BR112015030822B1 - Vetor, ácido nucleico isolado, composição, método para preparar uma célula t e molécula de ácido nucleico isolada - Google Patents

Abstract

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA REDUZIR A IMUNOSSUPRESSÃO PELAS CÉLULAS TUMORAIS. A presente divulgação fornece, em parte, métodos de descobrir alvos de imunoterapia in vivo, composições terapêuticas (por exemplo, shRNA, células imunorresponsivas que expressam shRNA e/ou um receptor de antígeno quimérico (CAR)), e métodos de uso dos mesmos.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade para e o benefício do pedido provisório USSN 61/929,821, depositado em 21 de janeiro de 2014, USSN 61/921,303, depositado em 27 de dezembro de 2013 e USSN 61/833,298, depositado em 10 de junho de 2013.

SUPORTE GOVERNAMENTAL

[0002] Esta invenção foi feita com o suporte do governo sob as Concessões Nos. 1R01CA173750-01 e T32 AI07386, outorgadas pelo Instituto Nacional de Saúde (National Institutes of Health), e a Concessão No. P30-CA14051 Instituto Nacional do Câncer (National Cancer Institute). O Governo tem certos direitos na invenção.

CAMPO TÉCNICO

[0003] Esta invenção diz respeito a métodos de descobrir alvos de imunoterapia in vivo, composições terapêuticas que modulam alvos de imunoterapia (por exemplo, shRNA, células imunorresponsivas que expressam shRNA e, em alguns casos um receptor que mira em uma célula cancerosa, por exemplo, um receptor de antígeno quimérico (CAR)), e métodos relacionados de uso.

FUNDAMENTOS

[0004] As células citotóxicas T desempenham um papel central no controle imunomediado de cânceres1-3, e os anticorpos monoclonais que miram receptores inibidores nas células T podem induzir benefícios clínicos significantes em pacientes com doença avançada4-6. Para a sobrevivência, os tumores desenvolveram numerosos mecanismos imunossupressores para promover o seu próprio crescimento e para evitar com êxito o sistema imunológico do hospedeiro, bloqueando eficazmente a atividade de células T no microambiente de tumor. Este é um problema central na oncologia porque a forte infiltração pelas células T CD8, que têm função citotóxica contra células tumorais, é associada com um prognóstico favorável em tipos múltiplos de câncer humano1,3,8. Este mecanismo de defesa natural é severamente enfraquecido na maioria dos pacientes pelos sinais inibidores múltiplos que emanam do tumor, seu estroma, células T reguladoras e populações de célula mielóide.9-11 Vários mecanismos imunossupressores moleculares e celulares responsáveis pela evasão de tumor foram identificados. Certos destes mecanismos miram células imunes antitumor efetoras. Entretanto, muitos dos mecanismos reguladores que resultam na perda da função da célula T dentro de tumores imunossupressivos permanecem desconhecidos. Aperfeiçoar o sucesso limitado da imunoterapia contra o câncer requer novos métodos para inibir os caminhos imunossupressivos iniciados pelas células tumorais para escapar do sistema imunológico do hospedeiro.

SUMÁRIO

[0005] A presente divulgação fornece alvos para inibir caminhos imunossupressivos utilizados pelas células tumorais para inativar e/ou suprimir as células imunes.

[0006] A divulgação também fornece composições e métodos relacionados com shRNA com potencial terapêutico.

[0007] A divulgação também fornece células imunorresponsivas, incluindo células T (por exemplo, células que mira um antígeno tumoral) que expressam pelo menos um shRNA ou outra molécula de ácido nucleico capaz de silenciar genes que inibem a função da célula T.

[0008] A divulgação também fornece células imunorresponsivas, incluindo células T, que abrigam pelo menos um vetor expressando um shRNA e pelo menos um receptor de antígeno quimérico direcionado a um antígeno tumoral.

[0009] Em algumas formas de realização, a divulgação fornece células imunorresponsivas possuindo especificidade tumoral compreendendo um vetor que codifica um shRNA capaz de silenciar genes que inibem a função da célula T. Em alguns aspectos, a sequência de shRNA reduz a expressão de um gene selecionado do grupo consistido de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 ou Ppp3cc. Em outro aspecto, o shRNA compreende 15 nucleotídeos contíguos complementares a uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir grupo consistindo das SEQ ID NOs: 604 a 620 e 653 a 678. Em alguns aspectos, a célula imunorresponsiva compreende ainda um vetor que codifica um receptor de célula T específico de tumor. Em alguns aspectos, a célula imunorresponsiva é selecionada do grupo consistindo de um linfócito de infiltração de tumor (TIL), uma célula T Exterminadora Natural (NKT), um linfócito citotóxico T (CTL), e uma célula T CD4.

[0010] Em algumas formas de realização, a célula imunorresponsiva compreende um vetor que codifica um CAR, em que o CAR compreende um domínio de ligação de antígeno, um domínio de transmembrana, e um domínio estimulador. Em alguns aspectos, o domínio de ligação de antígeno liga um antígeno tumoral ou antígeno patogênico. Os antígenos de tumor exemplares incluem, por exemplo, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), antígeno carcinoembrionário (CEA), CD19, CD20, CD22, ROR1, mesotelina, CD333/IL3Ra, c- Met, Glicolipídeo F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, ERBB2, BIRC5, CEACAM5, WDR46, BAGE, CSAG2, DCT, MAGED4, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7, GAGE8, IL13RA2, MAGEA1, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA9, MAGEA10, MAGEA12, MAGEB1, MAGEB2, MAGEC2, TP53, TYR, TYRP1, SAGE1, SYCP1, SSX2, SSX4, KRAS, PRAME, NRAS, ACTN4, CTNNB1, CASP8, CDC27, CDK4, EEF2, FN1, HSPA1B, LPGAT1, ME1, HHAT, TRAPPC1, MUM3, MYO1B, PAPOLG, OS9, PTPRK, TPI1, ADFP, AFP, AIM2, ANXA2, ART4, CLCA2, CPSF1, PPIB, EPHA2, EPHA3, FGF5, CA9, TERT, MGAT5, CEL, F4.2, CAN, ETV6, BIRC7, CSF1, OGT, MUC1, MUC2, MUM1, CTAG1A, CTAG2, CTAG, MRPL28, FOLH1, RAGE, SFMBT1, KAAG1, SART1, TSPYL1, SART3, SOX10, TRG, WT1, TACSTD1, SILV, SCGB2A2, MC1R, MLANA, GPR143, OCA2, KLK3, SUPT7L, ARTC1, BRAF, CASP5, CDKN2A, UBXD5, EFTUD2, GPNMB, NFYC, PRDX5, ZUBR1, SIRT2, SNRPD1, HERV-K-MEL, CXorf61, CCDC110, VENTXP1, SPA17, KLK4, ANKRD30A, RAB38, CCND1, CYP1B1, MDM2, MMP2, ZNF395, RNF43, SCRN1, STEAP1, 707-AP, TGFBR2, PXDNL, AKAP13, PRTN3, PSCA, RHAMM, ACPP, ACRBP, LCK, RCVRN, RPS2, RPL10A, SLC45A3, BCL2L1, DKK1, ENAH, CSPG4, RGS5, BCR, BCR-ABL, ABL- BCR, DEK, DEK-CAN, ETV6-AML1, LDLR-FUT, NPM1-ALK1, PML-RARA, SYT- SSX1, SYT-SSX2, FLT3, ABL1, AML1, LDLR, FUT1, NPM1, ALK, PML1, RARA, SYT, SSX1, MSLN, UBE2V1, HNRPL, WHSC2, EIF4EBP1, WNK2, OAS3, BCL-2, MCL1, CTSH, ABCC3, BST2, MFGE8, TPBG, FMOD, XAGE1, RPSA, COTL1, CALR3, PA2G4, EZH2, FMNL1, HPSE, APC, UBE2A, BCAP31, TOP2A, TOP2B, ITGB8, RPA1, ABI2, CCNI, CDC2, SEPT2, STAT1, LRP1, ADAM17, JUP, DDR1, ITPR2, HMOX1, TPM4, BAAT, DNAJC8, TAPBP, LGALS3BP, PAGE4, PAK2, CDKN1A, PTHLH, SOX2, SOX11, TRPM8, TYMS, ATIC, PGK1, SOX4, TOR3A, TRGC2, BTBD2, SLBP, EGFR, IER3, TTK, LY6K, IGF2BP3, GPC3, SLC35A4, HSMD, H3F3A, ALDH1A1, MFI2, MMP14, SDCBP, PARP12, MET, CCNB1, PAX3- FKHR, PAX3, FOXO1, XBP1, SYND1, ETV5, HSPA1A, HMHA1, TRIM68, e qualquer combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, o domínio de ligação de antígeno é um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo (por exemplo, Fab ou um scFv). Os domínios intracelulares de tais CARs contêm domínios de ligação citoplásmica derivados do receptor de célula T e moléculas coestimuladoras.

[0011] Em algumas formas de realização, o vetor é um plasmídeo, vetor retroviral, ou vetor lentiviral.

[0012] Em algumas formas de realização, a divulgação fornece moléculas de ácido nucleico isoladas codificando uma sequência de shRNA. Em outra modalidade, a divulgação fornece moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam um CAR. Em uma outra modalidade, a divulgação fornece moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam um CAR e uma sequência de shRNA. Em alguns aspectos, o ácido nucleico isolado codifica uma sequência de shRNA reduz a expressão de um gene selecionado do grupo consistindo de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, , Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, ou Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 ou Ppp3cc. Em outro aspecto, o ácido nucleico isolado codifica um shRNA compreendendo 15 nucleotídeos complementares contíguos de uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 604-620 e 653-678.

[0013] Em algumas formas de realização, o ácido nucleico isolado codifica um CAR compreendendo um domínio de ligação de antígeno, um domínio de transmembrana, um domínio estimulador, e um domínio co-estimulador. Em algumas formas de realização, o domínio de ligação de antígeno é um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo (por exemplo, Fab ou um scFv). Em algumas formas de realização, o domínio de ligação de antígeno é um domínio de sinalização citoplásmico derivado do receptor de célula T e moléculas coestimuladoras.

[0014] Em algumas formas de realização, o domínio de ligação de antígeno liga antígeno tumoral (por exemplo, um antígeno tumoral associado com um tumor sólido, tumor linfoide, melanoma, carcinoma, sarcomas, adenocarcinoma, linfoma, leucemia, câncer renal, de mama, de pulmão, vesical, cólon, de ovário, de prostata, de pâncreas, de estômago, cerebral, da cabeça e pescoço, de pele, de útero, de testículo, glioma, de esfôfago, e de fígado).

[0015] Em algumas formas de realização a divulgação fornece vetores compreendendo um ácido nucleico isolado que codifica uma sequência de shRNA, um ácido nucleico isolado que codifica um CAR, ou um ácido nucleico isolado que codifica um CAR e uma sequência de shRNA. Em alguns aspectos, o vetor é um plasmídeo, vetor lentiviral, vetor retroviral, vetor adenoviral, vetor viral adeno- associado. O shRNA pode ser operavelmente ligado ao promotor da RNA polimerase II ou um promotor da RNA polimerase III.

[0016] Já em outras formas de realização, a invenção fornece composições compreendendo células imunorresponsivas de acordo com a invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0017] Em algumas formas de realização, a divulgação fornece células imunorresponsivas transfectadas com um primeiro vetor que codifica um CAR e um segundo vetor que codifica uma sequência de shRNA. Em alguns aspectos, a sequência de shRNA reduz a expressão de um gene selecionado do grupo consistindo de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Map3k3, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 ou Ppp3cc. Em outro aspecto, o shRNA compreende 15 nucleotídeos complementares contíguos de uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 604 a 620 e 653 a 678. Em alguns aspectos, a célula imunorresponsiva compreende ainda um vetor que codifica um receptor de célula T específico de tumor. Em alguns aspectos, a célula imunorresponsiva é selecionada do grupo consistindo de um linfócito de infiltração de tumor (TIL), uma célula T Exterminadora Natural (NKT), um linfócito citotóxico T (CTL), e uma célula T CD4.

[0018] Em algumas formas de realização, a divulgação fornece métodos para tratamento de câncer em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma célula T autóloga modificada para expressar um receptor de célula T específico de tumor ou CAR e um shRNA, em que a sequência de shRNA reduz a expressão de um gene selecionado do grupo consistindo de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Map3k3, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 ou Ppp3cc. Em alguns aspectos, a sequência de shRNA compreende 15 nucleotídeos complementares contíguos de uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo de: SEQ ID NOs: 604 a 620 e 653 a 678; e em que o CAR compreende um domínio de ligação de antígeno, um domínio de transmembrana, um domínio estimulador, e um domínio co-estimulador. Em alguns aspectos, o CAR compreende um domínio de ligação de antígeno, um domínio de transmembrana, um domínio estimulador, e um domínio co-estimulador.

[0019] Em algumas formas de realização, a divulgação fornece métodos para tratar câncer em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma célula T autóloga modificada para expressar um receptor de célula T específico de tumor ou CAR e um shRNA da invenção. Em outra modalidade, a divulgação fornece métodos para tratar câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo pelo silenciamento de genes que inibem a função da célula T compreendendo administrar ao indivíduo uma célula imunorresponsiva compreendendo um vetor, o vetor codificando um receptor de célula T específico de tumor ou um CAR e uma sequência de shRNA da invenção.

[0020] Em algumas formas de realização, a divulgação fornece métodos para identificar um gene que inibe a função de uma célula T imunorresponsiva, o método compreendendo fornecer uma população de células T imunorresponsivas que abrigam vetores que expressam um shRNA, contatar a população de células T imunorresponsivas com um tumor imunossupressivos,determinar se um shRNA restaura a função da célula T dentro do tumor imunossupressivo, e identificar um gene associado com um shRNA que restaura a função da célula T dentro do tumor como um gene que inibe a função de células T de infiltração em tumor.

[0021] Em algumas formas de realização, a divulgação fornece métodos para aumentar a resposta imune em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar um agente terapêutico que module a atividade de um gene selecionado do grupo consistindo de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 e Ppp3cc.

[0022] Em alguns casos a sequência que codifica um shRNA compreende uma primeira sequência compreendendo 15 a 25 (15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25) nucleotídeos complementares a qualquer uma das SEQ ID NOs: 604 a 620 ou SEQ ID NOs: 653 a 678 e uma segunda sequência que é o complemento reverso da primeira sequência com um ou nenhum emparelhamento (isto é, é perfeitamente complementar à primeira sequência), e uma terceira sequência de 5 a 9 nucleotídeos posicionada entre a primeira e segunda sequências.

[0023] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. Métodos e materiais são aqui descritos para o uso na presente invenção; outros métodos e materiais adequados conhecidos na técnica também podem ser utilizados. Os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não intencionados a serem limitantes. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, controlará.

[0024] Outras características e vantagens da invenção estarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e figuras, e a partir das reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] O depósito de patente ou pedido contém pelo menos um desenho executado a cores. As cópias da publicação desta patente ou pedido de patente com desenho(s) a cores serão fornecidos pelo Escritório sob requisição e pagamento das taxas necessárias.

[0026] A FIG. 1 é um diagrama esquemático demonstrando um método exemplar para a descoberta in vivo de shRNAs que realçam a infiltração e acúmulo de célula T dentro do microambiente de tumor.

[0027] A FIG. 2 é um conjunto de gráficos que mostram plotagens representativas de citometria de fluxo de células T CD8+ de camundongos transgênicos Rag1-/-/OT-I TCR a seguir da infecção com um vetor shRNA. A eficiência de transdução foi determinada com base na expressão do repórter Thy1.1 codificado pelo vetor lentiviral. As células T que expressam o shRNA de controle LacZ cultivadas em citocina foram depois tingidas com um painel de marcadores de ativação (linhas pretas; controle de isótipo, sombreado). A maioria das células T infectadas exibiu um fenótipo de memória central (CD62L+CD44+).

[0028] A FIG. 3 é um conjunto de gráficos demonstrando plotagens da citometria de fluxo representativas de células T OT-I classificadas a partir de tumores e órgãos linfoides secundários para a análise de sequenciamento profundo (dLN, linfonodo de drenagem de tumor; irLN, linfonodo irrelevante). As células CD8+Vα2+Vβ5+Thy1.1+ foram classificadas e o DNA genômico foi extraído para a amplificação pela PCR do cassete de shRNA.

[0029] A FIG. 4 é um conjunto de gráficos demonstrando dados de sequenciamento profundo a partir da triagem de reunião de shRNA in vivo. Linha superior, leituras de sequência para todos os genes em uma reunião em tumor, linfonodo de irrelevante (irLN) e de drenagem (dLN); linha inferior, três genes individuais (LacZ, controle negativo) são plotados em comparação ao baço quanto aos tumores, linfonodos irrelevantes (irLN) e linfonodos de drenagem de tumor (dLN). As leituras de sequência são plotadas para estes tecidos versus baços. Linhas tracejadas indicam um desvio em log2 da diagonal.

[0030] A FIG. 5 é um conjunto de gráficos demonstrando dados de sequenciamento profundo da triagem de disfunção de célula T. As leituras do sequenciamento de shRNA para genes positivos na triagem secundárias são plotados em comparação ao baço para tumores (vermelho), linfonodos irrelevantes (irLN, azul) e linfonodos de drenagem de tumor (dLN, verde), com linhas tracejadas indicando um desvio de log2 da diagonal. Os dados mostram enriquecimento de shRNAs particulares representando estes genes em tumores comparado aos baços ou linfonodos.

[0031] A FIG. 6 são gráficos demonstrando a quantificação com base na citometria de fluxo de enriquecimento de célula T OT-I CD8+ em tumores relativos ao baço. A porcentagem de células T OT-I que expressam shRNA foi determinada pela citometria de fluxo em tumores/baços pela comutação nas proteínas repórter em células T CD8+Vα2+Vβ5+. A significância estatística foi determinada para cada shRNA experimental contra shRNA LacZ (vezes de enriquecimento tumor/baço) (n = 3; * p < 0,05, ** p < 0,01, teste t de Student).

[0032] A FIG. 7 é um conjunto de gráficos demonstrando plotagens da citometria de fluxo representativas de enriquecimento de célula em tumor transduzido com vetores de shRNA (LacZ, Akap8I, Smad2, Rbks, Dgkz). A porcentagem de células T OT-I que expressam shRNA foi determinada pela citometria de fluxo em tumores/baços pela comutação nas proteínas repórter em células T CD8+Vα2+Vβ5+.

[0033] A FIG. 8 é um conjunto de gráficos demonstrando a quantificação com base na citometria de fluxo do enriquecimento de célula T CD4+ e CD8+ em tumores. As células T que expressam shRNA foram identificadas em tumores e baços utilizando repórter Thy1.1 (% de células T CD8 Thy1.1+ ou células T CD4+, painéis de topo e fundo). Os números totais de células T que expressam LacZ ou Ppp2r2d shRNA foram determinados nos tumores e baços 7 dias a seguir da transferência de 2 x 106 células que expressam shRNA (painéis da direita). Vezes de enriquecimento de células que expressam shRNA T Ppp2r2d versus LacZ em tumores são indicadas.

[0034] A FIG. 9 é um gráfico demonstrando a reversão da expansão da célula T mediada por Ppp2r2d shRNA em tumores pelo cDNA de Ppp2r2d com um sítio de ligação de shRNA mutado mas a sequência de proteína preservada. As três populações de célula foram identificadas com base nos relatórios coexpressados; às vezes de enriquecimento foram calculadas com base na porcentagem de células positivas em repórter em tumores versus baços.

[0035] A FIG. 10a descreve a geração de cDNA de Ppp2r2d mutante com sequência de proteína preservada mas o sítio de ligação de shRNA rompido. As células EL4 foram transduzidas com cDNA de Ppp2r2d mutante ou tipo selvagem em um vetor também contendo GFP. As células positivas em GFP foram classificadas quanto à pureza e transduzidas com vetores de shRNA LacZ ou Ppp2r2d que expressam um repórter Thy1.1. As células transduzidas com shRNA (Thy1.1+) foram analisadas pela citometria de fluxo quanto à expressão de GFP. O shRNA Ppp2r2d reduziu os níveis de GFP quando Ppp2r2d do tipo selvagem, mas não quando Ppp2r2d mutante foi expressado. (SEQ ID Nos: 679-681 apresentadas)

[0036] A FIG. 10b demonstra que a expressão de cDNA mutante em Ppp2r2d impede o fenótipo induzido pelo shRNA Ppp2r2d. As células T OT-I foram transduzidas com um vetor que codifica shRNA LacZ, shRNA Ppp2r2d ou shRNA Ppp2r2d mais cDNA de Ppp2r2d mutante. As populações de célula diferentes foram normalizadas quanto à eficiência de transdução e co-injetadas em camundongo que carrega o tumor B16-Ova. A porcentagem de cada população de célula T em tumores e baços foi quantificada pela comutação nas células T CD8+Vα2+Vβ5+; células transduzidas foram detectadas com base na expressão de Thy1.1 ou relatórios fluorescentes de Ametrina/GFP (dados representativos de 2 experimentos independentes, n = 3 camundongos por experimento).

[0037] A FIG. 10c é um gráfico que demonstra a análise de PCR em tempo real para a expressão de Ppp2r2d nas células T OT-I transduzidas com shRNA LacZ, shRNA Ppp2r2d, e shRNA Ppp2r2d mais cDNA mutante de Ppp2r2d. Os dados representam replicas biológicas (n = 3), cada valor representa a média +/- desvio padrão.

[0038] A FIG. 11 são gráficos demonstrando a análise de qPCR em tempo real para os níveis de mRNA de Ppp2r2d em células T OT-I transduzidas com shRNA LacZ ou um dos três shRNAs Ppp2r2d identificados na triagem.

[0039] A FIG. 12a é uma tabela demonstrando o enriquecimento de shRNAs particulares em tumor versus baço que foi calculado com base nos resultados do sequenciamento profundo da triagem secundária.

[0040] A FIG. 12b demonstra o agrupamento de níveis de expressão médias para mRNAs descobertos como sendo significantemente regulados pelas células T em ou tumores que expressam shRNA de controle LacZ ou um de cinco shRNAs experimentais. As diferenças de expressão significantes foram definidas como um valor Anova p<0,01 entre as células T que expressam shRNA de controle LacZ ou um de cinco shRNAs experimentais (Alk, Arhgap5, Egr2, Ptpn2 ou Ppp2r2d) (JMP- Genomics 6,0, SAS Institute Inc.). mRNAs significantemente reguladas em um ou mais grupos de tratamento são demonstrados depois do agrupamento (Fast Ward).

[0041] A FIG. 12c é um diagrama de Venn demonstrando sobreposições entre as assinaturas de expressão pelas células T de infiltração em tumor transduzidas com um dos cinco shRNAs experimentais (assinaturas definidas como um Anova p<0,01 como descrito acima). São indicados os números das IDs da sonda de sobreposição para qualquer combinação das 5 assinaturas, como indicado pelos ovais de sobreposição. A significância das sobreposições versus aquela esperada pela chance aleatória (Teste Exato de Fisher) é demonstrado na tabela anexa.

[0042] A FIG. 13a é um conjunto de gráficos demonstrando plotagens da citometria de fluxo representativas da demonstração da frequência de células T CD8 transduzidas por Ppp2r2d ou LacZ em tumores no dia 1.

[0043] A FIG. 13b é um par de gráficos demonstrando o grau de proliferação (com base na diluição de CFSE) pelas células T CD8 transduzidas por shRNA Ppp2r2d comparadas com as células T transduzidas com shRNA LacZ em tumores nos dias 1, 3, 5, e 7.

[0044] A FIG. 13c é um conjunto de gráficos demonstrando que o silenciamento de Ppp2r2d inibe a apoptose de célula T no encontro de células tumorais. As células T OT-I rotuladas com CFSE foram cocultivadas com células tumorais B16-Ova por 72 horas. As células foram tingidas com CD8 e anexina V.

[0045] A FIG. 13d é um conjunto de gráficos demonstrando o tingimento intracelular para as proteínas anti-apoptóticas. As células T OT-I que expressam shRNA LacZ ou Ppp2r2d foram cocultivadas com células tumorais B16-Ova por 48 horas e depois tingidas com controle de isótipo (cinza) e anticorpos fosfo-AKT (Ser473), fosfo-Bad (Ser 112) ou Bcl-2.

[0046] A FIG. 13e são gráficos demonstrando a secreção de IFN-Y aumentada pelas células T silenciadas com Ppp2r2d. As células T OT-I isoladas de camundongos que carregam tumor B16-Ova foram ensaiadas quanto à expressão de IFN-y pelo tingimento intracelular.

[0047] A FIG. 13f é um conjunto de gráficos demonstrando que as células T silenciadas em Ppp2r2d expandem nos tumores mesmo sem a apresentação de antígenos de tumor pelas células que apresentam antígeno profissionais. As células T OT-I que expressam shRNA LacZ ou Ppp2r2d foram transferidas para camundongos C57BL/6 ou b2m-/- que carregam tumor B16-Ova de 14 dias. As células T que expressam shRNA foram identificadas com base na expressão de proteína fluorescente verde azulada (TFP) ou Thy1.1 (vezes de enriquecimento em tumores comparado aos baços).

[0048] A FIG. 13g são gráficos demonstrando que o silenciamento de Ppp2r2d inibe a apoptose de célula T no encontro de células tumorais. As células T OT-I rotuladas com CFSE foram cocultivadas com células tumorais B16-Ova por 72 horas (caspase-3 ativada).

[0049] A FIG. 14 é um conjunto de gráficos demonstrando células T OT-I que expressam shRNAs LacZ ou Ppp2r2d rotuladas com CFSE e estimuladas com anticorpo CD3 por 72 h. As células foram depois tingidas com CD8 e anexina V e analisadas pela citometria de fluxo.

[0050] A FIG. 15 é um conjunto de gráficos demonstrando o acúmulo de células T Ppp2r2d que expressam shRNA em tumores e linfonodos de drenagem de tumor, mas não outros órgãos linfoides secundários. As células T OT-I que expressam shRNAs Ppp2r2d ou LacZ foram rotuladas com CFSE e injetadas em camundongos que carregam tumor B16-Ova. As células T foram isoladas dos órgãos indicados nos dias 1, 3, 5 e 7 para examinar o grau de acúmulo de célula T com base na diluição do corante CSFE.

[0051] As FIGs. 16a-c são um conjunto de gráficos demonstrando que o silenciamento de Ppp2r2d realça a atividade antitumor de células T CD4 e CD8. As células T foram ativadas com grânulos anti-CD3/CD28, infectadas com lentivírus que direciona a expressão de shRNA LacZ ou Ppp2r2d e injetadas em camundongos que carregam os tumores B16-Ova (a,b) ou B16 (c). O tamanho dos tumores foi medido a cada três dias seguindo a transferência de célula T utilizando paquímeros nos dois eixos mais longos. As células T OT-I a,b CD4+ TRP-1 e/ou CD8+ (2 x 106) foram transferidas (dia 12 e 17) para em camundongos que carregam tumores B16- Ova de 12 dias. A carga tumoral (a) e a sobrevivência (b) foram avaliadas. Células T CD4+ TRP-1 e CD8+ pmel-1 (3 x 106 CD4+ TRP-1 mais 3 x 106 CD8+ pmel-1) foram transferidas (dias 10 e 15) para camundongos com tumores B16 de 10 dias. O teste de classificação Log (Mantel-Cox) foi realizado utilizando GráficoPad Prism versão 6 comparando a sobrevivência de camundongos tratados com células T que expressam shRNA LacZ versus Ppp2r2d.

[0052] A FIG. 17 é um conjunto de gráficos demonstrando a análise de FACS do enriquecimento de célula T em tumores comparados ao baço para células que expressam um painel de shRNAs Ppp2r2d ou Cblb (painéis superiores). Os níveis de mRNA Ppp2r2d e Cblb foram medidos pela qPCR antes da transferência de célula T (painéis inferiores). Os dados representam réplicas biológicas (n = 3), cada valor representa a média +/- desvio padrão.

[0053] A FIG. 18 é um conjunto de gráficos demonstrando a quantificação da proteína Ppp2r2d pela espectrometria de massa com peptídeos sintéticos rotulados (AQUA, razão de peptídeos endógenos para AQUA). Os dados representativos de dois experimentos independentes (a-d); teste t de student bilateral, * P<0.05, ** P<0.01; média +/- desvio padrão.

[0054] A FIG. 19 é um gráfico demonstrando a análise de qPCR para mRNA Ppp2r2d em células T OT-I que infiltram tumor (dia 7).

[0055] A FIG. 20a são gráficos demonstrando plotagens da citometria de fluxo representativas demonstrando a proliferação de células T que expressam shRNA Ppp2r2d em tumores e linfonodos de drenagem de tumor. As células T OTI que expressam shRNAs Ppp2r2d ou LacZ foram rotuladas com CFSE e injetadas em camundongos que carregam o tumor B16-Ova. As células T foram isoladas dos órgãos indicados nos dias 1, 3, 5 e 7 para examinar o grau de proliferação de célula T com base na diluição de CFSE. As células T que não diluíram CFSE (células que não se dividem) foram quantificadas (direita).

[0056] A FIG. 20b são gráficos demonstrando plotagens da citometria de fluxo representativas demonstrando a viabilidade das células T de infiltração em tumor. As células T OT-I que expressam shRNAs Pp2r2d ou LacZ foram injetadas em camundongos que carregam tumor B16-Ova. As células T foram isoladas no dia 7 e a apoptose foi avaliada pelo tingimento intracelular com um anticorpo específico para a caspase-3 ativada (alguma morte de célula T pode ter sido causada pelo procedimento de isolação de tumores).

[0057] FIG. 20c são gráficos demonstrando plotagens da citometria de fluxo representativas demonstrando o tingimento da citocina intracelular para IFNY pelas células T LacZ e Ppp2r2d que expressam shRNA colhidas de tumores B16-Ova; as células T foram rotuladas com CFSE antes da injeção. Os dados para todos os experimentos são representativos de dois testes independentes. A análise estatística foi realizada em réplicas biológicas (n = 3); * P<0.05, ** P<0.01, teste t de Student bilateral. Cada valor representa média +/- desvio padrão.

[0058] As FIGs. 21a-c são uma série de gráficos demonstrando a análise ex vivo da produção de citocina pelas células T OT-I que infiltram tumor em um nível de célula única utilizando um dispositivo de nanorreservatório (84,672 reservatórios com volume de picolitro). a, Células únicas representativas em nanorreservatórios e padrões correspondentes de secreção de citocina. b, Porcentagem de células T que secretam as citocinas indicadas. c, Taxas de secreção de citocina calculadas a partir de curvas padrão (média +/- desvio padrão, teste de Mann Whitney * P<0.05).

[0059] A FIG. 22a é um conjunto de gráficos demonstrando plotagens da citometria de fluxo representativas demonstrando que a maioria das células OT-I adotivamente transferida tem um fenótipo de memória em linfonodos, mas um fenótipo efetor em tumores. As células pré-tratadas com citocina que expressam shRNAs Ppp2r2d ou LacZ foram injetadas em camundongos que carregam tumores B16-Ova de 14 dias. No dia 7 a seguir da transferência, as células T foram colhidas dos órgãos indicados e tingidas com anticorpos CD62L e CD44. A análise FACS de células OT-I que expressam shRNA foi realizada pela comutação nas células CD8/Thy1.1 positivas duplas.

[0060] A FIG. 22b é um conjunto de gráficos demonstrando plotagens da citometria de fluxo representativas demonstrando a análise de marcadores de exaustão. As células OT-I foram colhidas a partir de linfonodos de drenagem e tumores de camundongos e tingidas com anticorpos específicos para TIM-3, LAG-3, PD-1 e CD25. Para todos os experimentos (n = 3 réplicas biológicas; * P<0.05, ** P<0.01, Teste t de Student bilateral); cada valor representa média +/- desvio padrão.

[0061] A FIG. 23a é um conjunto de gráficos que apresentam a demonstração de tingimento intracelular para granzyme B pelas células T OT-I nos linfonodos de drenagem de tumor e tumores.

[0062] A FIG. 23b é um par de imagens e um gráfico demonstrando a infiltração de células T que expressam shRNA dentro de tumores. As células T OT-I foram transduzidas com vetores shRNA LacZ ou Ppp2r2d que codificam um repórter de GFP e injetadas em camundongos que carregam tumor B16-Ova. Depois de 7 dias, os tumores foram excisados e as seções congeladas tingidas com anti-GFP e DAPI para enumerar células T OT-I que expressam shRNA em tumores.

[0063] A FIG. 23c é um par de imagens e um gráfico demonstrando a imunoistoquímica TUNEL realizada nas seções de tecido e as células apoptóticas foram quantificadas.

[0064] A FIG. 23d é um conjunto de gráficos demonstrando a expressão de MHC classe I pelas células tumorais. Os tumores foram digeridos com colagenase e tingidos com anticorpos CD45.2 e H-2Kb. A análise de FACS para a expressão de H-2Kb foi realizada pela comutação nas células de melanoma negativas em CD45.2. Os dados representam réplicas biológicas (n = 3), cada valor representa a média +/- desvio padrão.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0065] A presente divulgação está fundamentada, em parte, na observação de que os mecanismos regulatórios que resultam na perda de função da célula T dentro de tumores imunossupressivos podem ser sistematicamente descobertos in vivo utilizando um método de triagem de RNA de grampo de cabelo pequeno reunido (shRNA) intencionado na identificação de genes que bloqueiam a função de células T que infiltram no tumor. Como descrito na seção de fundamentos acima, os mecanismos imunossupressores associados a tumor ativamente bloqueiam a atividade das células T no microambiente de tumor. Os métodos aqui descritos identificam shRNAs que possibilitam a infiltração robusta de célula T e o acúmulo em tumores, a despeito dos sinais inibidores múltiplos. Como descrito abaixo, os métodos identificam shRNA que silenciam a expressão de genes responsáveis pela imunossupressão pelos tumores, possibilitando a infiltração realçada de célula T e acúmulo em tumores e resistência à apoptose.

[0066] Em alguns casos, a divulgação fornece métodos para identificar especificamente mecanismos reguladores que resultam na perda de função da célula T dentro do microambiente do tumor. Estes métodos podem incluir: fornecer uma população de células T que abrigam vetores que expressam um shRNA; contatando a população de células T com um tumor imunossupressivo; determinar se um shRNA restaura a função da célula T (por exemplo, restaura a capacidade da célula T para infiltrar e proliferar dentro do microambiente do tumor) dentro do tumor imunossupressivo; identificar um gene associado com um shRNA que restaura a função da célula T dentro do tumor como um gene que inibe a função da célula T dentro do microambiente do tumor.

[0067] A divulgação fornece genes alvos para reduzir o efeito imunossupressivo de tumores. A expressão dos genes alvos pode ser reduzido nas células imunes, por exemplo, células T que reconhecem antígenos associados a tumor, e a redução na expressão dos genes alvo pode aumentar a capacidade das células para evitar os mecanismos imunossupressores associados a tumor.

[0068] A divulgação fornece shRNAs que reduzem (por exemplo, silenciam, eliminam, reduzem, desativam, ou diminuem) a expressão de genes que comunicam a função de células T que infiltram tumores. Estes shRNA foram identificados a partir da transferência de células T transduzidas em shRNA em tumores, seguida pelo sequenciamento profundo para quantificar a representação de todos shRNAs no tumor e órgãos linfoides. Os shRNA divulgados representativos aqui incluem shRNA que reduzem a atividade de genes incluindo, por exemplo, Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 e Ppp3cc.

[0069] Em alguns casos, a divulgação fornece composições terapêuticas (por exemplo, incluindo moléculas de ácido nucleico isoladas, vetores que expressam moléculas de ácido nucleico que codificam o shRNA) relacionados com os shRNAs que silenciam a expressão de genes que bloqueiam a função de células T que infiltram tumor. Em outros aspectos, a divulgação fornece células imunorresponsivas modificadas (por exemplo, células T, incluindo células T Exterminadoras Naturais (NKT), um linfócito citotóxico T (CTL), e uma célula T reguladora) que abrigam vetores capazes de expressar o shRNA aqui descrito. Em outro aspecto, as células imunorresponsivas modificadas abrigam ainda um vetor capaz de expressar um CAR tendo um domínio de ligação de antígeno que mira um antígeno específico de tumor.

Interferência de RNA

[0070] Uma das descobertas recentes mais importantes na pesquisa biomédica é o caminho da interferência de RNA (RNAi), que é utilizado pelas células para regular a atividade de muitos genes. Os princípios de RNAi têm aberto muitas novas possibilidades para a identificação de alvos terapêuticos. A interferência de RNA (RNAi) é uma ferramenta eficaz para a escala de genoma, análise de alto rendimento da função de gene. O termo “interferência de RNA” (RNAi), também chamado silenciamento de gene pós transcricional (PTGS), refere-se ao processo biológico no qual as moléculas de RNA inibem a expressão gênica. Um “agente de interferência de RNA” como aqui utilizado, é definido como qualquer agente que interfere com a expressão ou a inibe de um gene alvo, por exemplo, um gene alvo da invenção, pela interferência de RNA (RNAi). Tais agentes que interferem no RNA incluem, mas não são limitados a, moléculas de ácido nucleico incluindo moléculas de RNA que são homólogas ao gene alvo, por exemplo, um gene alvo da invenção, ou um fragmento do mesmo, RNA curto interferente (siRNA), RNA curto de grampo de cabelo (shRNA), e moléculas pequenas que interferem com a expressão ou a inibem de um gene alvo pela interferência de RNA (RNAi).

[0071] A “interferência de RNA (RNAi)” é um processo por meio do qual a expressão ou introdução de RNA de uma sequência que é idêntica ou altamente similar a um gene alvo resulta na degradação específica de sequência ou PTGS do RNA mensageiro (mRNA) transcrito a partir deste gene mirado, inibindo, deste modo, a expressão do gene alvo. Este processo foi descrito em células de plantas, invertebrados, e mamíferos. O RNAi também pode ser iniciado pela introdução de moléculas de ácido nucleico, por exemplo, siRNAs sintéticos ou agentes que interferem no RNA, para inibir ou silenciar a expressão de genes alvos. Como aqui utilizado, “inibição da expressão de gene alvo” ou “inibição da expressão de gene marcador” incluem qualquer diminuição na expressão ou atividade de proteína ou nível do gene alvo (por exemplo, um gene marcador da invenção) ou proteína codificada pelo gene alvo, por exemplo, uma proteína marcadora da invenção. A diminuição pode ser de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% ou mais quando comparado com a expressão de um gene alvo ou a atividade ou nível da proteína codificada por um gene alvo que não foi mirado por um agente que interfere no RNA.

[0072] O “RNA interferente curto” (siRNA), também aqui aludido como “RNA interferente pequeno” é definido como um agente que funciona para inibir a expressão de um gene alvo. Estas são as moléculas efetoras para induzir RNAi, levando ao silenciamento de gene pós transcricional com o complexo de silenciamento indutor de RNA (RISC). Além do siRNA, que pode ser quimicamente sintetizado, vários outros sistemas na forma de moléculas efetoras potenciais para o silenciamento de gene pós transcricional estão disponíveis, incluindo RNA de grampo de cabelo curtos (shRNAs), dsRNAs longos, RNAs temporais curtos, e micro RNAs (miRNAs). Estas moléculas efetoras são processadas em siRNA, tais como no caso de shRNA, ou diretamente ajudam no silenciamento de gene, como no caso de miRNA. A presente invenção abrange assim o uso de shRNA assim como qualquer outra forma adequada de RNA para efetuar o silenciamento de gene pós transcricional pelo RNAi. O uso de shRNA tem a vantagem em relação ao uso de siRNA quimicamente sintetizado em que a supressão do gene alvo é tipicamente de longa duração e estável. Um siRNA pode ser quimicamente sintetizado, pode ser produzido in vitro pela transcrição, ou pode ser produzido dentro de uma célula hospedeira a partir do shRNA expressado.

[0073] Em uma modalidade, um siRNA é um RNA de grampo de cabelo pequeno (shRNA) (também chamado de haste alça). Estes shRNAs são compostos de um filamento de antissentido curto (por exemplo, 19 a 25 nucleotídeos), seguido por uma alça de 5 a 9 nucleotídeos, e o filamento de sentido complementar. Alternativamente, o filamento de sentido pode preceder a estrutura de alça de nucleotídeo e o antifilamento de sentido pode seguir. Estes shRNAs podem estar contidos em plasmídeos, retrovírus, e lentivírus.

[0074] Como aqui utilizado, “silenciamento de gene” induzido pela interferência de RNA se refere a um diminuição no nível de mRNA em uma célula para um gene alvo em pelo menos cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99%, cerca de 100% do nível de mRNA encontrado na célula sem introdução da interferência de RNA. Em uma modalidade preferida, os níveis de mRNA são diminuídos em pelo menos cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99%, cerca de 100%.

[0075] Os termos “reduzido” ou “reduzir” tal como aqui utilizados geralmente significam uma diminuição em pelo menos 10% quando comparado a um nível de referência, por exemplo uma diminuição em pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90% ou até e incluindo uma diminuição de 100%, ou qualquer diminuição de número inteiro entre 10 e 100% quando comparado a um nível de referência.

[0076] Os termos “aumentado” ou “aumentar” tal como aqui utilizados no geral significa um aumento de pelo menos 10% quando comparado a um nível de referência, por exemplo um aumento de pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90% ou até e incluindo um aumento de 100% ou qualquer aumento de número inteiro entre 10 e 100% quando comparado a um nível de referência, ou um aumento de cerca de 2 vezes, ou um de cerca de 3 vezes, ou um de cerca de 4 vezes, ou um de cerca de 5 vezes ou um de cerca de 10 vezes, ou qualquer aumento entre 2 vezes e 10 vezes ou maior quando comparado a um nível de referência.

Células imunorresponsivas

[0077] Em algumas formas de realização, a divulgação fornece células imunorresponsivas, incluindo células T, células T citotóxica, linfócito de infiltração de tumores (TIL), células T (CD4) reguladoras, e células Exterminadoras Naturais (NKT), que expressam pelo menos um de um receptor que reconhece antígeno. Em qualquer aspecto, as células imunorresponsivas expressam pelo menos um receptor que reconhece antígeno específico de tumor. Em alguns aspectos, as células T específicas de antígeno de célula de tumor, células NKT, TIL, células CTL ou outras células imunorresponsivas são utilizadas. Os exemplos não limitantes de células imunorresponsivas incluem células T, tais como, por exemplo, células T αβ-TCR+ (por exemplo, células T CD8+ ou células T CD4+) células T Yδ- TCR+, linfócito de infiltração de tumores (TIL), células T Exterminadoras Naturais (NKT), um linfócito citotóxico Ts (CTL), e uma células T CD4.

Composições de Ácido Nucleico

[0078] Em algumas formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA compreendendo uma sequência de pelo menos 12, 15, 20 ou 25 nucleotídeos complementares contíguos a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 604 a 620 e 653 a 678. O shRNA também inclui o complemento reverso da sequência de nucleotídeo contígua e uma sequência curta localizada entre as duas sequências de modo que as duas sequências formem uma haste alça shRNA que pode ser processada dentro de uma célula fornecendo um siRNA que inibe a expressão da proteína codificada por uma das SEQ ID NOs: 604 a 620 e 653 a 678, e composições das mesmas.

[0079] A Tabela 1 fornece uma lista de genes aqui identificados como estando envolvidos com a imunossupressão de tumor de células T. TABELA 1

[0080] Em alguns aspectos, os ácidos nucleicos das composições codificam as sequências de shRNA que miram as sequências fornecidas na Tabela 2. A Tabela 2 demonstra ainda o enriquecimento em tumor versus baço para o shRNA selecionado com base na análise de sequenciamento profundo (“Enrich Fold”) TABELA 2

[0081] shRNAs demonstrando um enriquecimento dos shRNAs de pelo menos > 3 vezes em tumores relativos ao baço indicam uma região de sequência alvo mais ativa.

[0082] Em alguns aspectos, os ácidos nucleicos das composições codificam a sequência de shRNAs que mira as sequências de Ppp2r2d e Cblb humana fornecida na Tabela 2a. TABELA 2a.

[0083] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo de Ppp2r2d idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, ou 386.

[0084] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência de Pp2r2d humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, ou 386.

[0085] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo de Eif2ak3 idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 ou 147.

[0086] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Eif2ak3 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 ou 147.

[0087] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Arhgap5 idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, ou 42.

[0088] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Arhgap5 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, ou 42.

[0089] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Smad2 idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, ou 490.

[0090] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Smad2 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, ou 490.

[0091] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam as sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Akap8l idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15.

[0092] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Akap8l humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15.

[0093] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam as sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Rbks idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, ou 445.

[0094] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Rbks humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, ou 445.

[0095] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Egr2 idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, ou 132.

[0096] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Egr2 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, ou 132.

[0097] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Dgka idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 ou 117.

[0098] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Dgka humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 ou 117.

[0099] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Cblb idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, ou 72.

[00100] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência de Cblb humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, ou 72.

[00101] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Mdfic idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, ou 299.

[00102] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Mdfic humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, ou 299.

[00103] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Entpd1 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, ou 162.

[00104] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Entpd1 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, ou 162.

[00105] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Vamp7 idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, ou 587.

[00106] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Vamp7 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, ou 587.

[00107] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Hipk1 idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, ou 222.

[00108] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Hipk1 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, ou 222.

[00109] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Nuak2 idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, ou 329.

[00110] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Nuak2 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, ou 329.

[00111] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Alk idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou 31.

[00112] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Alk humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou 31.

[00113] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Pdzk1ip1 idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, ou 341.

[00114] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma sequência Pdzk1ip1 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, ou 341.

[00115] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Blvrb idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56 ou 57.

[00116] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Blvrb humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56 ou 57.

[00117] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência alvo Cdkn2a idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86 ou 87.

[00118] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Cdkn2a humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86 ou 87.

[00119] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência F11r alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 175, 176 ou 177.

[00120] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma F11r humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 175, 176 ou 177.

[00121] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Fyn alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 187, 191 ou 192.

[00122] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Fyn humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 187, 191 ou 192.

[00123] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Grk6 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 204, 205, 206 ou 207.

[00124] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Grk6 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 204, 205, 206 ou 207.

[00125] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Inpp5b alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 232, 234, 235, 236 ou 237.

[00126] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Inpp5b humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 232, 234, 235, 236 ou 237.

[00127] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Impk alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 248, 249, 250, 251 ou 252.

[00128] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Impk humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 248, 249, 250, 251 ou 252.

[00129] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Jun alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 263, 264, 265, 266, 267, 268 ou 269.

[00130] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Jun humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 263, 264, 265, 266, 267, 268 ou 269.

[00131] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Mast2 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 281, 282, 283 ou 284.

[00132] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Mast2 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 281, 282, 283 ou 284.

[00133] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Nptxr alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 311, 312, 313 ou 314.

[00134] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Nptxr humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 311, 312, 313 ou 314.

[00135] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Pkd1 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 351, 352, 353, 354, 355 ou 356.

[00136] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Pkd1 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 351, 352, 353, 354, 355 ou 356.

[00137] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Ppm1g alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 367, 368, 369, 370 ou 371.

[00138] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Ppm1g humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 367, 368, 369, 370 ou 371.

[00139] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Ppp3cc alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 399, 400 ou 401.

[00140] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Ppp3cc humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 399, 400 ou 401.

[00141] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Prkab2 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 414, 415 ou 416.

[00142] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Prkab2 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 414, 415 ou 416.

[00143] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Ptpn2 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 426, 427, 428, 429 ou 430.

[00144] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Ptpn2 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 426, 427, 428, 429 ou 430.

[00145] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Rock1 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 457, 458, 459 ou 460.

[00146] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Rock1 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 457, 458, 459 ou 460.

[00147] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Sbf1 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 470, 471, 472, 473, 474 ou 475.

[00148] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Sbf1 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 470, 471, 472, 473, 474 ou 475.

[00149] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Socs1 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 504, 505, 506, 507, 508, 509 ou 510.

[00150] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Socs1 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 504, 505, 506, 507, 508, 509 ou 510.

[00151] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Socs3 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 524, 525, 526, 527 ou 528.

[00152] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Socs3 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 524, 525, 526, 527 ou 528.

[00153] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Stk17b alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 539, 540, 541, 542 ou 543.

[00154] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Stk17b humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 539, 540, 541, 542 ou 543.

[00155] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Tnk1 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 556, 557 ou 558.

[00156] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Tnk1 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 556, 557 ou 558.

[00157] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Trpm7 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 569, 570, 571, 572 ou 573.

[00158] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Trpm7 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 569, 570, 571, 572 ou 573.

[00159] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de shRNA complementares a uma sequência Yes1 alvo idêntica a pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos apresentados na SEQ ID NO: 600, 601, 602 ou 603.

[00160] Em outras formas de realização, a divulgação fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um shRNA compreendendo uma sequência complementar a uma Yes1 humana que corresponde a uma sequência alvo de murino apresentada na SEQ ID NO: 600, 601, 602 ou 603.

[00161] Em qualquer modalidade, uma sequência humana que corresponde a uma sequência alvo de murino é uma sequência que corresponde perfeitamente à sequência de gene humana, e por exemplo, pode ter nenhum, 1, 2, 3 ou 4 desemparelhamentos de nucleotídeo com o pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da sequência alvo de murino selecionada.

[00162] Um ácido nucleico isolado pode ser, por exemplo, uma molécula de DNA, contanto com uma das sequências de ácido nucleico normalmente encontradas imediatamente flanqueando esta molécula de DNA em um genoma que ocorre naturalmente seja removido ou ausente. Assim, um ácido nucleico isolado inclui, sem limitação, uma molécula de DNA que existe como uma molécula separada (por exemplo, um ácido nucleico quimicamente sintetizado, cDNA, ou fragmento de DNA genômico produzido pela PCR ou tratamento com endonuclease de restrição) independente de outras sequências assim como DNA que é incorporado em um vetor, um plasmídeo que replica autonomamente, um vírus (por exemplo, um retrovírus, lentivírus, adenovírus, vírus adeno-associado, ou vírus do herpes), ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota. Além disso, um ácido nucleico isolado pode incluir um ácido nucleico engendrado tal como uma molécula de DNA recombinante que é parte de um ácido nucleico híbrido ou de fusão. Um ácido nucleico existente entre centenas a milhões de outros ácidos nucleico dentro, por exemplo, de bibliotecas de cDNA ou bibliotecas genômicas, ou fatias de gel contendo uma digestão de restrição de DNA genômico, é não ser considerado um ácido nucleico isolado.

[00163] No cálculo da identidade de sequência percentual, duas sequências são alinhadas e o número de emparelhamentos idênticos de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido entre as duas sequências é determinado. O número de emparelhamentos idênticos é dividido pelo comprimento da região alinhada (isto é, o número de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido alinhados) e multiplicados por 100 para chegar a um valor de identidade de sequência percentual. Será avaliado que o comprimento da região alinhada pode ser uma porção de uma ou ambas sequências até o tamanho natural da sequência mais curta. Também será avaliado que uma única sequência pode se alinhar com mais do que uma outra sequência e consequentemente, pode ter valores de identidade de sequência percentual diferentes em cada região alinhada. É mencionado que o valor de identidade percentual é usualmente arredondado até o número inteiro mais próximo. Por exemplo, 78,1%, 78,2%, 78,3%, e 78,4% são arredondados para baixo para 78%, enquanto que 78,5%, 78,6%, 78,7%, 78,8%, e 78,9% são arredondados até 79%. Também é mencionado que o comprimento da região alinhada é sempre um número inteiro.

[00164] Como aqui utilizado, o termo “identidade de sequência percentual” se refere ao grau de identidade entre qualquer sequência de consulta dada e uma sequência individual. Uma identidade percentual para qualquer sequência de ácido nucleico ou aminoácido de consulta, por exemplo, um fator de transcrição, relativo a uma outra sequência de ácido nucleico ou aminoácido individual pode ser determinado como segue.

[00165] Como aqui utilizado, o termo “sequência de nucleotídeo complementar,” também conhecida como uma “sequência de antissentido”, se refere a uma sequência de um ácido nucleico que é inteiramente complementar à sequência de um ácido nucleico de “sentido” que codifica uma proteína (por exemplo, complementar ao filamento codificador de uma molécula de cDNA de filamento duplo ou complementar a uma sequência de mRNA). Aqui, moléculas de ácido nucleico são fornecidas que compreendem uma sequência complementar a pelo menos cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotídeos ou um filamento codificador de gene inteiro, ou a apenas uma porção do mesmo.

[00166] Como aqui utilizado, o termo “corresponde a uma sequência de nucleotídeo” se refere a uma sequência de nucleotídeo de um ácido nucleico que codifica uma sequência idêntica. Em alguns casos, quando nucleotídeos de antissentido (ácidos nucleicos) ou siRNA's (RNA inibidor pequeno) hibridizam uma sequência alvo de uma sequência de antissentido particular ou o RNA inibidor pequeno (siRNA) é substancialmente complementar à sequência alvo, e assim ligar-se-á especificamente a uma porção de um polipeptídeo que codifica mRNA. Como tal, tipicamente as sequências destes ácidos nucleicos serão altamente complementares à sequência de mRNA alvo, e não terão mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 desemparelhamentos de base por toda a sequência. Em muitos casos, pode ser desejável que as sequências dos ácidos nucleicos sejam emparelhamentos exatos, isto é, sejam completamente complementares à sequência à qual o oligonucleotídeo especificamente se liga, e, portanto, têm zero desemparelhamentos ao longo do trecho complementar. As sequências altamente complementares tipicamente ligar-se-ão muito especificamente à região da sequência alvo do mRNA e, portanto, será altamente eficiente na redução, e/ou mesmo na inibição da tradução da sequência de mRNA alvo no produto de polipeptídeo.

[00167] Como aqui utilizado, o termo “vetor” se refere a qualquer vetor viral ou não viral, assim como qualquer plasmídeo, cosmídeo, fago ou vetor binário nas formas linear ou circular de filamento duplo ou único que podem ser auto transmissíveis ou mobilizáveis ou não, e que podem transformar células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas pela integração no genoma celular ou que podem existir extracromossomicamente (por exemplo, plasmídeo de replicação autônoma com uma origem de replicação). Qualquer vetor conhecido na técnica é considerado para o uso na prática desta invenção.

[00168] Os vetores podem ser vetores virais ou vetores não virais. Quando do uso de vetores virais, é preferido que os vetores virais possuam replicação defeituosa, o que pode ser obtido por exemplo pela remoção de todos os ácidos nucleicos virais que codificam a replicação. Um vetor viral defeituoso na replicação reterá ainda as suas propriedades infecciosas e entrará nas células em uma maneira similar como um vetor de replicação adenoviral, entretanto uma vez admitido na célula um vetor viral defeituoso na replicação não se reproduz ou multiplica. Os vetores também abrangem lipossomas e nanopartículas e outros meios para liberar molécula de DNA a uma célula.

[00169] O termo “vetores virais” se refere ao uso de vírus, ou vetores associados a vírus como carreadores de uma construção de ácido nucleico dentro de uma célula. As construções podem ser integradas e empacotadas dentro de genomas virais não replicativos, defeituosos como Adenovírus, vírus adeno-associados (AAV), ou vírus simples do herpes (HSV) ou outros, incluindo vetores retrovirais e lentivirais, para a infecção ou transdução dentro das células. O vetor pode ser incorporado ou não no genoma da célula.

[00170] “Codificando” se refere à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, tal como um gene, um cDNA, ou um mRNA, para servir como padrões para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos tendo uma sequência definida de nucleotídeos (isto é, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas que resultam das mesmas, Assim, um gene codifica uma proteína se a transcrição e tradução de mRNA que corresponde a este gene produz a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto o filamento codificador, a sequência de nucleotídeo do qual é idêntica à sequência de mRNA e é usualmente fornecida nas listagens de sequência, quanto o filamento não codificador, utilizados como o padrão para a transcrição de um gene ou cDNA, podem ser aludidos como codificando a proteína ou outro produto deste gene ou cDNA.

[00171] O termo “expressão” como aqui utilizado é definido como a transcrição e/ou tradução de uma sequência de nucleotídeo particular dirigida pelo seu promotor.

[00172] Os vetores capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operativamente ligados são aqui aludidos como “vetores de expressão”. Assim, um “Vetor de Expressão” é um vetor especializado compreendendo um polinucleotídeo recombinante compreendendo sequências de controle de expressão operativamente ligados a uma sequência de nucleotídeo a ser expressa. Um Vetor de Expressão compreende elementos que atuam em cis suficientes para a expressão; outros elementos para a expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos naqueles conhecidos na técnica, tais como cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus, e vírus adeno- associados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.

[00173] Em alguns aspectos, a divulgação fornece células modificadas que abrigam vetores capazes de expressar o shRNA aqui descrito e modificadas ainda para expressar um CAR. Em um aspecto o shRNA e o CAR são expressos no mesmo vetor. Em um outro aspecto, o shRNA e o CAR são expressos nos vetores separados.

[00174] Em algumas formas de realização, as células modificadas aqui descritas são células imunorresponsivas. Em alguns aspectos, as células imunorresponsivas expressam pelo menos um receptor que reconhece antígeno. Em qualquer aspecto, as células imunorresponsivas expressam pelo menos um de um receptor que reconhece tumor específico de antígeno. Em alguns aspectos, as células T específicas de antígeno de célula de tumor, células NKT, TIL, células CTL ou outras células imunorresponsivas são utilizadas. Os exemplos não limitantes de células imunorresponsivas incluem células T, tais como, por exemplo, células T αβ-TCR+ (por exemplo, células T CD8+ ou células T CD4+) células T Yδ-TCR+, linfócito de infiltração de tumores (TIL), células T Exterminadoras Naturais (NKT), um linfócito citotóxico T (CTL), e uma célula T CD4.

[00175] As composições compreendendo as células imunorresponsivas da invenção (por exemplo, células T, células NKT, TILs, células CTL, ou suas progenitoras) podem ser fornecidas sistêmica ou diretamente a um indivíduo para o tratamento de um câncer. Em uma modalidade, as células da invenção são diretamente injetadas em um órgão de interesse (por exemplo, um órgão afetado por um câncer). Alternativamente, as composições compreendendo células imunorresponsivas geneticamente modificadas são fornecidas indiretamente ao órgão de interesse, por exemplo, pela administração no sistema circulatório (por exemplo, a vasculatura de tumor). Agentes de expansão e diferenciação podem ser fornecidos antes, durante ou depois da administração das células para aumentar a produção de células T, células NKT, TILs, células CTL in vitro ou in vivo.

[00176] As células imunorresponsivas modificadas podem ser administradas em qualquer veículo fisiologicamente aceitável, normalmente intravascularmente, embora eles também possam ser introduzidos em osso ou outro local conveniente onde as células possam encontrar um local apropriado para a regeneração e diferenciação (por exemplo, timo). Usualmente, pelo menos 1 x 105 células serão administradas, eventualmente atingindo 1 x 1010, ou mais. As células imunorresponsivas da invenção podem compreender uma população purificada de células. Aqueles habilitados na técnica podem facilmente determinar a porcentagem de células imunorresponsivas geneticamente modificadas em uma população utilizando vários métodos bem conhecidos, tais como a classificação de célula ativada pela fluorescência (FACS). As faixas preferíveis de pureza em populações compreendendo células imunorresponsivas geneticamente modificadas são de cerca de 50 a cerca de 55%, de cerca de 55 a cerca de 60%, e de cerca de 65 a cerca de 70%. Mais preferivelmente a pureza é de cerca de 70 a cerca de 75%, de cerca de 75 a cerca de 80%, de cerca de 80 a cerca de 85%; e ainda mais preferivelmente a pureza é de cerca de 85 a cerca de 90%, de cerca de 90 a cerca de 95%, e de cerca de 95 a cerca de 100%. As dosagens podem ser facilmente ajustadas por aqueles habilitados na técnica (por exemplo, uma diminuição na pureza pode requerer um aumento na dosagem).

[00177] As células podem ser introduzidas por injeção, cateter, ou os semelhantes. Se desejado, os fatores também podem ser incluídos, incluindo, mas não limitado a, interleucinas, por exemplo IL-2, IL-3, IL-6, e IL-11, assim como as outras interleucinas, os fatores estimuladores de colônia, tais como G-, M- e GM-CSF, interferons, por exemplo .gama.-interferon e eritropoietina.

[00178] As composições da invenção incluem composições farmacêuticas compreendendo as células imunorresponsivas da invenção ou suas progenitoras e um carreador farmaceuticamente aceitável. A administração pode ser autóloga ou heteróloga. Por exemplo, as células imunorresponsivas, ou progenitoras podem ser obtidas de um indivíduo, e administradas ao mesmo indivíduo ou um indivíduo diferente, compatível.

Receptor de antígeno quimérico

[00179] Em alguns casos, a invenção fornece receptor de antígeno quimérico (CARs) compreendendo um domínio de ligação de antígeno direcionado a um antígeno de célula de tumor. Um CAR é uma proteína híbrida artificialmente construída ou polipeptídeo contendo uma porção extracelular que reconhece um antígeno de célula de tumor (por exemplo, os domínios de ligação de antígeno de um anticorpo (scFv) e um domínio de sinalização citoplásmico derivado do receptor de célula T e codomínio estimulador. (Kalos M, et al., Sci Transl Med. 10 de Agosto de 2011; 3(95)) Kalos et al. descrevem a geração de células T CAR que miram CD19 e demonstram o efeito antitumor potente mediado pelas células T modificadas por CAR em pacientes com leucemia linfocítica crônica. As características de CARs incluem a sua capacidade para redirecionar a especificidade de célula T e reatividade para um alvo selecionado em uma maneira não restrita ao MHC, explorando as propriedades de ligação de antígeno de anticorpos monoclonais. As células T modificadas por CAR têm o potencial para replicar in vivo e a persistência de longa duração possibilita o controle de tumor prolongado e evitar a necessidade quanto a infusões repetidas de anticorpo. (Kalos M, et al., Sci Transl Med. 10 de Agosto de 2011; 3(95)) O reconhecimento de antígeno não restrito a MHC dá às células T que expressam CARs a capacidade para reconhecer antígeno independente do processamento de antígeno, desviando assim um mecanismo principal de escape de tumor. Além disso, quando expressos em células T, CARs vantajosamente não dimerizam com as cadeias alfa e beta de receptor de célula T endógeno (TCR). As células T modificadas com CAR são descritas em detalhes na WO2012/079000 e WO2012/09999 e em Milum et al. 2009 Mol. Ther. 17: 1453.

[00180] Um CAR combina com o sítio de ligação de uma molécula que reconhece um antígeno que é mirado (isto é, um “domínio de ligação de antígeno”) com um ou mais domínios de receptores imunes convencionais responsáveis pelo início da transdução de sinal que leva à ativação de linfócito (por exemplo, o “domínio estimulador” ou “domínio de sinalização”).

[00181] Em algumas formas de realização, a porção de ligação usada é derivada da estrutura do fragmento de Fab (ligação de antígeno) de um anticorpo monoclonal (mAb) que tem alta afinidade para o antígeno tumoral que é mirado. Porque o Fab é o produto de dois genes, as sequências correspondentes são usualmente combinadas por intermédio de um fragmento ligador curto que possibilita que a cadeia pesada se dobre sobre os peptídeos derivados da cadeia leve na sua configuração nativa, criando uma região variável de fragmento de cadeia única (scFv).

[00182] Os fragmentos de anticorpo ou Fv (scFv) compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. No geral o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligador de polipeptídeo entre os domínios VH e VL, que possibilita o scFv formar a estrutura desejada para a ligação de antígeno.

[00183] Em algumas formas de realização, a porção de ligação usada é derivada de um domínio de sinalização citoplásmico derivado de receptor de célula T e moléculas coestimuladoras.

[00184] Em algumas formas de realização, a porção de sinalização de CARs contém usualmente os domínios intracelulares da cadeia zeta (Z) do complexo TCR/CD325 ou, menos habitualmente, da cadeia gama (Y) do receptor de imunoglobulina FcεRI2627 ou a cadeia CD3-épsilon (ε),28 com a região de transmembrana sendo derivada da mesma molécula.

[00185] Em alguns aspectos, o CARs compreende um domínio de ligação de antígeno, um domínio de transmembrana, um domínio estimulador, e um domínio co- estimulador. Outras formas de realização da invenção fornecem ácidos nucleicos relacionados, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras, populações de células, anticorpos, ou porções de ligação de antígeno do mesmo, e composições farmacêuticas relacionadas com os CARs da invenção.

[00186] Em um aspecto, o domínio de ligação de antígeno se liga a um antígeno de célula de tumor. O termo “antígeno de célula de tumor” ou “antígeno tumoral” como aqui utilizado se refere a qualquer polipeptídeo expresso por um tumor que seja capaz de induzir uma resposta imune. Os exemplos não limitantes de antígenos de tumor incluem, por exemplo, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), Antígeno carcinoembrionário (CEA), CD19, CD20, CD22, ROR1, mesotelina, CD333/IL3Ra, c- Met, Glicolipídeo F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, ERBB2, BIRC5, CEACAM5, WDR46, BAGE, CSAG2, DCT, MAGED4, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7, GAGE8, IL13RA2, MAGEA1, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA9, MAGEA10, MAGEA12, MAGEB1, MAGEB2, MAGEC2, TP53, TYR, TYRP1, SAGE1, SYCP1, SSX2, SSX4, KRAS, PRAME, NRAS, ACTN4, CTNNB1, CASP8, CDC27, CDK4, EEF2, FN1, HSPA1B, LPGAT1, ME1, HHAT, TRAPPC1, MUM3, MYO1B, PAPOLG, OS9, PTPRK, TPI1, ADFP, AFP, AIM2, ANXA2, ART4, CLCA2, CPSF1, PPIB, EPHA2, EPHA3, FGF5, CA9, TERT, MGAT5, CEL, F4,2, PODE, ETV6, BIRC7, CSF1, OGT, MUC1, MUC2, MUM1, CTAG1A, CTAG2, CTAG, MRPL28, FOLH1, RAGE, SFMBT1, KAAG1, SART1, TSPYL1, SART3, SOX10, TRG, WT1, TACSTD1, SILV, SCGB2A2, MC1R, MLANA, GPR143, OCA2, KLK3, SUPT7L, ARTC1, BRAF, CASP5, CDKN2A, UBXD5, EFTUD2, GPNMB, NFYC, PRDX5, ZUBR1, SIRT2, SNRPD1, HERV-K-MEL, CXorf61, CCDC110, VENTXP1, SPA17, KLK4, ANKRD30A, RAB38, CCND1, CYP1B1, MDM2, MMP2, ZNF395, RNF43, SCRN1, STEAP1, 707-AP, TGFBR2, PXDNL, AKAP13, PRTN3, PSCA, RHAMM, ACPP, ACRBP, LCK, RCVRN, RPS2, RPL10A, SLC45A3, BCL2L1, DKK1, ENAH, CSPG4, RGS5, BCR, BCR-ABL, ABL-BCR, DEK, DEK-CAN, ETV6-AML1, LDLR-FUT, NPM1-ALK1, PML-RARA, SYT- SSX1, SYT-SSX2, FLT3, ABL1, AML1, LDLR, FUT1, NPM1, ALK, PML1, RARA, SYT, SSX1, MSLN, UBE2V1, HNRPL, WHSC2, EIF4EBP1, WNK2, OAS3, BCL-2, MCL1, CTSH, ABCC3, BST2, MFGE8, TPBG, FMOD, XAGE1, RPSA, COTL1, CALR3, PA2G4, EZH2, FMNL1, HPSE, APC, UBE2A, BCAP31, TOP2A, TOP2B, ITGB8, RPA1, ABI2, CCNI, CDC2, SEPT2, STAT1, LRP1, ADAM17, JUP, DDR1, ITPR2, HMOX1, TPM4, BAAT, DNAJC8, TAPBP, LGALS3BP, PAGE4, PAK2, CDKN1A, PTHLH, SOX2, SOX11, TRPM8, TYMS, ATIC, PGK1, SOX4, TOR3A, TRGC2, BTBD2, SLBP, EGFR, IER3, TTK, LY6K, IGF2BP3, GPC3, SLC35A4, HSMD, H3F3A, ALDH1A1, MFI2, MMP14, SDCBP, PARP12, MET, CCNB1, PAX3-FKHR, PAX3, FOXO1, XBP1, SYND1, ETV5, HSPA1A, HMHA1, TRIM68 e qualquer combinação dos mesmos.

[00187] A presente invenção geralmente diz respeito ao uso de células T geneticamente modificadas para expressar estavelmente um shRNA da invenção e um CAR desejado. Células T que expressam um CAR são geralmente aludidas como células T CAR. Células T que expressam um CAR são aqui aludidas como células T CAR ou células T modificadas por CAR. Preferivelmente, a célula pode ser geneticamente modificada para expressar estavelmente um domínio de ligação de anticorpo na sua superfície, conferindo nova especificidade de antígeno que é independente de MHC. Em alguns casos, a célula T é geneticamente modificada para expressar estavelmente um CAR que combina um domínio de reconhecimento de antígeno de um anticorpo específico com um domínio estimulador intracelular (por exemplo, domínio de sinalização). Assim, além de um domínio de ligação de antígeno o CAR pode incluir os domínios intracelulares da cadeia zeta (Z) do complexo TCR/CD3, a cadeia gama (Y) do receptor de imunoglobulina FcεRI26, 27 ou a cadeia CD3-épsilon (ε). O CAR também pode incluir uma região de transmembrana sendo das mesmas moléculas ou de outras proteínas de transmembrana do tipo I tais como CD4, CD8 e CD28.

[00188] Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio extracelular tendo um domínio de reconhecimento de antígeno, um domínio de transmembrana, e um domínio citoplásmico.

[00189] Em uma modalidade, o domínio de transmembrana que naturalmente está associado com um dos domínios no CAR é utilizado. Em uma outra modalidade, o domínio citoplásmico pode ser planejado para compreender um domínio estimulador e um domínio coestimulador.

[00190] Um CAR pode incluir porção intracitoplasmática de moléculas co- estimulatórias, tais como CD28, CD134/OX40, CD137/4-1BB, Lck, ICOS ou DAP10.

[00191] A divulgação também diz respeito a uma estratégia de terapia de célula adotiva (ACT). ACT é um procedimento no qual linfócitos terapêutico são administrados aos pacientes de modo a tratar câncer. Este método acarreta necessariamente a geração ex vivo de linfócitos de célula T específicos de tumor e inoculando as mesmas nos pacientes. Além da infusão de linfócito o hospedeiro pode ser manipulado de outros modos que sustentem a absorção das células T e a sua resposta imune, por exemplo, precondicionando o hospedeiro (com radiação ou quimioterapia) e administração de fatores de crescimento de linfócito (tais como IL-2). Um método para gerar tais linfócitos específicos de tumor envolve a expansão de células T específicas de antígeno.

[00192] Em uma modalidade, a invenção fornece gerar as células T que expressam um shRNA da invenção e um CAR desejado direcionado a um antígeno tumoral. As células T modificadas podem ser geradas pela introdução de um vetor (por exemplo, plasmídeo, vetor lentiviral, vetor retroviral, vetor adenoviral, vetor viral adeno-associado) que codifica tanto 1) um shRNA capaz de reduzir a expressão de um gene alvo aqui descrito quanto 2) um CAR desejado nas células. As células T modificadas da invenção são capazes de replicar in vivo resultando em persistência de longa duração que pode levar ao controle de tumor.

[00193] Em um aspecto, a divulgação fornece métodos de tratar câncer compreendendo administrar uma composição capaz de silenciar genes que inibem a função da célula T. Em uma modalidade, os métodos dizem respeito a administrar a célula T que expressa um shRNA da invenção e um CAR desejado direcionado a um antígeno tumoral. Em um aspecto a célula T a ser administrada compreende um vetor que codifica um shRNA da invenção e um CAR desejado direcionado a um antígeno tumoral.

Formulações Farmacêuticas

[00194] Em alguns casos, as composições terapêuticas aqui divulgadas podem incluir, além das células T que miram tumor, compostos, medicamentos, e/ou agentes utilizados para o tratamento de câncer. Tais compostos, medicamentos, e/ou agentes podem incluir, por exemplo, medicamentos de quimioterapia, medicamentos ou anticorpos de molécula pequena que estimulam a resposta imune para um dado câncer. Em outros casos, as composições terapêuticas podem incluir, por exemplo, um ou mais inibidores de molécula pequena que silenciam, reduzem, eliminam, reduzem, desativam, ou diminuições na expressão e/ou atividade de genes selecionados do grupo consistindo de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 e Ppp3cc. Consequentemente, a invenção fornece um ou mais inibidores de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 ou Ppp3cc.

[00195] Em um aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Ppp2r2d.

[00196] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Eif2ak3.

[00197] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Arhgap5.

[00198] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Smad2.

[00199] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Akap81.

[00200] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Rbks.

[00201] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Egr2.

[00202] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Dgka.

[00203] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Cblb.

[00204] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Map3k3.

[00205] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores vMdfic.

[00206] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Entpd1.

[00207] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Dgkz.

[00208] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Vamp7.

[00209] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Nuak2.

[00210] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Hipk1.

[00211] Em um outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Alk. Em uma modalidade, o inibidor de Alk inclui, por exemplo, CH5424802 (Hoffmann-La Roche), LDK378 (Novartis), Crizotinib e PF-02341066 (Pfizer) ou AP26113 (Ariad Pharmaceuticals).

[00212] Em outro aspecto, a invenção fornece um ou mais inibidores de Pdzk1ip1.

[00213] Em alguns casos, as composições terapêuticas podem incluir, por exemplo, citocinas, quimiocinas e outras moléculas de sinalização biológica, vacinas específicas de tumor, vacinas contra câncer celular (por exemplo, células cancerosas transduzidas por GM-CSF), anticorpos monoclonais específicos de tumor, resgate de célula tronco autóloga e alogênica (por exemplo, para aumentar os efeitos de enxerto versus tumor), outros anticorpos terapêuticos, terapias miradas moleculares, terapia anti-angiogênica, agentes infecciosos com intenção terapêutica (tais como bactérias que localizam tumor) e terapia de gene.

[00214] Em alguns casos, as composições terapêuticas aqui divulgadas podem ser formuladas para o uso como ou em composições farmacêuticas. Tais composições podem ser formuladas ou adaptadas para a administração a um indivíduo por intermédio de qualquer via, por exemplo, qualquer via aprovada pela Food and Drug Administration (FDA). Os métodos exemplares são descritos no CDER Data Standards Manual da FDA, versão número 004 (que está disponível na fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm).

[00215] Em alguns casos, as farmacêuticas composições podem incluir uma quantidade eficaz de um ou mais peptídeos. Os termos “quantidade eficaz” e “eficaz para tratar,” como aqui utilizados, refere-se a uma quantidade ou uma concentração de um ou mais peptídeos por um período de tempo (incluindo a administração aguda ou crônica e a administração periódica ou contínua) que é eficaz dentro do contexto desta administração para causar um efeito ou resultado fisiológico pretendidos.

[00216] As composições farmacêuticas desta invenção podem conter qualquer um de carreadores, adjuvantes ou veículos não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis convencionais. Em alguns casos, o pH da formulação pode ser ajustado com ácidos, bases ou tampões farmaceuticamente aceitáveis para realçar a estabilidade do composto formulado ou sua forma de liberação.

Métodos

[00217] Em alguns casos, os métodos podem incluir a seleção de um indivíduo humano que tem ou teve uma condição ou doença (por exemplo, câncer). Em alguns casos, os indivíduos adequados incluem, por exemplo, indivíduos que têm ou tiveram uma condição ou doença, mas que resolveram a doença ou um aspecto da mesma, sintomas reduzidos presentes da doença (por exemplo, em relação aos outros indivíduos (por exemplo, a maioria dos indivíduos) com a mesma condição ou doença), e/ou que sobrevive por períodos prolongados de tempo com a condição ou doença (por exemplo, em relação aos outros indivíduos (por exemplo, a maioria dos indivíduos) com a mesma condição ou doença), por exemplo, em um estado assintomático (por exemplo, em relação aos outros indivíduos (por exemplo, a maioria dos indivíduos) com a mesma condição ou doença).

[00218] O termo “indivíduo”, como aqui utilizado, se refere a qualquer animal. Em alguns casos, o indivíduo é um mamífero. Em alguns casos, o termo “indivíduo”, como aqui utilizado, se refere a um ser humano (por exemplo, um homem, uma mulher, ou uma criança). As amostras para o uso nos métodos podem incluir amostras de soro, por exemplo, obtidas do indivíduo selecionado.

[00219] Em alguns casos, a seleção de indivíduo pode incluir a obtenção de uma amostra de um indivíduo (por exemplo, um indivíduo candidato) e testar a amostra quanto a uma indicação de que o indivíduo é adequado para a seleção. Em alguns casos, o indivíduo pode ser confirmado ou identificado, por exemplo por um profissional de cuidado de saúde, como tendo tido ou tendo uma condição ou doença. Em alguns casos, a exibição de uma resposta imune positiva para uma condição ou doença pode ser feita a partir de registros do paciente, história familiar, e/ou detectar uma indicação de uma resposta imune positiva. Em alguns casos participantes múltiplos podem ser incluídos na seleção de indivíduo. Por exemplo, um primeiro participante pode obter uma amostra de um indivíduo candidato e um segundo participante pode testar a amostra. Em alguns casos, indivíduos podem ser selecionados e/ou encaminhados por um médico (por exemplo, um médico geral). Em alguns casos, a seleção de indivíduo pode incluir a obtenção de uma amostra de um indivíduo selecionado e armazenar a amostra e/ou utilizando a mesma nos métodos aqui divulgados. As amostras podem incluir, por exemplo, células ou populações de células.

Métodos de uso

[00220] Em algumas formas de realização, a divulgação fornece métodos para aumentar a resposta imune em um indivíduo em necessidade da mesma. A divulgação fornece terapias que são particularmente úteis para o tratamento de indivíduos tendo câncer. Em alguns casos, a divulgação fornece métodos de tratamento que incluem administrar a um indivíduo uma composição aqui divulgada.

[00221] São aqui fornecidos métodos para tratar e/ou prevenir câncer ou sintomas de câncer em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição capaz de silenciar genes que inibem a função da célula T (por exemplo, uma célula T imunorresponsiva que expressa um shRNA da invenção e um CAR desejado direcionado a um antígeno tumoral). Em alguns casos a célula T é derivada do paciente a ser tratado e foi modificada para expressar o CAR e um shRNA que reduz a expressão de um gene alvo aqui descrito.

[00222] Em algumas formas de realização, o câncer é um carcinoma, sarcomas, adenocarcinoma, linfoma, leucemia, etc., incluindo cânceres sólidos e linfoides, de fígado, de mama, de pulmão, vesical, cólon, de ovário, de prostata, de pâncreas, de estômago, cerebral, da cabeça e pescoço, de pele, de útero, de testículo, glioma, de esfôfago, e de fígado, incluindo hepatocarcinoma, linfoma, incluindo linfoma linfoblástico agudo B, linfomas de não Hodgkin (por exemplo, linfomas de Burkitt, Célula Pequena, e Célula Grande) e linfoma de Hodgkin, leucemia (incluindo AML, ALL, e CML), e mieloma múltiplo. Em algumas formas de realização, o câncer é melanoma. Em algumas formas de realização, o câncer é uma malignidade de célula plasmática, por exemplo, mieloma múltiplo (MM) ou condição pré-maligna de células plasmáticas. Em algumas formas de realização o indivíduo foi diagnosticado como tendo um câncer ou como estando predisposto ao câncer.

[00223] Como aqui utilizado, “câncer” se refere a cânceres e carcinomas, sarcomas, adenocarcinomas, linfomas, leucemias, etc. humanos, incluindo cânceres sólidos e linfoides, câncer renal, de mama, de pulmão, vesical, cólon, de ovário, de prostata, de pâncreas, de estômago, cerebral, da cabeça e pescoço, de pele, de útero, de testículo, glioma, de esfôfago, e de fígado, incluindo hepatocarcinoma, linfoma, incluindo linfoma linfoblástico agudo B, linfomas de não Hodgkin (por exemplo, linfomas de Burkitt, Célula Pequena, e Célula Grande) e linfoma de Hodgkin, leucemia (incluindo AML, ALL, e CML), e mieloma múltiplo.

[00224] O termo “efeito antitumor” como aqui utilizado, se refere a um efeito biológico que pode ser manifestado por uma diminuição no volume de tumor, uma diminuição no número de células tumorais, uma diminuição no número de metástases, um aumento na expectativa de vida, ou melhora de vários sintomas fisiológicos associados com a condição cancerosa. Um “efeito antitumor” também pode ser manifestado pela capacidade dos peptídeos, polinucleotídeos, células e anticorpos da invenção na prevenção da ocorrência de tumor no primeiro lugar.

[00225] Os termos “tratar” ou “tratamento,” como aqui utilizado, se refere a aliviar, inibir, melhorar, e/ou aliviar a doença ou condição da qual o indivíduo está sofrendo. Em alguns casos, o tratamento pode resultar na ausência contínua da doença ou condição da qual o indivíduo está sofrendo.

[00226] No geral, métodos incluem selecionar um indivíduo em risco ou com uma condição ou doença. Em alguns casos, a condição ou doença do indivíduo podem ser tratadas com uma composição farmacêutica aqui divulgada. Por exemplo, em alguns casos, os métodos incluem selecionar um indivíduo com câncer, por exemplo, em que o câncer do indivíduo pode ser tratado aumentando-se o acúmulo de célula T e infiltração dentro do tumor.

[00227] Em alguns casos, os métodos de tratamento podem incluir uma única administração, administrações múltiplas, e administração repetida como requerido para a profilaxia ou tratamento da doença ou condição da qual o indivíduo está sofrendo. Em alguns casos os métodos de tratamento podem incluir avaliar um nível de doença no indivíduo antes do tratamento, durante o tratamento, e/ou depois do tratamento. Em alguns casos, o tratamento pode continuar até que uma diminuição no nível de doença no indivíduo seja detectado.

[00228] Seguindo a administração, o indivíduo pode ser avaliado para detectar, avaliar, ou determinar o seu nível de doença. Em alguns casos, o tratamento pode continuar até que uma mudança (por exemplo, redução) no nível of doença no indivíduo seja detectado.

[00229] Na melhora de uma condição do paciente (por exemplo, uma mudança (por exemplo, diminuição) no nível de doença no indivíduo), uma dose de manutenção de um composto, composição ou combinação desta invenção pode ser administrada, se necessária. Subsequentemente, a dosagem ou frequência de administração, ou ambos, pode ser reduzido, como uma função dos sintomas, a um nível no qual a condição melhorada é retida. Pacientes, entretanto, podem requerer tratamento intermitente em uma base de longa duração em qualquer recaída de sintomas de doença.

[00230] Também está dentro do escopo da presente invenção combinar qualquer um dos métodos e qualquer uma das composições aqui divulgadas com um ou mais agentes terapêuticos. Um agente terapêutico inclui, mas não é limitado a, moléculas pequenas, peptídeos, anticorpos, ribozimas, oligonucleotídeo de antissentido, agentes quimioterapêuticos e radiação.

[00231] Também está dentro do escopo da presente invenção combinar qualquer um dos métodos e qualquer uma das composições aqui divulgadas com terapias contra o câncer convencionais e vários medicamentos de modo a realçar a eficácia de tais terapias através da redução de doses/toxicidade de terapias convencionais e/ou aumentar a sensibilidade das terapias convencionais. Uma terapia convencional é o uso de terapia de radiação. Uma outra terapia convencional é o uso de medicamentos quimioterapêuticos que podem ser divididos em: agentes de alquilação, antimetabólitos, antraciclinas, alcalóides vegetais, inibidores da topoisomerase, e agentes antitumor. Todos estes medicamentos afetam a divisão celular ou a síntese e função do DNA em algum modo. Outras terapias contra o câncer convencionais são agentes que não interferem diretamente com DNA. Os exemplos de tais agentes para combinar com a presente invenção podem incluir por exemplo medicamentos de “molécula pequena” que bloqueiam enzimas específicas envolvidas no crescimento de célula cancerosa. Anticorpos monoclonais, vacinas contra o câncer, inibidores da angiogênese, e terapia de gene são terapias miradas que também podem ser combinadas com as composições e métodos aqui divulgados porque eles também interferem com o crescimento de células cancerosas.

Métodos de Triar Compostos de Teste

[00232] São aqui incluídos métodos para triar compostos de teste, por exemplo, polipeptídeos, polinucleotídeos, compostos de teste de molécula grande ou pequena inorgânica ou orgânica grande ou pequena, para identificar agentes úteis no tratamento de câncer, por exemplo, compostos de teste que silenciam, reduzem, eliminam, reduzem, desativam, modula, ou diminui a expressão e/ou atividade de genes selecionados do grupo consistindo de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 e Ppp3cc.

[00233] Como aqui utilizado, “moléculas pequenas” se refere a moléculas orgânicas ou inorgânicas pequenas de peso molecular abaixo de cerca de 3.000 Daltons. No geral, as moléculas pequenas úteis para a invenção têm um peso molecular de menos do que 3.000 Daltons (Da). As moléculas pequenas podem ser, por exemplo, de pelo menos cerca de 100 Da à cerca de 3.000 Da (por exemplo, entre cerca de 100 a cerca de 3.000 Da, cerca de 100 a cerca de 2500 Da, cerca de 100 a cerca de 2.000 Da, cerca de 100 a cerca de 1.750 Da, cerca de 100 a cerca de 1,500 Da, cerca de 100 a cerca de 1,250 Da, cerca de 100 a cerca de 1.000 Da, cerca de 100 a cerca de 750 Da, cerca de 100 a cerca de 500 Da, cerca de 200 a cerca de 1500, cerca de 500 a cerca de 1000, cerca de 300 a cerca de 1000 Da, ou cerca de 100 a cerca de 250 Da).

[00234] Os compostos de teste podem ser, por exemplo, produtos naturais ou membros de uma biblioteca química combinatória. Um conjunto de diversas moléculas deve ser utilizado para abranger uma variedade de funções tais como carga, aromaticidade, ligação de hidrogênio, flexibilidade, tamanho, comprimento da cadeia lateral, hidrofobicidade, e rigidez. As técnicas combinatórias adequadas para sintetizar moléculas pequenas são conhecidas na técnica, por exemplo, como exemplificado por Obrecht e Villalgordo, Solids-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small- Molecular-Weight Compound Libraries, Pergamon-Elsevier Science Limited (1998), e incluem aquelas tais como as técnicas de síntese “split and pool” ou “paralela”, técnicas de fase sólida e fase de solução, e técnicas codificadoras (ver, por exemplo, Czarnik, Curr. Opin. Chem. Bio. 1:60-6 (1997)). Além disso, várias bibliotecas de molécula pequena são comercialmente disponíveis. Vários compostos de teste de molécula pequena adequados são listados na Patente U.S. No. 6.503.713.

[00235] As bibliotecas triadas utilizando os métodos da presente invenção podem compreender uma variedade de tipos de compostos de teste. Uma dada biblioteca pode compreender um conjunto de compostos de teste estruturalmente relacionados ou não relacionados. Em algumas formas de realização, os compostos de teste são peptídeos ou moléculas peptidomiméticas. Em algumas formas de realização, os compostos de teste são ácidos nucleicos.

[00236] Em algumas formas de realização, os compostos de teste e bibliotecas dos mesmos podem ser obtidos alterando-se sistematicamente a estrutura de um primeiro composto de teste, por exemplo, um primeiro composto de teste que é estruturalmente similar a um parceiro de ligação natural conhecido do polipeptídeo alvo, ou uma primeira molécula pequena identificada como capaz de ligar o polipeptídeo alvo, por exemplo, utilizando métodos conhecidos na técnica ou os métodos aqui descritos, e correlacionando esta estrutura com uma atividade biológica resultante, por exemplo, um estudo de relação de estrutura-atividade. Como uma pessoa de habilidade na técnica avaliará, existe uma variedade de métodos padrão para criar tal relação de estrutura- atividade. Assim, em alguns casos, o trabalho pode ser amplamente empírico, e em outros, a estrutura tridimensional de um polipeptídeo endógeno ou porção do mesmo pode ser usada como um ponto de partida para o planejamento racional de um composto ou compostos de molécula pequena. Por exemplo, em uma modalidade, uma biblioteca geral de moléculas pequenas é triada, por exemplo, utilizando os métodos aqui descritos.

[00237] Em algumas formas de realização, um composto de teste é aplicado a uma amostra de teste, por exemplo, uma célula ou tecido vivo ou órgão, por exemplo, um olho, e um ou mais efeitos do composto de teste são avaliados. Em uma célula cultivada ou primária, por exemplo, a capacidade do composto de teste para silenciar, reduzir, eliminar, reduzir a expressão, desativar, modular, ou diminuir a expressão e/ou atividade de genes selecionados do grupo consistindo de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 e Ppp3cc.

[00238] Em algumas formas de realização, a amostra de teste é, ou é derivada de, (por exemplo, uma amostra tirada de) um modelo in vivo de um distúrbio como aqui descrito. Por exemplo, um modelo animal, por exemplo, um roedor tal como um rato, pode ser utilizado.

[00239] Os métodos para avaliar cada um destes efeitos são conhecidos na técnica. Por exemplo, a capacidade para modular a expressão de uma proteína pode ser avaliada ao nível do gene ou proteína, por exemplo, utilizando métodos de PCR quantitativa ou de imunoensaio. Em algumas formas de realização, métodos de alto rendimento, por exemplo, chips de proteína ou gene como são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Cap. 12, Genomics, in Griffiths et al., Eds. Modern Genetic Analysis, 1999, W. H. Freeman and Company; Ekins e Chu, Trends in Biotechnology, 1999, 17: 217-218; MacBeath e Schreiber, Science 2000, 289(5485): 1760-1763; Simpson, Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2002; Hardiman, Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts, DNA Press, 2003), podem ser utilizados para detectar um efeito sobre a atividade ou expressão de gene de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 e Ppp3cc.

[00240] Um composto de teste que foi triado por um método aqui descrito e determinado silenciar, reduzir, eliminar, reduzir a expressão, desativar, ou diminuir a expressão e/ou atividade de genes selecionados do grupo consistindo de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 e Ppp3cc, pode ser considerado um composto candidato. Um composto candidato que foi triado, por exemplo, em um modelo in vivo de um distúrbio, por exemplo, câncer, e determinado ter um efeito desejável sobre o distúrbio, por exemplo, em um ou mais sintomas do distúrbio, pode ser considerado um agente terapêutico candidato. Agentes terapêuticos candidatos, uma vez triados em um cenário clínico, são agentes terapêuticos. Os compostos candidatos, agentes terapêuticos candidatos, e agentes terapêuticos podem ser opcionalmente otimizados e/ou derivatizados, e formulados com excipientes fisiologicamente aceitáveis para formar composições farmacêuticas.

[00241] Assim, os compostos de teste identificados como “acertos” (por exemplo, compostos de teste que inibem caminhos imunossupressivos utilizados pelas células tumorais para inativar e/ou suprimir células imunes) em uma primeira triagem podem ser selecionados e sistematicamente alterados, por exemplo, utilizando planejamento racional, para otimizar a afinidade de ligação, avidez, especificidade, ou outro parâmetro. Tal otimização também pode ser triada para o uso dos métodos aqui descritos. Assim, em uma modalidade, a invenção inclui triar uma primeira biblioteca de compostos utilizando um método conhecido na técnica e/ou aqui descrito, identificar um ou mais acertos nesta biblioteca, submetendo estes acertos à alteração estrutural sistemática para criar uma segunda biblioteca de compostos estruturalmente relacionados com o acerto, e triar a segunda biblioteca utilizando os métodos aqui descritos.

EXEMPLOS

[00242] A invenção é descrita ainda nos seguintes exemplos, que não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações.

[00243] Trabalho recente tem demonstrado que as células T citotóxicas desempenham um papel central no controle imunomediado de cânceres1-3, e anticorpos monoclonais que miram receptores inibidores nas células T podem induzir benefícios clínicos significantes em pacientes com doença avançada4-6. Entretanto, muitos dos mecanismos reguladores que resultam na perda de função da célula T dentro de tumores imunossupressivos permanecem desconhecidos. Nos seguintes exemplos, os inventores demonstram que tais mecanismos reguladores podem ser sistematicamente descobertos in vivo no microambiente de tumor. Os inventores postularam que shRNAs que miram inibidores chave possibilitariam a infiltração de célula T robusta e acúmulo em tumores, a despeito de sinais inibidores múltiplos. Utilizando um método de triagem de shRNA reunido intencionado na identificação de genes que bloqueiam a função de células T de infiltração em tumor CD8, shRNA candidatos foram descobertos pela transferência de células T transduzidas em shRNA em camundongos que carregam tumor, seguido pelo sequenciamento profundo para quantificar a representação de todos os grampos de cabelo em tumores e órgãos linfoides. A maioria dos shRNAs induziram o acúmulo de célula T em tumores mas não no baço, demonstrando praticabilidade da descoberta de shRNAs com ação diferencial através dos tecidos. Um dos alvos foi Ppp2r2d, uma subunidade reguladora da PP2A fosfatase7. As células T transduzidas sofreram apoptose no reconhecimento de células de melanoma, enquanto que as células T transduzidas com shRNA Ppp2r2d acumularam em tumores devido à proliferação realçada e resistência à apoptose. As células T que expressam shRNA Ppp2r2d também significantemente retardaram o crescimento de tumor. Este método in vivo tem aplicações muito difundidas para dissecar funções imunes complexas em microambientes de tecido relevantes.

[00244] As células imunes realizam as funções de vigilância complexas por todo o corpo e interagem com muitos tipos diferentes de células em microambientes de tecido distintos. Os alvos terapêuticos para modular respostas imunes são tipicamente identificados in vitro e testados em modelos de animal em uma fase avançada do processo. Aqui os inventores têm tratado o desafio de quantos alvos para a modulação imune podem ser sistematicamente descoberto in vivo. Este é um problema central na oncologia porque a forte infiltração pelas células T CD8 - que têm função citotóxica contra células tumorais - está associada com um prognóstico favorável em tipos múltiplos de câncer humano1,3,8. Infelizmente, este mecanismo de defesa natural é severamente enfraquecido na maioria dos pacientes pelos sinais inibidores múltiplos que emanam do tumor, seus estromas, células T reguladoras e populações de célula de mielóide.9-11

[00245] As bibliotecas de shRNA reunidas mostraram ser ferramentas de descoberta poderosas12-14. Os inventores argumentaram que shRNAs capazes de restaurar a função CD8 da célula T pode ser sistematicamente descoberta in vivo tirando-se vantagem da capacidade proliferativa extensiva das células T a seguir da deflagração do receptor de célula T por um antígeno associado a tumor. Quando introduzido dentro das células T, apenas um pequeno subconjunto de shRNAs de uma reunião restaurará a proliferação de célula T que resulta no seu enriquecimento dentro de tumores. A representação excessiva de shRNAs ativos dentro de cada grupo pode ser quantificada pelo sequenciamento profundo do cassete de shRNA de tumores e órgãos linfoides secundários (FIG. 1).

[00246] Animais Experimentais. Camundongos C57BL/6, camundongos TRP-1 (camundongos transgênicos que expressam receptor de célula T (TCR) específico para proteína 1 relacionada com a tirosinase)23, camundongos pmel-1 (camundongos transgênicos que expressam TCR específica para gp100)18, e camundongos b2m-/-24 foram adquiridos da Jackson Laboratory. Os camundongos Rag1-/- OT-I16 foram adquiridos da Taconic Farms, Inc. Os camundongos foram cruzados na instalação de animal do Dana-Farber Cancer Institute. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Dana-Farber Cancer Institute Animal Care and Use Committee.

[00247] Linhagens de Célula. Melanomas B16, um tumor agressivo que é difícil de tratar, expressam o antígeno tumoral substituto Ovalbumina (Ova), que é reconhecido pelas células T CD8 de camundongos transgênicos no receptor de célula T OT-I16,17. As células de timoma EL438 e melanoma B16-F1015 foram mantidas em RPMI 1640 suplementado com 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 μg/ml de estreptomicina e 100 μg/ml de penicilina. As células tumorais B16 que expressam Ovalbumina (B16-Ova) foram mantidas no mesmo meio com a adição de 600 μg/mL de G418 (Invitrogen).

[00248] Vetores e sequências de shRNA. Os shRNAs foram selecionados para os 255 genes expressos em excesso nas células T disfuncionais (estado anérgico ou exaurido). O vetor pLKO.3G foi obtido do RNAi Consortium. Os vetores pLKO-Thy1.1, pLKO-Ametrina, pLKO-RFP, pLKO-TFP foram modificados a partir do vetor pLKO.3G substituindo-se GFP com o gene repórter correspondente. As sequências Ppp2r2d e Cblb de murino miradas por 10 shRNAs selecionados são fornecidas na Tabela 3 (listada na ordem de atividade de shRNA (mais alta para mais baixa)). A sequência alvo LacZ mirada por um shRNA de controle também é listada. Todas as outras sequências alvo podem ser encontradas na Tabela 2. TABELA 3.

[00249] Anticorpos e citometria de fluxo. Suspensões de célula única foram tingidas em PBS, 2% de FBS com anticorpos rotulados a 4°C por 20 minutos, seguido por duas lavagens com PBS gelado, 2% de FBS. As células foram analisadas/classificadas utilizando um FACSAria (BD Biosciences) e software FlowJo (TriStar). Os anticorpos utilizados foram específicos para CD4, CD8, Vα2, Vβ5,1/5,2, Thy1.1, CD25, CD44, CD62L, CD69, CD122, CD127, IFNy, TNFα (BioLegend), PD-1, TIM-3, LAG-3, granzyme B, e H-2Kb (BioLegend), Vα3,2 (eBioscience), Vβ13, Vβ14 (BD Biosciences), fosfo-Akt (Ser473) e fosfo-Bad (Ser112) (Cell Signaling). As células apoptóticas foram detectadas pela rotulação com anexina V (BioLegend) ou anticorpo de caspase-3 ativada (Cell Signaling). Grânulos anti-CD3/CD28 de camundongo foram adquiridas da Invitrogen.

[00250] Isolação de célula T de tumores. Melanomas B16-Ova foram cortados em pedaços pequenos em placas de petri contendo 5 ml de PBS, 2% de FBS e lavados com PBS. Os tumores foram recolocados em suspensão em 15 ml de RPMI suplementado com 2% de FBS, 50 U/ml de Colagenase Tipo IV (Invitrogen), 20 U/ml de DNase (Roche), as amostras incubadas a 37°C por 2 horas e o tecido dissociado ainda utilizando um Dissociador gentleMACS (Miltenyi Biotech). As suspensões foram lavadas três vezes com PBS e passadas através de uma peneira de 70 μ M. Os linfócitos foram isolados pela centrifugação de gradiente de densidade e depois analisados ou classificados pela citometria de fluxo utilizando um FACSAria (BD Biosciences).

[00251] Apoptose de célula T. As células OT-I pré-tratadas com citocina foram transduzidas com shRNAs LacZ ou Ppp2r2d e injetadas em camundongos que carregam tumores B16-Ova de 14 dias. Depois de 7 dias, o tingimento intracelular foi realizado utilizando um anticorpo de caspase-3 ativada (Cell Signaling) e as células T positivas duplas CD8/Thy1.1 foram ativadas na análise FACS.

[00252] Imunofluorescência e imunoistoquímica. Os tumores B16-Ova de camundongos tratados com células T OT-I que expressam shRNAs LacZ ou Ppp2r2d (vetor que expressa GFP) foram criopreservadas em temperatura de corte ideal (O.C.T.) (Tissue-Tek). As seções de 10 μm de tumores criopreservados foram permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100, fixadas em 4% de paraformaldeído e tingidas com um anticorpo GFP (Molecular Probes) em combinação com DAPI. Para a detecção de TUNEL, as seções foram tingidas com TACS 2 TdT Blue Label (Trevigen) com base nas diretrizes do fabricante. As amostras foram visualizadas utilizando um microscópio confocal de varredura a laser (Leica SP5X) e analisada com software de ImageJ (NIH).

[00253] Análise de qRT-PCR. O RNA total foi extraído utilizando reagente TRIzol (Invitrogen). O RNA foi transcrito reverso com o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems). As reações de PCR quantitativa em tempo real foram realizadas como triplicata utilizando um instrumento ABI 7900HT com verde de SYBR (ABI). Os níveis Rpl23 foram utilizados para a normalização. Os seguintes iniciadores foram utilizados: Ppp2r2d avançado GGAAGCCGACATCATCTCCAC (SEQ ID NO: 622), Ppp2r2d reverso GTGAGCGCGGCCTTTATTCT (SEQ ID NO: 623); Cblb avançado GGTCGCATTTTGGGGATTATTGA (SEQ ID NO: 624), Cblb reverso TTTGGCACAGTCTTACCACTTT (SEQ ID NO: 625); Rpl23 avançado CTGTGAAGGGAATCAAGGGA (SEQ ID NO: 626) e Rpl23 reverso TGTCGAATTACCACTGCTGG (SEQ ID NO: 627).

[00254] Análise de Microarranjo. Células T OT-I cultivadas em IL-7/IL-15 foram transduzidas com um de cinco shRNAs experimentais (Ppp2r2d, Arhgap5, Alk, Egr2, Ptpn2) ou um shRNA LacZ de controle. As células infectadas foram classificadas quanto à pureza utilizando GFP codificada pelo vetor como um repórter. Células T (5 x 106) foram injetadas i.v. em camundongos que carregam tumores B16-Ova de 14 dias. Sete dias mais tarde, as células T OT-I que expressam shRNA (CD8+GFP+) foram isoladas de tumores e baços. As células foram classificadas duas vezes para pureza alta e o RNA total foi extraído utilizando reagente TRIzol (Invitrogen) para o perfil de expressão de gene Affymetrix (Genome de Camundongo 430 Conjunto 2.0). Os conjuntos para cada shRNA foram feitos em triplicata (6 camundongos por grupo).

Análise em nanorreservatório da produção de citocina em um nível de célula única

[00255] Materiais. Os anticorpos utilizados para a ativação de célula T foram CD3 anti-camundongo e CD28 anti-camundongo (Biolegend). Os anticorpos utilizados para capturar citocinas secretadas foram IFNY anti-camundongo (Biolegend), IL-2 anti- camundongo (Biolegend), TNFα anti-camundongo (Biolegend) e GM-CSF anti- camundongo (Biolegend). Os anticorpos de detecção foram IFNY anti-camundongo (Biolegend), IL-2 anti-camundongo (Biolegend), TNFα anti-camundongo (Biolegend) e GM-CSF anti-camundongo (Biolegend), e eles foram fluorescentemente rotulados com corantes Alexa Fluor apropriados (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. Os lipídeos utilizados para preparar bicamadas sustentadas foram: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinil) (Biotinil Cap PE ) (Avanti Polar Lipids).

[00256] Fabricação de conjuntos PDMS de nanoreservatórios e preparação de bicamadas lipídicas sustentadas. O conjunto de nanorreservatórios foi fabricado pela injeção de polidimetilsiloxano (PDMS, Dow Corning) preparado em uma razão em peso de base/catalisador de 10:1 em um molde fabricado sob encomenda envolvendo um mestre de silicone micropadronizado. Os conjuntos de nanorreservatórios foram curados a 70°C por 4 a 16 h. Cada conjunto compreendeu 72 x 24 blocos, cada um contendo um subconjunto de 7 x 7 (50 μm x 50 μm x 50 μm) de nanorreservatórios (total de 84,672 reservatórios). Os conjuntos de PDMS aderiram diretamente a uma lâmina de vidro de 3’’ x 1’’ (7,6 cm x 2,5 cm) formando uma camada de 1 mm de espessura. As bicamadas lipídicas sustentadas foram preparadas como descrito anteriormente14. As bicamadas foram geradas aplicando-se lipossomas DOPC contendo 2% em mol de biotina-Cap-lipídeos PE no conjunto PDMS de nanorreservatórios. As superfícies foram enxaguadas com água desionizada para remover lipossomas em excesso. Antes do uso, a bicamada lipídica foi bloqueada com BSA em PBS (100 μg/ml) por 45 minutos. A bicamada foi depois incubada com 1 μg/ml de estreptavidina em uma solução de 100 μg/ml de BSA em PBS, seguido pela incubação com anticorpos CD3 e CD28 biotinilados. O dispositivo foi enxaguado extensivamente com PBS antes de adicionar as células.

[00257] Microgravação. Os anticorpos de captura foram diluídos em tampão de borato (50 mM de borato de sódio, 8 mM de sacarose, e 50 mM de NaCl, pH 9,0) a uma concentração final de 10 μg/ml e depositados na superfície de lâminas modificadas com epóxi por 1 h na temperatura ambiente. As lâminas foram bloqueadas com 3% de leite desnatado em PBST (PBS com 0,05% (v/v) de Tween 20) por 30 min na temperatura ambiente e lavadas com PBS antes de coloca-las em contato com o conjunto de PDMS de nanorreservatórios. Uma suspensão de células T foi dispensada na superfície dos nanorreservatórios, modificada com uma bicamada lipídica sustentada no meio e deixado sedimentar nos reservatórios. A densidade de células colocadas em suspensão aplicada ao conjunto foi optimizada empiricamente para maximizar a ocupação do reservatório pelas células únicas (tipicamente ~30% dos reservatórios). Depois da incubação dos reservatórios carregados com célula, uma lâmina de vidro revestida com anticorpos de captura foi depois colocada sobre o conjunto carregado para a captura de citocina. O microconjunto e a lâmina de vidro foram mantidos juntos pela compressão em uma câmara de hibridização (Agilent Technologies, G2534A) e incubados por 1 h a 37°C com 5% de CO2. A lâmina de vidro foi depois separada do conjunto e colocada em PBS.

[00258] Depois da microgravação, as lâminas foram incubadas por 30 min com tampão de bloqueio (PBS, 10 mg/ml de BSA, 0,05% (v/v) de Tween-20, 2% de soro de camundongo e 2 mM de azida de sódio), lavado com PBST (PBS+ 0,05% v/v de Tween-20), e depois incubados com anticorpos de detecção de fluorescência a 1 μg/ml por 45 min a 25°C. As lâminas foram lavadas com PBST e PBS, enxaguadas ligeiramente com água, e secadas com uma corrente de N2. As lâminas de referência foram geradas no final de cada experimento com os mesmos anticorpos de detecção utilizados nas lâminas impressas. Para as lâminas de referência, os anticorpos foram diluídos em água, manchados em lâminas de poli-L-lisina em branco (1 μL/mancha), e as lâminas de referência foram secadas sob vácuo. As lâminas foram escaneadas utilizando um Genepix 4200AL microarray scanner (Molecular Devices). A intensidade de fluorescência média de cada mancha foi extraída utilizando Genepix Pro.

[00259] Citometria com base na imagem no chip. Antes de formar a imagem, as células T foram tingidas com CellMask® Plasma Membrane Stain (Invitrogen, Life Technologies) e SYTOX verde (para a detecção de células mortas, Life Technologies). Os conjuntos carregados com célula de nanorreservatórios foram montados com a face para cima no microscópio com uma lamínula colocada no topo do conjunto. As imagens foram adquiridas em um microscópio de epifluorescência invertido automatizado (Carl Zeiss). A luz transmitida e micrográficos de epifluorescência foram coletados bloco por bloco (7 x 7 microrreservatórios por bloco). A coleção resultante de imagens foi analisada utilizando um programa feito de encomenda para determinar o número de células presentes em cada reservatório e a intensidade de fluorescência média de cada rótulo. Apenas as células T viáveis foram consideradas para a análise. Embora as células expressem GFP, a intensidade de fluorescência de GFP foi negligenciável sob o fundo de aquisição do microscópio utilizado comparado ao SYTOX verde, possibilitando a identificação de células mortas.

[00260] Análise de dados. Os dados extraídos tanto da citometria no chip quanto citocinas impressas foram emparelhadas no Microsoft Excel utilizando identificadores únicos designados a cada reservatório dentro do conjunto. O conjunto de dados foi filtrado para incluir reservatórios contendo apenas células únicas. Para compensar o vazamento de sinal e converter a intensidade de fluorescência medida quanto às citocinas capturadas de uma dada célula em uma taxa de secreção, os dados das curvas de calibração padrão (das lâminas de referência) preparadas com quantidades conhecidas de anticorpos de detecção foram utilizados para converter intensidades de medida para várias moléculas, como descrito anteriormente (Han, Q., et al., Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab Chip 10, 1391-1400, doi:10,1039/b926849a (2010).

Exemplo 1: Descoberta de RNAi in vivo de Alvos de Imunoterapia

[00261] Duas triagens primárias grandes foram realizadas, com a primeira focalizando nos genes expressos em excesso em células T disfuncionais (anergia de célula T ou exaustão; 255 genes, 1.275 shRNAs divididos em dois grupos), e a segunda nas cinases/fosfatases (1.307 genes, 6.535 shRNAs divididos em sete grupos) (Tabela 4). Nestas triagens primárias, cada gene foi representado por ~5 shRNAs. TABELA 4

[00262] shRNAs que miram 255 genes expressos em excesso em células T disfuncionais (estado anérgico ou exaurido)31-37 e 1.307 genes da cinase/fosfatase (~5 shRNAs por gene) foram obtidos do The RNAi Consortium (TRC; Broad Institute, Cambridge, MA, USA). Nove grupos foram criados e shRNAs subclonados no vetor lentiviral pLKO-Thy1.1. Cada grupo também conteve 85 shRNAs de controle negativo (número de shRNAs: GFP, 24; LacZ, 20; luciferase 25; RFP 16). As células T OT-I isoladas pela seleção negativa (Stemcell Technologies) foram cultivados com IL-7 (5 ng/ml, Peprotech) e IL-15 (100 ng/ml, Peprotech) em meio RPMI completo (RPMI 1640, 10 % de FBS, 20 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 0,05 mM de 2- mercaptoetonal, 2 mM de L-glutamina, 100 μg/ml de estreptomicina e 100 μg/ml de penicilina). No dia 2, as células T OT-I foram infectadas por rotação com grupos lentivirais (nove grupos shRNA lentivirais e um controle lentiviral de vetor shRNA de controle LacZ) suplementado com sulfato de protamina (5 μg/ml) em placas de 24 reservatórios revestidas com retronectina (5 μg/ml) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 15. Tipicamente, ~5 x 106 células T OT-1 foram infectadas para cada grupo.

[00263] A seguir da infecção, as células OT-I foram cultivadas com IL-7 (2,5 ng/ml), IL-15 (50 ng/ml) e IL-2 (2 ng/ml) em meio RPMI completo. No dia 5, células T vivas transduzidas com shRNA foram enriquecidas utilizando um kit de remoção de célula morta (Miltenyi), e as células infectadas foram positivamente selecionadas com base no marcador Thy1.1 (Stemcell Technologies) de 50 a 60 % de positividade de Thy1.1. A transdução bem sucedida foi monitorada pela expressão na superfície do repórter Thy1.1 (FIG. 2). As células T (5 x 106) foram injetadas i.v. em camundongos C57BL/6 que carregam tumores B16-Ova de 14 dias (15 camundongos por grupo de shRNA) (número de animais escolhidos para fornecer células suficientes para a isolação de célula T e PCR). O DNA genômico foi isolado de 5 x 106 células OT-I enriquecidas como a população de partida para o sequenciamento profundo. Sete dias mais tarde, as células T que expressam shRNA (CD8+Vα2+Vβ5+Thy1.1+) foram isoladas pela citometria de fluxo de tumores, baços, linfonodos de drenagem de tumor e linfonodos irrelevantes para a isolação de DNA genômico, seguido pela amplificação pela PCR do cassete de shRNA. (FIG. 3) O DNA genômico foi isolado (Qiagen) e os padrões de sequenciamento profundo foram gerados pela PCR do cassete de shRNA. A representação de shRNAs em cada grupo foi analisada pelo sequenciamento profundo utilizando um Illumina Genome Analyzer30. Os dados foram normalizados utilizando as leituras médias de shRNAs de controle em cada grupo. Os genes da cinase/fosfatase foram selecionados para a triagem secundária com base nos níveis de expressão nas células T.

[00264] Para certos genes, shRNAs foram representados em excesso em todos os tecidos testados comparado com a população de célula T de partida (por exemplo SHP- 1), indicativo de proliferação realçada independente do reconhecimento de um antígeno tumoral. Para outros genes, houve uma perda seletiva de shRNAs dentro de tumores (por exemplo ZAP-70, uma cinase crítica no caminho da ativação de célula T). Nós focalizamos nossas análises nos genes cujos shRNAs mostraram representação excessiva substancial em tumor mas não no baço, um órgão linfoide secundário. O acúmulo de célula T substancial em tumores foi observado para vários shRNAs, a despeito do ambiente imunossupressivo. Para as triagens secundárias, nós criamos grupos focalizados em que cada gene candidato foi representado por ~15 shRNAs.

[00265] Os dados primários desta análise são demonstrados para três genes na FIG. 4: LacZ (controle negativo), Cblb (uma E3 ubiquitina ligase que induz a internalização do receptor de célula T)19 e Ppp2r2d (não anteriormente estudado nas células T). Tanto para Ppp2r2d quanto Cblb, cinco shRNAs foram substancialmente aumentados em tumores (vermelho) comparado com o baço, enquanto que nenhum enriquecimento foi observado para shRNAs LacZ. No geral, 43 genes atingiram os seguintes critérios: > 4 vezes de enriquecimento por 3 ou mais shRNAs em tumores comparado com o baço (Tabela 5, FIG. 4, FIG. 5). O conjunto incluiu produtos de gene previamente identificados como inibidores da sinalização do receptor de célula T (incluindo Cblb, Dgka, Dgkz, Ptpn2) assim como outros inibidores da função da célula T bem conhecidos (por exemplo Smad2, Socs1, Socs3, Egr2), validando nosso método (Tabela 5, Tabela 6).20-22 A Tabela 5 descreve a classificação funcional de genes candidatos da triagem secundária. TABELA 5

[00266] Triagens secundárias foram realizadas focalizando nos genes cujos shRNAs mostraram representação em excesso substancial em tumor mas não no baço, um órgão linfoide secundário. O acúmulo substancial de célula T nos tumores foi observado para vários shRNAs, a despeito do ambiente imunossupressivo. Para estas triagens secundárias, ~10 shRNAs adicionais foram sintetizados para cada gene (IDT) por um total de ~15 shRNAs por gene. Estes grupos focalizados contiveram 85 shRNAs de controle negativo. Dois shRNAs de controle (um para RFP, um para luciferase) mostraram algum enriquecimento em tumores relativos ao baço (4,0 e 5,1 vezes, respectivamente). O corte na triagem secundária foi definido como >3 shRNAs com >4 vezes de enriquecimento em tumor relativo ao baço. Os resultados da triagem foram validados em um nível celular pela introdução de shRNAs individuais dentro das células T, junto com uma proteína repórter (GFP, TFP, RFP ou proteínas fluorescentes de Ametrina, Thy1.1). Este método possibilitou o teste simultâneo de cinco shRNAs em um animal (três camundongos por grupo). A proliferação de células T transduzidas com shRNA foi visualizada com base na diluição com CFSE depois de 24 horas assim como 3, 5 e 7 dias. Além disso, o tingimento intracelulares foi realizado nos dias 3, 5 e 7 para IFNY, TNFα e controles de isótipo. Os resultados da triagem primária e secundária da biblioteca de shRNA do grupo da disfunção da célula T são fornecidos na Tabela 6. Os genes para os quais pelo menos 3 shRNAs mostraram >4 vezes de enriquecimento em tumores são listados, juntos com uma breve descrição da sua função. Os resultados da triagem secundária das bibliotecas da cinase e fosfatase de shRNA são demonstrados na Tabela 7. TABELA 6

TABELA 7

Exemplo 2: Expansão dirigida por shRNA de células T CD4 e CD8 em melanomas B16

[00267] Os shRNAs positivos da análise de sequenciamento profundo foram clonados em vetores lentivirais que codificam cinco proteínas repórter diferentes (GFP, TFP, RFP ou proteínas fluorescentes de Ametrina, Thy1.1). As células T OT-I pretratadas com citocina foram transduzidas com vetores lentivirais que direcionam a expressão de um único shRNA e uma proteína repórter; 1 x 106 células T de cada população foram misturadas e co-injetadas i.v. em camundongos C57BL/6 que carregam tumores B16-Ova de 14 dias. Depois de sete dias as células T foram isoladas dos tumores, baços e linfonodos, e a porcentagem de células T CD8+Vα2+Vβ5+ repórter-positivas foi determinada pela citometria de fluxo com base nos relatórios co- introduzidos. As vezes de enriquecimento em tumores comparados com o baço foram calculadas com base na porcentagem de células T OT-I em cada órgão que expressa um repórter particular. Quando o shRNA LacZ de controle foi expresso em células T CD8 OT-I, a frequência de células T CD8 OT-I que expressam shRNA foi mais baixa em tumores comparada ao baço (~2 vezes). Ao contrário, os shRNAs experimentais induziram o acúmulo de células T CD8 OT-I em tumores mas não no baço (FIG. 6, FIG. 7). Para sete destes shRNAs (por exemplo, Ppp2r2D, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap8I, Rbks e Egr2), o acúmulo de célula T em tumores foi >10 vezes em relação ao baço. O fenótipo mais forte foi observado com shRNAs que mira Ppp2r2d, uma subunidade reguladora da PP2A fosfatase7.

[00268] As células T CD8+ OT-I ou CD4+ TRP-1 que expressam shRNAs Ppp2r2d ou LacZ foram injetadas em camundongos que carregam tumores B16-Ova de 14 dias. As células T que expressam shRNA foram identificadas em tumores e baços utilizando repórter Thy1.1 (FIG. 8, % de células T CD8 Thy1.1+, painéis esquerdos). Os números totais de células T LacZ ou Ppp2r2d que expressam shRNA foram determinados em tumores e baços 7 dias a seguir da transferência de 2 x 106 células que expressam shRNA (FIG. 8, painéis direitos). As vezes de enriquecimento de células T que expressam shRNA Ppp2r2d versus LacZ em tumores é indicado. O shRNA Ppp2r2d não apenas induziu o acúmulo de células T CD8 OT-I, mas também células T CD4 (de camundongos transgênicos TRP-1 TCR)23, com os números de célula T nos tumores sendo significantemente mais altos quando shRNA Ppp2r2d ao invés de LacZ foi expresso (36,3 vezes para células T CD8; 16,2 vezes para células T CD4) (FIG. 8).

[00269] O enriquecimento de célula T em tumores comparado ao baço para as células que expressam um painel de shRNAs Ppp2r2d ou Cblb (FIG. 17, canais superiores) os níveis de mRNA Ppp2r2d e Cblb também foram medidos pela qPCR antes da transferência de célula T (FIG. 17, painéis inferiores). O enriquecimento de célula T mais forte em tumores foi observado para shRNAs com >80 % de eficiência reduzida ao nível de mRNA (shRNAs #1 e 2 tanto para Ppp2r2d quanto Cblb). O acúmulo de célula T CD8 correlacionou-se com o grau de redução de Ppp2r2d, e dois shRNAs Ppp2r2d com a atividade in vivo mais alta induziu os níveis mais baixos de mRNA de Ppp2r2d (FIG. 17).

[00270] A redução de Ppp2r2d também foi confirmada ao nível da proteína utilizando um método de espectrometria de massa quantitativa (FIG. 18). Um método anteriormente relatado para a quantificação absoluta (AQUA) de proteínas a partir de lisados de célula pela espectrometria de massa foi utilizado para medir o efeito da expressão de shRNA Ppp2r2d ao nível da proteína (Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W. & Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. PNAS, 100, 6940-6945 (2003). Esta estratégia está fundamentada em um método de ‘monitoramento de reação seletiva’ em que um peptídeo sintético com isótopos estáveis incorporados é utilizado como um padrão interno para a análise de espectrometria massa. As células OT-I que expressam shRNAs LacZ ou Ppp2r2d foram classificadas quanto à pureza utilizando FACS. As células (1 x 106) foram lisadas em 1 ml de reagente de extração MPER (Pierce) contendo um Coquetel de Inibidor da Protease (Sigma), 1 mM de EDTA e 1 mM de PMSF por 15 minutos em gelo com turbilhonamento ocasional. Os fragmentos de célula foram removidos pela centrifugação e o sobrenadante de proteína foi filtrado (filtro de centrífuga SpinX de 0,2 μm, Costar). A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de Bradford (Biorad) e análise de UV280 nm (Nanodrop instrument); 0,1 mg de proteína celular foi separado pela SDS-PAGE e tingido com reagente azul de Coomassie (Pierce). As faixas de gel correspondendo a uma faixa de PM de 45 a 60 kDa foram excisadas seguido pela digestão em gel de proteínas com tripsina. Os peptídeos eluídos foram reforçados com 300 fmol de Ppp2r2d isotopicamente rotulado peptídeos (FFEEPEDPSS[13C-15N-R]-OH) (SEQ ID NO: 628) e Actina B (GYSFTTTAE[13C-15N-R]-OH) (SEQ ID NO: 629) (21st Century Biochemicals) para a quantificação pela LC MS/MS (LTQ XL Orbitrap, Thermo Scientific). O peptídeo Ppp2r2d foi escolhido de uma região da proteína que difere de outras subunidades reguladoras de PP2A. Inicial\, uma rodada de LC-MS/MS de uma amostra de shRNA LacZ foi analisada para localizar os peptídeos Ppp2r2d e Actina B que estavam sendo monitorados. Os peptídeos AQUA de quantificação absoluta co-eluiu com os peptídeos endógenos correspondentes da coluna de fase reversa, embora seu PM mais alto (10 Da) possibiltasse que a razão de intensidade de pico para peptídeos endógenos e AQUA fossem determinados utilizando íons de fragmento de peptídeo abundante. As amostras em triplicata foram analisadas pela SDS-PAGE - LC-MS/MS e a significância estatística foi determinada utilizando o software Graphpad Prism 6.0 utilizando um teste t de Student bilateral (teste F, * p = 0,0062).

[00271] A especificidade do shRNA Ppp2r2d foi determinada. A atividade do shRNA Ppp2r2d foi específica porque o fenótipo foi revertido quando um cDNA Ppp2r2d mutado (com sequência de proteína do tipo selvagem, mas a sequência de DNA mutado no sítio de ligação de shRNA) foi cointroduzido com o shRNA Ppp2r2d (FIG. 9, 10a-c). Além disso, as células T CD8 OT-I super-expressam Ppp2r2d em tumores comparado com o baço (na ausência de qualquer expressão de shRNA), sugerindo que as mesmas sejam um componente intrínseco da rede de sinalização que inibem a função da célula T em tumores (FIG. 19).

[00272] As células T OT-I transduzidas com vetores lentivirais que dirigem a expressão de shRNA LacZ, shRNA Ppp2r2d, shRNA Ppp2r2d. O cDNA Ppp2r2d mutante com sequência de proteína preservada mas sítio de ligação de shRNA rompido foram geradas. O cDNA Ppp2r2d do tipo selvagem foi isolado pela RT-PCR utilizando o iniciador avançado GGATCCATGGCAGGAGCTGGAGGC (SEQ ID NO: 630) e iniciador reverso: GCTAGCATTAATTTTGTCCTGGAATATATACAAGTTATTGGTGG (SEQ ID NO: 631). A sequência alvo de shRNA Ppp2r2d, CCCACATCAGTGCAATGTATT (SEQ ID NO: 632) foi mutada para TCCCCACCAATGTAACGTGTT (SEQ ID NO: 633) pela PCR de sobreposição (que conserva a sequência codificadora da proteína) utilizando iniciador avançado: TCCATCCCCACCAATGTAACGTGTTTGTTTACAGCAGCAGCAAGG (SEQ ID NO: 634) e iniciador reverso: AAACAAACACGTTACATTGGTGGGGATGGAACTCTGCGGCAGTGA (SEQ ID NO: 635). (FIG. 10a). os cDNAs Ppp2r2d tanto do tipo selvagem quanto mutante foram clonados em um vetor pLKO,3 modificado com uma sequência de peptídeo de supressão ribossômica 2A-GFP (que resulta na expressão estequiométrica de Ppp2r2d e GFP nas células). As construções foram introduzidas em células de timoma EL4. As células EL4 que expressam GFP foram classificadas quanto à pureza e depois transduzidas com vetores lentivirais de shRNA LacZ ou Ppp2r2d que direcionam a expressão de um repórter Thy1.1. As células transduzidas com shRNA (Thy1.1+) foram analisadas pela citometria de fluxo quanto à expressão de GFP. O shRNA Ppp2r2d reduziu os níveis de GFP quando Ppp2r2d do tipo selvagem. O shRNA Ppp2r2d não foi capaz de reduzir a expressão do repórter GFP nas células que expressam o cDNA Ppp2r2d mutante, demonstrando que o sítio de ligação de shRNA foi mutado com êxito. (FIG. 10a)

[00273] A expressão de cDNA Ppp2r2d mutante também impede o fenótipo induzido pelo shRNA Ppp2r2d. (FIG. 10b) O shRNA Ppp2r2d foi clonado na construção cDNA Ppp2r2d mutante-2A-GFP que resultou na coexpressão de shRNA Ppp2r2d e cDNA Ppp2r2d mutado em um vetor. As células T OT-I foram separadamente infectadas com lentivírus que codificam shRNA LacZ (Thy1.1), shRNA Ppp2r2d (Ametrina) ou shRNA Ppp2r2d mais cDNA Ppp2r2d mutante (GFP). (FIG. 10b) Estas três populações depois foram misturadas na mesma razão e injetadas em camundongos que carregam tumores B16-Ova de 14 dias. No dia 7, cada população de célula T foi quantificada em tumores e baços pela comutação nas células T OT-I (CD8+Vα2+Vβ5+) seguido pela análise de populações marcadas pela expressão de Thy1.1, Ametrina ou GFP. A porcentagem de cada população de célula T em tumores e baços foi quantificada pela comutação nas células T Vα2+Vβ5+; as células transduzidas foram detectadas com base na expressão de relatórios fluorescentes Thy1.1 ou Ametrina/GFP e os resultados são demonstrados na FIG. 10b. (dados representativos de 2 experimentos independentes, n = 3 camundongos por experimento).

[00274] A FIG. 10c fornece a análise de PCR em tempo real para a expressão de Ppp2r2d em células T OT-I transduzidas com shRNA LacZ, shRNA Ppp2r2d, e shRNA Ppp2r2d mais cDNA de Ppp2r2d mutante. Também, o shRNA Ppp2r2d com a atividade in vivo mais alta foi associada com os níveis mais baixos de mRNA Ppp2r2d (FIG. 11).

[00275] A análise de microarranjo de células T de infiltração em tumor que expressam shRNAs experimentais ou de controle mostraram que cada shRNA induziu um conjunto distinto de mudanças na expressão de gene, com alguma sobreposição entre shRNAs particulares (FIG. 12a-c). Dois genes (Egr2 e Ptpn2) têm funções conhecidas nas células T. O enriquecimento em tumor versus baço foi calculado com base nos resultados de sequenciamento profundo da triagem secundária. (FIG. 12a) O agrupamento dos níveis de expressão médios para mRNAs descobertos serem significantemente regulados pelas células T em baços ou tumores que expressam o shRNA LacZ de controle ou um dos cinco shRNAs experimentais. (FIG. 12b) as diferenças de expressão significantes foram definidas como um valor p de Anova <0,01 entre células T que expressam shRNA LacZ de controle ou um de cinco shRNAs experimentais (Alk, Arhgap5, Egr2, Ptpn2 ou Ppp2r2d) (JMP-Genomics 6,0, SAS Institute Inc.). Os mRNAs significantemente regularam em um ou mais grupos de tratamento são demonstrados depois do agrupamento (Fast Ward). A FIG. 12c é um diagrama de Venn demonstrando as sobreposições entre as assinaturas de expressão pelas células T de infiltração em tumor transduzidas com um dos cinco shRNAs experimentais (assinaturas definidas como um Anova p<0,01 como descrito acima). São indicados os números de IDs de sonda de sobreposição para qualquer combinação das 5 assinaturas, como indicado pelos ovais de sobreposição. A significância das sobreposições versus aquela esperada pela chance aleatória (Teste Exato de Fisher) é mostrada na tabela anexa.

Exemplo 3: Mudanças na função da célula T induzidas por Ppp2r2d

[00276] Para este exemplo, os mecanismos celulares que direcionam o acúmulo de célula T por um shRNA Ppp2r2d em tumores - especificamente a infiltração, acúmulo e apoptose de célula T foram examinados. A infiltração de célula T em tumores foi avaliado pela transferência de células T CD8 OT-I rotuladas com um corante citossólico, CFSE. As células T OT-I que expressam shRNAs Ppp2r2d ou LacZ foram rotulados com CFSE e injetados em camundongos que carregam tumor B16-Ova. Vinte e quatro horas mais tarde as células T transduzidas foram isoladas de tumores e baços e quantificadas pela citometria de fluxo. As células T OT-I que expressam shRNAs LacZ ou Ppp2r2d foram purificadas utilizando o repórter Thy1.1 e cultivadas em meio RPMI completo sem citocinas adicionadas por 24 horas. As células vivas isoladas pela centrifugação de gradiente de densidade Ficoll (Sigma) foram rotuladas com CFSE (diacetato de carboxifluoresceína, éster succinimidílico, Invitrogen), e 2 x 106 células rotuladas foram injetadas em camundongos que carregam tumores B16-Ova de 14 dias. A diluição de CFSE foi quantificada pela citometria de fluxo em 24 horas e 3, 5 e 7 dias a seguir da transferência. Além disso, o tingimento intracelular foi realizado nos dias 3, 5 e 7 para IFNY, TNFα e controles de isótipo (BD). Nenhuma diferença foi observada na frequência de células T CD8 transduzidas com shRNA Ppp2r2d ou LacZ em tumores no dia 1, argumentando contra um efeito substancial sobre a infiltração de célula T (FIG. 13a). Entretanto, a análise dos últimos pontos de tempo (dias 3 e 5) demonstraram um grau mais alto de proliferação (com base na diluição de CFSE) pelo Ppp2r2d comparado com as células T transduzidas com shRNA LacZ (FIG. 13b, FIG. 20a). As células T transduzidas com shRNA Ppp2r2d também produziram níveis mais altos de interferon-Y, uma citocina crítica para a imunidade antitumor (Fig. 13e). A ação de Ppp2r2d foi a jusante da ativação do receptor de célula T porque o acúmulo de célula T foi realçado em tumores e a um grau menor nos linfonodos de drenagem de tumor. Ao contrário, nenhum acúmulo foi observado em linfonodos irrelevantes ou no baço onde o antígeno relevante não é apresentado às células T (FIG. 15). Um grau substancial de acúmulo de célula T foi ainda observado para as células T transduzidas com shRNA LacZ (diluição completa de corante CFSE no dia 7), a despeito da presença de números pequenos de tais células em tumores. Isto sugeriu que as células T transduzidas com shRNA LacZ foram perdidas pela apoptose. De fato, uma porcentagem maior de células T de infiltração em tumor foram rotuladas com um anticorpo específico para a caspase-3 ativa quando o shRNA LacZ de controle (ao invés do shRNA Ppp2r2d) foi expresso (FIG. 13g, FIG. 20b). Além disso, a co-cultura de células T CD8 com células tumorais B16-Ova mostrou que a maioria das células T que expressam shRNA LacZ tornam-se apoptóticas (65,7 %) enquanto a maioria das células T transduzidas com shRNA Ppp2r2d foram viáveis (89,5 %, FIG. 13c).

[00277] As células T OT-I que expressam os shRNAs LacZ ou Ppp2r2d foram purificadas com base na expressão de Thy1.1 e rotuladas com CFSE, como descrito acima. As células T OT-I rotuladas com CFSE (1 x 105) foram co-cultivadas com 5 x 104 células B16-Ova por reservatório em uma placa de 96 reservatórios por 72 h. Antes do ensaio, as células B16-Ova foram expostos a 1 ng/ml de IFNY por 48 horas (para induzir MHC classe I, que não é expresso in vitro) e lavadas três vezes. A apoptose de células T OT-I foi detectada pela rotulação com anexina V de células CD8+. (FIG. 13c) Tingimento intracelular de fosfo-AKT (Ser473), fosfo-Bad (Ser 112), Bcl-2 e o controle de isótipo foi realizado em 48 horas utilizando um kit de tingimento intracelular BD. A cocultura de células T CD8 com células tumorais B16-Ova de fato mostraram que a maioria das células T que expressam shRNA LacZ foram apoptóticas (65,7 %) enquanto a maioria das células T transduzidas com shRNA Ppp2r2d foram viáveis (89,5 %, FIG. 13c). Um fenótipo similar foi observado quando as células T que expressam shRNA Ppp2r2d e LacZ foram estimuladas com anticorpo CD3 imobilizado na ausência de coestimulação com CD28 (FIG. 14). Especificamente, as células B16-Ova (2 x 105) foram injetadas s.c. em camundongos C57BL/6 fêmeas (10 semanas de idade). No dia 12, os camundongos que carregam tumores de tamanho similar foram divididos em 7 grupos (7 a 8 camundongos/grupo). As células T CD4 TRP-1 ou/e CD8 OT-I ativadas com grânulos anti-CD3/CD28 infectadas com vetores de shRNA Ppp2r2d ou LacZ (2 x 106 células T cada) foram injetadas i.v. nos dias 12 e dia 17. Para o tratamento de tumores B16, camundongos foram tratados no dia 10 com células T CD4 TRP-1 e CD8 pmel-1 ativadas por pérola anti-CD3/CD28 que expressam shRNAs Ppp2r2d ou LacZ (3 x 106 células T cada). O tamanho do tumor foi medido a cada três dias a seguir da transferência e calculado como comprimento x largura. Camundongos com tumores >20 mm no eixo mais longo foram sacrificados.

[00278] Estes resultados sugeriram a possibilidade de que as células T CD8 transduzidas por shRNA Ppp2r2d podem ser capazes de proliferar e sobreviver mesmo quando elas reconhecem seu antígeno diretamente apresentado pelas células tumorais B16-Ova. Esta idéia foi testada pela implantação de células tumorais em camundongos b2m-/- que são deficientes na expressão de proteínas MHC classe I24. Em tais camundongos, apenas as células tumorais mas não as células que apresentam antígeno profissionais do hospedeiro apresentariam antígenos de tumor para as células T. De fato, as células T CD8 OT-I transduzidas com shRNA Ppp2r2d mostraram acúmulo maciço dentro de tumores B16-Ova em camundongos b2m-/- (FIG. 12f) enquanto houve números muito pequenos de células T em tumores B16 contralaterais que careceram da expressão do antígeno Ova. As células T que expressam um shRNA Ppp2r2d assim eficazmente proliferariam e sobreviveriam em resposta às células tumorais, a despeito de uma falta de sinais coestimulatórios adequados e um microambiente inibidor.

[00279] A análise ex vivo de células T de infiltração em tumor em um nível de célula única utilizando um dispositivo de nanorreservatório também demonstrou que o silenciamento de Ppp2r2d aumentou a produção de citocina pelas células T (FIG. 21a- c). As células T foram ativadas por 3 horas pelos anticorpos CD3/CD28 nas bicamadas lipídicas, seguido por 1 hora de captura de citocina nas lâminas revestidas com anticorpo. As células T CD8 mostraram uma taxa de secreção mais alta para IFNY, IL-2 e GM-CSF, e uma fração maior de células T mais do que uma citocina (FIG. 21b, c). A presença de números grandes de células T que produzem IFNY foi confirmada pelo tingimento de citocina intracelular (FIG. 21d, FIG. 20).

[00280] A PP2A fosfatase é composta de uma subunidade catalítica e esqueletação, e a sua especificidade de substrato é determinada por uma de muitas subunidades reguladoras7. Ppp2r2d direciona PP2A para substratos Cdk1 durante a interfase e anáfase; o mesmo inibe deste modo a entrada na mitose e induz a saída da mitose25. PP2A desempenha um papel de porteiro para a apoptose mediada por BAD. BAD fosforilado é sequestrado na sua forma inativa no citossol em 14-3-3, enquanto que BAD desfosforilado é mirado à mitocondria onde causa a morte da célula pela ligação de Bcl-XL e Bcl-226. As PP2A fosfatases também foram mostradas interagir com os domínios citoplásmicos de CD28 e CTLA-4 assim como Carma1 (a montante do caminho NF-KB), mas não é conhecido que subunidades reguladoras sejam requeridas para estas atividades; os anticorpos de Ppp2r2d adequados para os estudos bioquímicos requeridos correntemente não são disponíveis.

Exemplo 4: O silenciamento de Ppp2r2d realça a atividade antitumor de células T CD4 e CD8

[00281] A capacidade de um shRNA Ppp2r2d para realçar a eficácia de terapia de célula T adotiva foi avaliada. As células tumorais B16-Ova (2 x 105) foram injetadas subcutaneamente em camundongos C57BL/6 fêmea (10 semanas de idade). No dia 12, camundongos que carregam tumores de tamanho similar foram divididos em sete grupos (7 a 8 camundongos/grupo), não recebendo nenhuma célula T, 2 x 106 células T CD4 TRP-1 transduzidas com shRNA, 2 x 106 células T CD8 OT-I infectadas com shRNA, ou células T tanto CD4 quanto CD8 (dias 12 e dia 17). De acordo com o grupo, células T CD4 TRP-1 ou/e CD8 OT-I ativadas com pérola anti-CD3/CD28 infectadas com vetores de shRNA Ppp2r2d ou LacZ (2 x 106 células T cada) foram injetadas i.v. no dia 12 e dia 17. Para o tratamento de tumores B16, camundongos foram tratados no dia 10 com células T CD4 TRP-1 e CD8 pmel-1 ativadas com pérola anti-CD3/CD28 que expressam shRNAs Ppp2r2d ou LacZ (3 x 106 células T cada). O tamanho de tumor foi medido a cada três dias a seguir da transferência e calculado como comprimento x largura. Os camundongos com tumores >20 mm no eixo mais longo foram sacrificados. O silenciamento de Ppp2r2d melhorou a atividade terapêutica de células T CD4 e CD8, e um efeito sinergístico foi observado quando as células T CD4 e CD8 transduzidas com shRNA Ppp2r2d foram co-administradas (FIG. 16a, b). Um shRNA Ppp2r2d também realçou as respostas antitumor quando introduzidas em células T específicas para antígenos de tumor endógenos (células T CD8 pmel-1 e células T CD4 TRP-1) (FIG. 16c).

[00282] As células T silenciadas com Ppp2r2d adquiriram um fenótipo efetor em tumores (FIG. 22a) e >30% das células expressam granzyme B (FIG. 23a). Compatível com números enormemente aumentados de tais células T efetoras em tumores (FIG. 23b), o tingimento de TUNEL demonstrou apoptose aumentada em tumores quando Ppp2r2d ao invés de células T que expressam shRNA LacZ foram presentes (FIG. 23c). os melanomas B16 são tumores altamente agressivos em parte porque a expressão de MHC classe I é muito baixa. Interessantemente, as células T que expressam shRNA Ppp2r2d mas não LacZ significantemente aumentaram a expressão de MHC classe I (H-2Kb) pelas células tumorais (FIG. 23d), possivelmente devido ao aumento observado na secreção de IFNY pelas células T (FIG. 21a-c, FIG. 13e). Um shRNA Ppp2r2d não reduziu a expressão de receptores PD-1 ou LAG-3 inibidores nas células T de infiltração em tumor, demonstrando que o seu mecanismo de ação é distinto destes reguladores negativos conhecidos de função da célula T (FIG. 22b). Esta descoberta sugere métodos de combinação que alvejem estas moléculas intracelulares e de superfície de célula.

[00283] Estes resultados estabelecem a praticabilidade da descoberta in vivo de novos alvos para a imunoterapia em microambientes de tecido complexos. Os inventores mostraram que é possível descobrir genes com ação diferenciada através dos tecidos, como exemplificado pelo acúmulo de célula T em tumores comparados aos órgãos linfoides secundários. Para genes com ação seletiva de tecido, o acúmulo e a sobrevivência de célula T são prováveis de estar sob o controle do receptor de célula T e, portanto não ocorrem em tecidos que carecem de apresentação de um antígeno relevante. Muitas variações do método aqui apresentado podem ser previstas para investigar o controle de funções de célula imune particular in vivo. Por exemplo, relatórios fluorescentes para a expressão de citocinas ou moléculas citotóxica (granzyme B, perforin) podem ser integrados em nossos métodos para descobrir genes que controlam as funções efetoras de célula T críticas em tumores.

[00284] Mirar em comutações reguladoras chave pode oferecer novos métodos para modificar a atividade de células T em câncer e outras patologias. A eficácia de tais terapias com base em célula T pode ser realçada pelo silenciamento mediada por shRNA de genes que inibem a função da célula T no microambiente de tumor.

OUTRAS MODALIDADES

[00285] Deve ser entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunção com a descrição detalhada da mesma, a descrição precedente é intencionada a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens, e modificações estão dentro do escopo das seguintes reivindicações. REFERÊNCIAS 1. Galon, J., et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science 313, 1960-1964 (2006). 2. Hamanishi, J., et al. Programmed cell death 1 ligand 1 and tumorinfiltrating CD8+ T lymphocytes are prognostic factors of human ovarian cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 3360-3365 (2007). 3. Mahmoud, S.M., et al. Tumor-Infiltrating CD8+ Lymphocytes Predict Clinical Outcome in Breast Cancer. J Clin Oncol 29, 1949-1955 (2011). 4. Topalian, S.L., et al. 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Claims (19)

1. Vetor, caracterizada pelo fato de compreender uma sequência que codifica um shRNA, em que o shRNA compreende 15 nucleotídeos complementares contíguos a uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 604.

2. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vetor codifica um receptor de célula T específica de tumor.

3. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o vetor compreende ainda uma sequência que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação de antígeno, um domínio de transmembrana, e um domínio estimulador.

4. Vetor, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação de antígeno liga um antígeno tumoral ou antígeno patogênico, preferivelmente em que o antígeno tumoral é selecionado do grupo consistindo de antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), Antígeno carcinoembrionário (CEA), CD19, CD20, CD22, ROR1, mesotelina, CD333/IL3Ra, c-Met, Glicolipídeo F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, ERBB2, BIRC5, CEACAM5, WDR46, BAGE, CSAG2, DCT, MAGED4, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7, GAGE8, IL13RA2, MAGEA1, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA9, MAGEA10, MAGEA12, MAGEB1, MAGEB2, MAGEC2, TP53, TYR, TYRP1, SAGE1, SYCP1, SSX2, SSX4, KRAS, PRAME, NRAS, ACTN4, CTNNB1, CASP8, CDC27, CDK4, EEF2, FN1, HSPA1B, LPGAT1, ME1, HHAT, TRAPPC1, MUM3, MYO1B, PAPOLG, OS9, PTPRK, TPI1, ADFP, AFP, AIM2, ANXA2, ART4, CLCA2, CPSF1, PPIB, EPHA2, EPHA3, FGF5, CA9, TERT, MGAT5, CEL, F4.2, CAN, ETV6, BIRC7, CSF1, OGT, MUC1, MUC2, MUM1, CTAG1A, CTAG2, CTAG, MRPL28, FOLH1, RAGE, SFMBT1, KAAG1, SART1, TSPIL1, SART3, SOX10, TRG, WT1, TACSTD1, SILV, SCGB2A2, MC1R, MLANA, GPR143, OCA2, KLK3, SUPT7L, ARTC1, BRAF, CASP5, CDKN2A, UBXD5, EFTUD2, GPNMB, NFYC, PRDX5, ZUBR1, SIRT2, SNRPD1, HERV-K-MEL, CXorf61, CCDC110, VENTXP1, SPA17, KLK4, ANKRD30A, RAB38, CCND1, CYP1B1, MDM2, MMP2, ZNF395, RNF43, SCRN1, STEAP1, 707-AP, TGFBR2, PXDNL, AKAP13, PRTN3, PSCA, RHAMM, ACPP, ACRBP, LCK, RCVRN, RPS2, RPL10A, SLC45A3, BCL2L1, DKK1, ENAH, CSPG4, RGS5, BCR, BCR-ABL, ABL-BCR, DEK, DEK-CAN, ETV6-AML1, LDLR- FUT, NPM1-ALK1, PML-RARA, SYT-SSX1, SYT-SSX2, FLT3, ABL1, AML1, LDLR, FUT1, NPM1, ALK, PML1, RARA, SYT, SSX1, MSLN, UBE2V1, HNRPL, WHSC2, EIF4EBP1, WNK2, OAS3, BCL-2, MCL1, CTSH, ABCC3, BST2, MFGE8, TPBG, FMOD, XAGE1, RPSA, COTL1, CALR3, PA2G4, EZH2, FMNL1, HPSE, APC, UBE2A, BCAP31, TOP2A, TOP2B, ITGB8, RPA1, ABI2, CCNI, CDC2, SEPT2, STAT1, LRP1, ADAM17, JUP, DDR1, ITPR2, HMOX1, TPM4, BAAT, DNAJC8, TAPBP, LGALS3BP, PAGE4, PAK2, CDKN1A, PTHLH, SOX2, SOX11, TRPM8, TYMS, ATIC, PGK1, SOX4, TOR3A, TRGC2, BTBD2, SLBP, EGFR, IER3, TTK, LY6K, IGF2BP3, GPC3, SLC35A4, HSMD, H3F3A, ALDH1A1, MFI2, MMP14, SDCBP, PARP12, MET, CCNB1, PAX3-FKHR, PAX3, FOXO1, XBP1, SYND1, ETV5, HSPA1A, HMHA1, TRIM68, e qualquer combinação dos mesmos.

5. Vetor, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o CAR compreende ainda um domínio coestimulador.

6. Ácido nucleico isolado que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) e uma sequência que codifica um shRNA, em que o shRNA consiste de 15 nucleotídeos complementares contíguos a uma sequência de ácido nucleico de: SEQ ID NO: 604, e caracterizado pelo fato de que o CAR consiste de um domínio de ligação de antígeno, um domínio de transmembrana, um domínio estimulador e um domínio co-estimulador.

7. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, ou ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a sequência de shRNA reduz a expressão de Ppp2r2d.

8. Vetor, de acordo com a reivindicação 4, ou ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de antígeno é um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo, preferivelmente em que o fragmento de ligação de antígeno é um Fab ou scFv.

9. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de antígeno liga antígeno tumoral, preferencialmente em que o antígeno tumoral está associado com um melanoma, carcinoma, sarcomas, adenocarcinoma, linfoma, leucemia, câncer renal, de mama, de pulmão, vesical, cólon, de ovário, de próstata, de pâncreas, de estômago, cerebral, da cabeça e pescoço, de pele, de útero, de testículo, glioma, de esôfago e de fígado e preferencialmente em que o antígeno tumoral está associado com um tumor sólido ou tumor linfoide.

10. Vetor caracterizado pelo fato de compreender o ácido nucleico definido na reivindicação 6, preferencialmente em que o vetor é um plasmídeo, vetor lentiviral, vetor retroviral, vetor adenoviral, vetor adeno-associado, e preferencialmente em que a sequência que codifica o shRNA é operavelmente ligado ao promotor da RNA polimerase II ou um promotor RNA polimerase III.

11. Composição caracterizada pelo fato de compreender uma célula T tendo uma especificidade tumoral compreendendo um vetor, o vetor compreendendo uma sequência que codifica um shRNA, em que o shRNA compreende 15 nucleotídeos complementares contíguos a uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 604, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de compreender ainda um inibidor de Ppp2r2d, Eif2ak3, Arhgap5, Smad2, Akap81, Rbks, Egr2, Dgka, Cblb, Mdfic, Entpd1, Dgkz, Vamp7, Hipk1, Nuak2, Alk, Pdzk1ip1, Inpp5b, Socs1, Jun, Nptxr, Socs3, F11r, Fyn, Ypel2, Pkd1, Grk6, Cdkn2a, Sbf1, Ipmk, Rock1, Stk17b, Mast2, Pdp1, Yes1, Met, Ppm1g, Blvrb, Tnk1, Prkab2, Trpm7 ou Ppp3cc.

13. Método para preparar uma célula T tendo especificidade de tumor e resistência aumentada à imunossupressão caracterizado pelo fato de compreender fornecer uma célula T tendo especificidade de tumor; e introduzir dentro da célula um vetor compreendendo uma sequência que codifica um shRNA, em que o shRNA compreende 15 nucleotídeos complementares contíguos a uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 604.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a célula T é selecionada do grupo consistindo de um linfócito de infiltração de tumor (TIL), uma célula T Exterminadora Natural (NKT), um linfócito citotóxico T (CTL) e uma célula T CD4.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a célula T expressa um receptor de célula T específico de tumor.

16. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a célula T compreende um vetor que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação de antígeno, um domínio de transmembrana e um domínio estimulador.

17. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o shRNA compreende uma primeira sequência compreendendo 15-25, preferencialmente 19-25 nucleotídeos complementares a SEQ ID NO: 604 e uma segunda sequência que é o complemento reverso da primeira sequência com um ou nenhum emparelhamento, e uma terceira sequência de 5-9 nucleotídeos posicionada entre a primeira e segunda sequências.

18. Molécula de ácido nucleico isolada, definida na reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o shRNA compreende uma primeira sequência compreendendo 15-25, preferencialmente 19-25 nucleotídeos complementares a SEQ ID NO: 604 e uma segunda sequência que é o complemento reverso da primeira sequência com um ou nenhum emparelhamento, e uma terceira sequência de 5-9 nucleotídeos posicionada entre a primeira e segunda sequências.

19. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a segunda sequência é perfeitamente complementar à segunda sequência.

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