KR102519166B1 - Cd39의 발현을 억제하는 면역억제-복구 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

Cd39의 발현을 억제하는 면역억제-복구 올리고뉴클레오타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 12-18 뉴클레오타이드를 포함하면서 최소 한 개의 뉴클레오타이드가 변형된 면역억제-복구 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열(인간)의 엑토뉴클레오티다제(NTPdase; CD73)와 혼성화하고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 CD39 발현을 최소 50% 억제한다. 본 발명은 또한 이러한 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

CD39의 발현을 억제하는 면역억제-복구 올리고뉴클레오타이드
본 발명은 엑토뉴클레오사이드트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-l(ENTPDl 또는 CD39)의 핵산서열과 혼성화하는 면역 억제-복구 올리고뉴클레오타이드 및 상기 올리고뉴클레오타이드와 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
최근 몇 년간 악성 종양과 같은 몇몇 질환에서 면역치료, 특히 소위“면역 체크포인트”의 억제제들을 이용한 치료는 매우 성공적이었다. 이들 체크포인트는 신호를 공동 자극하기도 하고 저해하기도 하는 면역 시스템 내의 분자이다. 이러한 치료적 접근의 개념은 내생의 항-종양 면역반응 활성화에 기반하고 있다. 예를 들어 많은 암들은 면역 시스템으로부터 스스로를 보호하기 위해 T 세포 및 NK 세포 활성을 각각 억제한다.
면역 체크포인트 조절자, 즉 자극인자 또는 억제인자는 예를 들어 sare 예를 들어 directed to one 또는 more of CTLA-4, PD-1, PD-Ll, LAG-3, VISTA, A2AR, BTLA, IDO, CD39, CD73, STAT3, TD02, TIM-3, MICA, NKG2A, KIR, TIGIT, TGF-beta, Ox40, GITR, CD27, CD160, 2B4 및 4-IBB 중 하나 이상에 작용한다.
CD39는 다양한 종류의 암에 대한 면역력을 향상시킬 수 있는 새롭고 유망한 후보물질로 간주될 필요가 있다. CD39는 ATP를 ADP로, 그리고 ADP를 AMP로 전환하는 엑토뉴클레오티다제(ectonucleotidase, NTPdase)이다. 이는 AMP를 면역억제성 아데노신으로 분해하는 엑토뉴클레오티다제 CD73와 함께 작용한다 .
CD39는 단핵구, 중석구(neutrophil), 대식세포, B 림프구, 수지상 세포(DC), 일부 자연살해(NK)세포 및 T 세포와 같은 다양한 면역세포에서 광범위하게 발현된다. 주로 조절 T 세포(T reg)가 CD39 및 CD73를 두드러지게 발현하여 아데노신을 생성함으로써 T 세포 반응을 억제한다. 또한, CD39 발현수준의 증가는 많은 다양한 종양(혈액종양 뿐 아니라 고형종양에서도) 및 종양관련 면역세포에서 발견된다. 예를 들어, 흑색종에서는 멜라닌 세포에서 CD39 발현이 증가하고 이것이 악성세포로 분화하는 데 관련된다는 것이 밝혀졌다. 뿐만 아니라, 신장, 폐, 고환, 갑상선 종양 및 림프종에서 CD39 mRNA 및 단백질 수준의 증가가 관찰되었다. 다양한 종양에서 이러한 CD39의 발현증가는 종양 생성, 성장 및 면역억제성 미세환경의 조성에 있어 엑토뉴클레오티다제가 중요한 역할을 함을 시사한다.
사멸하는 암세포는 ATP를 종양 미세환경의 세포 외 공간으로 분비한다. 살아있는 종양세포는 면역억제성 아데노신을 생성하는 ATP로부터 득을 볼 수 있다. 이에 의해, 종양세포는 조절되지 않는 증식과 확장을 할 수 있게 된다. 상술한 바와 같이, 다양한 종양세포 또는 종양관련 면역세포는 CD39 및 CD73 발현을 강하게 발현함으로써 종양 미세환경에서 아데노신을 증가시킨다. 림프구에서 A2A 또는 A2B 수용체에 결합함으로써, 아데노신은 이들 세포에 대한 면역억제성 신호를 매개한다. 예를 들어, 이들의 증식, 세포독성 사이토카인의 생성 및 활성화에 의해 T 세포가 억제된다. NK 세포는 세포독성이 감소한다. 아데노신은 대식세포(면역 억제성 M2 표현형)의 대안적 활성화를 유도하여 호염증성 사이토카인 생성을 감소시키고 면역억제성 사이토카인인 IL-10의 생성을 증가시킨다. CD39 및 CD73 녹아웃 마우스를 이용한 종양모델이 향상된 질환경과를 보였다는 점에서, CD39가 다양한 종양에서 치료 타겟으로서의 중요한 역할을 가짐을 알 수 있다.
그러나, 항종양 면역반응을 촉진시키기 위해 CD39를 억제하는 것이 CD73만을 억제하는 것보다 효율적일 것이다. 우선 CD39의 차단은 종양 미세환경에서 아데노신 수준의 감소를 야기할 것이고, 또 한편 종양 미세환경에서 높은 ATP 수준은 대식세포 및 면역자극 신호를 매개하는 이들의 전구체에 대한 “날 잡아봐라”신호로 작용할 수 있다.
DC에서 ATP는 P2X7 수용체와 결합하여 이들을 활성화시킴으로써 IL-1β 또는 IL-28과 같은 호염증성 사이토카인을 분비하게끔 한다. 이들 사이토카인은 NK 세포, T 세포 및 대식세포를 차례로 활성화시키고 이들의 증식, 세포독성 및 성숙화를 촉진한다. 이에, T 세포 수용체(TCR)에 의해 T 세포 활성화 동안 ATP가 분비된다. ATP는 자가분비를 통해 n an autocrine manner via P2X 수용체를 경유하여 TCR로 촉발되는 활성화 및 IL-2 생성을 촉진시킨다. ATP는 또한 P2X 수용체를 경유하여 인접한 림프구로 곁분비(paracrine)되어 림프절에서의 운동성을 억제함으로써 T 세포와 APC 간의 상호작용을 촉진할 수 있다. 이를 종합하면, 종양 미세환경에서의 ATP 수준 증가는 최적의 항-종양 면역반응을 개시하기 위한 완벽한 조건이 된다.
CD39 엑토뉴클레오티다제 활성을 차단하기 위해, IPH52(Bastid et al, Cancerlmmunology Research, 2014) 및 OREG-103/BY40(Bennefoy et al., Oncolmmunology 4:5, 2015)과 같은 항-인간 CD39 단클론 항체에 대한 전임상 연구가 진행 중으로 동물 모델에서의 생명연장으로 이어지는 결과가 기대된다. 그러나, 이들 단클론 항체는 공간 장애로 인해 종양 미세환경으로 이동하지 못할 수 있다. 나아가, ARL67156(Oncolmmunology 1:3; 2012) 및 POM-1(Gastroenterology; 2010; 139(3): 1030-1040)과 같은 CD39에 대한 저분자 억제제는 인 비트로 및 인 비보 동물모델에서 시험한 결과 종양의 성장이 둔화됨을 확인하였다. 그러나, 이들 저분자는 인 비보에서의 낮은 활성 및 짧은 반감기로 인해 고용량, 고빈도로 투여되어야만 한다.
면역 치료는 장기적 관해(long-term remission)에 이르도록 하지만, 지금까지는 소규모 환자군에 대해서만 효과를 보였다. 이는 수많은 면역 체크포인트 및 면역 시스템과 종양세포 간의 상호작용에 관여하는 추가적인 면역억제성 메카니즘 때문일 수 있다. 면역 체크포인트와 가능한 다른 메카니즘의 조합은 종양의 종류 및 신체 방어체계를 벗어나려는 개개 환자의 상태에 따라 다양할 수 있다.
몇몇 면역억제성 메카니즘의 억제를 위해 항체 및/또는 저분자를 이용하는 일반적인 접근은 분자 타겟이 세포 내에 존재하거나 효소 활성을 가지지 않기 때문에 적합하지 않다. 따라서, 안전하면서도 CD39와 같은 “면역체크포인트”의 기능을 효과적으로 억제하는 제제는 이 효소의 활성에 영향을 받는 질환 또는 상태로 인해 고통받는 환자의 치료에 중요한 방점이 될 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 CD39의 발현 및 활성을 각각 매우 성공적으로 억제한다. 올리고뉴클레오타이드의 작용기전은 항체 또는 저분자의 그것과 상이하며, 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 다음과 같은 점에서 큰 이점이 있다:
(i) 고형 종양에서 종양 조직에의 침투,
(ii) 타겟의 다중적인 기능 및 활성을 각각 차단,
(iii) 올리고뉴클레오타이드 들의 조합 또는 올리고뉴클레오타이드와 항체 또는 저분자와의 조합이 가능하고
(iv) 항체를 통해서는 접근이 불가능하거나 저분자를 통해서는 억제가 불가능한 한 세포 내 영향의 억제.
따라서, 암과 면역세포에서 CD39 발현을 안티센스-올리고뉴클레오타이드를 이용하여 mRNA 수준에서 타겟팅하는 것은 다양한 암과 면역질환에 대한 면역치료 개발을 위한 유망한 최신기술이 될 것이다.
본 발명은 하나 이상의 뉴클레오타이드가 변형된 10 내지 20 뉴클레오타이드를 포함하는 면역 억제-복구 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 서열목록 제1서열(인간) 및/또는 서열목록 제2서열(마우스/랫트)의 엑토뉴클레오시다제 CD39 핵산 서열과 혼성화된다. 변형된 뉴클레오타이드는 예를 들어 가교 핵산(예를 들어 LNA, cET, ENA, 2'플루오로 변형 뉴클레오타이드 또는 2'O-메틸 변형 뉴클레오타이드 및 이들의 조합)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에 따르면, 상기 올리고뉴클레오타이드는 CD39 발현의 최소 50%를 억제하며, 일 구현예에 따르면 상기 올리고뉴클레오타이드는 나노몰 농도에서 CD39 발현을 억제한다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 RNAi와 비교하여 중요한 이점을 가진다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인 비트로에서 형질감염 시약 없이도 도입될 수 있어, 형질감염 시약이 필수적인 RNAi에 비해 보다 인 비보 환경에 가까운 조건에서 형질감염될 수 있다. RNAi의 상이한 조직에서의 투여는 예를 들어 간에서의 GalNAc과 같은 전달 시스템에 좌우됨에 반해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다양한 조직에서 전신적 생체 투여가 가능하다. 나아가, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 RNAi보다 짧아서, 합성이 덜 복잡하고 세포에 보다 간단하게 흡수된다.
RNAi는 규칙적으로 똑같이 RNAi를 개시할 수 있는 운송가닥(passenger strand)의 오프-타겟 효과를 보인다. 운송가닥의 RISC 로딩은 운송가닥이 RNAi 활성을 의도치 않은 타겟으로 향하게 함으로써 독성의 부작용을 유발할 수 있기 때문에 RNAi 의약에서 주된 우려이다(Chackalamannil, Rotella, Ward, Comprehensive Modicinal Chemistry III Elsevier, 03.06.2017). 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 운송가닥을 포함하지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역억제-복구 올리고뉴클레오타이드와, 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에 따르면, 이러한 약제학적 조성물은 추가적으로 백금이나 젬시타빈 같은 화학요법제, 다른 올리고뉴클레오타이드, 항체 또는 Fab 절편과 같은 이의 절편, HERA 융합 단백질, 리간드 트랩, 나노바디, BiTe 및/또는 종양 치료에 효과적인 저분자 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 다른 올리고뉴클레오타이드, 항체 및/또는 저분자와 함께 사용될 수 있는데, 이들 각각의 물질은 약제학적 조성물 내에서 각각 분리되거나 결합될 수 있으며, 이들 올리고뉴클레오타이드, 항체 또는 Fab 절편과 같은 이의 절편, HERA 융합 단백질, 리간드 트랩, 나노바디, BiTe 및/또는 저분자는 IDOl, ID02, CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, VISTA, A2AR, CD39, CD73, STAT3, TD02, TIM-3, TIGIT, TGF-beta, BTLA, MICA, NKG2A, KIR, CD160, Chop, 및/또는 Xbpl와 같은 면역억제인자를 억제하거나 자극한다. 나아가 또는 그 대신에, 이들 올리고뉴클레오타이드, 항체 및/또는 저분자는 4-IBB, Ox40, KIR, GITR, CD27 및/또는 2B4같은 면역촉진인자를 억제하거나 자극한다.
나아가, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 약제학적 조성물의 CD39 불균형과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 일 구현예에 따르면, 상기 질환은 예를 들어 자가면역질환, 예를 들어 자가면역 관절염 또는 염증성 장질환(IBD) 또는 대장염과 같은 위장관 자가면역질환, 면역질환, 예를 들어 HIV 감염과 같은 만성 바이러스 감염에 의한 면역소진, 심혈관 질환, 염증성 질환, 예를 들어 만성 기도염증, 박테리아, 바이러스 및/또는 진균 감염, 예를 들어 패혈증 또는 소결핵균 감염, 간 질환, 만성 신장질환, 정신과 질환 및/또는 암이다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 약제학적 조성물은 국소적 또는 전신적으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 인용된 모든 문헌("인용문헌"), 및 인용된 문헌에서 인용되거나 참조된 모든 문헌은 본 명세서에서 언급된 제조자의 지침서, 설명서, 상품설명서, 데이터시트와 함께 본 명세서에서 참조로서 삽입되어 있으며, 발명의 실시에 이용될 수 있다. 모든 참조된 문헌은 각각의 문헌이 구체적이고 개별적으로 참조로서 삽입된 것과 똑같은 정도로 참조로서 삽입되어 있다.
도 1은 서열목록 제1서열(NM_001776.5)의 hCD39 mRNA 상에서의 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드 결합부위의 분포 및 이들의 변형과 길이를 보여주는 그림으로, hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 서열목록 제1서열의 hCD39 mRNA에 정렬하였다. 각 그레이스케일은 서로 다른 LNA 변형을 나타내고, 기호들은 상이한 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.
도 2a 내지 2d는 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 hCD39 mRNA 녹다운 효율을 보여주는 그림으로, 각각 인간 암세포주 HDLM-2(인간 호지킨 림프종)에서 1차 및 2차 스크리닝 시의 녹다운 효율[도 2a(파트 1과 2) 및 도 2b(파트 1과 2)]과, A-172 (인간 교아종)에서 1차 및 2차 스크리닝 시의 녹다운 효율[도 2c(파트 1과 2) 및 도 2d(파트 1과 2)]를 각각 나타낸다. HDLM-2 및 A-172 세포에 3일간 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 10μΜ를 처리하였다. 음성 대조군으로서, 세포들에 CGTTTAGGCTATGTACTT (W2014154843 Al 참조)의 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 negl를 처리하였다. 처리하지 않은 세포와 비교한 상대적인 hCD39 mRNA 발현량을 나타내었다. 발현값은 하우스키핑 유전자인 HPRT1의 발현량에 대해 표준화하였다. 표시된 값은 3배수 웰 평균의 +/- 표준편차이다.
도 3은 HDLM-2 및 A-172 세포에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효용성에 대한 상관분석 결과를 나타내는 그림이다.
도 4는 HDLM-2 세포 내 선정된 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 즉 A04019H(서열목록 제23서열), A04033H(서열목록 제37서열), A04039H(서열목록 제43서열), A04040H(서열목록 제3서열), A04042H(서열목록 제45서열), A04044H(서열목록 제47서열) 및 A04045H(서열목록 제4서열)에 의한 농도-의존적 hCD39 mRNA 녹다운을 보여주는 그림이다. HDLM-2 세포에 지정된 농도의 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 3일간 처리하였다. 잔여 hCD39 발현은 처리되지 않은 대조군 세포와 비교하여 표시하였다. hCD39 mRNA 발현값은 하우스키핑 유전자인 HPRT1의 발현량에 대해 표준화하였다. 농도-의존적인 타겟 녹다운을 통해 표 8의 IC50 값을 계산하였다.
도 5는 HDLM-2 세포 내 추가적으로 선정된 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 즉 A04010H(서열목록 제14서열), A04016H(서열목록 제20서열), A04017H(서열목록 제21서열), A04019H(서열목록 제23서열), A04020H(서열목록 제24서열) 및 A04026H(서열목록 제30서열)에 의한 농도-의존적 hCD39 mRNA 녹다운을 보여주는 그림이다. 1차 및 2차 스크리닝에서 강력한 활성을 보여준 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04040H(서열목록 제3서열)가 기준으로 사용되었다. HDLM-2 세포에 지정된 농도의 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 3일간 처리하였다. hCD39 mRNA 발현값은 하우스키핑 유전자인 HPRT1의 발현량에 대해 표준화하였다. 잔여 hCD39 발현은 처리되지 않은 대조군 세포(100으로 설정)와 비교하여 표시하였다. 표시된 값은 3배수 웰 평균의 +/- 표준편차이다. 농도-의존적인 타겟 녹다운을 통해 표 9의 IC50 값을 계산하였다.
도 6은 3차 스크리닝을 통한 추가적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 설계를 보여주는 그림이다. 이들 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 1차 및 2차 스크리닝에서 선정된 것들 중 효율적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 기반한다. 따라서, hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 인간암세포주 HDLM-2(인간 호지킨 림프종)(도 6a) 및 A-172(인간 교아종)(도 6b)에서 시험하였다. HDLM-2 및 A-172 세포에 3일간 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 10μΜ를 처리하였다. 1차 스크리닝에서 강력한 활성을 보인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04019H, A04040H 및 A04042H가 기준으로 사용되었다. 잔여 hCD39 발현은 처리되지 않은 대조군 세포(1로 설정)와 비교하여 표시하였다.
도 7은 HDLM-2 및 A-172 세포에서의 3차 스크리닝에서 추가적으로 선정된 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 농도-의존적 hCD39 mRNA 녹다운을 보여주는 그림으로, 이들 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 A04051H(서열목록 제88서열), A04052H(서열목록 제89서열), A04053H(서열목록 제89서열), A04056H(서열목록 제92서열), A04059H(서열목록 제94서열), A04060H(서열목록 제95서열) 및 A04061H(서열목록 제96서열)이다. 1차 및 2차 스크리닝에서 강력한 활성을 보여준 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04040H(서열목록 제3서열)가 기준으로 사용되었다. HDLM-2 세포에 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 정해진 농도로 3일간 처리하였다. hCD39 mRNA 발현값은 하우스키핑 유전자인 HPRT1의 발현량에 대해 표준화하였다. 잔여 hCD39 발현은 처리되지 않은 대조군 세포(100으로 설정)와 비교하여 표시하였다. 표시된 값은 3배수 웰 평균의 +/- 표준편차이다. 농도-의존적인 타겟 녹다운을 통해 표 12의 IC50 값을 계산하였다.
도 8은 A04040H(서열목록 제3서열) 및 A04045H(서열목록 제4서열)에 의한 농도 및 시간 의존적인 CD39 단백질 녹다운을 보여주는 그림이다. 각 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 3, 4 및 6일간 처리 후 HDML-2 세포의 유세포분석을 통해 CD39 단백질 발현을 측정하였다. 대조군 처리 후, 세포들에 negl을 정해진 농도로 3, 4 및 6일간 처리하였다. 미처리 대조군 세포(=1)와 비교한 상대적 발현량을 표시하였다.
도 9는 항-CD3 항체의 존재 하에 10μΜ의 hCD39 특이적 ASO A04040H(검은색 컬럼) 또는 대조군 올리고뉴클레오타이드 S6(흰색 컬럼)를 1차 인간 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 처리한 결과를 보여주는 그림이다. 대조군 세포는 항-CD3로 활성화되었으나 어떤 올리고뉴클레오타이드도 처리하지 않았다(줄무늬 컬럼). 이후, 올리고뉴클레오타이드 및 항-CD3를 제거하고 올리고뉴클레오타이드 제거 3, 6 및 11일 후 유세포분석으로 hCD39 단백질 발현을 측정하였다. CD39 단백질 발현은 평균형광강도(MFI)로 나타냈으며, CD39의 MFI에서 불특정 이소타입 대조군의 MFI를 빼서 계산하였다. 표시된 값은 2배수 웰 평균의 +/- 표준편차이다.
도 lOa-lOc는 hCD39 녹다운이 JIYOYE 세포의 생존성과 ATP 농도에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. JIYOYE 세포에 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04040H(서열목록 제3서열) 또는 negl를 6일간 총 5μΜ를 처리하였다. 3일 후 배지를 신선한 올리고뉴클레오타이드-함유 배지로 교환하고 6일 째에 유세포분석으로 hCD39 단백질 녹다운 효능을 분석하였다. 잔여 hCD39 발현 및 올리고뉴클레오타이드-처리 세포의 생존성은 미처리 세포와 비교하여 표시하였다(도 10a 및 10b). 6일 후, 20μΜ of the CD39의 저분자 억제제인 ARL67156 트리소듐 염 20μΜ를 ASO 미처리 세포에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이후, 2μΜ ATP를 세포 또는 각 조건의 세포가 없는 세포 배양배지에 첨가하고 30분 후 ATP Bioluminescence 어세이 Kit(Roche)을 이용하여 세포 상층액 또는 세포 배양배지의 ATP 농도를 측정하였다(도 10c).
도 11a-11d는 hCD39 단백질의 녹다운(도 11a) 및 MACS로 말초혈에서 분리한 일차 인간 CD8+ T 세포의 생존성(도 11b)을 보여준다. CD8+ T 세포를 플레이트-결합 항-인간 CD3(OKT-3) 항체로 활성화시켰다. 활성화된 세포에 A04040H(서열목록 제3서열)이 보충된 RPMI-1640 배지 및 negl 5μΜ가 보충된 RPMI-1640 배지를 각각 총 6일 동안 처리하였다. 3일 후, 배지를 5μΜ A04040H(서열목록 제3서열) 및 neg1를 각각 함유하는 신선한 배지로 교체하고, 유세포분석으로 hCD39 단백질 녹다운 효율(도 11a) 및 세포 생존성(도 11b)을 측정하였다. 잔여 hCD39 발현 및 생존성(7-AAD 양성세포의 중앙값)은 미처리 세포와 비교하여 표시하였다(도 11a-11b). 같은 날, 세포를 수집하고 세척 후 다시 일정한 세포수(96-웰플레이드에 150.000 세포/웰)로 3배수로 플레이팅하였다. 이후, 2μΜ(도 11c) 또는 20μΜ(도 11d) ATP를 세포 또는 세포가 없는 세포 배양배지에 첨가하고 30분 후 ATP Bioluminescence 어세이 Kit(Roche)을 이용하여 세포 상층액 또는 세포 배양배지의 ATP 농도를 측정하였다.
도 12a-12c는 세포 증식 염료로 표지된 인간 CD8+ T 세포를 항-CD3로 활성화시키고 5μΜ 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04040H(검은색 컬럼) 또는 대조군 올리고뉴클레오타이드 S6(흰색 컬럼)로 총 5일간 처리한 결과를 보여주는 그림이다. 비이클 대조군(줄무늬 컬럼)에서, 세포는 항-CD3에 의해서만 활성화되었다. 이어서, 400μΜ의 ATP 또는 비이클을 올리고뉴클레오타이드 처리 시작일로부터 3일 및 4일 후에 세포에 첨가하였다. 나아가, 추가적인 대조군으로, 저분자 CD39-억제제인 ARL67156 트리소듐 염 20μΜ을 24시간의 인큐베이션 동안 세포에 첨가하였다. 올리고뉴클레오타이드 처리 시작일로부터 5일 째에, CD39 단백질 발현(도 12a), 증식(도 12b) 및 CD8+ T 세포의 절대세포 수(도 12c)를 유세포분석을 통해 측정하였다. 표시된 값은 3배수 웰 평균의 +/- 표준편차이다.
도 13은 서열목록 제2서열(NM_001304721.1)의 mCD39 mRNA의 mCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드 결합 부위 분포 및 이들의 변이와 길이를 보여주는 그림이다. mCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열을 mCD39 mRNA 서열에 정렬하였다. 각 그레이스케일은 서로 다른 LNA 변형을 나타내고, 기호들은 상이한 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.
도 14(파트 1 및 2)는 뮤린 암 세포주 A20(마우스 B세포 림프종)에서 mCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 mCD39 mRNA 녹다운 효능을 보여주는 그림이다. A20 세포에 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 10μΜ를 단회 투여하였다. 음성 대조군 세포에 CGTTTAGGCTATGTACTT 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 negl를 처리하였다. 잔여 hCD39 발현은 미처리 세포와 비교하여 표시하였다. 발현값은 하우스키핑 유전자인 HPRT1의 발현량에 대해 표준화하였다.
도 15a 및 15b는 A04011MR 또는 음성 대조군 올리고뉴클레오타이드인 negl을 25 mg/kg 또는 10 mg/kg 용량으로 1, 2, 3, 4, 5, 9, 12, 16 및 19일째(5 마우스/그룹)에 투여한 C57BL/6 마우스 비장에서의 CD39 mRNA 발현수준을 보여주는 그림이다. 발현값은 하우스키핑 유전자인 HPRT1의 발현량에 대해 표준화하였다.
도 16a 및 16b는 올리고뉴클레오타이드-처리된 마우스 종양 침윤 조절 T 세포(Tregs)(도 16a) 및 종양 관련 대식세포(TAMs)(도 16b)에서의 CD39 단백질 발현을 비처리 마우스의 종양과 비교하여 상대적으로 나타낸 그림이다.
도 17은 서열목록 제1서열(NM_001776.5)의 hCD39 mRNA을 보여주는 그림이다(pos: 1-3420).
본 발명은 엑토뉴클레오티다제 CD39의 mRNA 서열과 혼성화되어 예를 들어 종양세포 또는 종양-관련 면역세포에서 CD39의 발현과 활성을 각각 억제하는 인간 및 뮤린 올리고뉴클레오타이드를 최초로 제공한다. 그 결과 ATP의 수준은 증가하고 이의 분해 산물인 ADP, AMP 및 면역억제성 아데노신은 감소한다. 이러한 모든 효과는 항종양 면역세포의 증가, 면역 활성화(예를 들어 세포독성 T 세포 또는 NK 세포를 통한)의 증가 및 종양세포의 인식 및 제거의 증가를 각각 가져온다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 CD39의 발현과 활성이 각각 증가하는 질환의 예방 및/또는 치료하는 방법에 흥미롭고 효과적인 수단이 될 수 있다.
이하에서, 본 발명의 구성을 보다 상세하게 설명한다. 이러한 구성은 특정 구현예와 함께 나열되지만, 이들은 추가적인 구현예를 창출하기 위해 어떠한 방식으로도 어떠한 숫자로도 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 기술된 실시예 및 구현예들이 본 발명을 명시적으로 기술한 구현예로 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 서술은 명시적으로 기술한 구현예와 어떠한 수의 기재된 구성요소가 결합한 구현예를 뒷받침하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 나아가, 본 명세서에서 나열한 모든 구성요소들의 여하한 치환이나 조합도 다르게 제시하지 않는 한 본 발명의 명세서에 기재되어 있는 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐, 달리 표현되지 않았거나 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다" 및“포함하는”과 “포함하고 있는”과 같은 이의 파생어는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함한다는 의미로 이해되며 언급되지 않은 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹이 제외되는 것은 아니다.
본 발명을 기술하면서 사용된“a”,“an”,“the” 및 유사 단어(특히 청구항에 사용된 경우)는 내용상 명백히 다르게 제시하지 않는 한 단수형과 복수형을 모두 포함한다.
본 명세서에서 수치 범위의 인용은 단지 상기 범위 내에 포함되는 각각의 구분되는 값을 개별적으로 언급하는 간단한 방법으로 사용하기 위함이다. 본 명세서에서 다르게 명시하지 않는 한, 각각의 개별적인 값은 개별적으로 언급된 것과 마찬가지로 명세서에 포함되어 있다.
본 명세서에서 기술된 모든 방법은 본 명세서에서 다르기 제시하거나 문맥상 명백히 반하는 경우가 아니면 어떠한 적절한 순서로도 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 어떠한 또는 모든 예시 또는 예시적 언어(“~과 같은”,“예를 들어”등)는 발명을 보다 잘 설명하기 위한 목적에 불과할 뿐 청구항에서 다르게 기재되지 않는 한 발명의 범위에 제한을 가하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 발명의 실시에 필수적인, 청구되지 않는 구성요소를 지시하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 예를 들어 10에서 25 뉴클레오타이드, 10에서 15 뉴클레오타이드, 15에서 20 뉴클레오타이드, 12에서 18 뉴클레오타이드, 또는 14에서 17 뉴클레오타이드로 구성되거나 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 25 뉴클레오타이드로 구성되거나 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 최소 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 뉴클레오타이드는 예를 들어 고정(locked) 핵산(LNA, 예를 들어 2',4'-LNA)과 같은 가교 뉴클레오타이드, cET, ENA, 2'플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'O-메틸 변형 뉴클레오타이드 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드들은 동일하거나 상이한 변형을 가지는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 포스페이트가 예를 들어 포스포로티오에이트인 변형된 포스페이트 골격을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 3'- 및/또는 5'- 말단에 및/또는 올리고뉴클레오타이드 내의 어느 위치에라도 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는데, 상기 변형된 뉴클레오타이드는 연속적인 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 변형된 뉴클레오타이드이거나, 또는 변형된 뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형되지 않은 뉴클레오타이드와 조합될 수 있다. 다음의 표 1, 2 및 3은 예를 들어 (+)로 표시된 LNA와 (*)로 표시된 포스포로티오에이트 (PTO)와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 구현예를 보여준다. 표 1, 2 및 3의 서열로 구성되거나 이를 포함하는 각각의 올리고뉴클레오타이드는 다른 어떤 변형된 뉴클레오타이드 및 변형된 뉴클레오타이드와 다른 어떤 변형되지 않은 뉴클레오타이드와의 조합도 포함할 수 있다. 표 1의 올리고뉴클레오타이드는 인간 CD39의 mRNA와 혼성화된다:
인간 CD39 와 혼성화되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 목록, 예를 들어 Negl는 서열목록 제1서열의 CD39과 혼성화하지 않는 음성 대조군인 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
서열번호 이름 mRNA (안티센스) 서열5’-3’ PTO(*) 및 LNA(+)를 가지는 5’-3’안티센스 서열
3 A04040H GTTTGTGTGAGAGCTT +G*+T*+T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T*+T
4 A04045H CACTTACGTTCACTACC +C*+A*+C*T*T*A*C*G*T*T*C*A*C*T*+A*+C*+C
5 A04001H GGCGAAATTGCAGA +G*+G*+C*G*A*A*A*T*T*G*C*+A*+G*+A
6 A04002H CTCCAGCGTAAGAT +C*+T*+C*C*A*G*C*G*T*A*A*G*+A*+T
7 A04003H TTGAACACTGCGAT +T*+T*+G*A*A*C*A*C*T*G*C*+G*+A*+T
8 A04004H GCCATAGGCACCTTC +G*+C*C*A*T*A*G*G*C*A*C*C*+T*+T*+C
9 A04005H CTATGCTGAACCACC +C*+T*+A*T*G*C*T*G*A*A*C*C*+A*+C*+C
10 A04006H TGTAGAGGCTCCCCC +T*G*+T*A*G*A*G*G*C*T*C*C*C*+C*+C
11 A04007H TTGCAGAGCATTATC +T*+T*+G*C*A*G*A*G*C*A*T*T*+A*+T*+C
12 A04008H AGGCGAAATTGCAGA +A*+G*+G*C*G*A*A*A*T*T*G*C*+A*+G*+A
13 A04009H TAGACATTGTAGTCC +T*+A*G*A*C*A*T*T*G*T*A*G*+T*+C*+C
14 A04010H GAGTGCCTGATCCTT +G*+A*G*T*G*C*C*T*G*A*T*C*C*+T*+T
15 A04011H AATCCCCCTGGAGTG +A*+A*+T*C*C*C*C*C*T*G*G*A*+G*+T*+G
16 A04012H AGCGTAAGATGTTTT +A*+G*+C*G*T*A*A*G*A*T*G*T*+T*+T*+T
17 A04013H ACTCCAGCGTAAGAT +A*+C*+T*C*C*A*G*C*G*T*A*A*+G*+A*+T
18 A04014H TGATAGCCTTGCAGA +T*+G*+A*T*A*G*C*C*T*T*G*C*+A*+G*+A
19 A04015H AGTCCAGCCGGCGTC +A*+G*T*C*C*A*G*C*C*G*G*C*G*T*+C
20 A04016H GGACAATGGTTGCTC +G*G*+A*C*A*A*T*G*G*T*T*G*+C*+T*+C
21 A04017H CTTGAACACTGCGAT +C*+T*+T*G*A*A*C*A*C*T*G*C*+G*+A*+T
22 A04018H GAGTACAACTGAACC +G*+A*G*T*A*C*A*A*C*T*G*A*+A*+C*+C
23 A04019H GTAAGCCCTGATGTT +G*+T*+A*A*G*C*C*C*T*G*A*T*+G*+T*+T
24 A04020H TATGGTACAGTTGGT +T*+A*+T*G*G*T*A*C*A*G*T*+T*G*+G*+T
25 A04021H CTGACTGAATTTGCCC +C*+T*+G*A*C*T*G*A*A*T*T*T*G*+C*+C*+C
26 A04022H ACTATGCTGAACCACC +A*+C*+T*A*T*G*C*T*G*A*A*C*C*A*+C*+C
27 A04023H GACTATGCTGAACCAC +G*+A*C*T*A*T*G*C*T*G*A*A*C*+C*+A*+C
28 A04024H GAGGCGAAATTGCAGA +G*+A*+G*G*C*G*A*A*A*T*T*G*C*A*+G*+A
29 A04025H AGAGTGCCTGATCCTT +A*+G*A*G*T*G*C*C*T*G*A*T*C*C*+T*+T
30 A04026H GATAGTTTCCAATACC +G*+A*+T*A*G*T*T*T*C*C*A*A*T*+A*+C*+C
31 A04027H TACTCCAGCGTAAGAT +T*+A*+C*T*C*C*A*G*C*G*T*A*A*+G*+A*+T
32 A04028H ATGTAGCCCAAAGTCC +A*+T*+G*T*A*G*C*C*C*A*A*A*G*T*+C*+C
33 A04029H CATGTAGCCCAAAGTC +C*+A*+T*G*T*A*G*C*C*C*A*A*A*+G*+T*+C
34 A04030H GGACAATGGTTGCTCA +G*+G*+A*C*A*A*T*G*G*T*T*G*C*+T*C*+A
35 A04031H AGCCTATGATGGCCAC +A*+G*+C*C*T*A*T*G*A*T*G*G*C*C*+A*+C
36 A04032H GCCTTGAACACTGCGA +G*+C*+C*T*T*G*A*A*C*A*C*T*G*C*+G*+A
37 A04033H ACCCTGAGTTGTAACT +A*+C*C*C*T*G*A*G*T*T*G*T*A*A*C*+T
38 A04034H AGGATAGTCTTGTCTC +A*+G*G*A*T*A*G*T*C*T*T*G*T*C*+T*+C
39 A04035H CCTACCCAGGATAGTC +C*C*T*A*C*C*C*A*G*G*A*T*A*G*+T*+C
40 A04036H CCCTCTCACTAAATTA +C*+C*+C*T*C*T*C*A*C*T*A*A*A*+T*+T*+A
41 A04037H ACTCCACACTAATGCT +A*+C*+T*C*C*A*C*A*C*T*A*A*T*+G*+C*+T
42 A04038H GTCAATCCTGCTCAAC +G*T*+C*A*A*T*C*C*T*G*C*T*C*A*+A*+C
43 A04039H CAGTCAATCCTGCTCA +C*+A*+G*T*C*A*A*T*C*C*T*G*C*+T*+C*+A
44 A04041H CTTGCCATAGAGGCGAA +C*T*+T*G*C*C*A*T*A*G*A*G*G*C*+G*A*+A
45 A04042H TGCCAGAGTGCCTGATC +T*+G*+C*C*A*G*A*G*T*G*C*C*T*G*+A*+T*+C
46 A04043H ACGTTCACTACCTTCTT +A*+C*+G*T*T*C*A*C*T*A*C*C*T*T*+C*+T*+T
47 A04044H TTACGTTCACTACCTTC +T*+T*+A*C*G*T*T*C*A*C*T*A*C*C*+T*+T*+C
48 A04046H AAGGTCACTTACGTTCA +A*+A*+G*G*T*C*A*C*T*T*A*C*G*T*+T*+C*+A
49 A04047H GCCCCAAAATCCCCCTG +G*+C*+C*C*C*A*A*A*A*T*C*C*C*C*+C*+T*+G
50 A04048H GAGAGAATGTAGGTACC +G*+A*+G*A*G*A*A*T*G*T*A*G*G*T*+A*C*+C
51 A04049H CCCTGGATCTTGCCAAT +C*+C*C*T*G*G*A*T*C*T*T*G*C*C*+A*+A*+T
52 A04050H AAAGTCCAGCCGGCGTC +A*+A*+A*G*T*C*C*A*G*C*C*G*G*C*G*+T*+C
53 Neg1 +C*+G*+T*T*T*A*G*G*C*T*A*T*G*T*A*+C*+T*+T
표 2는 다른 스크리닝 과정에서 동정된, 인간 CD39 mRNA와 혼성화되는 추가적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 목록이다.
2차 스크리닝에서 선별된 인간 CD39와 혼성화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 목록. neg 1 및 S6는 어떤 인간 mRNA와도 상보성을 가지지 않는 조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
서열번호 이름 mRNA (안티센스)
서열 5’-3’		 PTO(*) 및 LNA(+)를 가지는 5’-3’
안티센스 서열
88 A04051H AGAGTGCCTGATCCTT +A*+G*+A*G*T*G*C*C*T*G*A*T*C*+C*+T*+T
89 A04052H TACGTTCACTACCTTCT +T*+A*+C*G*T*T*C*A*C*T*A*C*C*T*+T*+C*+T
89 A04053H TACGTTCACTACCTTCT +T*+A*+C*G*T*T*C*A*C*T*A*C*C*T*+T*C*+T
90 A04054H GCCCTGATGTTTGAAT +G*+C*+C*C*T*G*A*T*G*T*T*T*G*+A*+A*+T
91 A04055H TAGTAAGCCCTGATG +T*+A*+G*T*A*A*G*C*C*C*T*G*+A*+T*+G
92 A04056H GTTTGTGTGAGAGCTTT +G*+T*+T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T*+T*+T
93 A04058H TTTGTGTGAGAGCTT +T*+T*+T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*+C*+T*+T
94 A04059H GGTTTGTGTGAGAGCTT +G*+G*+T*T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T*+T
95 A04060H GGTTTGTGTGAGAGCT +G*+G*+T*T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T
96 A04061H GTTTGTGTGAGAGCT +G*+T*+T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T
97 A04062H GGTTTGTGTGAGAGC +G*G*+T*T*T*G*T*G*T*G*A*G*+A*G*+C
53 neg 1 +C*+G*+T*T*T*A*G*G*C*T*A*T*G*T*A*+C*+T*+T
98 S6 +T*+C*+T*A*T*C*G*T*G*A*T*G*T*T*+T*+C*+T
다음의 표 3은 랫트 또는 뮤린 CD39와 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.
예를 들어 서열목록 제2서열의 랫트 또는 뮤린 CD39와 혼성화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드; Negl은 서열목록 제2서열의 CD39와 혼성화하지 않는 음성 대조군인 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
서열번호 이름 mRNA (안티센스)
서열 5’-3’		 PTO(*) 및 LNA(+)를 가지는 5’-3’
안티센스 서열
54 A04011MR AGTAATCCACCCATAG +A*+G*+T*A*A*T*C*C*A*C*C*C*A*+T*+A*+G
55 A04001MR AGTAATCCACCCATA +A*+G*+T*A*A*T*C*C*A*C*C*C*+A*+T*+A
56 A04002MR GATCCAAAGCGCCAA +G*+A*+T*C*C*A*A*A*G*C*G*C*+C*+A*+A
57 A04003MR GTTCGTAGTCTCCAG +G*+T*+T*C*G*T*A*G*T*C*T*C*+C*+A*+G
58 A04004MR CTGTTCGTAGTCTCC +C*+T*+G*T*T*C*G*T*A*G*T*C*+T*+C*+C
59 A04005MR GGTGGCACTGTTCGT +G*+G*+T*G*G*C*A*C*T*G*T*T*+C*+G*+T
60 A04006MR GTTATAGCCTTGCAG +G*+T*+T*A*T*A*G*C*C*T*T*G*+C*+A*+G
61 A04007MR CACATTAGCTGCACG +C*+A*+C*A*T*T*A*G*C*T*G*C*+A*+C*+G
62 A04008MR CCTAGTTGTGTATAC +C*+C*+T*A*G*T*T*G*T*G*T*A*+T*+A*+C
63 A04009MR GTACAGGTTGGTGTGA +G*+T*+A*C*A*G*G*T*T*G*G*T*G*+T*+G*+A
64 A04010MR CCACTTGTAGATGTAC +C*+C*+A*C*T*T*G*T*A*G*A*T*G*+T*+A*+C
65 A04012MR GCCCAGCAGATAGTTA +G*+C*+C*C*A*G*C*A*G*A*T*A*G*+T*+T*+A
66 A04013MR AGATCCAAAGCGCCAA +A*+G*+A*T*C*C*A*A*A*G*C*G*C*+C*+A*+A
67 A04014MR CACTGTTCGTAGTCTC +C*+A*+C*T*G*T*T*C*G*T*A*G*T*+C*+T*+C
68 A04015MR TGGCACTGTTCGTAGT +T*+G*+G*C*A*C*T*G*T*T*C*G*T*+A*+G*+T
69 A04016MR GGTACTTCTCCTTTAC +G*+G*+T*A*C*T*T*C*T*C*C*T*T*+T*+A*+C
70 A04017MR AGTTATAGCCTTGCAG +A*+G*+T*T*A*T*A*G*C*C*T*T*G*+C*+A*+G
71 A04018MR CGTTGCTGTCTTTGAT +C*+G*+T*T*G*C*T*G*T*C*T*T*T*+G*+A*+T
72 A04019MR GCTATACTGCCTCTTT +G*+C*+T*A*T*A*C*T*G*C*C*T*C*+T*+T*+T
73 A04020MR AGCATTTTGGCATCAC +A*+G*+C*A*T*T*T*T*G*G*C*A*T*+C*+A*+C
74 A04021MR CCTAGTTGTGTATACT +C*+C*+T*A*G*T*T*G*T*G*T*A*T*+A*+C*+T
75 A04022MR ACATTTCTTACTCGTT +A*+C*+A*T*T*T*C*T*T*A*C*T*C*+G*+T*+T
76 A04023MR GACCTTTCACTTGGCAT +G*+A*+C*C*T*T*T*C*A*C*T*T*G*G*C*A*+T
77 A04024MR CCCAGCAGATAGTTAAT +C*+C*+C*A*G*C*A*G*A*T*A*G*T*T*+A*+A*+T
78 A04025MR GCCCAGCAGATAGTTAA +G*+C*+C*C*A*G*C*A*G*A*T*A*G*T*+T*+A*+A
79 A04026MR ATCCAAAGCGCCAAAGG +A*+T*+C*C*A*A*A*G*C*G*C*C*A*A*+A*+G*+G
80 A04027MR TCGTAGTCTCCAGTGCC +T*+C*+G*T*A*G*T*C*T*C*C*A*G*T*+G*+C*+C
81 A04028MR TTCGTAGTCTCCAGTGC +T*+T*+C*G*T*A*G*T*C*T*C*C*A*G*+T*+G*+C
82 A04029MR TGTTCGTAGTCTCCAGT +T*+G*+T*T*C*G*T*A*G*T*C*T*C*C*+A*+G*+T
83 A04030MR GGTGGCACTGTTCGTAG +G*+G*+T*G*G*C*A*C*T*G*T*T*C*G*+T*+A*+G
84 A04031MR CGTTGCTGTCTTTGATC +C*+G*+T*T*G*C*T*G*T*C*T*T*T*G*+A*+T*+C
85 A04032MR GCTATACTGCCTCTTTC +G*+C*+T*A*T*A*C*T*G*C*C*T*C*T*+T*+T*+C
86 A04033MR TACATTTCTTACTCGTT +T*+A*+C*A*T*T*T*C*T*T*A*C*T*C*+G*+T*+T
87 Neg1 +C*+G*+T*T*T*A*G*G*C*T*A*T*G*T*A*+C*+T*+T
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 서열목록 제1서열 및/또는 서열목록 제2서열의 인간 또는 뮤린 CD39와 혼성화한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 CD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 불린다. 일 구현예에 따르면, 상기 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 CD39 mRNA(예를 들어 서열목록 제1서열)의 1000-1700 또는 2500-3200 위치에 혼성화된다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 예를 들어 인간, 랫트 또는 뮤린의 CD39 발현을 억제한다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 세포, 조직, 기관 또는 대상체에서 면역 억제를 복귀시키는 면역 억제-복구 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 나노몰 또는 마이크로몰 수준, 예를 들어 0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 또는 950 nM, 또는 1, 10 또는 100 μΜ의 농도에서 CD39의 발현을 억제한다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 1, 3, 5, 9, 10, 15, 27, 30, 40, 50, 75, 82, 100, 250, 300, 500, 또는 740 nM, 또는 1, 2.2, 3, 5, 6.6 또는 10 μΜ의 농도로 사용된다.
일 구현예에 따르면 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 화학요법제, 다른 올리고뉴클레오타이드, 항체 및/또는 저분자를 추가적으로 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 약제학적 조성물은 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 용도로 사용된다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 약제학적 조성물의 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 용도는 방사선 치료와 병용할 수 있다. 방사선 치료는 화학 치료(예를 들어 백금, 젬시타빈)와 추가적으로 병용될 수 있다. 상기 질환은 예를 들어 CD39 불균형, 즉 CD39 수준이 정상적이고 건강한 세포, 조직, 기관 또는 대상체에 비해 증가함을 특징으로 한다. CD39 수준은 예를 들어 CD39 발현 및 활성이 증가함에 따라 각각 증가한다. CD39 수준은 면역조직화학, 웨스턴블롯, 정량적 실시간 PCR 또는 QuantiGene 분석과 같이 당업자에게 알려진 표준적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 약제학적 조성물은 국소적 또는 전신적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 경구, 설하, 비강, 피하, 정맥, 복강, 근육, 종양내, 척수, 경피 및/또는 직장 투여될 수 있다. 대안으로서 또는 조합하여 체외에서 처리된 면역세포를 투여할 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드는 단독으로 또는 본 발명의 다른 면역 억제-복구 올리고뉴클레오타이드와 병용 투여될 수 있으며, 선택적으로 다른 올리고뉴클레오타이드, 항체 또는 Fab 절편와 같은 그 절편, HERA 융합 단백질, 리간드 트랩, 나노바디, BiTe, 저분자 및/또는 화학요법제 (예를 들어 백금, 젬시타빈)와 같은 다른 물질과 함께 사용될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 다른 올리고뉴클레오타이드(즉, 본 발명의 일부분이 아닌), 항체 및/또는 저분자는 자가면역 질환, 예를 들어 자가면역 관절염 또는 염증성 장질환(IBD)과 같은 위장관 자가면역 질환 또는 대장염; 면역 질환, 예를 들어 HIV 감염과 같은 만성 바이러스 감염에 의한 면역 소진; 심혈관 질환; 염증성 질환, 예를 들어 만성 기도 염증; 박테리아, 바이러스 및/또는 진균감염, 예를 들어 패혈증 또는 소결핵균 감염; 간 질환; 만성 신장 질환; 정신과 질환(예를 들어 정신 분열증, 쌍극성 장애, 알츠하이머병); 및/또는 암을 예방 및/또는 치료하는 데에 효과적이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 약제학적 조성물은 예를 들어 고형종양 또는 혈액종양을 예방 및/또는 치료하는 방법에 이용될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 약제학적 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 암의 예는 유방암, 폐암, 악성 흑색종, 림프종, 피부암, 뼈암, 전립선암, 간암, 뇌암, 후두암, 담낭, 췌장, 고환, 직장, 부갑상선, 갑상선, 부신, 신경조직, 두경부, 대장, 위, 기관지, 신장, 기저세포암종, 편평세포암종, 피부전이암, 골육종, 유잉(Ewing) 육종, 세망세포 육종, 지방육종, 골수종, 거대세포 종양, 소세포 폐 종양, 섬세포 종양, 원발성 뇌종양, 수막종, 급성 및 만성 림프구 및 과립형백혈구 종양, 급성 및 만성 골수백혈병, 모발상세포 종양, 선종, 과증식증, 수질암종, 장 신경절신경세포종, 빌름스(Wilm) 종양, 정상피종, 난소 종양, 평활근종, 자궁경부 이형증, 망막아종, 연부조직 육종, 악성유암종, 국부성 피부손상, 횡문근육종, 카포시(Kaposi) 육종, 골원성 육종, 악성 고칼슘혈증, 신장 세포 종양, 진성 적혈구 증가, 선암, 역행성 성상세포종, 다형성 교아종, 백혈병 또는 표피세포암이 있다.
일 구현예에 따르면, 둘 또는 그 이상의 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 동시에, 예를 들어 하나의 약제학적 조성물에서 또는 분리되어 투여되거나 또는 시차를 가지고 투여될 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 하나 또느 그 이상의 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 다른 올리고뉴클레오타이드 (즉, 본 발명의 일부분이 아닌), 항체, 저분자 및/또는 화학요법제와 같은 다른 물질과 함께 동시에, 예를 들어 하나의 약제학적 조성물에서 또는 분리되어 투여되거나 또는 시차를 가지고 투여될 수 있다. 이러한 조합의 일 구현예에 따르면, 면역 억제-복구 올리고뉴클레오타이드는 면역 억제인자 및 다른 올리고뉴클레오타이드(즉, 본 발명의 일부분이 아닌), 항체 또는 Fab 절편과 같은 이의 절편, HERA 융합 단백질, 리간드 트랩, 나노바디, BiTe 및/또는 동일한 면역 억제인자 및/또는 다른 면역 억제인자를 억제하거나(길항제) 또는 자극하는 (아고니스트) 저분자의 발현 및 활성을 억제한다. 면역 억제인자 및/또는 면역 촉진인자 및/또는 면역 촉진인자. 면역 억제인자는 예를 들어 IDOl, ID02, CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, VISTA, A2AR, CD39, CD73, STAT3, TD02, TIM-3, TIGIT, TGF-beta, BTLA, MICA, NKG2A, KIR, CD160, Chop, Xbpl 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 면역 촉진인자는 예를 들어 4-1BB, Ox40, KIR, GITR, CD27, 2B4 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
면역 억제인자 예를 들어 세포, 조직, 기관 또는 대상체에서 발현 및/또는 활성이 증가하는 인자이다. 면역 촉진인자는 세포, 조직, 기관 또는 대상체 또는 개개의 상태에 따라 세포, 조직, 기관 또는 대상체에서 발현이 증가하거나 감소하는 인자이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 약제학적 조성물과 함께 사용되는 항체는 예를 들어 항-PD-1 항체, 항-PD-Ll 항체, 또는 이중특이성 항체이다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 약제학적 조성물과 함께 사용되는 저분자는 예를 들어 ARL67156(Oncolmmunology 1:3; 2012) 또는 POM-1(Gastroenterology; 2010; 139(3): 1030-1040)이다.
본 발명의 대상체는 예를 들어 포유류, 조류 또는 어류이다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 서로 다른 구현예를 보여주고 있지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되지 않는다. 다음의 실험은 IDO1를 내재적으로 발현하는 세포, 즉 형질전환된 리포터 컨스트럭트를 포함하는 인공 시스템을 가지지 않는 세포에 대해 수행되었다. 이러한 인공 시스템은 인 비보 시스템에서 치료학적으로 보다 적절한 내재적 시스템에 비하여 대개 더 높은 억제효율과 더 낮은 IC50 값을 보인다. 나아가, 다음의 실험에는 형질전환 시약이 사용되지 않았다. 즉, 짐노틱(gymnotic) 전달이 수행되었다. 형질전환 시약은 올리고뉴클레오타이드의 활성을 증가시켜 IC50 값에 영향을 미치는 것으로 알려졌다(예를 들어 Zhang et al., Gene Therapy, 2011, 18, 326-333; Stanton et al., Nucleic Acid Therapeutics, Vol. 22, No. 5, 2012 참조). 형질전환 시약을 이용하는 인공 시스템이 치료적 접근으로 사용되기 어렵거나 불가능하고, 올리고뉴클레오타이드를 위한 형질전환 제형 중 아직 허가받은 바가 없기 때문에 이후의 실험은 형질전환 시약 없이 수행하였다.
실시예 1: 인간 CD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 설계
인간(h) CD39에 특이성을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계하기 위해 서열목록 제1서열(seq. ref. ID NM_001776.5)의 hCD39 mRNA 서열을 이용하였다. 인-하우스 기준에 따라 14, 15, 16 및 17mer를 설계하고, 모든 실험에서 negl(WO2014154843 Al에 서술)을 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 사용하였다(표 1). hCD39 mRNA 상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 결합부위 분포를 도 1에 나타내었다.
실시예 2: 인간암 세포주에서 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효능 스크리닝
암 세포주에서 hCD39 mRNA 발현의 녹다운에 대한 본 발명의 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효능을 분석하기 위해, HDLM-2(인간 호지킨 림프종, DSMZ) 및 A-172(인간 교아종, ATCC) 세포에 도 2a 내지 2d에서 보는 바와 같이 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 단일투여(형질전환 시약 없이 10μΜ 농도, 이를 짐노틱 전달이라 칭함)하였다. 3일 후 QuantiGene Singleplex 어세이(Affymetrix)를 이용하여 hCD39 및 HPRTl mRNA 발현을 분석하였고, hCD39 발현값은 HPRTl 값에 대해 정규화하였다. 놀랍게도, 23번 및 18번 안티센스 올리고뉴클레오타이드(HDLM-2 세포; 도 2a 및 2b)에서 녹다운 효율>90%이 관찰되었으며, 8번 및 10번 안티센스 올리고뉴클레오타이드(A-172 세포)에서 녹다운 효율>90%이 관찰되었다(도 2c 및 2d). 비처리 세포와 비교한 hCD39 mRNA 발현 평균 정규화 값은 A-172에 대해 표 4(1차 스크리닝) 및 표 5(2차 스크리닝)에, HDLM-2 세포에 대해서는 표 6(1차 스크리닝) 및 표 7(2차 스크리닝)에 각각 나타내었다:
미처리 세포와 비교한 안티센스 올리고뉴클레오타이드-처리 A-172 세포의 평균 정규화된 hCD39 mRNA 발현 값 (1차 스크리닝).
Compound ID 평균 hCD39 mRNA 발현 (1로 설정된 미처리 세포 대비)
A04019H 0.03
A04020H 0.03
A04040H 0.07
A04044H 0.07
A04026H 0.07
A04048H 0.09
A04016H 0.09
A04023H 0.09
A04010H 0.10
A04005H 0.11
A04017H 0.11
A04025H 0.13
A04022H 0.14
A04046H 0.14
A04021H 0.16
A04045H 0.16
A04037H 0.17
A04003H 0.18
A04032H 0.19
A04018H 0.19
A04006H 0.19
A04030H 0.19
A04043H 0.21
A04014H 0.27
A04039H 0.27
A04033H 0.28
A04009H 0.28
A04034H 0.28
A04028H 0.29
A04042H 0.37
A04012H 0.43
A04024H 0.45
A04029H 0.45
A04008H 0.46
A04041H 0.46
A04007H 0.53
A04050H 0.55
A04036H 0.55
A04038H 0.56
A04027H 0.58
A04001H 0.58
A04004H 0.65
미처리 대조군 1.00
neg 1 1.36
미처리 세포와 비교한 안티센스 올리고뉴클레오타이드-처리 A-172 세포의 평균 정규화된 hCD39 mRNA 발현 값 (2차 스크리닝).
ASO 상대적 hCD39 mRNA 발현(미처리 세포 대비)
A04019H 0,03
A04020H 0,04
A04040H 0,04
A04044H 0,04
A04048H 0,05
A04046H 0,08
A04026H 0,08
A04045H 0,08
A04037H 0,09
A04016H 0,09
A04023H 0,10
A04032H 0,10
A04030H 0,10
A04043H 0,11
A04010H 0,11
A04005H 0,11
A04017H 0,11
A04025H 0,13
A04039H 0,14
A04033H 0,14
A04022H 0,15
A04034H 0,15
A04021H 0,16
A04003H 0,18
A04042H 0,19
A04018H 0,20
A04006H 0,20
A04041H 0,24
A04014H 0,27
A04050H 0,28
A04036H 0,28
A04009H 0,29
A04038H 0,29
A04028H 0,29
A04035H 0,37
A04012H 0,43
A04047H 0,43
A04024H 0,45
A04049H 0,45
A04029H 0,46
A04008H 0,46
A04007H 0,53
A04031H 0,55
A04027H 0,58
A04001H 0,58
A04004H 0,66
A04011H 0,69
A04013H 0,75
neg 1 0,79
A04002H 0,96
No ASO 1,00
A04015H 1,05
미처리 세포와 비교한 안티센스 올리고뉴클레오타이드-처리 HDLM-2 세포의 평균 정규화된 hCD39 mRNA 발현 값
Compound ID HPRT1 에 대해 정규화된 미처리 대조군(=1) 대비 평균 hCD39 mRNA 발현
A04029H 0.03
A04026H 0.03
A04043H 0.04
A04046H 0.04
A04048H 0.05
A04044H 0.05
A04032H 0.06
A04023H 0.06
A04034H 0.06
A04039H 0.06
A04030H 0.07
A04028H 0.07
A04040H 0.08
A04019H 0.08
A04020H 0.08
A04025H 0.08
A04045H 0.09
A04022H 0.09
A04033H 0.10
A04042H 0.10
A04016H 0.10
A04012H 0.11
A04050H 0.11
A04021H 0.11
A04017H 0.11
A04037H 0.12
A04018H 0.12
A04009H 0.15
A04024H 0.15
A04014H 0.17
A04010H 0.17
A04035H 0.17
A04041H 0.18
A04008H 0.20
A04038H 0.20
A04003H 0.20
A04006H 0.20
A04005H 0.21
A04004H 0.22
A04013H 0.22
A04007H 0.23
A04027H 0.24
A04001H 0.25
A04036H 0.26
A04011H 0.29
A04015H 0.29
미처리 대조군 1.00
neg 1 1.09
미처리 세포 대비 안티센스 올리고뉴클레오타이드-처리 HDLM-2 세포의 평균 정규화된 hCD39 mRNA 발현값(*= 검출 한계값 미만; 2차 스크리닝)
ASO 상대적 hCD39 mRNA 발현 (미처리 세포 대비)
A03045H = A04045H *
A03042H = A04042H *
A03047H = A04047H *
A03041H = A04041H *
A03043H = A04043H *
A03039H = A04039H *
A03049H = A04049H *
A03038H = A04038H *
A03044H = A04044H *
A03033H = A04033H *
A03031H = A04031H *
A03036H = A04036H 0,01
A03032H = A04032H 0,01
A03029H = A04029H 0,03
A03026H = A04026H 0,03
A03040H = A04040H 0,06
A03023H = A04023H 0,06
A03034H = A04034H 0,06
A03028H = A04028H 0,07
A03019H = A04019H 0,08
A03020H = A04020H 0,08
A03025H = A04025H 0,08
A03022H = A04022H 0,09
A03037H = A04037H 0,10
A03016H = A04016H 0,10
A03012H = A04012H 0,10
A03021H = A04021H 0,11
A03017H = A04017H 0,11
A03018H = A04018H 0,12
A03009H = A04009H 0,15
A03024H = A04024H 0,15
A03010H = A04010H 0,15
A03014H = A04014H 0,17
A03035H = A04035H 0,18
A03008H = A04008H 0,20
A03003H = A04003H 0,20
A03006H = A04006H 0,20
A03005H = A04005H 0,21
A03004H = A04004H 0,21
A03013H = A04013H 0,22
A03007H = A04007H 0,23
A03027H = A04027H 0,24
A03001H = A04001H 0,25
A03015H = A04015H 0,29
A03011H = A04011H 0,30
A03048H = A04048H 0,36
A03046H = A04046H 0,37
A03030H = A04030H 0,38
A03002H = A04002H 0,53
A03050H = A04050H 0,80
neg1 1,09
실시예 3: HDLM-2 및 A-172 세포에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드 효능의 상관분석
실험 세포주인 HDLM-2 및 A-172 모두에서 가장 높은 활성을 가지는 후보군에 대한 추가 선별을 위해 상관분석을 수행하였다(도 2b 및 2d의 데이터). 도 3에 나타난 바와 같이 HDLM-2 및 A-172 세포에서의 IC50 값 결정을 위해 다음의 7개의 강력한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 선정하였다(검은색으로 표시): A04019H(서열목록 제23서열), A04033H(서열목록 제37서열), A04039H(서열목록 제43서열), A04040H(서열목록 제3서열), A04042H(서열목록 제45서열), A04044H(서열목록 제47서열) 및 A04045H(서열목록 제4서열). 주목할만한 것은, 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 negl은 양쪽 세포주 모두에서 hCD39 발현에 부정적인 영향을 미치지 않았다는 것이다.
실시예 4: 1차 스크리닝에서 선정된 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 HDLM-2 세포에서의 IC50 값 결정(mRNA 수준)
A04019H(서열목록 제23서열), A04033H(서열목록 제37서열), A04039H(서열목록 제43서열), A04040H(서열목록 제3서열), A04042H(서열목록 제45서열), A04044H(서열목록 제47서열), A04045H(서열목록 제4서열)의 IC50 값을 결정하기 위하여, HDLM-2 세포에 적정된 양의 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리하였다(농도: 10μΜ, 3.3μΜ, 1.1μΜ, 370nM, 120nM, 41nM, 14nM, 4.5nM). hCD39 mRNA 발현은 3일 후 분석하였다. 도 4 및 하기의 표 8에서 보는 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04040H(서열목록 제3서열) 및 A04045H(서열목록 제4서열)은 HDLM-2 세포에서 각각 99% 및 99.2%의 최대 타겟 억제율을 보임으로써 미처리 세포에 비해 가장 높은 hCD39 mRNA 저해 효율을 나타냈다. 표 8은 HDLM-2 세포에서 상술한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 IC50 값 및 적정된 농도에서의 타겟 억제율을 나타낸다:
Figure 112019046522609-pct00001
실시예 5: 2차 스크리닝에서 선정된 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 HDLM-2 세포에서의 IC50 값 결정(mRNA 수준)
두 번째 실험에서는 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04010H(서열목록 제14서열), A04016H(서열목록 제20서열), A04017H(서열목록 제21서열), A04020H(서열목록 제24서열) 및 A04026H(서열목록 제30서열)의 효과의 농도-의존성 IC50 값을 조사하였다. 첫 번째 IC50 값 측정에서 강력한 활성을 보인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04019H(서열목록 제23서열) 및 A04040H(서열목록 제3서열)를 기준으로 사용하였다. HDLM-2 세포에 적정된 양의 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리하였다(농도: 10μΜ, 3.3μΜ, 1.1μΜ, 370nM, 120nM, 41nM, 14nM, 4.5nM). hCD39 mRNA 발현은 처리 3일 후 분석하였다. 도 5 및 표 9는 선정된 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 농도-의존적 hCD39 mRNA 발현 감소를 보여준다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04016H, A04019H, A04020H 및 A04040H은 HDLM-2 세포에서 12.8 nM(A04016H), 11.58nM(A04019H), 10.11 nM(A04020H), 및 21.53 nM (A04040H)의 IC50 값을 보여 가장 강력한 hCD39 mRNA 억제활성을 나타냈다.
Figure 112019046522609-pct00002
실시예 6: 인간암 세포주에서 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 3차 스크리닝
3차 스크리닝을 위해, 새로운 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다. 이들 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 1차 스크리닝에서 발굴된 효율적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 길이, mRNA 상에서의 정확한 위치 및 화학적 변형 패턴에 변형을 가하였다. 이에, hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 were tested in 인간암세포주(도 6a, 표 10) HDLM-2 (인간 호지킨 림프종) 및 (도 6b, 표 11) A-172 (인간 교아종)에서 시험하였다. HDLM-2 및 A-172 세포에 3일간 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 10μΜ를 처리하였다. 1차 스크리닝에서 강력한 활성을 보인 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 A04019H(서열목록 제23서열), A04040H(서열목록 제3서열) 및 A04042H(서열목록 제45서열)을 기준으로 사용하였다. 잔여 hCD39 발현은 처리되지 않은 대조군 세포(1로 설정)와 비교하여 표시하였다.
미처리 세포(1로 설정)에 대비한 안티센스 올리고뉴클레오타이드-처리된 HDLM-2 세포의 평균 정규화된 hCD39 mRNA 발현 값
올리고 ID 미처리 세포(1로 설정) 대비 잔여 hCD39 mRNA 발현
A04052H 0.00
A04040H 0.01
A04053H 0.01
A04056H 0.01
A04057H 0.01
A04059H 0.01
A04061H 0.01
A04058H 0.01
A04060H 0.01
A04062H 0.01
A04019H 0.01
A04051H 0.02
A04055H 0.03
A04042H 0.09
A04054H 0.13
S6 0.95
미처리 대조군 1.00
미처리 세포(1로 설정)에 대비한 안티센스 올리고뉴클레오타이드-처리된 A-172 세포의 평균 정규화된 hCD39 mRNA 발현 값
Oligo ID 미처리 세포(1로 설정) 대비 잔여 hCD39 mRNA 발현 ± SD
A04019H 0.00 0.00
A04042H 0.00 0.00
A04040H 0.05 0.01
A04060H 0.08 0.01
A04059H 0.09 0.02
A04056H 0.09 0.01
A04061H 0.10 0.00
A04057H 0.13 0.00
A04062H 0.17 0.02
A04058H 0.25 0.02
A04052H 0.25 0.00
A04053H 0.31 0.02
A04051H 0.34 0.01
A04055H 0.52 0.02
A04054H 0.60 0.03
S6 0.95 0.07
미처리 대조군 1.00 0.00
실시예 7: HDLM-2 세포에서 3차 스크리닝에서 선정된 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 IC50 측정(mRNA 수준)
hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04051H(서열목록 제88서열), A04052H(서열목록 제89서열), A04053H(서열목록 제89서열), A04056H(서열목록 제92서열), A04059H(서열목록 제94서열), A04060H(서열목록 제95서열) 및 A04061H(서열목록 제96서열)은 HDLM-2 및 A-172 세포에서 강력한 단일 투여 활성을 보였다. 효과의 농도-의존성을 조사하고 IC50 값을 결정하기 위해 HDLM-2 세포에 1000 nM; 330 nM; 110 nM; 40 nM; 12 nM; 4 nM; 1.3 nM; 0.45 nM의 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리하였다. 1차 스크리닝에서 강력한 활성을 보여준 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04040H가 기준으로 사용되었다. 처리 3일 후 hCD39 mRNA 발현을 분석하였다. 도 7은 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 hCD39가 농도-의존적으로 감소함을 보여준다. IC50 값 및 타겟 억제율을 표 12에 나타내었다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04056H; A04059H; 및 A04060H가 각각 20.2 nM(A04056H); 18.32 nM(A04059H), 또는 20.5 nM (A04060H)의 IC50 값을 가져 HDLM-2 세포에서 가장 높은 hCD39 mRNA 억제활성을 보였다.
Figure 112019046522609-pct00003
실시예 8: A04040H(서열목록 제3서열) 및 A04045H(서열목록 제4서열)에 의한 농도 및 시간 의존적 hCD39 단백질 녹다운
강력한 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 A04040H(서열목록 제3서열) 및 A04045H(서열목록 제4서열)에 대해 이들의 hCD39 단백질 발현에 대한 녹다운 효능과 이들이 각기 다른 농도에서 세포 생존성 미치는 영향을 조사하였다. HDLM-2 세포에 상이한 농도의 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 3, 4 및 6일 째에 처리하였다. CD39 항체(클론 Al) 및 7-AAD을 이용한 유세포 분석을 통해 단백질 발현을 측정하여 생존성을 조사하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, 두가지 안티센스 올리고뉴클레오타이드 모두 모든 지정된 시점에서 hCD39 단백질을 강력하게 억제한 반면, negl을 처리할 경우 억제 효과가 나타나지 않았다. 반대로, A04045H(서열목록 제4서열)는 어떤 조건에서도 HDLM-2 세포의 생존성에 영향을 미치지 않았다. 표 13은 HDLM-2 세포에서 선정된 인간 CD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04040H (서열목록 제3서열) 및 A04045H(서열목록 제4서열)의 단백질 녹다운 효율을 각 시점 별로 요약한 것이다:
Figure 112019046522609-pct00004
실시예 9: hCD39-특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 1차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 hCD39 단백질 발현에 미치는 효과 및 올리고뉴클레오타이드 제거 후 효과의 지속 여부의 조사
A04040H은 인간암 세포주에서 mRNA 및 단백질 수준 모두에서 매우 강력한 hCD39 발현 억제활성을 보였다. 다음으로, 1차(primary) 인간 T 세포에서 이의 활성을 조사하였다. 나아가, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 제거 후 효과의 지속성도 조사하였다. 이에, CD8+ 및 CD4+ T 세포를 말초혈로부터 분리하고 hCD39 특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04040H(검은색 컬럼) 또는 어떠한 인간 mRNA와도 상보적이지 않은 대조군 올리고뉴클레오타이드 S6(흰색 컬럼) 존재 하에 항-CD3로 6일간의 총 투여기간 동안 활성화시켰다. 대조군 세포는 항-CD3로 활성화되었으나 어떤 올리고뉴클레오타이드도 투여되지 않았다(줄무늬 컬럼). 이후, 올리고뉴클레오타이드를 제거하고 hCD39 단백질 발현을 올리고뉴클레오타이드 제거 후 3, 6 및 11일 째에 유세포분석을 통해 측정하였다(도 9).
도 9에 나타난 바와 같이, A04040H는 안티센스 올리고뉴클레오타이드제거 후 최소 6일간 hCD39 단백질 발현을 유의하게 억제하는 반면, S6을 처리한 경우 미처리 대조군 세포에 비하여 CD39 단백질 발현에 대한 억제효과를 보이지 않는다. 후반부(6일 및 11일)에 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 hCD39 단백질 발현의 전반적인 감소가 관찰되었는데, 이는 세포 배양액에서 항-CD3 제거 후 T 세포 활성이 감소되었기 때문으로 보인다. 따라서, CD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 대조군 올리고뉴클레오타이드가 각각 처리된 T 세포에서의 hCD39 단백질 발현 수준의 차이는 ASO 제거 후 3일째가 가장 강했으며, 이는 올리고뉴클레오타이드 제거 후 6일까지도 유의하였다(도 9). 올리고뉴클레오타이드 제거 11일 후, CD8+ 및 CD4+ T 세포의 hCD39 발현량은 낮았으며 CD39 ASO, 대조군 ASO, 및 미처리된 대조군 세포에서 유사하였다(도 9).
실시예 10: JIYOYE 세포에서 hCD39 녹다운이 ATP 분해에 미치는 다운스트림 효과
hCD39에 의해 ATP가 분해되는 동안 생성되는 아데노신은 주요 면역억제성 분자이다. ATP는 ATP 생체 발광 어세이(ATP Bioluminescence 어세이 킷 CLS II; Roche)로 검출할 수 있다. JIYOYE에 5μΜ 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04040H (서열목록 제3서열) 또는 음성 대조군 올리고뉴클레오타이드인 negl를 6일간 처리하였다(3+3). 3일 뒤, RPMI-1640 배지를 5μΜ 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 신선한 RPMI-1640 배지로 교체하였다. 6일 뒤 유세포분석을 통해 단백질 녹다운 효능(도 10a) 및 생존성(도 10b)을 분석하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 존재는 세포 생존성에 영향을 주지 않았다(도 10b). 같은 날, 어떤 안티센스 올리고뉴클레오타이드도 처리하지 않은 세포를 20μΜ의 CD39 저분자 억제제인 ARL67156 트리소듐 염 (TOCRIS)과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 2μΜ의 ATP를 세포 또는 각 조건으로부터 유래한 세포가 없는 세포 배양배지에 처리하고, 30분 후 ATP 농도를 세포 상층액 또는 세포 배양배지에서 측정하였다. 놀랍게도, ATP 분해 효능은 A04040H(서열목록 제3서열)을 처리한 JIYOYE 세포에서 거의 소멸되어(도 IOC) neg 1을 처리한 세포에 비해 4배 높은 ATP 농도를, ARL67156를 처리한 세포와 비교하여 2배 높은 ATP 농도를 보였다(도 IOC). 표 14는 hCD39 녹다운이 JIYOYE 세포의 세포배양 상층액에서 상대적인 ATP 수준에 미치는 영향을 나타낸다 :
hCD39 단백질 녹다운 후 및 세포에 외인성 ATP 첨가 후 JIYOYE 세포 상층액에서의 ATP 농도 측정
처리 ATP 첨가 30분 후 JIYOYE 세포에서의 상대적 ATP 수준 (vs. 대조군 배지l)
No ASO 0
A04040H 0,76
neg 1 0,19
ARL67156 0,38
배지(무세포) 1
배지+ARL (무세포) 0,94
나아가, 1차 인간 CD8+ T 세포에서 ATP 분해에 hCD39 녹다운이 미치는 효과도 분석하였다(도 11a-11d). 활성화된 T 세포에 5μΜ 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04040H(서열목록 제3서열) 또는 음성 대조군 올리고뉴클레오타이드 negl를 6일간 처리하였다(3+3). 3일 뒤, RPMI-1640 배지를 5μΜ 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 신선한 RPMI-1640 배지로 교체하였다. 6일 뒤 단백질 녹다운 효능(도 11a) 및 생존성(도 11b)을 유세포분석으로 측정하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 존재는 세포 생존성에 영향을 미치지 않았다(도 11b). 6일 째에, 세포를 일정 세포수로 재-플레이팅하고 ATP를 2μΜ(도 11c) 또는 20μΜ(도 11d) 농도로 첨가하였다. ATP 농도는 30분 뒤 세포 상층액 또는 세포 배양배지에서 측정하였다(표 15).
놀랍게도, ATP 분해 효능은 A04040H(서열목록 제3서열)을 처리한 CD8+ T 세포에서 거의 소멸되어(도 11c-11d) neg 1을 처리한 세포에 비해 7배 높은 ATP 농도를 보이면서 배지 대조군과 거의 유사한 ATP 농도에 도달하였다. 표 15는 1차 인간 CD8+ T 세포에서 hCD39 녹다운이 ATP 농도에 미치는 영향을 나타낸다.
hCD39 단백질 녹다운 후 및 세포에 외인성 ATP 첨가 후 CD8+ T 세포 상층액에서의 ATP 농도 측정
ATP 첨가 30분 후 CD8+ T 세포 상층액에서의 상대적 ATP 수준
ASO 첨가된 ATP (2μmol/l) 첨가된 ATP (20μmol/l)
No ASO 0 0,37
neg 1 0 0,12
A04040H 0,59 0,89
배지 1 1
실시예 11: 세포외 ATP의 존재 및 부존재 하에서 CD39-특이적 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 T 세포 증식에 미치는 효과
앞서 살핀 본 발명의 결과는 1차 인간 CD8+ T에 A04040H를 투여할 경우 세포외 ATP를 분해하는 능력이 유의하게 감소됨을 보여주었다. 암에 있어서, ATP는 종양세포로부터, 예를 들어 화학치료 또는 방사선 치료에 의해 유발된 세포사멸 이후에 방출된다. CD39-CD73 축은 T세포 기능에 있어 중요한 역할을 하기 때문에, 세포외 ATP의 존재 또는 부재 하에 A04040H가 T 세포 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 인간 CD8+ T 세포를 세포증식 염료로 표지하고, 항-CD3으로 활성화시킨 후 5μΜ의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04040H 또는 대조군 올리고뉴클레오타이드 S6을 총 5일간 처리하였다. 비이클 대조군에서, 세포는 항-CD3 만으로 활성화시켰다. 이어서, 400μΜ ATP 또는 비이클을 올리고뉴클레오타이드 처리를 시작한 후 3일 및 4일째에 세포에 첨가하였다. 나아가, 추가적인 대조군으로서, 저분자 CD39-억제제인 ARL67156 트리소듐 염 20μΜ를 4일째에 24시간 배양시간으로 세포에 첨가하였다. 올리고뉴클레오타이드 처리를 시작한 후 5일째에 CD8+ T 세포의 CD39 단백질 발현, 증식 및 절대세포수를 유세포분석으로 측정하였다.
CD8+ T 세포에 A04040H를 처리하자 CD39 단백질 발현이 강하게 억제되었다(도 12a). 세포 외 ATP가 없을 때, A04040H-(검은색 컬럼), S6-(흰색 컬럼), ARL67156-(체크무늬 컬럼) 및 비이클-처리(줄무늬 컬럼) CD8+ T 세포 간에 증식(도 12b 상단 패널) 또는 절대세포수(도 12c)의 차이는 관찰되지 않았다. ATP 400μΜ을 보충하자 S6, ARL67156 또는 비이클을 처리한 CD8+ T 세포의 증식이 감소하고(도 12b 하단 패널) 절대세포수가 유의하게 줄어들었다(도 12c). 놀랍게도, A04040H 처리된 CD8+ T 세포의 증식(도 12b 하단 패널)은 세포 배양배지에 ATP를 보충하여도 감소하지 않았다. 따라서, A04040H-처리 세포에서 절대 T 세포수는 ATP를 보충한다고 하여 변하지 않았다(도 12c).
요약하면, 이들 결과는 세포 배양배지에 ATP를 보충하면 CD39를 발현하는 CD8+ T 세포의 증식을 유의하게 저해함을 알 수 있다. 놀랍게도, A04040H 처리에 의한 CD39-단백질 녹다운은 ATP 분해를 억제함으로써 보충된 ATP가 세포 증식 및 절대 T 세포수에 미치는 억제효과를 되돌려놓았다.
실시예 12: 마우스/랫트 CD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 설계
인간과 마우스(m)/랫트(r) 간의 CD39 서열차이 때문에 몇몇 hCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드만이 마우스/랫트 CD39에 대해 교차 반응성을 가졌다. 이들은 인간 세포주에서 제한된 녹다운 효능을 보였기 때문에, 마우스/랫트 CD39에 특이성을 가지는 대용(surrogate) 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다. 서열목록 제2서열(seq. ref. NM_001304721.1)의 마우스 CD39 mRNA 서열을 기반으로 하여 15, 16 및 17mer 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다. negl은 WO2014154843 Al에 기재되어 있으며 모든 실험에서 대조군으로 사용되었다(표 2). hCD39 mRNA 상에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드 결합 부위의 분포는 도 13에 나타내었다.
실시예 13: 뮤린 암 세포주에서 mCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효능 스크리닝
암 세포에서 mCD39 mRNA 발현을 녹다운하는 mCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효능을 분석하기 위하여, A20(마우스 B 세포 림프종, ATCC) 세포에 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 단일투여(농도:10μΜ 형질전환 시약을 사용하지 않음; 이러한 방법을 짐노틱 전달이라 부름)를 도 14에서와 같이 투여하였다. 대조군으로, 세포를 negl로 처리하고, 서열 CGTTTAGGCTATGTACTT를 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 negl로 처리하였다. 3일 후 mCD39 및 HPRTl mRNA 발현을 QuantiGene Singleplex 어세이(Affymetrix)를 이용하여 측정하고 mCD39 발현값을 HPRTl 발현값에 대해 정규화하였다. 놀랍게도, 도 14에서 보는 바와 같이, A20 세포에서 15개의 서로 다른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리한 결과 녹다운 효능 은 >90%로 나타났다. mCD39의 평균 정규화된 mRNA 발현의 정확한 값은 다음의 표 16에 나타내었다:
안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리한 A20 세포에서의 미처리 세포 대비 평균 정규화된 mCD39 mRNA 발현 값.
ASO 상대적 mCD39 mRNA 발현값 (미처리 세포 대비)
A04011MR 0,01
A04001MR 0,02
A04028MR 0,02
A04032MR 0,02
A04023MR 0,03
A04027MR 0,03
A04026MR 0,04
A04019MR 0,05
A04013MR 0,06
A04006MR 0,06
A04002MR 0,06
A04020MR 0,06
A04003MR 0,07
A04017MR 0,07
A04007MR 0,07
A04029MR 0,11
A04033MR 0,12
A04031MR 0,14
A04005MR 0,15
A04016MR 0,17
A04004MR 0,17
A04018MR 0,18
A04014MR 0,20
A04022MR 0,20
A04030MR 0,21
A04010MR 0,25
A04015MR 0,32
A04021MR 0,35
A04024MR 0,35
A04025MR 0,35
A04008MR 0,58
neg1 0,67
A04012MR 0,78
A04009MR 0,89
실시예 14: C57BL/6 마우스에서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드-매개 인 비보 mCD39 mRNA 녹다운
강력한 mCD39 ASO A04011MR가 선정되어 C57BL/6 마우스에서 이의 인 비보 녹다운 능력을 분석하였다. C57BL/6 마우스에 A04011MR 또는 음성 대조군 올리고뉴클레오타이드 negl를 25 mg/kg 또는 10 mg/kg 용량으로 1, 2, 3, 4, 5, 9, 12, 16 및 19일째(5 마우스/그룹)에 피하주사하였다. 마지막 ASO 투여 후 7일 뒤(26일 째)에, 마우스를 희생시키고 비장을 채취하여 CD39 mRNA 분석을 수행하였다. 도 15에 나타난 결과는 A04011MR 또는 negl-처리 마우스의 비장에서의 CD39 mRNA 발현 수준을 보여준다. 놀랍게도, 마우스에 25 mg/kg(도 15a) 또는 10 mg/kg (도 15b)의 A04011MR를 전신적으로 투여하자 대조군 올리고뉴클레오타이드(neg 1) 처리된 마우스에 비해 mCD39 mRNA 수준은 비장에서 유의하게 감소하였다. 이들 데이터는 A04011MR가 비장의 CD39 발현을 mRNA 수준에서 인 비보에서 강하게 억제함을 명확하게 보여준다.
실시예 15: 동일계통 마우스 종양 모델에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드-매개 인 비보 mCD39 단백질 녹다운
강력한 mCD39 안티센스 올리고뉴클레오타이드 A04011MR를 선정하고 피하 동일계통 뮤린 종양모델에서 이의 인 비보 녹다운 능력을 분석하였다. 이에, 5 x 105 MC38 wt 종양세포를 C57BL/6 마우스에 피하주사하였다. 종양이 50-70 mm3 크기에 도달하면, 마우스에 상이한 용량의 A04011MR(20 mg/kg; 10 mg/kg; 5 mg/kg) 또는 음성 대조군 올리고뉴클레오타이드 negl(20 mg/kg)를 1, 2, 3, 4, 5, 9 및 12일째(4 마우스/그룹)에 전신적으로 피하주사하였다. 대조군으로서, MC-38 종양을 가진 마우스를 미처리 상태로 남겨두었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 마지막으로 처리한 후 4일 뒤 (16일째), 종양 침윤 면역 세포에서의 유세포분석을 통해 D39 단백질 발현을 분석하기 위해 종양을 분리하였다. 도 16a 및 16b는 미처리 마우스의 종양 대비 올리고뉴클레오타이드-처리 마우스의 종양-침윤 조절 T 세포(Treg)(도 16a) 및 종양 관련 대식세포(TAM)(도 16b)에서의 CD39 단백질 발현을 보여주는 그림이다. 놀랍게도, A04011MR은 Treg(도 16a) 및 TAM(도 16b)에서 용량-의존적으로 mCD39 단백질 발현을 억제하였으며, 20 mg/kg 용량에서 대조군에 비해 가장 높은 억제 효율을 보였다. 이들 데이터는 A04011MR가 종양 침윤 면역 세포의 CD39의 단백질 수준 발현을 인 비보에서 강력하게 억제함을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> Secarna Pharmaceuticals GmbH & Co KG <120> Immunosuppression-reverting oligonucleotides inhibiting the expression of CD39 <130> P112474PC00 <140> PCT/EP2017/075647 <141> 2017-10-09 <150> EP 16192807.2 <151> 2016-10-07 <150> EP 17187774.9 <151> 2017-08-24 <160> 98 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3420 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (187)..(1857) <400> 1 agggaagaag ggagaaagag agagagattt gaatatacat tgcttcaagg atgcaaaaaa 60 ttacaacctg gaaaaggctt cgagtaactt taggaaaatg agctgctgga ctcctcagtc 120 aatctgtcct ttctagtcaa tgaaaaagac agggtttgag gttccttccg aaacggggcc 180 ggctaa ttt agc ccc tcc cac gag ccc aag ggt ctg tta tat ctc tgt 228 Phe Ser Pro Ser His Glu Pro Lys Gly Leu Leu Tyr Leu Cys 1 5 10 ttc ctt gag gac ctc tct cac gga gac gga cca cag caa gca gag gct 276 Phe Leu Glu Asp Leu Ser His Gly Asp Gly Pro Gln Gln Ala Glu Ala 15 20 25 30 ggg ggg ggg aaa gac gag gaa aga gga gga aaa caa aag ctg cta ctt 324 Gly Gly Gly Lys Asp Glu Glu Arg Gly Gly Lys Gln Lys Leu Leu Leu 35 40 45 atg gaa gat aca aag gag tct aac gtg aag aca ttt tgc tcc aag aat 372 Met Glu Asp Thr Lys Glu Ser Asn Val Lys Thr Phe Cys Ser Lys Asn 50 55 60 atc cta gcc atc ctt ggc ttc tcc tct atc ata gct gtg ata gct ttg 420 Ile Leu Ala Ile Leu Gly Phe Ser Ser Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu 65 70 75 ctt gct gtg ggg ttg acc cag aac aaa gca ttg cca gaa aac gtt aag 468 Leu Ala Val Gly Leu Thr Gln Asn Lys Ala Leu Pro Glu Asn Val Lys 80 85 90 tat ggg att gtg ctg gat gcg ggt tct tct cac aca agt tta tac atc 516 Tyr Gly Ile Val Leu Asp Ala Gly Ser Ser His Thr Ser Leu Tyr Ile 95 100 105 110 tat aag tgg cca gca gaa aag gag aat gac aca ggc gtg gtg cat caa 564 Tyr Lys Trp Pro Ala Glu Lys Glu Asn Asp Thr Gly Val Val His Gln 115 120 125 gta gaa gaa tgc agg gtt aaa ggt cct gga atc tca aaa ttt gtt cag 612 Val Glu Glu Cys Arg Val Lys Gly Pro Gly Ile Ser Lys Phe Val Gln 130 135 140 aaa gta aat gaa ata ggc att tac ctg act gat tgc atg gaa aga gct 660 Lys Val Asn Glu Ile Gly Ile Tyr Leu Thr Asp Cys Met Glu Arg Ala 145 150 155 agg gaa gtg att cca agg tcc cag cac caa gag aca ccc gtt tac ctg 708 Arg Glu Val Ile Pro Arg Ser Gln His Gln Glu Thr Pro Val Tyr Leu 160 165 170 gga gcc acg gca ggc atg cgg ttg ctc agg atg gaa agt gaa gag ttg 756 Gly Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Arg Met Glu Ser Glu Glu Leu 175 180 185 190 gca gac agg gtt ctg gat gtg gtg gag agg agc ctc agc aac tac ccc 804 Ala Asp Arg Val Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Leu Ser Asn Tyr Pro 195 200 205 ttt gac ttc cag ggt gcc agg atc att act ggc caa gag gaa ggt gcc 852 Phe Asp Phe Gln Gly Ala Arg Ile Ile Thr Gly Gln Glu Glu Gly Ala 210 215 220 tat ggc tgg att act atc aac tat ctg ctg ggc aaa ttc agt cag aaa 900 Tyr Gly Trp Ile Thr Ile Asn Tyr Leu Leu Gly Lys Phe Ser Gln Lys 225 230 235 aca agg tgg ttc agc ata gtc cca tat gaa acc aat aat cag gaa acc 948 Thr Arg Trp Phe Ser Ile Val Pro Tyr Glu Thr Asn Asn Gln Glu Thr 240 245 250 ttt gga gct ttg gac ctt ggg gga gcc tct aca caa gtc act ttt gta 996 Phe Gly Ala Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln Val Thr Phe Val 255 260 265 270 ccc caa aac cag act atc gag tcc cca gat aat gct ctg caa ttt cgc 1044 Pro Gln Asn Gln Thr Ile Glu Ser Pro Asp Asn Ala Leu Gln Phe Arg 275 280 285 ctc tat ggc aag gac tac aat gtc tac aca cat agc ttc ttg tgc tat 1092 Leu Tyr Gly Lys Asp Tyr Asn Val Tyr Thr His Ser Phe Leu Cys Tyr 290 295 300 ggg aag gat cag gca ctc tgg cag aaa ctg gcc aag gac att cag gtt 1140 Gly Lys Asp Gln Ala Leu Trp Gln Lys Leu Ala Lys Asp Ile Gln Val 305 310 315 gca agt aat gaa att ctc agg gac cca tgc ttt cat cct gga tat aag 1188 Ala Ser Asn Glu Ile Leu Arg Asp Pro Cys Phe His Pro Gly Tyr Lys 320 325 330 aag gta gtg aac gta agt gac ctt tac aag acc ccc tgc acc aag aga 1236 Lys Val Val Asn Val Ser Asp Leu Tyr Lys Thr Pro Cys Thr Lys Arg 335 340 345 350 ttt gag atg act ctt cca ttc cag cag ttt gaa atc cag ggt att gga 1284 Phe Glu Met Thr Leu Pro Phe Gln Gln Phe Glu Ile Gln Gly Ile Gly 355 360 365 aac tat caa caa tgc cat caa agc atc ctg gag ctc ttc aac acc agt 1332 Asn Tyr Gln Gln Cys His Gln Ser Ile Leu Glu Leu Phe Asn Thr Ser 370 375 380 tac tgc cct tac tcc cag tgt gcc ttc aat ggg att ttc ttg cca cca 1380 Tyr Cys Pro Tyr Ser Gln Cys Ala Phe Asn Gly Ile Phe Leu Pro Pro 385 390 395 ctc cag ggg gat ttt ggg gca ttt tca gct ttt tac ttt gtg atg aag 1428 Leu Gln Gly Asp Phe Gly Ala Phe Ser Ala Phe Tyr Phe Val Met Lys 400 405 410 ttt tta aac ttg aca tca gag aaa gtc tct cag gaa aag gtg act gag 1476 Phe Leu Asn Leu Thr Ser Glu Lys Val Ser Gln Glu Lys Val Thr Glu 415 420 425 430 atg atg aaa aag ttc tgt gct cag cct tgg gag gag ata aaa aca tct 1524 Met Met Lys Lys Phe Cys Ala Gln Pro Trp Glu Glu Ile Lys Thr Ser 435 440 445 tac gct gga gta aag gag aag tac ctg agt gaa tac tgc ttt tct ggt 1572 Tyr Ala Gly Val Lys Glu Lys Tyr Leu Ser Glu Tyr Cys Phe Ser Gly 450 455 460 acc tac att ctc tcc ctc ctt ctg caa ggc tat cat ttc aca gct gat 1620 Thr Tyr Ile Leu Ser Leu Leu Leu Gln Gly Tyr His Phe Thr Ala Asp 465 470 475 tcc tgg gag cac atc cat ttc att ggc aag atc cag ggc agc gac gcc 1668 Ser Trp Glu His Ile His Phe Ile Gly Lys Ile Gln Gly Ser Asp Ala 480 485 490 ggc tgg act ttg ggc tac atg ctg aac ctg acc aac atg atc cca gct 1716 Gly Trp Thr Leu Gly Tyr Met Leu Asn Leu Thr Asn Met Ile Pro Ala 495 500 505 510 gag caa cca ttg tcc aca cct ctc tcc cac tcc acc tat gtc ttc ctc 1764 Glu Gln Pro Leu Ser Thr Pro Leu Ser His Ser Thr Tyr Val Phe Leu 515 520 525 atg gtt cta ttc tcc ctg gtc ctt ttc aca gtg gcc atc ata ggc ttg 1812 Met Val Leu Phe Ser Leu Val Leu Phe Thr Val Ala Ile Ile Gly Leu 530 535 540 ctt atc ttt cac aag cct tca tat ttc tgg aaa gat atg gta tag 1857 Leu Ile Phe His Lys Pro Ser Tyr Phe Trp Lys Asp Met Val 545 550 555 caaaagcagc tgaaatatgc tggctggagt gaggaaaaaa atcgtccagg gagcattttc 1917 ctccatcgca gtgttcaagg ccatccttcc ctgtctgcca gggccagtct tgacgagtgt 1977 gaagcttcct tggcttttac tgaagccttt cttttggagg tattcaatat cctttgcctc 2037 aaggacttcg gcagatactg tctctttcat gagtttttcc cagctacacc tttctccttt 2097 gtactttgtg cttgtatagg ttttaaagac ctgacacctt tcataatctt 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gagtggcatg 2997 cttttgccct atcgtggaat ttacacatca gaatgtgcag gatccaagtc tgaaagtgtt 3057 gccacccgtc acacaacatg ggctttgttt gcttattcca tgaagcagca gctatagacc 3117 ttaccatgga aacatgaaga gaccctgcac ccctttcctt aaggattgct gcaagagtta 3177 cctgttgagc aggattgact ggtgatgttt cattctgacc ttgtcccaag ctctccatct 3237 ctagatctgg ggactgactg ttgagctgat ggggaaagaa aagctctcac acaaaccgga 3297 agccaaatgt cccctatctc ttgaatgatc aagtcacttt tgacaacatc caggtgaata 3357 taaaaactta ataaagctgt ggaaaggaac tcttaatctt cttttctgct acttaggtta 3417 aat 3420 <210> 2 <211> 556 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Ser Pro Ser His Glu Pro Lys Gly Leu Leu Tyr Leu Cys Phe Leu 1 5 10 15 Glu Asp Leu Ser His Gly Asp Gly Pro Gln Gln Ala Glu Ala Gly Gly 20 25 30 Gly Lys Asp Glu Glu Arg Gly Gly Lys Gln Lys Leu Leu Leu Met Glu 35 40 45 Asp Thr Lys Glu Ser Asn Val Lys Thr Phe Cys Ser Lys Asn Ile Leu 50 55 60 Ala Ile Leu Gly Phe Ser Ser Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu Leu Ala 65 70 75 80 Val Gly Leu Thr Gln Asn Lys Ala Leu Pro Glu Asn Val Lys Tyr Gly 85 90 95 Ile Val Leu Asp Ala Gly Ser Ser His Thr Ser Leu Tyr Ile Tyr Lys 100 105 110 Trp Pro Ala Glu Lys Glu Asn Asp Thr Gly Val Val His Gln Val Glu 115 120 125 Glu Cys Arg Val Lys Gly Pro Gly Ile Ser Lys Phe Val Gln Lys Val 130 135 140 Asn Glu Ile Gly Ile Tyr Leu Thr Asp Cys Met Glu Arg Ala Arg Glu 145 150 155 160 Val Ile Pro Arg Ser Gln His Gln Glu Thr Pro Val Tyr Leu Gly Ala 165 170 175 Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Arg Met Glu Ser Glu Glu Leu Ala Asp 180 185 190 Arg Val Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Leu Ser Asn Tyr Pro Phe Asp 195 200 205 Phe Gln Gly Ala Arg Ile Ile Thr Gly Gln Glu Glu Gly Ala Tyr Gly 210 215 220 Trp Ile Thr Ile Asn Tyr Leu Leu Gly Lys Phe Ser Gln Lys Thr Arg 225 230 235 240 Trp Phe Ser Ile Val Pro Tyr Glu Thr Asn Asn Gln Glu Thr Phe Gly 245 250 255 Ala Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln Val Thr Phe Val Pro Gln 260 265 270 Asn Gln Thr Ile Glu Ser Pro Asp Asn Ala Leu Gln Phe Arg Leu Tyr 275 280 285 Gly Lys Asp Tyr Asn Val Tyr Thr His Ser Phe Leu Cys Tyr Gly Lys 290 295 300 Asp Gln Ala Leu Trp Gln Lys Leu Ala Lys Asp Ile Gln Val Ala Ser 305 310 315 320 Asn Glu Ile Leu Arg Asp Pro Cys Phe His Pro Gly Tyr Lys Lys Val 325 330 335 Val Asn Val Ser Asp Leu Tyr Lys Thr Pro Cys Thr Lys Arg Phe Glu 340 345 350 Met Thr Leu Pro Phe Gln Gln Phe Glu Ile Gln Gly Ile Gly Asn Tyr 355 360 365 Gln Gln Cys His Gln Ser Ile Leu Glu Leu Phe Asn Thr Ser Tyr Cys 370 375 380 Pro Tyr Ser Gln Cys Ala Phe Asn Gly Ile Phe Leu Pro Pro Leu Gln 385 390 395 400 Gly Asp Phe Gly Ala Phe Ser Ala Phe Tyr Phe Val Met Lys Phe Leu 405 410 415 Asn Leu Thr Ser Glu Lys Val Ser Gln Glu Lys Val Thr Glu Met Met 420 425 430 Lys Lys Phe Cys Ala Gln Pro Trp Glu Glu Ile Lys Thr Ser Tyr Ala 435 440 445 Gly Val Lys Glu Lys Tyr Leu Ser Glu Tyr Cys Phe Ser Gly Thr Tyr 450 455 460 Ile Leu Ser Leu Leu Leu Gln Gly Tyr His Phe Thr Ala Asp Ser Trp 465 470 475 480 Glu His Ile His Phe Ile Gly Lys Ile Gln Gly Ser Asp Ala Gly Trp 485 490 495 Thr Leu Gly Tyr Met Leu Asn Leu Thr Asn Met Ile Pro Ala Glu Gln 500 505 510 Pro Leu Ser Thr Pro Leu Ser His Ser Thr Tyr Val Phe Leu Met Val 515 520 525 Leu Phe Ser Leu Val Leu Phe Thr Val Ala Ile Ile Gly Leu Leu Ile 530 535 540 Phe His Lys Pro Ser Tyr Phe Trp Lys Asp Met Val 545 550 555 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 3 gtttgtgtga gagctt 16 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 4 cacttacgtt cactacc 17 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 5 ggcgaaattg caga 14 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 6 ctccagcgta agat 14 <210> 7 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 7 ttgaacactg cgat 14 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 8 gccataggca ccttc 15 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 9 ctatgctgaa ccacc 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 10 tgtagaggct ccccc 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 11 ttgcagagca ttatc 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 12 aggcgaaatt gcaga 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 13 tagacattgt agtcc 15 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 14 gagtgcctga tcctt 15 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 15 aatccccctg gagtg 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 16 agcgtaagat gtttt 15 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 17 actccagcgt aagat 15 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 18 tgatagcctt gcaga 15 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 19 agtccagccg gcgtc 15 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 20 ggacaatggt tgctc 15 <210> 21 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 21 cttgaacact gcgat 15 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 22 gagtacaact gaacc 15 <210> 23 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 23 gtaagccctg atgtt 15 <210> 24 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 24 tatggtacag ttggt 15 <210> 25 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 25 ctgactgaat ttgccc 16 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 26 actatgctga accacc 16 <210> 27 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 27 gactatgctg aaccac 16 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 28 gaggcgaaat tgcaga 16 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 29 agagtgcctg atcctt 16 <210> 30 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 30 gatagtttcc aatacc 16 <210> 31 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 31 tactccagcg taagat 16 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 32 atgtagccca aagtcc 16 <210> 33 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 33 catgtagccc aaagtc 16 <210> 34 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 34 ggacaatggt tgctca 16 <210> 35 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 35 agcctatgat ggccac 16 <210> 36 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 36 gccttgaaca ctgcga 16 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 37 accctgagtt gtaact 16 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 38 aggatagtct tgtctc 16 <210> 39 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 39 cctacccagg atagtc 16 <210> 40 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 40 ccctctcact aaatta 16 <210> 41 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 41 actccacact aatgct 16 <210> 42 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 42 gtcaatcctg ctcaac 16 <210> 43 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 43 cagtcaatcc tgctca 16 <210> 44 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 44 cttgccatag aggcgaa 17 <210> 45 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 45 tgccagagtg cctgatc 17 <210> 46 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 46 acgttcacta ccttctt 17 <210> 47 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 47 ttacgttcac taccttc 17 <210> 48 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 48 aaggtcactt acgttca 17 <210> 49 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 49 gccccaaaat ccccctg 17 <210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 50 gagagaatgt aggtacc 17 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 51 ccctggatct tgccaat 17 <210> 52 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) sequence <400> 52 aaagtccagc cggcgtc 17 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> negative control sequence <400> 53 cgtttaggct atgtactt 18 <210> 54 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 54 agtaatccac ccatag 16 <210> 55 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 55 agtaatccac ccata 15 <210> 56 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 56 gatccaaagc gccaa 15 <210> 57 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 57 gttcgtagtc tccag 15 <210> 58 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 58 ctgttcgtag tctcc 15 <210> 59 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 59 ggtggcactg ttcgt 15 <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 60 gttatagcct tgcag 15 <210> 61 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 61 cacattagct gcacg 15 <210> 62 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 62 cctagttgtg tatac 15 <210> 63 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 63 gtacaggttg gtgtga 16 <210> 64 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 64 ccacttgtag atgtac 16 <210> 65 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 65 gcccagcaga tagtta 16 <210> 66 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 66 agatccaaag cgccaa 16 <210> 67 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 67 cactgttcgt agtctc 16 <210> 68 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 68 tggcactgtt cgtagt 16 <210> 69 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 69 ggtacttctc ctttac 16 <210> 70 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 70 agttatagcc ttgcag 16 <210> 71 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 71 cgttgctgtc tttgat 16 <210> 72 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 72 gctatactgc ctcttt 16 <210> 73 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 73 agcattttgg catcac 16 <210> 74 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 74 cctagttgtg tatact 16 <210> 75 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 75 acatttctta ctcgtt 16 <210> 76 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 76 gacctttcac ttggcat 17 <210> 77 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 77 cccagcagat agttaat 17 <210> 78 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 78 gcccagcaga tagttaa 17 <210> 79 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 79 atccaaagcg ccaaagg 17 <210> 80 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 80 tcgtagtctc cagtgcc 17 <210> 81 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 81 ttcgtagtct ccagtgc 17 <210> 82 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 82 tgttcgtagt ctccagt 17 <210> 83 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 83 ggtggcactg ttcgtag 17 <210> 84 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 84 cgttgctgtc tttgatc 17 <210> 85 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 85 gctatactgc ctctttc 17 <210> 86 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (antisense) sequence <400> 86 tacatttctt actcgtt 17 <210> 87 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> negative control sequence <400> 87 cgtttaggct atgtactt 18 <210> 88 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) <400> 88 agagtgcctg atcctt 16 <210> 89 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) <400> 89 tacgttcact accttct 17 <210> 90 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) <400> 90 gccctgatgt ttgaat 16 <210> 91 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) <400> 91 tagtaagccc tgatg 15 <210> 92 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) <400> 92 gtttgtgtga gagcttt 17 <210> 93 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) <400> 93 tttgtgtgag agctt 15 <210> 94 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) <400> 94 ggtttgtgtg agagctt 17 <210> 95 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) <400> 95 ggtttgtgtg agagct 16 <210> 96 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) <400> 96 gtttgtgtga gagct 15 <210> 97 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA (Antisense) <400> 97 ggtttgtgtg agagc 15 <210> 98 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S6 control sequence <400> 98 tctatcgtga tgtttct 17

Claims (16)

12 내지 18개의 뉴클레오타이드를 포함하는 면역 억제-복구 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 최소 하나의 뉴클레오타이드가 변형되고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제l서열(인간)의 엑토뉴클레오티다제(NTPdase) CD39의 핵산서열과 혼성화되며,
상기 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제3서열, 서열목록 제4서열, 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열, 서열목록 제7서열, 서열목록 제8서열, 서열목록 제9서열, 서열목록 제10서열, 서열목록 제11서열, 서열목록 제12서열, 서열목록 제13서열, 서열목록 제14서열, 서열목록 제15서열, 서열목록 제16서열, 서열목록 제17서열, 서열목록 제18서열, 서열목록 제19서열, 서열목록 제20서열, 서열목록 제21서열, 서열목록 제22서열, 서열목록 제23서열, 서열목록 제24서열, 서열목록 제25서열, 서열목록 제26서열, 서열목록 제27서열, 서열목록 제28서열, 서열목록 제29서열, 서열목록 제30서열, 서열목록 제31서열, 서열목록 제32서열, 서열목록 제33서열, 서열목록 제34서열, 서열목록 제35서열, 서열목록 제36서열, 서열목록 제37서열, 서열목록 제38서열, 서열목록 제39서열, 서열목록 제40서열, 서열목록 제41서열, 서열목록 제42서열, 서열목록 제43서열, 서열목록 제44서열, 서열목록 제45서열, 서열목록 제46서열, 서열목록 제47서열, 서열목록 제48서열, 서열목록 제49서열, 서열목록 제50서열, 서열목록 제51서열, 서열목록 제52서열, 서열목록 제88서열, 서열목록 제89서열, 서열목록 제90서열, 서열목록 제91서열, 서열목록 제92서열, 서열목록 제93서열, 서열목록 제94서열, 서열목록 제95서열, 서열목록 제96서열, 서열목록 제97서열 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하고,
상기 변형된 뉴클레오타이드는 LNA, cET, ENA, 2'플루오로 변형 뉴클레오타이드, 2'O-메틸 변형 뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 가교핵산으로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드.
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제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는
+G*+T*+T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T*+T (A04040H),
+C*+A*+C*T*T*A*C*G*T*T*C*A*C*T*+A*+C*+C (A04045H),
+G*+G*+C*G*A*A*A*T*T*G*C*+A*+G*+A (A04001H),
+C*+T*+C*C*A*G*C*G*T*A*A*G*+A*+T (A04002H),
+T*+T*+G*A*A*C*A*C*T*G*C*+G*+A*+T (A04003H),
+G*+C*C*A*T*A*G*G*C*A*C*C*+T*+T*+C (A04004H),
+C*+T*+A*T*G*C*T*G*A*A*C*C*+A*+C*+C (A04005H),
+T*G*+T*A*G*A*G*G*C*T*C*C*C*+C*+C(A04006H),
+T*+T*+G*C*A*G*A*G*C*A*T*T*+A*+T*+C(A04007H),
+A*+G*+G*C*G*A*A*A*T*T*G*C*+A*+G*+A(A04008H),
+T*+A*G*A*C*A*T*T*G*T*A*G*+T*+C*+C(A04009H),
+G*+A*G*T*G*C*C*T*G*A*T*C*C*+T*+T(A04010H),
+A*+A*+T*C*C*C*C*C*T*G*G*A*+G*+T*+G(A04011H),
+A*+G*+C*G*T*A*A*G*A*T*G*T*+T*+T*+T(A04012H),
+A*+C*+T*C*C*A*G*C*G*T*A*A*+G*+A*+T(A04013H),
+T*+G*+A*T*A*G*C*C*T*T*G*C*+A*+G*+A(A04014H),
+A*+G*T*C*C*A*G*C*C*G*G*C*G*T*+C (A04015H),
+G*G*+A*C*A*A*T*G*G*T*T*G*+C*+T*+C(A04016H),
+C*+T*+T*G*A*A*C*A*C*T*G*C*+G*+A*+T(A04017H),
+G*+A*G*T*A*C*A*A*C*T*G*A*+A*+C*+C(A04018H),
+G*+T*+A*A*G*C*C*C*T*G*A*T*+G*+T*+T(A04019H),
+T*+A*+T*G*G*T*A*C*A*G*T*+T*G*+G*+T(A04020H),
+C*+T*+G*A*C*T*G*A*A*T*T*T*G*+C*+C*+C(A04021HM),
+A*+C*+T*A*T*G*C*T*G*A*A*C*C*A*+C*+C(A04022HM),
+G*+A*C*T*A*T*G*C*T*G*A*A*C*+C*+A*+C(A04023HM),
+G*+A*+G*G*C*G*A*A*A*T*T*G*C*A*+G*+A(A04024HM),
+A*+G*A*G*T*G*C*C*T*G*A*T*C*C*+T*+T(A04025H),
+G*+A*+T*A*G*T*T*T*C*C*A*A*T*+A*+C*+C(A04026H),
+T*+A*+C*T*C*C*A*G*C*G*T*A*A*+G*+A*+T(A04027H),
+A*+T*+G*T*A*G*C*C*C*A*A*A*G*T*+C*+C(A04028H),
+C*+A*+T*G*T*A*G*C*C*C*A*A*A*+G*+T*+C(A04029H),
+G*+G*+A*C*A*A*T*G*G*T*T*G*C*+T*C*+A(A04030H),
+A*+G*+C*C*T*A*T*G*A*T*G*G*C*C*+A*+C(A04031H),
+G*+C*+C*T*T*G*A*A*C*A*C*T*G*C*+G*+A(A04032H),
+A*+C*C*C*T*G*A*G*T*T*G*T*A*A*C*+T(A04033H),
+A*+G*G*A*T*A*G*T*C*T*T*G*T*C*+T*+C(A04034H),
+C*C*T*A*C*C*C*A*G*G*A*T*A*G*+T*+C(A04035H),
+C*+C*+C*T*C*T*C*A*C*T*A*A*A*+T*+T*+A(A04036H),
+A*+C*+T*C*C*A*C*A*C*T*A*A*T*+G*+C*+T(A04037H),
+G*T*+C*A*A*T*C*C*T*G*C*T*C*A*+A*+C(A04038H),
+C*+A*+G*T*C*A*A*T*C*C*T*G*C*+T*+C*+A(A04039H),
+C*T*+T*G*C*C*A*T*A*G*A*G*G*C*+G*A*+A(A04041HM),
+T*+G*+C*C*A*G*A*G*T*G*C*C*T*G*+A*+T*+C(A04042H),
+A*+C*+G*T*T*C*A*C*T*A*C*C*T*T*+C*+T*+T (A04043H),
+T*+T*+A*C*G*T*T*C*A*C*T*A*C*C*+T*+T*+C (A04044H),
+A*+A*+G*G*T*C*A*C*T*T*A*C*G*T*+T*+C*+A (A04046H),
+G*+C*+C*C*C*A*A*A*A*T*C*C*C*C*+C*+T*+G (A04047H),
+G*+A*+G*A*G*A*A*T*G*T*A*G*G*T*+A*C*+C (A04048H),
+C*+C*C*T*G*G*A*T*C*T*T*G*C*C*+A*+A*+T (A04049H),
+A*+A*+A*G*T*C*C*A*G*C*C*G*G*C*G*+T*+C (A04050H),
+A*+G*+A*G*T*G*C*C*T*G*A*T*C*+C*+T*+T (A04051H),
+T+A*+C*G*T*T*C*A*C*T*A*C*C*T*+T*+C*+T (A04052H),
+T*+A*+C*G*T*T*C*A*C*T*A*C*C*T*+T*C*+T (A04053H),
+G*+C*+C*C*T*G*A*T*G*T*T*T*G*+A*+A*+T (A04054H) ,
+T*+A*+G*T*A*A*G*C*C*C*T*G*+A*+T*+G (A04055H),
+G*+T*+T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T*+T*+T (A04056H),
+T*+T*+T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*+C*+T*+T (A04058H),
+G*+G*+T*T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T*+T (A04059H),
+G*+G*+T*T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T (A04060H),
+G*+T*+T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T (A04061H),
+G*G*+T*T*T*G*T*G*T*G*A*G*+A*G*+C (A04062H) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, +은 LNA 뉴클레오타이드를 나타내고 *는 뉴클레오타이드 간의 포스포로티오에이트(PTO) 결합을 나타내는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 나노몰 농도에서 CD39의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
제 1 항의 면역 억제-복구 올리고뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 및 이들의 조합을 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 질환은 자가면역 질환; 면역 질환; 심혈관 질환; 염증성 질환; 박테리아, 바이러스 또는 진균의 감염; 간 질환; 만성 신장 질환; 정신과 질환; 및 암인 약제학적 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 화학요법제, 다른 올리고뉴클레오타이드, 항체, 저분자 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 다른 올리고뉴클레오타이드, 항체 또는 저분자는 면역 억제인자 또는 면역 촉진인자를 억제하거나 자극하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 면역 억제인자는 IDOl, ID02, CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, VISTA, A2AR, CD39, CD73, STAT3, TD02, TIM-3, TIGIT, TGF-beta, BTLA, MICA, NKG2A, KIR, CD160, Chop, Xbpl 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 면역 촉진인자는 4-1BB, Ox40, KIR, GITR, CD27, 2B4 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
질환의 예방 또는 치료용 제 1 항의 면역 억제-복구 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 질환은 자가면역 질환; 면역 질환; 심혈관 질환; 염증성 질환; 박테리아, 바이러스 또는 진균의 감염; 간 질환; 만성 신장 질환; 정신과 질환; 및 암인 면역 억제-복구 올리고뉴클레오타이드.
삭제
제 6 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 악성 흑색종, 림프종, 피부암, 뼈암, 전립선암, 간암, 뇌암, 후두암, 담낭, 췌장, 고환, 직장, 부갑상선, 갑상선, 부신, 신경조직, 두경부, 대장, 위, 기관지, 신장, 기저세포암종, 편평세포암종, 피부전이암, 골육종, 유잉(Ewing) 육종, 세망세포 육종, 지방육종, 골수종, 거대세포 종양, 소세포 폐 종양, 섬세포 종양, 원발성 뇌종양, 수막종, 급성 및 만성 림프구 및 과립형백혈구 종양, 급성 및 만성 골수백혈병, 모발상세포 종양, 선종, 과증식증, 수질암종, 장 신경절신경세포종, 빌름스(Wilm) 종양, 정상피종, 난소 종양, 평활근종, 자궁경부 이형증, 망막아종, 연부조직 육종, 악성유암종, 국부성 피부손상, 횡문근육종, 카포시(Kaposi) 육종, 골원성 육종, 악성 고칼슘혈증, 신장세포 종양, 진성 적혈구 증가, 선암, 역행성 성상세포종, 다형성 교아종, 백혈병 또는 표피세포암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 투여에 적합한 것으로 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 악성 흑색종, 림프종, 피부암, 뼈암, 전립선암, 간암, 뇌암, 후두암, 담낭, 췌장, 고환, 직장, 부갑상선, 갑상선, 부신, 신경조직, 두경부, 대장, 위, 기관지, 신장, 기저세포암종, 편평세포암종, 피부전이암, 골육종, 유잉(Ewing) 육종, 세망세포 육종, 지방육종, 골수종, 거대세포 종양, 소세포 폐 종양, 섬세포 종양, 원발성 뇌종양, 수막종, 급성 및 만성 림프구 및 과립형백혈구 종양, 급성 및 만성 골수백혈병, 모발상세포 종양, 선종, 과증식증, 수질암종, 장 신경절신경세포종, 빌름스(Wilm) 종양, 정상피종, 난소 종양, 평활근종, 자궁경부 이형증, 망막아종, 연부조직 육종, 악성유암종, 국부성 피부손상, 횡문근육종, 카포시(Kaposi) 육종, 골원성 육종, 악성 고칼슘혈증, 신장세포 종양, 진성 적혈구 증가, 선암, 역행성 성상세포종, 다형성 교아종, 백혈병 또는 표피세포암인 것을 특징으로 하는 면역억제-복구 올리고뉴클레오타이드.
제 15 항에 있어서, 상기 면역억제-복구 올리고뉴클레오타이드는 국소 또는 전신 투여에 적합한 것으로 특징으로 하는 면역억제-복구 올리고뉴클레오타이드.
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