感器254、电池电压302、测压仪272以及加速计291和293，产生转变成由微控制器290接受的数字输入的模拟输出。微控制器290以预定时间间隔记录、贮存且分析那些输入。微控制器控制伺服电动机248、关于光学传感器254的LED256和状态LEDs294。当包括计量阀138的袋组100正确放置到处理设备200内时，伺服电动机248通过其传动轴与阀门致动器套箍246连接，并且响应来自微控制器290的信号，伺服电动机248引起计量阀138移动至不同位置，以打开或关闭至袋组100的袋的流体流动。 

电池296位于处理设备200的侧面210处在顶部202上的电池腔300中。电池296是可再充电的镍金属氢化物电池，包括具有总共约3.8-4伏的3个电池，所述电压进行调节以提供5伏的恒定电压。电池296给微控制器290、光学传感器254、加速计291和293、测压仪272、光学传感器LED256、状态LEDs294、伺服电动机248、以及处理设备200中的所有电路包括与个人计算机的通讯连接提供动力。 

处理单元200可以放置在分开的扩展坞（docking station）中，所述扩展坞包括电池充电器并且可以与个人计算机连接。来自微控制器290的数据可以转移给个人计算机，并且经由扩展坞通过界面接触印刷电路板288，可以接受来自个人计算机的命令。 

如图12-15中所示，袋组100如下插入处理设备200内。将干细胞袋106放置到干细胞袋区室220内，从而使得底部边缘119首先配合，并且小区室146折叠并且放置在较大侧面270中。入口121和钉孔150放置在铰接门274的凹进278内部。干细胞袋入口管路152放置在铰接门274的槽280中。铰接门274随后关闭并且用闩276闩上。干细胞袋入口管路152放置在通道282中。计量阀138的柄145放置到阀门致动器套箍246内。处理袋102在主区室230中这样定向，从而使得前门214在处理袋102的垂直侧面112上关闭。F连接头154放置在RBC浓缩袋凹进264内。管路夹165关闭且连同取样管路162一起放置在通道262内部。冷冻保护剂供应管路165、管路夹172（关闭的）和取样位点170放置到贮存腔260内，其中无菌滤器174放置到贮存腔260的右侧壁插座内。取样位点166锚定在钩268处。取样枕168安装到直接在RBC浓缩袋凹进264的右侧中的滤器插座下的凹进内。随后，将供应管路142放置到底部通道284内，并且将RBC浓缩袋104放置到RBC浓缩袋凹进264内。入口管路118和取样位点136向下并且朝向在侧面210处的处理袋吊架226折叠。处理袋102的洞116与吊架226的接片227附着。前门214关闭。钉孔140安装到槽口258内，其中底部边缘107在支持架266上，从而使得RBC浓缩袋104安装在贮存腔260上。分支管路158沿着贮存腔260的左侧垂直放置。 

从骨髓或脐带血回收干细胞和祖细胞组合物的方法

该方法包括使骨髓或脐带血细胞通过细胞密度和大小分层且分离的离心。待处理的骨髓或脐带血包含血浆、RBCs、WBCs和干细胞，如由CD34+和ALDHBr+干细胞标记的存在指示的。所得到的干细胞产物是干细胞和祖细胞的组合物，其包括一些WBCs、以及显著减少的RBCs和血浆。使用上文描述的系统的该方法在能够处理一系列骨髓或脐带血体积的无菌、功能上封闭的系统中执行，并且产生其体积可以预先由用户选择的最终产物。该方法通过取出过量RBCs和血浆，并且如果临床上有利的，则取出嗜中性粒细胞和血小板，来显著减少骨髓体积，从而使最终干细胞组合物中的干细胞浓缩。对于这种方法不需要异生素添加剂，所述方法从骨髓或脐带血回收高百分比的干细 胞和祖细胞。 

如本说明书中使用的，术语“g力”指相对离心力，并且所有对特定g力的参考均在处理设备200中的光学传感器254位置处测定。应当理解本文提及的特定g力和时间段举例说明该方法的实施方案，并且除所提及的那些外的g力和时间段是有用的并且包括在该方法的其他实施方案中。 

在该方法的一个实施方案中，包括下述步骤： 

1.将骨髓或脐带血转移到处理袋内。 

将骨髓或脐带血收获或收集到收集容器例如袋、注射器或其他容器内，与抗凝剂例如肝素或CPD一起保存，并且转移到处理袋102内。转移可以这样完成：通过将钉124插入收集袋内，使凹形旋锁luer口（luerlock）120与注射器附着，或使用无菌连接设备无菌对接收集袋和处理袋的管道系统。管路夹130是打开的。骨髓或脐带血随后经由重力流动通过入口管路118从收集容器转移到处理袋102。骨髓或脐带血经过凝块和骨碎片滤器128，在它到达处理袋102前，所述凝块和骨碎片滤器128从骨髓或脐带血取出聚集物（例如血凝块、脂肪球和骨碎片）。在骨髓或脐带血转移后，入口管路118在取样位点132之上进行热封，并且取出收集容器、凝块和骨碎片滤器128以及管路118的其余部分。 

约25-200mL体积的骨髓或脐带血可以放置到处理袋102内，其中约50-170mL是优选的。如果收集的骨髓或脐带血的原始体积是约100mL，并且骨髓或脐带血具有约30％的血细胞比容，那么RBC体积将是约30mL，WBC以及干细胞和祖细胞体积将是约1mL，并且剩余体积将是血浆。 

出乎意料地，不必需沉降试剂或其他异生素添加剂，以执行这个方法并且达到干细胞和祖细胞从骨髓或脐带血的有效回收，如本文所描述的。如果需要沉降试剂例如HES，那么它任选加入处理袋102中的骨髓中。 

如果需要，在取样位点132之上的入口管路118热封后，待处理的骨髓或脐带血样品可以从处理袋102中获取。对取样枕134进行挤压并且释放以将样品抽取到枕内。入口管路118随后在取样位点136之上进行热封，并且连同取样位点132取出取样枕134。取样枕134 中的骨髓或脐带血随后可以通过取样位点132接近用于分开的测定，例如用于细胞计数、细胞生存力、微生物污染和HLA分析。 

如果未从处理袋102中获取样品，那么入口管路118在取样位点136之上进行热封，并且取出在取样位点136之上的所有组分。 

2.将装载的袋组放置到处理设备内。 

将袋组100包括袋、管路和计量阀放置到如上所述的处理设备200内。 

如图16和17中所示，将处理设备200与袋组100一起放置到离心机的离心桶228内，所述离心桶228可以进行冷冻。离心机需要用另一个处理设备200或用合适的砝码进行平衡。 

3.使袋组以足够的g力和经过时间在处理设备中离心，以使处理袋中的骨髓或脐带血细胞基于其密度和大小分为数层。 

处理设备200中的袋组100以足够的预定g力和预定时间进行离心，以使处理袋102中的骨髓或脐带血细胞群体通过细胞密度和大小分为数层。例如，离心可以在约1400xg下执行约20-约40分钟。在这个分层步骤过程中，计量阀138处于其关闭位置，从而使得不允许流体流动通过计量阀138。加速计293测量在离心过程中的g力。 

离心优选继续直至细胞已分为3层。参见显示在这个分层步骤已执行后的处理袋102的图19。下面、最浓的层400主要是RBCs；中间密度的中间层402是WBC/干细胞和祖细胞以及一些血小板的层；并且上面、最不浓的层404主要是血浆伴随一些另外的血小板。与干细胞和祖细胞一起存在的血小板百分比将随着离心持续时间增加而变大。1400g力和20-40分钟的离心时间足以引起超过70％的干细胞迁移至WBC/干细胞和祖细胞层，尽管优选至少约80％-90％的干细胞位于这个层中。 

4.袋组在处理设备中以较低g力离心，以允许大多数RBCs从处理袋分离且转移到RBC浓缩袋内。 

细胞已在先前步骤中在处理袋102中分层后，处理设备200中的袋组100以足够的预定较低g力和预定时间进行离心，以允许大多数RBCs从处理袋102分离且转移到RBC浓缩袋104内。g力低于步骤3中使用的g力，以依具有细胞损伤的最低危险的受控方式，允许RBC层从处理袋102通过计量阀138通过供应管路142流动到RBC浓缩 袋104内。例如，离心可以在约80xg下执行约3-约10分钟。这个离心步骤可以通过使先前步骤的g力自动减少至预定较低g力与先前分层步骤的离心连续，或它可以在先前离心步骤已完成且停下来后起始且执行。 

加速计291测量在离心过程中的g力。微控制器290一接受预定g力稳定例如约30秒的来自加速计291的输入，微控制器290就指导伺服电动机248，以引起阀门致动器套箍246使计量阀138打开至这样的位置，所述位置产生从处理袋102通过供应管路142且到RBC浓缩袋104内的流体通道。在计量阀138打开时，处理袋102中由压紧的RBCs组成的大部分下层流动到RBC浓缩袋104内。 

同时在计量阀138打开时，微控制器290在流体流过LED256时指导光学传感器254从LED256获取通过在处理袋102中的骨髓或脐带血的透光率读数。微控制器290连续记录且分析透光率，它接受所述透光率作为随时间而变的来自光学传感器254的输入。图20显示随着细胞层流经LED256和光学传感器254在离心过程中随时间而变的相对透光率，在步骤4中计量阀138打开后开始并且持续经过步骤8，排除任选步骤5。线近似S形曲线，具有其中存在很少的透光率或无透光率并且线几乎水平的区域A；其中存在透光率量中的快速增加并且线的斜率陡的区域B；和其中存在大量透光率并且线几乎水平的区域C。 

在这个步骤过程中，RBC层流经光学传感器254。因为RBC层具有最大的细胞浓度，所以它阻断光透射至光学传感器254。因此，在这个步骤过程中，光学传感器254检测出来自LED256的很少光或未检测出光，如图20上的区域A所示。 

在RBC层已流经光学传感器254后，RBC层和WBC/干细胞和祖细胞层之间的界面开始流过光学传感器254。因为这个层具有比RBC层更低的细胞浓度，所以更多的光通过光学传感器254从LED256检测出。微控制器290一由光学传感器254通知，预定量的透光率已达到，这指示WBC/干细胞和祖细胞组合物层的经过的开始，微控制器就指导伺服电动机248，以引起阀门致动器套箍246使计量阀138关闭，从而使得通过计量阀138的流体流动停止。这由图20上的点D显示。因此，WBC/干细胞和祖细胞层的最低部分一开始达到光学传 感器254，计量阀138就关闭。 

在这个分离步骤后，约2mL压紧的RBC体积保留在处理袋102中，大部分RBC体积已转移到RBC浓缩袋104内。例如，在具有30％血细胞比容的100mL收集的骨髓的原始体积中，约28mLRBC体积（约93％）目前将在RBC浓缩袋104中，并且约2mL（7％）RBC体积将保留在处理袋102中。 

5.袋组可以任选在处理设备中以足够的g力和经过时间离心，以使处理袋中的细胞基于细胞密度和大小再次分为数层。 

这是个任选步骤。如果这个步骤不执行，那么该方法前进到下一个步骤。 

由于先前分离步骤和当细胞溶液通过计量阀138取出时发展的科里奥利（Coriolis）力，处理袋102中的细胞层（这包括RBC层的剩余部分、所有WBC/干细胞和祖细胞层、和所有血浆层）可以在其界面处变得略微更少确定且更多混合。在这个任选步骤中，处理设备200中的袋组100可以以足够的预定g力和时间离心，以使剩余细胞通过细胞密度和大小再次分为更确定的层。例如，离心可以在约1400xg下执行约5-约15分钟。这个离心步骤可以通过给离心机编程以自动增加g力与先前分离步骤的离心连续，或它可以在先前离心步骤已完成且停下来后起始且执行。 

在这个离心步骤过程中，计量阀138处于其关闭位置，从而使得不允许流体流动通过计量阀138。离心优选持续直至细胞已再次分为在层之间的界面处具有减少的混合的3层：剩余RBCs的下层、WBC/干细胞和祖细胞的中间层、和血浆上层。离心力和时间是足够的，从而使得超过70％的干细胞位于WBC/干细胞和祖细胞层中，尽管优选至少约80％-90％的干细胞位于这个层中。 

6.袋组在处理设备中离心，同时计量阀接连快速打开且关闭多次，以使剩余RBCs的相当大部分从处理袋更精确地转移到RBC浓缩袋内，而不同时转移WBC/干细胞和祖细胞层。 

先前任选再分层步骤后，或如果未执行再分层步骤，那么在先前分离步骤后，处理设备200中的袋组100以足够的预定g力和预定时间段离心，以完成这个步骤以及步骤7和8。例如，离心可以在约80xg（与步骤4中使用的相同的g力）下执行约5-约15分钟。 

在这个步骤中，在处理袋102中剩余RBCs的相当大部分精确地转移到RBC浓缩袋104内。较低g力的目的是以具有细胞损伤的最低危险的受控方式，允许RBCs从处理袋102流动到RBC浓缩袋104内。这个离心步骤可以与先前步骤的离心连续，如果先前步骤是再分层，那么通过给离心机编程以自动减少g力来实现，或如果先前步骤是分离，那么通过以相同g力继续离心来实现，或它可以在先前离心步骤完成且停下来后起始且执行。 

加速计291测量在离心过程中的g力。微控制器290一接受预定g力稳定例如约30秒的来自加速计291的输入，微控制器290就指导伺服电动机248，以引起阀门致动器套箍246使计量阀138打开至这样的位置，所述位置产生从处理袋102通过供应管路142且到RBC浓缩袋104内的流体通道，并且随后关闭，经过预定时间间隔的预定持续时间连续重复打开和关闭多次达预定数目的循环，允许从处理袋102到RBC浓缩袋104访问足够的重复的、不连续时间量，以允许血浆层接近光学传感器254水平。例如，计量阀138可以设定为打开约0.1-约0.2秒的持续时间，并且关闭约10秒，这个循环重复约10-约30次，尽管持续时间、时间间隔和重复的其他组合也将良好工作。随着计量阀138打开且关闭，处理袋102中剩余RBCs部分流动到RBC浓缩袋104内。这个精确的红细胞取出步骤引起在先前步骤后保留在处理袋102中的2mLRBC体积中约1-1.5mL从处理袋102流动到RBC浓缩袋104内，甚至进一步减少处理袋102中留下的RBC体积，并且由于伴随计量阀138每次短暂打开和关闭的微小体积的RBC转移，RBCs不与干细胞和祖细胞混合，并且由于科里奥利力，干细胞和祖细胞不吸入到转移的红细胞内。如果需要，甚至更大比例的剩余RBCs也可以通过这种方式转移到RBC浓缩袋102内。 

这个最终精确计量活性由微控制器290指导，所述微控制器290随着处理袋102中的细胞层流过LED256，从光学传感器254接受来自LED256的透光率读数。微控制器290连续记录且分析随时间而变的透光率，并且使当前值与先前值比较。在这个步骤过程中，WBC/干细胞和祖细胞层流经光学传感器254。因为这个层在其与RBC层的界面处具有较高的细胞浓度，并且在其与血浆层的界面处具有较低的细胞浓度，所以随着WBC/干细胞和祖细胞层流经光学传感器254和 与血浆层的界面接近，透光率稳定增加。因此，在这个步骤过程中，光学传感器254检测出在来自LED256的透光率中的稳定增加。这由图20上区域B中线的斜率显示。 

WBC/干细胞和祖细胞层已流经光学传感器254后，WBC/干细胞和祖细胞层和血浆层之间的界面开始流过光学传感器254。因为血浆层具有比WBC/干细胞和祖细胞层更少的细胞，所以通过光学传感器254从LED256检测出更多的光。微控制器290一接受来自光学传感器254的输入，所述输入为透光率的变化率中的预定减少已发生，这基于光学传感器254检测预定速率值，微控制器290就指导伺服电动机248，以引起阀门致动器套箍246使计量阀138关闭，从而使得RBCs通过计量阀138的转移终止。这由图20上的点E显示，在从区域B中线的陡斜率到区域C中几乎水平的线的转换处，这是在其下WBC/干细胞和祖细胞组合物层已流过光学传感器254之下并且血浆层已开始流经光学传感器254的点。因此，血浆层的最低部分一开始达到光学传感器254，计量阀138就关闭。 

在这个分离步骤后，约0.5-1.0mLRBC体积保留在处理袋102中，另外1-1.5mLRBC体积已转移到RBC浓缩袋104内。 

7.当袋组在离心时，处理设备使空干细胞袋的重量校准为零。 

计量阀138在先前步骤中已关闭后，离心以步骤6中设定的g力和时间继续。加速计291证实设定的g力，在这个点下测压仪272和微控制器290组合以使空干细胞袋106的重量校准为零。 

8.袋组在处理设备中离心，同时计量阀接连快速打开且关闭多次，以使小量剩余RBCs、WBC/干细胞和祖细胞层以及一些血浆从处理袋中分离且转移到干细胞袋内。 

袋组106在处理设备200中的离心以步骤6中设定的g力和时间继续。当微控制器290接受来自测压仪272的输入，所述输入为空干细胞袋106的重量已校准为零，微控制器290就指导伺服电动机248，以引起阀门致动器套箍246使计量阀138打开至这样的位置，所述位置产生从处理袋102通过供应管路156和干细胞袋入口管路152到干细胞袋106内的流体通道，并且随后关闭，经过预定时间间隔的预定持续时间连续重复打开和关闭多次达预定数目的循环，允许从处理袋102到干细胞袋106访问足够的重复的、不连续时间量，以允许干细 胞袋106填充直至达到它的预定重量。例如，计量阀138可以设定为打开约0.1-约0.2秒的持续时间，并且关闭约10秒，这个循环重复多次。随着计量阀138打开且关闭，处理袋102中的剩余RBCs、WBC/干细胞和祖细胞层以及一些血浆流动到干细胞袋106内。这个步骤过程中较低g力的目的是以具有细胞损伤（其在较高g力下将发生）的最低危险的受控方式，允许这些细胞从处理袋102流动到干细胞袋106内。 

在这个分离步骤过程中，测压仪272测量干细胞袋106的重量，并且微控制器290接受来自测压仪272的输入。预设WBC/干细胞和祖细胞层的所需重量，并且可以设定为约3克-约30克。例如，如果干细胞袋106中最终干细胞产物的所需体积是10mL，那么可以使用10克的重量。微控制器290一接受来自测压仪272的输入，所述输入为干细胞袋106已达到其预设重量，微控制器290就指导伺服电动机248，以引起阀门致动器套箍246使计量阀138关闭，从而使得通过计量阀138的流体流动停止。 

计量阀138关闭后，离心以相同的g力继续直至已达到步骤6中的预设时间段设置。 

9.离心结束并且从处理设备中取出袋组。 

在预设离心时间段结束时，离心终止并且从离心机中取出处理设备200。从处理单元200中取出袋组100，包括所有袋、计量阀138和管路。 

干细胞袋106包含剩余RBCs、WBC/干细胞和祖细胞、以及一些血浆。干细胞袋106的内容物在本文中称为“干细胞组合物”或“干细胞的组合物”。RBC浓缩袋104包含RBCs。处理袋102包含在干细胞袋106中不包含的血浆的剩余部分。 

若需要，可以获取来自RBC浓缩袋104和干细胞袋106的样品。取样管路162、取样枕168、取样位点166和管路夹164用于取样干细胞袋106。 

如果干细胞组合物立即使用，例如在自体背景中，那么干细胞袋106随后使用Sebra密封器（Sebra Corp.，Tucson，AZ.）与袋组100的其余部分分离。 

如果干细胞组合物待冷冻，那么冷冻保护剂溶液例如DMSO溶液 应通过无菌滤器174和冷冻保护剂供应管路165加入干细胞袋106中。 使用骨髓和脐带血作为干细胞来源的方法的例子

从授权供应商收集5单位人骨髓和6单位脐带血，并且在收集1-3天内进行处理。下表显示对于通过本文所述方法处理的骨髓和脐带血获得的数据。骨髓用肝素进行抗凝，并且脐带血用CPD进行抗凝。依一定尺寸制造以包含处理设备的台式离心机提供离心场。在这些实验中不使用异生素添加剂作为沉降助剂。下表1提供用于骨髓和脐带血实验的方法步骤概括。 

表1：用于骨髓和脐带血实验的方法概括

在处理前获取骨髓和脐带血样品，并且在处理后获取最终产物（干细胞组合物）样品。使用Sysmex XE-2100执行RBCs、WBCs、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的细胞计数。使用商业Stem-Count试剂盒（Beckman Coulter，Inc，Miami，FL）根据制造商的说明书，对处理前和后的样品执行CD34+细胞和CD45+细胞（在所 有白细胞上和在大多数CD34+细胞上表达的抗原）的计算。试剂盒允许通过流式细胞术同时鉴定且计算在生物样品中的CD45+和双阳性CD45+，CD34+细胞群体百分比和绝对细胞计数。CD45+细胞的生存力基于活体染料7-AAD的染料排除进行测定。通过流式细胞术用在适当配置的Beckman CoulterFC-500流式细胞仪（Beckman Coulter，Inc.，Miami，FL）上的合适门控和分析获得细胞群体测量。使用商购可得的具有Beckman CoulterFC-500流式细胞仪的Aldecount试剂盒（Aldagen，Durham，NC）根据制造商的说明书，对来自骨髓单位1、2和3的样品在处理前和后执行ALDHBr+细胞的鉴定和计算。试剂盒中提供的试剂促使干细胞染为亮荧光绿色。这些细胞命名为Aldagen亮（ALDHBr+）细胞。 

A.骨髓数据 

表2显示在处理前关于5次实验的骨髓体积和细胞计数。显示了每个单位中RBCs、血小板、TNCs、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、MNCs、CD34+细胞和ALDHBr+细胞的总数目。ND的条目指示数据“未测定”。 

表2：骨髓处理前（体积和总细胞计数/骨髓单位）

表3显示来自在表2中提及的5单位骨髓关于在5次实验中获得的干细胞组合物的体积和细胞计数。显示了每个单位中RBCs、血小 板、TNCs、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、MNCs、CD34+细胞和ALDHBr+细胞的总数目。 

表3：骨髓干细胞组合物（体积和总细胞计数/骨髓单位）

表4呈现了基于表2和3中呈现的5次实验结果，每个细胞类型的百分比回收。通过将干细胞组合物中的细胞计数（表3）除以骨髓处理前样品中的相应值（表2），并且将这个商乘以100，计算百分比回收。例如，在实验1中，通过将（6,700x10⁶）除以（329,000x10⁶），并且将商乘以100，以得到2.0％的回收（表4），计算RBCs的百分比回收。可以通过从100％中减去百分比回收简单地计算百分比消耗。例如，在实验1中，红细胞的百分比消耗是100％-2.0％=98.0％。 

表4：在骨髓干细胞组合物中每个细胞类型的百分比细胞回收

表4中的数据出乎意料地证实可能达到平均97.9％的RBCs消耗 （2.1％回收），同时回收超过90％的干细胞，如通过CD34+细胞和ALDHBr+细胞测量的（分别为98.9％和92.0％的平均回收）。更加出乎意料地，表4证实甚至可以回收超过90％的干细胞，同时回收平均仅59％的嗜中性粒细胞。骨髓的这个选择性细胞分离水平将预期需要使用异生素沉降试剂。 

表5和6显示在处理前骨髓中和在干细胞组合物中RBCs与具核细胞类型比，其基于表2和3的数据。这些细胞彼此的比限定在自然界中未发现也未由任何其他细胞处理系统产生的独特干细胞组合物。具有非常低数目RBCs的干细胞组合物的开发通过产生更安全的细胞产物代表干细胞治疗的重要进展，这是由于与关于干细胞输液的过量红细胞相关的不利作用和有助于用免疫亲和或流式细胞术方法的进一步纯化过程的细胞产物。具体地，表5和6中的数据显示在处理前的骨髓中，RBCs与CD34+细胞的平均比最初是25,642：1，并且在处理后，干细胞组合物中的比是539：1。RBCs与干细胞比中的这种急剧减少反映该方法选择性消除RBCs而不损失CD34+细胞的成功。观察到红细胞与ALDHBr+细胞比中的相似减少。 

表5：骨髓单位（处理前）中RBCs与具核细胞比

表6：骨髓干细胞组合物中RBCs与具核细胞比

这些细胞群体的效用是其包含活细胞固有的。表7包含关于骨髓 中CD45+细胞的细胞生存力的分析结果，如使用商业试剂盒（Stem-Kit，Beckman Coulter，Fullerton，CA）测量的。不存在处理后CD45+细胞生存力中的显著变化，这证实该过程的生物相容性。 

表7：在骨髓处理前中和在干细胞组合物中活CD45+细胞百分比

B.脐带血数据 

表8显示在处理前6个脐带血单位的体积和细胞计数。显示了处理前每个单位中RBCs、血小板、TNCs、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、MNCs和CD34+细胞的总数目。 

表8：脐带血处理前（体积和总细胞计数/脐带血单位）

*Plt.=血小板，Neut.=嗜中性粒细胞，Lymph.=淋巴细胞，Mono.=单核细胞 

表9显示关于来自表8中提及的脐带血相应单位的6次实验中获 得的干细胞组合物的体积和细胞计数。显示了处理后每个单位中RBCs、血小板、TNCs、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、MNCs和CD34+细胞的总数目。 

表9：脐带血干细胞组合物。（体积和总细胞计数/脐带血单位）

*Plt.=血小板，Neut.=嗜中性粒细胞，Lymph.=淋巴细胞，Mono.=单核细胞 

表10呈现了基于表8和9中呈现的6次实验结果，每个细胞类型的百分比回收。通过将干细胞组合物中的细胞计数（表9）除以脐带血处理前样品中的相应值（表8），并且将这个商乘以100，计算百分比回收。 

表10：在干细胞组合物中每个脐带血细胞类型的细胞百分比回收

*Plt.=血小板，Neut.=嗜中性粒细胞，Lymph.=淋巴细胞，Mono.=单核细胞 

表10中的数据证实可能达到98.0％的平均RBCs消耗（2.0％回收），同时回收平均95％的干细胞，如通过CD34+标记测量的。此外，表10证实甚至回收平均95％的干细胞，同时仅回收平均55％的嗜中性粒细胞。与骨髓的情况一样，将预期需要使用异生素沉降助剂以达到这个选择性细胞分离水平。 

下表11和12显示在处理前脐带血中和在脐带血干细胞组合物中RBCs与各种其他细胞类型比，这基于表8和9的数据。不存在异生素添加剂，这些细胞彼此的比限定在自然界中未发现也未由任何其他细胞处理系统产生的独特干细胞组合物。这些干细胞组合物的效用要求干细胞是活的，具有红细胞的显著消耗且无异生素添加剂。包含位于来源骨髓或脐带血中的大多数干细胞和祖细胞且具有非常低RBC与CD34+细胞比的干细胞组合物的可用性通过产生更安全的细胞产物代表干细胞治疗的重要进展，这是由于与关于干细胞输液的过量红细胞相关的潜在不利作用。 

RBCs与CD34+细胞的平均比最初是201,834：1，并且在处理后，它减少至5,007：1。RBCs与干细胞比中的这种急剧减少反映该方法选择性消除RBCs而不显著损失CD34+细胞的成功。 

表11：在脐带血单位（处理前）中RBCs与具核细胞比

*Neut.=嗜中性粒细胞，Lymph.=淋巴细胞，Mono.=单核细胞 

表12：在脐带血干细胞组合物中RBCs与具核细胞比

*Neut.=嗜中性粒细胞，Lymph.=淋巴细胞，Mono.=单核细胞 

这些细胞群体的效用是其包含活细胞固有的。表13包含关于脐带血中CD45+细胞的细胞生存力的分析结果，如使用Stem-Kit测量的。不存在CD45+细胞生存力中的显著变化，这是展示处理后脐带血产物中干细胞生存力维持的公认替代物。 

表13：在脐带血处理前中和在脐带血干细胞组合物中活CD45+细胞百分比

干细胞组合物

如上所述的方法产生了衍生自骨髓或脐带血的干细胞组合物，其包括干细胞、血浆、RBCs和WBCs，并且不具有异生素添加剂。衍生自骨髓的干细胞组合物具有对于每个TNC约5个RBCs，对于每个嗜中性粒细胞约10个RBCs，对于每个MNC约18个RBCs，和对于 每个干细胞约400-500个RBCs的比，如通过CD34+细胞或ALDHBr+细胞测量的（表6）。衍生自脐带血的干细胞组合物具有对于每个TNC约11个RBCs，对于每个嗜中性粒细胞约24个RBCs，对于每个MNC约23个RBCs，和对于每个干细胞约5,000个RBCs的比，如通过CD34+细胞测量的（表12）。 

衍生自骨髓的干细胞组合物回收约79％-约100％CD34+细胞，和约74％-约100％ALDHBr+细胞，同时消耗约97％-约99％RBCs。衍生自脐带血的干细胞组合物回收超过约77％-约100％CD34+细胞，同时消耗约96％-约99％RBCs。 

结果证实出乎意料的发现：在RBCs从处理袋分离且转移到RBC浓缩袋内的过程自始至终，骨髓或脐带血中的干细胞可以维持其在WBC/干细胞和祖细胞层中相对较高的位置（比红细胞层更接近于血浆层），并且嗜中性粒细胞维持其在WBC/干细胞和祖细胞层中相对较低的位置（更接近于红细胞层）。将预期流出处理袋的RBCs将引起干细胞、嗜中性粒细胞和红细胞以及其他细胞类型的显著混合，这是由于随着RBCs向下朝着计量阀流动的科里奥利效应和非层流。此种混合将预期阻碍观察到的相对于嗜中性粒细胞低回收的干细胞高回收，以及相对于RBCs高效消耗的干细胞高回收。 

本发明在上文已参考特定实施方案进行描述。本领域技术人员可以设想包含在权利要求范围内的本发明的其他实施方案和变化。 

Claims (10)

1.一种用于从骨髓或脐带血制备干细胞产物的系统，其包括：

a.袋组，包括容纳收集的骨髓或脐带血的处理袋、红细胞浓缩袋、干细胞袋和计量阀，其中所述计量阀与所述处理袋、所述红细胞浓缩袋和所述干细胞袋连接；

b.处理设备，所述袋组安装到其内，并且包括微控制器、电动机、光学传感器、LED、测压仪和加速计，

c.所述微控制器可操作地偶联至所述电动机、所述光学传感器、所述LED、所述测压仪和所述加速计；

d.当所述袋组包含在所述处理设备中时，所述电动机与所述计量阀可操作地偶联；

e.其中所述微控制器被设定为接受来自所述加速计的输入，其中在所述处理设备中所述计量阀关闭，所述袋组以第一g力被离心，所述第一g力足够使所述处理袋中的骨髓或脐带血分层为包含红细胞的层，包含白细胞/干细胞和祖细胞的层，以及包含血浆的层；和

f.其中所述微控制器被设定为在骨髓或脐带血在所述处理袋中被分层后接受来自所述加速计的输入，其中在所述处理设备中所述袋组以第二g力被离心，所述第二g力低于所述第一g力，然后控制所述电动机，促使所述计量阀打开所述处理袋与所述红细胞浓缩袋之间的流体通道，以允许相当一部分所述红细胞从所述处理袋转移至所述红细胞浓缩袋，然后响应所述光学传感器，控制所述电动机，促使所述计量阀关闭所述处理袋与所述红细胞浓缩袋之间的所述流体通道，所述光学传感器检测在所述处理袋的顶部边缘和底部出口之间水平通过所述处理袋的来自所述LED的透光率的一组量；和

g.其中所述微控制器被设定为在促使所述计量阀关闭所述处理袋与所述红细胞浓缩袋之间的所述流体通道后接受来自所述加速计的输入，其中在所述处理设备中所述袋组以第三g力被离心，然后控制所述电动机，促使所述计量阀接连多次打开和关闭所述处理袋与所述红细胞浓缩袋之间的所述流体通道以相继重复打开和关闭所述处理袋与所述红细胞浓缩袋之间的所述流体通道接连重复的、不连续时间量，以允许另一部分所述红细胞从所述处理袋转移至所述红细胞浓缩袋，然后响应所述光学传感器，控制所述电动机，促使所述计量阀关闭所述处理袋与所述红细胞浓缩袋之间的所述流体通道，所述光学传感器检测在所述处理袋的所述顶部边缘和所述底部出口之间所述水平的通过所述处理袋的来自所述LED的透光率的变化速率的降低；和

h.其中所述微控制器被设定为响应所述微控制器接受的来自所述测压仪测量所述干细胞袋重量的输入，使所述干细胞袋校准为零；和

i.其中所述微控制器被设定为在所述干细胞袋校准为零后控制所述电动机，促使所述计量阀接连多次打开和关闭所述处理袋与所述红细胞浓缩袋之间的所述流体通道以相继重复打开和关闭所述处理袋与所述红细胞浓缩袋之间的所述流体通道接连重复的、不连续时间量，以足够使至少剩余的红细胞以及白细胞/干细胞和祖细胞层转移至所述干细胞袋然后响应所述微控制器对来自预设重量的所述测压仪输入的接受，控制所述电动机，促使所述计量阀关闭所述处理袋与所述干细胞袋之间的所述流体通道。

2.权利要求1的系统，其中所述光学传感器位于所述处理设备中，从而使得在所述光学传感器水平和所述计量阀水平之间的所述处理袋中的体积是约2mL。

3.权利要求1的系统，其中所述微控制器被设定为在步骤（f）之后且步骤（g）之前接受来自所述加速计的输入，其中在所述处理设备中所述计量阀关闭，所述袋组以第四g力离心，所述第四g力足够使所述处理袋中的骨髓或脐带血再次分层为包含红细胞的层，包含白细胞/干细胞和祖细胞的层，以及包含血浆的层。

4.权利要求1的系统，其中所述第二和所述第三g力低于所述第一g力，并且其中所述第四g力等于所述第一g力。

5.一种用于从骨髓或脐带血制备干细胞产物的系统，其包括：

袋组，包括容纳收集的骨髓或脐带血的处理袋、红细胞浓缩袋、干细胞袋和计量阀，其中所述计量阀与所述处理袋、所述红细胞浓缩袋和所述干细胞袋连接；

处理设备，所述袋组安装到其内，

测压仪装置，用于测量所述干细胞袋的重量；

加速计装置，用于含有所述袋组的所述处理装置的离心g力；

光学传感器装置，用于测量通过所述处理袋的来自LED的透光率；

装置，用于接受第一、加速计装置测量的、含有所述袋组的所述处理装置的离心g力足够的时间段以使所述处理袋中的骨髓或脐带血分层为包含红细胞的层，包含白细胞/干细胞和祖细胞的层，以及包含血浆的层，其中所述计量阀关闭；

装置，用于以第二、加速计装置测量的、含有所述袋组的所述处理装置的离心g力打开所述计量阀，用于打开含有所述分层的骨髓或脐带血的所述处理袋与所述红细胞浓缩袋之间的流体通道，以允许相当一部分所述红细胞从所述处理袋转移至所述红细胞浓缩袋，并根据光学传感器装置测量的用于关闭所述流体通道的通过所述处理袋的来自所述LED的透光率一组量，用于关闭计量阀；和

装置，用于接连多次以第三、加速计装置测量的、含有所述袋组的所述处理装置的离心g力打开和关闭所述计量阀以相继重复打开和关闭所述处理袋与所述红细胞浓缩袋之间的所述流体通道接连重复的、不连续时间量，以允许另一部分所述红细胞从所述处理袋转移至所述红细胞浓缩袋，并根据所述光学传感器装置检测通过所述处理袋的来自所述LED的透光率的变化率的降低，用于关闭计量阀；和

装置，用于接连多次打开和关闭所述计量阀以相继重复打开和关闭所述处理袋与所述红细胞浓缩袋之间的流体通道接连重复的、不连续时间量，以足够使至少剩余的红细胞和白细胞/干细胞和祖细胞的层转移至所述干细胞袋，并根据预设的、测压仪装置测量的、所述干细胞袋的重量，用于关闭所述计量阀。

6.一种从骨髓或脐带血制备干细胞组合物的方法，其包括：

a.将收集的骨髓或脐带血放置到处理袋内，其中所述处理袋是袋组的部分，所述袋组还包括红细胞浓缩袋、干细胞袋和计量阀，并且进一步地，其中所述计量阀与所述处理袋、所述红细胞浓缩袋和所述干细胞袋连接；

b.将所述袋组放置到处理设备内，其中所述处理设备包括微控制器、伺服电动机、光学传感器、LED、测压仪和加速计，其中当所述袋组包含在所述处理设备中时，所述伺服电动机与所述计量阀可操作地偶联；

c.使包含所述袋组的所述处理设备以足够的g力和时间离心，以使所述处理袋中的所述骨髓或脐带血细胞分为红细胞层、WBC/干细胞和祖细胞层以及血浆层，其中所述计量阀关闭；

d.使包含所述袋组的所述处理设备以低于所述分层步骤中使用的g力的g力和足够的时间离心，以使大多数所述红细胞从所述处理袋分离到所述红细胞浓缩袋内，其中所述计量阀从所述处理袋打开到所述红细胞浓缩袋；

e.促使所述计量阀响应所述光学传感器检测来自所述LED的预定量透光率而关闭；

f.使包含所述袋组的所述处理设备以足够的g力和时间离心，以使更多所述红细胞从所述处理袋分离到所述红细胞浓缩袋内，其中所述计量阀接连打开且关闭多次；

g.促使所述计量阀响应所述光学传感器检测透光率的预设变化速率而关闭；

h.使所述干细胞袋校准为零，其中所述校准使用来自所述测压仪的数据来执行；

i.使包含所述袋组的所述处理设备以足够的g力和时间离心，以使剩余红细胞、所述WBC/干细胞和祖细胞层以及一些所述血浆从所述处理袋分离到所述干细胞袋内，其中所述计量阀接连打开且关闭多次；

j.促使所述计量阀响应所述测压仪测量所述干细胞袋的预设重量而关闭；

k.从所述处理单元中取出所述袋组；和

l.从所述袋组中取出包含所述干细胞组合物的所述干细胞袋。

7.权利要求6的方法，其在步骤（e）和（f）之间进一步包括，使包含所述袋组的所述处理设备以足够的g力和时间离心，以使所述处理袋中的所述骨髓或脐带血细胞再次分为红细胞层、WBC/干细胞和祖细胞层以及血浆层，其中所述计量阀关闭。

8.权利要求6的方法，其进一步包括预先选择所述干细胞组合物的体积。

9.权利要求8的方法，其中所述选择的体积通过选择所述干细胞袋中所述干细胞组合物的重量进行测定。

10.权利要求6的方法，其中所述收集骨髓的体积是约40mL-约240mL。

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