CN110168089A - 抑制cd39表达的免疫抑制恢复寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含12至18个核苷酸的免疫抑制恢复寡核苷酸，其中至少一个核苷酸被修饰，并且该寡核苷酸与SEQ ID NO.1(人)的外核苷酶(NTPdase；CD73)的核酸序列杂交，其中该寡核苷酸抑制至少50％的CD39表达。本发明还涉及包含这种寡核苷酸的药物组合物。

Description

抑制CD39表达的免疫抑制恢复寡核苷酸
技术领域
本公开涉及与外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(ENTPD1或CD39)的核酸序列杂交的免疫抑制恢复寡核苷酸，以及包含这种免疫抑制恢复寡核苷酸和药用载体、赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。
背景技术
近年来，通过应用免疫疗法，特别是通过所谓的“免疫检查点”的抑制剂，对如恶性肿瘤的几种不同疾病的治疗非常成功。这些检查点是免疫系统中的分子，其上调(共刺激分子)或下调信号。治疗方法的概念基于内源性抗肿瘤免疫反应的激活。例如，许多癌症分别通过抑制T细胞和NK细胞活性来保护自己免受免疫系统的侵害。免疫检查点调节剂，即刺激剂或抑制剂，例如针对CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR、BTLA、IDO、CD39、CD73、STAT3、TDO2、TIM-3、MICA、NKG2A、KIR、TIGIT、TGF-β、Ox40、GITR、CD27、CD160、2B4和4-1Bb中的一种或多种。
CD39需要被认为是改进对不同类型癌症的免疫力的一种新颖且有前景的候选物。CD39是一种外核苷酶(NTPdase)，负责将ATP转化为ADP，和将ADP转化为AMP。其与外核苷酶CD73协同作用，CD73将AMP降解为免疫抑制性腺苷。
CD39在不同的免疫细胞上广泛表达为单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、树状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)的一些亚群和T细胞。主要是T reg细胞突出表达CD39和CD73，使它们能够产生腺苷以抑制T细胞反应。此外，已经在许多不同的肿瘤(实体和血液肿瘤)和肿瘤相关免疫细胞中发现了增强的CD39表达水平。例如，在黑色素瘤中，已经在黑色素细胞上研究了增加的CD39表达，并且发现其与它们分化成恶性细胞有关。此外，在来自肾、肺、睾丸、甲状腺肿瘤以及淋巴瘤的癌细胞上研究了增强的CD39 mRNA和蛋白质水平。不同肿瘤中的这些增加的CD39的表达水平强烈表明该外核苷酶在肿瘤诱发、生长和免疫抑制微环境介导中的重要作用。
垂死的癌细胞将ATP释放到肿瘤微环境中的细胞外空间。由于免疫抑制性腺苷的产生，活肿瘤细胞可从ATP中获益。由此，肿瘤细胞能够进行不受控制的增殖和扩增。如上所述，不同的肿瘤细胞或肿瘤相关的免疫细胞显示出有效的CD39和CD73表达，导致肿瘤微环境中腺苷水平的增加。通过与淋巴细胞上的A2A或A2B受体结合，腺苷介导对这些细胞的免疫抑制信号。例如，T细胞的增殖、细胞毒性细胞因子产生和激活受到抑制。NK细胞显示出降低的细胞毒性潜力。腺苷诱导巨噬细胞中的替代激活(免疫抑制性M2表型)，导致促炎性细胞因子产生减少，但免疫抑制性细胞因子IL-10的产生增加。CD39作为相关治疗靶标在不同肿瘤中的重要作用由以下事实强调：使用CD39和CD73敲除小鼠的肿瘤模型显示出改善的疾病结果。
然而，CD39的抑制很可能比单独CD73的抑制更有效，以增强抗肿瘤免疫应答。一方面，因为CD39的阻断会导致肿瘤微环境中腺苷水平降低。另一方面，肿瘤微环境中的高ATP水平可以充当DC、巨噬细胞及其介导免疫刺激信号的前体的“发现我”信号。
ATP与DC上的P2X7受体结合并激活它们以释放促炎细胞因子如IL-1β或IL-28。这些细胞因子转而激活NK细胞、T细胞和巨噬细胞并增强它们的增殖、细胞毒性和成熟。因此，T细胞受体(TCR)的参与导致T细胞激活期间的ATP释放。该ATP可以通过P2X受体以自分泌的方式起作用，以增强TCR触发的激活和IL-2的产生。相同的ATP可能通过P2X受体以旁分泌的方式作用于邻近的淋巴细胞，以抑制它们在淋巴结中的运动，从而增强T细胞和APC之间的相互作用。总之，增加肿瘤微环境中的ATP水平为启动最佳抗肿瘤免疫应答设定了完美条件。
为了阻断CD39外核苷酶活性，抗人CD39单克隆抗体如IPH52(Bastid et,al,CancerImmunology Research,2014)和OREG-103/BY40(Bennefoy et,al,OncoImmunology4:5,2015)目前正在进行临床前研究，其导致动物模型的预期寿命延长。然而，由于空间位阻，这些单克隆抗体可能无法定位于肿瘤微环境。此外，CD39的小分子抑制剂如ARL67156(OncoImmunology1:3；2012)和POM-1(Gastroenterology；2010；139(3):1030-1040)已经在动物模型中体外和体内测试，导致肿瘤生长减少。然而，这些小分子由于其低活性和体内半衰期短而必须以高剂量和高频率给予。
免疫疗法已经导致长期缓解，但到目前为止只对小患者群体。原因可能是许多免疫检查点和可选的其它免疫抑制机制参与例如免疫系统和肿瘤细胞之间的相互作用。免疫检查点和潜在的其它机制的组合可以根据肿瘤和受试者的个体状况而不同，以逃避身体的防御。
为了抑制几种免疫抑制机制，使用抗体和/或小分子的常用方法不适合或几乎不适合，因为分子靶标位于细胞内或不具有酶活性。因此，安全有效地抑制如CD39的“免疫检查点”功能的药剂将是治疗患有例如由该酶活性影响的疾病或病症的患者的重要补充。
本发明的寡核苷酸分别在抑制CD39的表达和活性方面非常成功。寡核苷酸的作用方式不同于抗体或小分子的作用方式，并且寡核苷酸对于例如以下是非常有利的
(i)肿瘤组织在实体肿瘤中的渗透，
(ii)分别阻断靶标的多项功能和活动，
(iii)寡核苷酸彼此或与抗体或小分子的组合，和
(iv)抑制对于抗体是不可接近的或通过小分子可抑制的细胞内效果。
因此，通过反义寡核苷酸在mRNA水平上靶向癌症和免疫细胞上的CD39表达是开发和改进例如分别针对不同癌症和免疫疾病的免疫疗法的有前景的最新技术方法。
发明内容
本发明涉及寡核苷酸，如包含约10至20个核苷酸的免疫抑制恢复(immunosuppression-reverting)寡核苷酸，其中至少一个核苷酸被修饰。寡核苷酸与例如SEQ ID NO.1(人)的外核苷酶CD39的核酸序列和/或SEQ ID NO.2(小鼠/大鼠)的序列杂交。修饰的核苷酸例如选自由桥接核酸(例如，LNA、cET、ENA、2’氟修饰的核苷酸或2'O-甲基修饰的核苷酸，及它们的组合)组成的组。在一些实施方式中，寡核苷酸抑制至少50％的CD39表达，并且在一些实施方式中，寡核苷酸以纳摩尔浓度抑制CD39的表达。
与RNAi相比，反义寡核苷酸具有显着的优势。可以在体外转染反义寡核苷酸而不转染试剂，因此与使用专门转染RNAi的转染试剂的转染相比，该转染更接近体内条件。在不同组织中体内全身给予反义寡核苷酸是可能的，而体内给予RNAi依赖于递送系统，如GalNAc，例如在肝脏中。此外，反义寡核苷酸比RNAi短，因此在合成和吸收入细胞方面较不复杂。RNAi规律地显示同样可以启动RNAi的随从链的脱靶(off-target)效果。随从链RISC加载是RNAi药物的重要问题，因为随从链可能将RNAi活性导向非预期的靶标，导致毒副作用。“(参见Chackalamannil,Rotella,Ward,Comprehensive Modicinal Chemistry IIIElsevier,03.06.2017)。反义寡核苷酸不包含随从链。
本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的免疫抑制恢复寡核苷酸和可选的药用载体、赋形剂和/或稀释剂。在一些实施方式中，该药物组合物另外包含化学治疗剂，如铂或吉西他滨，另一种寡核苷酸、抗体或其片段，例如Fab片段、HERA融合蛋白、配体陷阱、纳米抗体、BiTe和/或例如在肿瘤治疗中有效的小分子，及它们的组合。
在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸与另一种寡核苷酸、抗体和/或小分子组合，这些化合物中的每一种在药物组合物中分离或组合，其中寡核苷酸、抗体或其片段如Fab片段、HERA融合蛋白、配体陷阱，纳米抗体、BiTe和/或小分子抑制或刺激免疫抑制因子，如IDO1、IDO2、CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR,CD39、CD73、STAT3,TDO2、TIM-3、TIGIT、TGF-β、BTLA、MICA、NKG2A、KIR、CD160、Chop和/或Xbp1。另外或可替代地，寡核苷酸、抗体和/或小分子抑制或刺激免疫刺激因子，例如4-1BB、Ox40、KIR、GITR、CD27和/或2B4。
此外，本发明涉及本发明的寡核苷酸或药物组合物在预防和/或治疗其中涉及CD39失衡的疾病的方法中的用途。在一些实施方式中，该病症是例如自身免疫病症，例如自身免疫性关节炎或胃肠道自身免疫疾病，例如炎性肠病(IBD)或结肠炎、免疫病症，例如由于慢性病毒感染如HIV感染引起的免疫衰竭、心血管疾病、炎性疾病，例如慢性气道炎症、细菌、病毒和/或真菌感染，例如败血症或牛结核分支杆菌(Mycobacterium bovis)感染、肝脏疾病、慢性肾病、精神疾病和/或癌症。在一些实施方式中，例如局部或全身给予本发明的寡核苷酸或药物组合物。
本文引用或参考的所有文件(“本文引用的文件”)，以及本文引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文或本文通过引证并入的任何文件提及的任何产品的任何制造商的说明、描述、产品规格和产品说明书，并且可以用于本发明的实践中。更具体地，所有参考文件通过引用并入，其程度如同每个单独的文件被具体和单独地指出通过引证并入。
附图说明
图1描绘了hCD39反义寡核苷酸结合位点在SEQ ID No.1的hCD39 mRNA(NM_001776.5)上的分布以及它们的修饰和长度。将hCD39反义寡核苷酸与SEQ ID No.1的hCD39mRNA序列比对。不同的灰度表示不同的LNA修饰，且符号表示反义寡核苷酸的不同长度。
图2A至2D描述了hCD39反义寡核苷酸在人癌细胞系HRLM-2(人霍奇金淋巴瘤)中在第一轮和第二轮筛选(图2A(部分1和2)和2B(部分1和2))中和在A-172(人胶质母细胞瘤)中在第一轮和第二轮筛选中(图2C(部分1和2)和2D(部分1和2))的hCD39 mRNA敲除效力。用10μM的各自的反义寡核苷酸处理HDLM-2和A-172细胞3天。作为阴性对照，用neg1处理细胞，neg1是具有序列CGTTTAGGCTATGTACTT的反义寡核苷酸(描述于WO2014154843 A1中)。描绘了相对于未处理细胞的残留的hCD39 mRNA表达。将表达值归一化至管家基因HPRT1的表达。描绘的是一式三份的孔的平均值+/-SD。
图3显示了反义寡核苷酸在HDLM-2和A-172细胞中的功效的相关性分析。
图4显示了在HDLM-2细胞中选择的hCD39反义寡核苷酸的浓度依赖性hCD39 mRNA敲除，选择的hCD39反义寡核苷酸是A04019H(SEQ ID No.23)、A04033H(SEQ ID No.37)、A04039H(SEQ ID No.43)、A04040H(SEQ ID No.3)、A04042H(SEQ ID No.45)、A04044H(SEQID No.47)和A04045H(SEQ ID No.4)。用指定浓度的相应反义寡核苷酸处理HDLM-2细胞3天。描绘了与未处理的对照细胞相比残留的hCD39表达。hCD39mRNA表达值归一化至管家基因HPRT1的表达。浓度依赖性靶标敲除用于计算表8中所示的IC50值。
图5显示了在HDLM-2细胞中进一步选择的hCD39反义寡核苷酸的浓度依赖性hCD39mRNA敲除，进一步选择的hCD39反义寡核苷酸是A04010H(SEQ ID No.14)、A04016H(SEQ ID No.20)、A04017H(SEQ ID No.21)、A04019H(SEQ ID No.23)、A04020H(SEQ IDNo.24)和A04026H(SEQ ID No.30)。在第一轮和第二轮筛选中显示出有效活性的反义寡核苷酸A04040H(SEQ ID No.3)用作参考。用指定浓度的相应反义寡核苷酸处理HDLM-2细胞3天。将hCD39 mRNA表达值归一化至管家基因HPRT1的表达。描绘了相对于未处理细胞(设定为100)的残留hCD39 mRNA表达。描绘的是一式三份的孔的平均值+/-SD。浓度依赖性靶标敲除用于计算表9中所示的IC50值。
图6显示了第三轮筛选，其中设计了另外的反义寡核苷酸。这些反义寡核苷酸基于来自第一轮和第二轮筛选的有效反义寡核苷酸。因此，在人癌细胞系HDLM-2(人霍奇金淋巴瘤)(图6A)和A-172(人胶质母细胞瘤)(图6B)中测试hCD39反义寡核苷酸。用10μM的相应的反义寡核苷酸处理HDLM-2和A-172细胞3天。在第一轮筛选中显示出有效活性的反义寡核苷酸A04019H、A04040H和A04042H用作参考。描绘了相对于未处理细胞(设定为1)的残留hCD39mRNA表达。
图7显示了在HDLM-2和A-172细胞中在第三轮筛选中进一步选择的hCD39反义寡核苷酸的浓度依赖性hCD39 mRNA敲除，进一步选择的hCD39反义寡核苷酸是A04051H(SEQ IDNo.88)、A04052H(SEQ ID No.89)、A04053H(SEQ ID No.89)、A04056H(SEQ ID No.92)、A04059H(SEQ ID No.94)、A04060H(SEQ ID No.95)和A04061H(SEQ ID No.96)。在第一轮和第二轮筛选中显示出有效活性的反义寡核苷酸A04040H(SEQ ID No.3)用作参考。用指定浓度的相应反义寡核苷酸处理HDLM-2细胞3天。将hCD39 mRNA表达值归一化至管家基因HPRT1的表达。描绘了相对于未处理细胞(设定为100)的残留hCD39 mRNA表达。描绘的是一式三份的孔的平均值+/-SD。浓度依赖性靶标敲除用于计算表12中所示的IC50值。
图8描绘了A04040H(SEQ ID No.3)和A04045H(SEQ ID No.4)的浓度和时间依赖性CD39蛋白质敲除。在用指定的反义寡核苷酸处理3、4和6天后，给出在HDML-2细胞中通过流式细胞术的CD39蛋白质表达的分析。作为处理对照，以指定浓度将细胞用neg1处理3、4和6天。描绘了与未处理的对照细胞(＝1)相比的相对表达。
图9显示了在抗CD3抗体存在下用10μM的hCD39特异性ASO A04040H(黑色柱)或对照寡核苷酸S6(白色柱)处理6天的原代人CD8+和CD4+T细胞。用抗CD3激活对照细胞，但未接受任何寡核苷酸处理(条纹柱)。此后，去除寡核苷酸和抗CD3，并在寡核苷酸去除后3天、6天和11天通过流式细胞术分析hCD39蛋白质表达。CD39蛋白质表达描绘为平均荧光强度(MFI)并通过从CD39的MFI减去非特异性同种型对照的MFI来计算。描绘的是一式二份的孔的平均值+/-SD。
图10A-10C描绘了hCD39敲除对JIYOYE细胞的活力和ATP浓度的影响。以5μM用指定的反义寡核苷酸A04040H(SEQ ID No.3)或neg1处理JIYOYE细胞共6天。在3天后用含有新鲜寡核苷酸的培养基替换培养基，并在第6天通过流式细胞术分析hCD39蛋白质敲除效力。描绘了与未处理的细胞相比，寡核苷酸处理的细胞的残留hCD39表达和活力(图10A-10B)。6天后，将20μM的CCD39小分子抑制剂ARL67156三钠盐加入到无ASO处理的细胞中，并在37℃下温育1小时。然后，将2μM的ATP加入到细胞或不含细胞的细胞培养基中，并在30分钟后使用ATP生物发光测定试剂盒(Roche)测定细胞上清液或细胞培养基的ATP浓度(图10C)。
图11A-11D显示了使用MACS从外周血分离的原代人CD8+T细胞的hCD39蛋白质的敲除(图11A)和活力(图11B)。通过结合至板的抗人CD3(OKT-3)激活CD8+T细胞。分别以5μM用RPMI-1640培养基、补充有A04040H(SEQ ID No.3)的培养基和补充有neg1的培养基处理激活的细胞共6天。3天后，分别用含有5μM的A04040H(SEQ ID No.3)和neg1的新鲜培养基替换培养基，并在第6天通过流式细胞术分析hCD39蛋白质敲除效力(图11A)和活力(图11B)。描绘了与未处理的细胞相比，残留的hCD39表达和活力(7-AAD阳性细胞的中值)(图11A-11B)。同一天，收获细胞，洗涤并以恒定的细胞数(150,000个细胞/孔，96孔板)重复涂板一式三份。然后，将2μM(图11C)或20μM(图11D)的ATP加入到细胞或不含细胞的细胞培养基中，并在30分钟后使用ATP生物发光测定试剂盒(Roche)测定细胞上清液或细胞培养基的ATP浓度。
图12A-12C描绘了用细胞增殖染料标记的人CD8+T细胞，用抗CD3激活并用5μM的反义寡核苷酸A04040H(黑色柱)或对照寡核苷酸S6(白色柱)处理5天的总处理时间。在载体对照(条纹柱)中，仅用抗CD3激活细胞。随后，在寡核苷酸处理开始后第3天和第4天将400μM的ATP或载体加入细胞中。此外，作为另外的对照，在第4天以20μM将小分子CD39-抑制剂ARL67156三钠盐加入细胞中，温育时间为24小时(格纹的柱)。在寡核苷酸处理开始后第5天，使用流式细胞术分析(图12A)CD39蛋白表达，(图12B)增殖和(图12C)CD8+T细胞的绝对细胞数。描绘的是一式三份的孔的平均值+/-SD。
图13显示了mCD39反义寡核苷酸结合位点在SEQ ID No.2(NM_001304721.1)的mCD39 mRNA上的分布以及它们的(一个或多个)修饰和长度。将mCD39反义寡核苷酸序列与mCD39 mRNA序列比对。不同的灰度表示不同的LNA修饰，且符号表示反义寡核苷酸的不同长度。
图14(部分1和2)显示了mCD39反义寡核苷酸在鼠癌细胞系A20(小鼠B细胞淋巴瘤)中的mCD39 mRNA敲除功效。用单剂量的10μM的相应的反义寡核苷酸处理A20细胞。作为阴性对照，用neg1处理细胞，neg1是具有序列CGTTTAGGCTATGTACTT的反义寡核苷酸。描绘了相对于未处理细胞的残留mCD39 mRNA表达。将表达值归一化至管家基因HPRT1的表达。
图15A和15B描绘了通过在第1、2、3、4、5、9、12、16和19天以25mg/kg或10mg/kg的剂量皮下注射A04011MR或阴性对照寡核苷酸neg1处理的C57BL/6小鼠的脾脏中的CD39 mRNA表达水平(5只小鼠/组)。将表达值归一化至管家基因HPRT1的表达值。
图16A和16B显示了相对于未处理小鼠的肿瘤，来自寡核苷酸处理的小鼠的肿瘤浸润调节T细胞(Tregs)(图16A)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)(图16B)的CD39蛋白表达。
图17显示了SEQ ID No.1的hCD39 mRNA(NM_001776.5)(pos：1-3420)。
具体实施方式
本发明首次提供了人和鼠寡核苷酸，其与外核苷酶CD39的mRNA序列杂交并分别抑制例如肿瘤细胞或肿瘤相关免疫细胞上的CD39的表达和活性。结果，ATP水平增加，且其降解产物如ADP、AMP和免疫抑制性腺苷水平降低。所有这些效果分别导致抗肿瘤免疫细胞增加，免疫激活(例如，通过细胞毒性T细胞或NK细胞)和肿瘤细胞的识别和消除。因此，本发明的寡核苷酸代表了用于预防和/或治疗其中CD39表达和活性分别增加的疾病的方法的感兴趣且高效的工具。
在下文中，将更详细地描述本发明的元素。这些元素与特定实施方式一起列出，然而，应该理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方式。不应将各种描述的实施例和实施方式解释为将本发明仅限于明确描述的实施方式。应该理解，该描述支持和包含将明确描述的实施方式与任何数量的公开元素组合的实施方式。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中的所有描述的元素的任何排列和组合应该被认为是由本申请的说明书公开。
在整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变体将被理解为暗示包括所述成员、整数或步骤，或成员、整数或步骤的组，但不排除任何其它成员、整数或步骤，或成员、整数或步骤的组。除非在本文中另有说明或上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中使用的术语“一个”和“一种”和“该”以及类似的指代(特别是在权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数。本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记法。除非本文另有说明，否则每个单独的值被并入说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对另外要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
本发明的寡核苷酸是例如反义寡核苷酸，其包含10至25个核苷酸、10至15个核苷酸、15至20个核苷酸、12至18个核苷酸或14至17个核苷酸或由其组成。例如，寡核苷酸包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个核苷酸或由其组成。本发明的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。修饰的核苷酸是例如，桥连核苷酸如锁核酸(LNA，例如，2’,4’-LNA)、cET、ENA、2'氟修饰的核苷酸、2'O-甲基修饰的核苷酸或它们的组合。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含具有相同或不同修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含修饰的磷酸酯主链，其中磷酸酯是例如硫代磷酸酯。
本发明的寡核苷酸在寡核苷酸的3'-末端和/或5'-末端和/或寡核苷酸内的任何位置包含一个或多个修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸在1、2、3、4、5或6个修饰的核苷酸的行中，或修饰的核苷酸与一个或多个未修饰的核苷酸组合。下表1、2和3给出了包含修饰的核苷酸的寡核苷酸的实施方式，例如由(+)表示的LNA和由(*)表示的硫代磷酸酯(PTO)。分别包含表1、2和3的序列由其组成的寡核苷酸可以包含任何其它修饰的核苷酸以及修饰的和未修饰的核苷酸的任何其它组合。表1的寡核苷酸与人CD39的mRNA杂交：
表1：与例如SEQ ID No.1的人CD39杂交的反义寡核苷酸列表；Neg1是代表阴性对照的反义寡核苷酸，其不与SEQ ID No.1的CD39杂交。
表2描述了在另一轮筛选中鉴定的与人CD39的mRNA杂交的其它反义寡核苷酸：
表2：与人CD39杂交的第二轮反义寡核苷酸的列表。neg 1和S6是没有与任何人mRNA互补的序列的对照反义寡核苷酸。
下表3显示了与大鼠或鼠CD39的mRNA杂交的寡核苷酸：
表3：与例如SEQ ID No.2的大鼠或鼠CD39杂交的反义寡核苷酸列表；Neg1是代表阴性对照的反义寡核苷酸，其不与SEQ ID No.2的CD39杂交。
本发明的寡核苷酸例如与SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2的人或鼠CD39的mRNA杂交。这种寡核苷酸称为CD39反义寡核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸在例如SEQ IDNo.1的CD39 mRNA的例如位置1000-1700或2500-3200内杂交。
在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸抑制至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CD39，例如人、大鼠或鼠CD39表达。因此，本发明的寡核苷酸是免疫抑制恢复寡核苷酸，其例如在细胞、组织、器官或受试者中恢复免疫抑制。本发明的寡核苷酸以纳摩尔或微摩尔浓度，例如0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950nM，或1、10或100μM的浓度抑制CD39的表达。
在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸以1、3、5、9、10、15、27、30、40、50、75、82、100、250、300、500或740nM，或1、2.2、3、5、6.6或10μM的浓度使用。
在一些实施方式中，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸和药用载体、赋形剂和/或稀释剂。在一些实施方式中，药物组合物还包含化学治疗剂、另一种寡核苷酸、抗体和/或小分子。
在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸或药物组合物用于预防和/或治疗病症的方法。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸或药物组合物用于预防和/或治疗病症的方法与放射疗法结合使用。放射疗法可以进一步与化学疗法(例如铂、吉西他滨)结合使用。该病症特征在于例如CD39失衡，即与正常健康细胞、组织、器官或受试者中的水平相比，CD39水平增加。CD39水平分别通过例如增加的CD39表达和活性而增加。CD39水平可以通过任何标准方法测量，例如本领域技术人员已知的免疫组织化学、蛋白质印迹、定量实时PCR或QuantiGene测定。
本发明的寡核苷酸或药物组合物局部或全身给予，例如口腔、舌下、经鼻、皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、瘤内、鞘内、透皮和/或直肠给予。可替换地或组合地，给予离体处理的免疫细胞。寡核苷酸单独给予或与本发明的另一种免疫抑制恢复寡核苷酸组合给予，并可选地与另一种化合物如另一种寡核苷酸、抗体或其片段如Fab片段、HERA融合蛋白、配体陷阱、纳米抗体、BiTe、小分子和/或化学治疗剂(例如铂、吉西他滨)组合给予。在一些实施方式中，其他的寡核苷酸(即，不是本发明的一部分)、抗体和/或小分子有效预防和/或治疗自身免疫性疾病，例如自身免疫性关节炎或胃肠道自身免疫疾病，如炎性肠病(IBD)或结肠炎、免疫疾病，例如由于慢性病毒感染如HIV感染引起的免疫衰竭、心血管疾病、炎性疾病例如慢性气道炎症、细菌、病毒和/或真菌感染，例如败血症或牛结核分支杆菌感染、肝脏疾病、慢性肾病、精神病症(例如，精神分裂症、双相情感障碍、阿尔茨海默病)和/或癌症。
本发明的寡核苷酸或药物组合物用于例如预防和/或治疗实体瘤或血液肿瘤的方法。通过使用本发明的寡核苷酸或药物组合物可预防和/或可治疗的癌症的实例是乳腺癌、肺癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、睾丸癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、网状细胞肉瘤、脂肪肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺肿瘤、胰岛细胞瘤、原发性脑肿瘤、脑膜瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞瘤、急性和慢性髓性白血病、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、肠神经节瘤、肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌瘤、宫颈非典型增生(dysplasia)、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌、局部皮损、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、骨原性肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、白血病或表皮样癌。
在一些实施方式中，本发明的两种或更多种寡核苷酸在同一时间点一起给予，例如在药物组合物中，或单独给予，或以交错的间隔给予。在其它实施方式中，本发明的一种或多种寡核苷酸与另一种化合物，如另一种寡核苷酸(即，不是本发明的一部分)、抗体、小分子和/或化学治疗剂，在同一时间点，例如在药物组合物中一起给予，或单独给予或以交错的间隔给予。在这些组合的一些实施方式中，免疫抑制恢复寡核苷酸分别抑制免疫抑制因子和其它寡核苷酸(即，不是本发明的一部分)，抗体或其片段如Fab片段、HERA融合蛋白、配体陷阱、纳米抗体、BiTe和/或其小分子抑制物(拮抗剂)或刺激物(激动剂)和/或另一种免疫抑制因子的表达和活性。免疫抑制因子和/或免疫刺激因子和/或免疫刺激因子。免疫抑制因子选自由例如IDO1、IDO2、CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR、CD39、CD73、STAT3,TDO2、TIM-3、TIGIT、TGF-β、BTLA、MICA、NKG2A、KIR、CD160、Chop、Xbp1和它们的组合组成的组。免疫刺激因子选自由例如4-1BB、Ox40、KIR、GITR、CD27、2B4和它们的组合组成的组。
免疫抑制因子是其表达和/或活性例如在细胞、组织、器官或受试者中增加的因子。免疫刺激因子是其水平取决于细胞、组织、器官或受试者及其个体状况而在细胞、组织、器官或受试者中升高或降低的因子。
与本发明的寡核苷酸或药物组合物组合的抗体是例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或双特异性抗体。与本发明的寡核苷酸或药物组合物组合的小分子是例如ARL67156(OncoImmunology 1:3；2012)或POM-1(Gastroenterology；2010；139(3):1030-1040)。
本发明的受试者是例如哺乳动物、鸟或鱼。
实施例
以下实施例说明了本发明的不同实施方式，但本发明不限于这些实施例。对内源表达IDO1的细胞(即该细胞不代表包含转染的报道基因构建体的人工系统)进行以下实验。与更接近治疗相关的体内系统的内源系统相比，这种人工系统通常显示出更高程度的抑制和更低的IC50值。此外，在以下实验中，不使用转染剂，即进行自主递送(gymnoticdelivery)。已知转染剂会增加影响IC 50值的寡核苷酸的活性(参见例如Zhang et,al,Gene Therapy,2011,18,326-333；Stanton et,al,Nucleic Acid Therapeutics,Vol.22,No.5,2012)。由于使用转染剂的人工系统难以或不可能转化为治疗方法，并且目前尚无批准用于寡核苷酸的转染制剂，因此在没有任何转染剂的情况下进行以下实验。
实施例1：人CD39反义寡核苷酸的设计
为了设计对人(h)CD39具有特异性的反义寡核苷酸，使用具有SEQ ID No.1的hCD39mRNA序列(序列参考ID NM_001776.5)。根据内部标准设计14、15、16和17聚体，在所有实验中使用neg1(在WO2014154843 A1中描述)作为对照反义寡核苷酸(表1)。hCD39 mRNA上反义寡核苷酸结合位点的分布如图1所示。
实施例2：hCD39反义寡核苷酸在人癌细胞系中的功效筛选
为了分析本发明的hCD39反义寡核苷酸在癌细胞系中对hCD39 mRNA表达的敲除的功效，使用单剂量的如图2A至2D所示的相应的反义寡核苷酸处理HDLM-2(人霍奇金淋巴瘤，DSMZ)和A-172(人胶质母细胞瘤，ATCC)细胞(浓度：10μM，不添加任何转染试剂；该过程称为自主递送)。三天后使用QuantiGeneSingleplex测定(Affymetrix)分析hCD39和HPRT1 mRNA表达，并将hCD39表达值归一化至HPRT1值。引人注目的是，对于23和18(HDLM-2细胞；参见图2A和2B)观察到>90％的敲除效率，且对于8和10(A-172细胞)反义寡核苷酸观察到>90％的敲除效率(参见图2C和2D)。在下面列出对于A-172(表4为第一轮筛选且表5为第二轮筛选)和HDLM-2细胞(表6为第一轮筛选且表7为第二轮筛选)与未处理细胞相比的归一化的hCD39的mRNA表达的值：
表4：与未处理的细胞相比，反义寡核苷酸处理的A-172细胞中的平均归一化的hCD39 mRNA表达值的列表(第一轮筛选)。
表5：与未处理的细胞相比，反义寡核苷酸处理的A-172细胞中的平均归一化的hCD39 mRNA表达值的列表(第二轮筛选)。
表6：与未处理的细胞相比，反义寡核苷酸处理的HDLM-2细胞中的平均归一化的hCD39 mRNA表达值的列表。
表7：与未处理的细胞相比，反义寡核苷酸处理的HDLM-2细胞中的平均归一化hCD39 mRNA表达值的列表。(*＝值低于检测限；第二轮筛选)。
实施例3：HDLM-2和A-172细胞中反义寡核苷酸功效的相关性分析
为了进一步选择在两种测试的细胞系HDLM-2和A-172中具有最高活性的候选物，进行相关性分析(来自图2B和2D的数据)。如图3所示，选择7种有效的反义寡核苷酸，用于测定HDLM-2和A-172细胞中的IC50，即A04019H(SEQ ID No.23)、A04033H(SEQ ID No.37)、A04039H(SEQ ID No.43)、A04040H(SEQ ID No.3)、A04042H(SEQ ID No.45)、A04044H(SEQID No.47)和A04045H(SEQ ID No.4)(标记为黑色)。重要的是，对照反义寡核苷酸neg1对两种细胞系中的hCD39的表达没有负面影响。
实施例4：在第一轮筛选中选择的hCD39反义寡核苷酸在HDLM-2细胞中的IC50测定(mRNA水平)
为了测定hCD39反义寡核苷酸A04019H(SEQ ID No.23)、A04033H(SEQ ID No.37)、A04039H(SEQ ID No.43)、A04040H(SEQ ID No.3)、A04042H(SEQ ID No.45)、A04044H(SEQID No.47)、A04045H(SEQ ID No.4)的IC50，用滴定量的相应反义寡核苷酸处理HDLM-2细胞(浓度：10μM、3.3μM、1.1μM、370nM、120nM、41nM、14nM、4.5nM)。三天后分析hCD39 mRNA表达。如图4和下表8所示，与未处理的细胞相比，反义寡核苷酸A04040H(SEQ ID No.3)和A04045H(SEQ ID No.4)在hCD39 mRNA的下调方面在HDLM-2细胞中具有最高的效力，具有分别为99％和99.2％的最大目标抑制率。表8显示了在HDLM-2细胞中在滴定浓度下上述选择的反义寡核苷酸的IC50值和靶标抑制：
表8：hCD39反义寡核苷酸的IC50值概览
实施例5：在第二轮筛选中在HDLM-2细胞中选择的hCD39反义寡核苷酸的IC50测定(mRNA水平)
在第二个实验中，测试了hCD39反义寡核苷酸A04010H(SEQ ID No.14)、A04016H(SEQ ID No.20)、A04017H(SEQ ID No.21)、A04020H(SEQ ID No.24)和A04026H(SEQ IDNo.30)的效果的浓度依赖性和IC50值。在第一次IC50测定中显示出有效活性的反义寡核苷酸A04019H(SEQID No.23)和A04040H(SEQ ID No.3)用作参照。用滴定量的相应反义寡核苷酸处理HDLM-2细胞(浓度：10μM、3.3μM、1.1μM、370nM、120nM、41nM、14nM、4.5nM)。在处理三天后分析hCD39mRNA表达。图5和表9描绘了选择的hCD39反义寡核苷酸对hCD39 mRNA表达的浓度依赖性降低。反义寡核苷酸A04016H、A04019H、A04020H和A04040H在抑制HDLM-2细胞中的hCD39 mRNA方面具有最高效力，由IC50值12.8nM(A04016H)、11.58nM(A04019H)、10.11nM(A04020H)和21.53nM(A04040H)表明。
表9：在HDLM-2细胞中在滴定浓度下选择的反义寡核苷酸的IC50值和靶标抑制：
实施例6：人癌细胞系中的hCD39反义寡核苷酸的第三轮筛选
对于第三轮筛选，设计了新的反义寡核苷酸。这些反义寡核苷酸基于来自第一轮筛选的有效反义寡核苷酸，其具有长度、mRNA上的精确位置和化学修饰模式上的修饰。因此，在人癌细胞系(图6A，表10)HDLM-2(人霍奇金淋巴瘤)和(图6B，表11)A-172(人胶质母细胞瘤)中测试hCD39反义寡核苷酸。用10μM相应的反义寡核苷酸处理HDLM-2和A-172细胞3天。在第一轮筛选中显示出有效活性的反义寡核苷酸A04019H(SEQ ID No.23)、A04040H(SEQ ID No.3)和A04042H(SEQ ID No.45)用作参照。描绘了相对于未处理细胞(设定为1)的残留hCD39 mRNA表达。
表10：相对于未处理的细胞(设定为1)，反义寡核苷酸处理的HDLM-2细胞中的平均归一化hCD39mRNA表达值。
表11：相对于未处理的细胞(设定为1)，反义寡核苷酸处理的A-172细胞中的平均归一化hCD39 mRNA表达值。
实施例7：在HDLM-2细胞中第三轮筛选的选择hCD39反义寡核苷酸的IC50测定(mRNA水平)
hCD39反义寡核苷酸A04051H(SEQ ID No.88)、A04052H(SEQ ID No.89)、A04053H(SEQ ID No.89)、A04056H(SEQ ID No.92)、A04059H(SEQ ID No.94)、A04060H(SEQ IDNo.95)和A04061H(SEQ ID No.96)在HDLM-2和A-172细胞中显示出有效的单剂量活性。为了研究效果的浓度依赖性并为了测定HDLM-2细胞的IC50值，用1000nM；330nM；110nM；40nM；12nM；4nM；1.3nM；0.45nM的相应的反义寡核苷酸处理。在第一轮筛选中显示出有效活性的反义寡核苷酸A04040H用作参照，处理3天后分析hCD39 mRNA表达。图7描绘了hCD39反义寡核苷酸对hCD39表达的浓度依赖性降低。IC50值和靶标抑制显示在表12中。因此，反义寡核苷酸A04056H；A04059H；和A04060H在抑制HDLM-2细胞中的hCD39 mRNA方面具有最高效力，由IC50值20.2nM(A04056H)；18.32nM(A04059H)，或20.5nM(A04060H)表明。
表12：在HDLM-2细胞中滴定浓度的来自第三轮筛选的选择的反义寡核苷酸的IC50值和靶标抑制(n.d.＝未测定)：
实施例8：A04040H(SEQ ID No.3)和A04045H(SEQ ID No.4)的浓度和时间依赖性hCD39蛋白质敲除
高效的hCD39反义寡核苷酸A04040H(SEQ ID No.3)和A04045H(SEQ ID No.4)的详细特征在于它们对hCD39蛋白表达的敲除效力及它们在不同浓度下对细胞活力的影响。因此，分别用不同浓度的相应的反义寡核苷酸处理HDLM-2细胞三天、四天和六天。使用CD39抗体(克隆A1)和7-AAD通过流式细胞术分析蛋白质表达以研究活力。如图8所示，两种反义寡核苷酸在所有指定的时间点后显示出hCD39蛋白的有效抑制，而使用neg1的处理没有抑制作用。相反，A04045H(SEQ ID No.4)在任何测试条件下都不影响HDLM-2细胞的活力。表13总结了在HDLM-2细胞中在不同时间点选择的人CD39反义寡核苷酸A04040H(SEQ ID No.3)和A04045H(SEQ ID No.4)的蛋白质敲除效率：
表13：选择的人CD39反义寡核苷酸在HDLM-2细胞中的蛋白质敲除效率
实施例9：hCD39特异性反义寡核苷酸对原代人CD4+和CD8+T细胞中的hCD39蛋白表达的影响的研究及寡核苷酸去除后的效果持续性的研究
A04040H在人癌细胞系中在mRNA和蛋白质水平上抑制hCD39表达方面表现出非常有效的活性。在下一步中，研究了其在原代人T细胞中的活性。此外，检验了反义寡核苷酸去除后效果的持续性。因此，从外周血中分离CD8+和CD4+T细胞，并在10μM的hCD39特异性反义寡核苷酸A04040H(黑色柱)或不与任何人mRNA互补的对照寡核苷酸S6(白色)存在下用抗CD3激活6天的总处理时间。用抗CD3激活对照细胞，但未接受任何寡核苷酸处理(条纹柱)。此后，除去寡核苷酸，并通过流式细胞术在除去寡核苷酸后第3天、第6天和第11天分析hCD39蛋白表达(图9)。
如图9所示，A04040H在去除反义寡核苷酸后显着抑制hCD39蛋白表达持续至少6天，而在与未处理的对照细胞相比时，使用S6的处理对hCD39蛋白表达没有抑制作用。在较晚的时间点(第6天和第11天)在CD8+和CD4+T细胞上观察到hCD39蛋白表达的总体降低，这很可能是由于从细胞培养物中除去抗CD3后T细胞激活减少。因此，在ASO去除后第3天，CD39反义寡核苷酸和对照寡核苷酸处理的T细胞之间的hCD39蛋白表达水平的差异最强。其在寡核苷酸去除后第6天仍然显着(图9)。在去除寡核苷酸后第11天，CD8+和CD4+T细胞上的hCD39表达低并且在CD39 ASO、对照ASO和未处理的对照细胞之间相当(图9)。
实施例10：hCD39敲除对JIYOYE细胞中的ATP降解的下游效应。
腺苷是在通过hCD39的ATP降解过程中产生的一种主要的免疫抑制分子。可以通过ATP生物发光测定(ATP生物发光测定试剂盒CLS II；Roche)检测ATP。用5μM反义寡核苷酸A04040H(SEQ ID No.3)或阴性对照寡核苷酸neg1处理JIYOYE细胞6天(3+3)。3天后，用含有5μM的寡核苷酸的新鲜RPMI-1640培养基替换RPMI-1640培养基。在6天后通过流式细胞术分析蛋白质敲除效力(图10A)和活力(图10B)。反义寡核苷酸的存在不影响细胞活力(图10B)。同一天，将未用任何反义寡核苷酸处理的细胞在37℃下与20μM的CD39小分子抑制剂ARL67156三钠盐(TOCRIS)一起温育1小时。然后，将2μM的ATP加入细胞不含来自每种条件的细胞的或细胞培养基中，并在30分钟后在细胞上清液或细胞培养基中测定ATP浓度。引人注目的是，用A04040H(SEQ ID No.3)处理的JIYOYE细胞中的ATP降解功效几乎被消除(图10C)，与用neg 1处理的细胞相比，导致ATP浓度高约4倍，并且与用ARL67156处理的细胞相比，导致ATP浓度高2倍(图10C)。表14表示hCD39敲除对JIYOYE细胞的细胞培养上清液中的相对ATP水平的影响：
表14：hCD39蛋白敲除后和外源ATP加入细胞后JIYOYE细胞的上清液中的ATP浓度的测定
此外，还在原代人CD8+T细胞中分析hCD39敲除对ATP降解的影响(图11A-11D)。用5μM反义寡核苷酸A04040H(SEQ ID No.3)或阴性对照寡核苷酸neg1处理激活的T细胞6天(3+3)。3天后，用含有5μM的反义寡核苷酸的新鲜RPMI-1640培养基替换RPMI-1640培养基。在6天后通过流式细胞术分析蛋白质敲除效力(图11A)和活力(图11B)。反义寡核苷酸的存在不影响细胞活力(图11B)。在第6天，将细胞以恒定的细胞数重新涂板，并以2μM(图11C)或20μM(图11D)的浓度添加ATP。30分钟后在细胞上清液或细胞培养基中测量ATP浓度(表15)。
引人注目的是，在用A04040H(SEQ ID No.3)处理的CD8+T细胞中，ATP降解功效几乎消除(图11C-11D)，当与neg1处理的细胞相比时，导致ATP浓度提高约7倍，并且几乎达到与培养基对照相同的ATP浓度。表15显示了hCD39敲除对原代人CD8+T细胞中的ATP浓度的影响。
表15：hCD39蛋白敲除后和外源ATP加入细胞后CD8+T细胞的上清液中的ATP浓度的测定
实施例11：在存在或不存在细胞外ATP的情况下CD39特异性反义寡核苷酸对T细胞增殖的影响的研究
本发明的先前结果揭示用A04040H处理原代人CD8+T细胞显着抑制降解细胞外ATP的能力。在癌症中，ATP例如在化学疗法或放射疗法诱导的细胞死亡后从肿瘤细胞释放。由于CD39-CD73轴对T细胞功能起重要作用，因此研究了在存在或不存在细胞外ATP的情况下A04040H对T细胞增殖的影响。用细胞增殖染料标记人CD8+T细胞，用抗CD3激活并用5μM的反义寡核苷酸A04040H或对照寡核苷酸S6处理5天的总处理时间。在载体对照中，仅用抗CD3激活细胞。随后，在寡核苷酸处理开始后第3天和第4天将400μM的ATP或载体加入细胞中。此外，作为另外的对照，在第4天将小分子CD39-抑制剂ARL67156三钠盐以20μM加入细胞中，温育时间24小时。在寡核苷酸处理开始后第5天，使用流式细胞术分析CD8+T细胞的CD39蛋白表达、增殖和绝对细胞数。
CD8+T细胞的A04040H处理有效抑制CD39蛋白表达(图12A)。在没有细胞外ATP的情况下，在A04040H(黑色柱)、S6(白色柱)、ARL67156(格纹柱)和载体(条纹柱)处理的CD8+T细胞之间未观察到增殖(图12B上图)或绝对细胞数(图12C)的差异。补充400μM的ATP减少了增殖(图12B下图)并且显着减少了用S6、ARL67156或载体处理的CD8+T细胞的绝对数量(图12C)。引人注目的是，通过补充含有ATP的细胞培养基，没有减少A04040H处理的CD8+T细胞的增殖(图12B下图)。因此，在A04040H处理的细胞中，ATP补充不改变绝对T细胞数(图12C)。
总之，这些结果表明，补充含有ATP的细胞培养基显着损害了表达CD8+T细胞的CD39的增殖。引人注目的是，通过A04040H处理的CD39蛋白敲除抑制了ATP降解，因此逆转了补充ATP对细胞增殖和绝对T细胞数量的抑制作用。
实施例12：小鼠/大鼠CD39反义寡核苷酸的设计
由于人和小鼠(m)/大鼠(r)CD39之间的序列差异，只有少数hCD39反义寡核苷酸对小鼠/大鼠CD39是交叉反应的。由于它们在人细胞系中仅表现出有限的敲除效力，因此设计了对小鼠/大鼠CD39具有特异性的替代反义寡核苷酸。具有SEQ ID No.2的小鼠CD39mRNA序列(序列参考号NM_001304721.1)用作设计15、16和17聚体反义寡核苷酸的基础，neg1描述于WO2014154843 A1中并且在所有实验中用作对照(表2)。hCD39mRNA上反义寡核苷酸结合位点的分布如图13所示。
实施例13：mCD39反义寡核苷酸在鼠癌细胞系中的功效筛选
为了分析mCD39反义寡核苷酸在癌细胞系中关于敲除mCD39 mRNA表达的功效，用单剂量(浓度：10μM，不添加任何转染试剂；该过程称为自主递送)的相应反义寡核苷酸处理A20(小鼠B细胞淋巴瘤，ATCC)细胞，如图14所示。作为对照，用neg1处理细胞，neg1为具有序列CGTTTAGGCTATGTACTT的反义寡核苷酸。在三天后使用QuantiGene Singleplex(Affymetrix)测定分析mCD39和HPRT1 mRNA表达，并将mCD39表达值归一化至HPRT1表达值。引人注目的是，如图14所示，用15种不同的反义寡核苷酸处理导致A20细胞中>90％的敲除效率。mCD39的平均归一化mRNA表达的确切值在下表16中给出：
表16：与未处理的细胞相比，反义寡核苷酸处理的A20细胞中的平均归一化的mCD39 mRNA表达值的列表。
实施例14：反义寡核苷酸介导的C57BL/6小鼠的体内mCD39 mRNA敲除
选择有效的mCD39 ASO A04011MR并分析其在C57BL/6小鼠中的体内敲除能力。在第1、2、3、4、5、9、12、16和19天，通过以25mg/kg或10mg/kg的剂量皮下注射A04011MR或阴性对照寡核苷酸neg1处理C57BL/6小鼠(5只小鼠/组)。在最后的ASO处理(第26天)后7天，处死小鼠并取样脾脏用于CD39 mRNA分析。图15中描绘的结果显示了A04011MR或neg1处理的小鼠的脾脏中的CD39mRNA表达水平。引人注目的是，在与对照寡核苷酸(neg 1)处理的小鼠相比时，当用25mg/kg(图15A)或10mg/kg(图15B)的A04011MR全身处理小鼠时，脾脏中的mCD39mRNA水平显着降低。这些数据清楚地表明A04011MR有效抑制体内脾脏中mRNA水平上的CD39表达。
实施例15：在同系小鼠肿瘤模型中反义寡核苷酸介导的体内mCD39蛋白质敲除
选择有效的mCD39反义寡核苷酸A04011MR，并分析其在皮下同系小鼠肿瘤模型中的体内敲除能力。因此，将5x 105个MC38wt肿瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠中。一旦肿瘤达到50-70mm3的大小，在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第9天和12天通过皮下注射不同剂量的A04011MR(20mg/kg；10mg/kg；5mg/kg)或阴性对照寡核苷酸neg1(20mg/kg)全身处理小鼠(每组4只小鼠)。作为另外的对照，带有MC-38肿瘤小鼠未经处理。在最后的使用反义寡核苷酸的处理(第16天)后4天，分离肿瘤以使用流式细胞术分析肿瘤浸润性免疫细胞的亚型中的CD39蛋白表达。图16A和16B描绘了相对于未处理小鼠的肿瘤，来自寡核苷酸处理的小鼠的肿瘤浸润调节T细胞(Tregs)(图16A)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)(图16B)的CD39蛋白表达。引人注目的是，当与对照相比时，A04011MR剂量依赖性地抑制Tregs(图16A)和TAM(图16B)上的mCD39蛋白表达，在20mg/kg下具有最高功效。这些数据清楚地表明A04011MR有效抑制体内的肿瘤浸润免疫细胞中的蛋白质水平上的CD39表达。

Claims (14)

1.一种包含12至18个核苷酸的免疫抑制恢复寡核苷酸，其中，至少一个所述核苷酸被修饰，并且所述寡核苷酸与SEQ ID NO.1(人)的外核苷酶(NTPdase)CD39的核酸序列杂交，其中所述寡核苷酸抑制至少50％的CD39表达。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，修饰的所述核苷酸选自由桥接核酸如LNA，cET，ENA，2’氟修饰的核苷酸，2'O-甲基修饰的核苷酸和它们的组合组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其与SEQ ID NO.1的人(h)CD39杂交，包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ IDNO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89、SEQ IDNO.90、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.94、SEQ ID NO.95、SEQ IDNO.96、SEQ ID No.97和它们的组合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸选自由以下组成的组
+G*+T*+T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T*+T(A04040H)、
+C*+A*+C*T*T*A*C*G*T*T*C*A*C*T*+A*+C*+C(A04045H)、
+G*+G*+C*G*A*A*A*T*T*G*C*+A*+G*+A(A04001H)、
+C*+T*+C*C*A*G*C*G*T*A*A*G*+A*+T(A04002H)、
+T*+T*+G*A*A*C*A*C*T*G*C*+G*+A*+T(A04003H)、
+G*+C*C*A*T*A*G*G*C*A*C*C*+T*+T*+C(A04004H)、
+C*+T*+A*T*G*C*T*G*A*A*C*C*+A*+C*+C(A04005H)、
+T*G*+T*A*G*A*G*G*C*T*C*C*C*+C*+C(A04006H)、
+T*+T*+G*C*A*G*A*G*C*A*T*T*+A*+T*+C(A04007H)、
+A*+G*+G*C*G*A*A*A*T*T*G*C*+A*+G*+A(A04008H)、
+T*+A*G*A*C*A*T*T*G*T*A*G*+T*+C*+C(A04009H)、
+G*+A*G*T*G*C*C*T*G*A*T*C*C*+T*+T(A04010H)、
+A*+A*+T*C*C*C*C*C*T*G*G*A*+G*+T*+G(A04011H)、
+A*+G*+C*G*T*A*A*G*A*T*G*T*+T*+T*+T(A04012H)、
+A*+C*+T*C*C*A*G*C*G*T*A*A*+G*+A*+T(A04013H)、
+T*+G*+A*T*A*G*C*C*T*T*G*C*+A*+G*+A(A04014H)、
+A*+G*T*C*C*A*G*C*C*G*G*C*G*T*+C(A04015H)、
+G*G*+A*C*A*A*T*G*G*T*T*G*+C*+T*+C(A04016H)、
+C*+T*+T*G*A*A*C*A*C*T*G*C*+G*+A*+T(A04017H)、
+G*+A*G*T*A*C*A*A*C*T*G*A*+A*+C*+C(A04018H)、
+G*+T*+A*A*G*C*C*C*T*G*A*T*+G*+T*+T(A04019H)、
+T*+A*+T*G*G*T*A*C*A*G*T*+T*G*+G*+T(A04020H)、
+C*+T*+G*A*C*T*G*A*A*T*T*T*G*+C*+C*+C(A04021HM)、
+A*+C*+T*A*T*G*C*T*G*A*A*C*C*A*+C*+C(A04022HM)、
+G*+A*C*T*A*T*G*C*T*G*A*A*C*+C*+A*+C(A04023HM)、
+G*+A*+G*G*C*G*A*A*A*T*T*G*C*A*+G*+A(A04024HM)、
+A*+G*A*G*T*G*C*C*T*G*A*T*C*C*+T*+T(A04025H)、
+G*+A*+T*A*G*T*T*T*C*C*A*A*T*+A*+C*+C(A04026H)、
+T*+A*+C*T*C*C*A*G*C*G*T*A*A*+G*+A*+T(A04027H)、
+A*+T*+G*T*A*G*C*C*C*A*A*A*G*T*+C*+C(A04028H)、
+C*+A*+T*G*T*A*G*C*C*C*A*A*A*+G*+T*+C(A04029H)、
+G*+G*+A*C*A*A*T*G*G*T*T*G*C*+T*C*+A(A04030H)、
+A*+G*+C*C*T*A*T*G*A*T*G*G*C*C*+A*+C(A04031H)、
+G*+C*+C*T*T*G*A*A*C*A*C*T*G*C*+G*+A(A04032H)、
+A*+C*C*C*T*G*A*G*T*T*G*T*A*A*C*+T(A04033H)、
+A*+G*G*A*T*A*G*T*C*T*T*G*T*C*+T*+C(A04034H)、
+C*C*T*A*C*C*C*A*G*G*A*T*A*G*+T*+C(A04035H)、
+C*+C*+C*T*C*T*C*A*C*T*A*A*A*+T*+T*+A(A04036H)、
+A*+C*+T*C*C*A*C*A*C*T*A*A*T*+G*+C*+T(A04037H)、
+G*T*+C*A*A*T*C*C*T*G*C*T*C*A*+A*+C(A04038H)、
+C*+A*+G*T*C*A*A*T*C*C*T*G*C*+T*+C*+A(A04039H)、
+C*T*+T*G*C*C*A*T*A*G*A*G*G*C*+G*A*+A(A04041HM)、
+T*+G*+C*C*A*G*A*G*T*G*C*C*T*G*+A*+T*+C(A04042H)、
+A*+C*+G*T*T*C*A*C*T*A*C*C*T*T*+C*+T*+T(A04043H)、
+T*+T*+A*C*G*T*T*C*A*C*T*A*C*C*+T*+T*+C(A04044H)、
+A*+A*+G*G*T*C*A*C*T*T*A*C*G*T*+T*+C*+A(A04046H)、
+G*+C*+C*C*C*A*A*A*A*T*C*C*C*C*+C*+T*+G(A04047H)、
+G*+A*+G*A*G*A*A*T*G*T*A*G*G*T*+A*C*+C(A04048H)、
+C*+C*C*T*G*G*A*T*C*T*T*G*C*C*+A*+A*+T(A04049H)、
+A*+A*+A*G*T*C*C*A*G*C*C*G*G*C*G*+T*+C(A04050H)、
+A*+G*+A*G*T*G*C*C*T*G*A*T*C*+C*+T*+T(A04051H)、
+T*+A*+C*G*T*T*C*A*C*T*A*C*C*T*+T*+C*+T(A04052H)、
+T*+A*+C*G*T*T*C*A*C*T*A*C*C*T*+T*C*+T(A04053H)、
+G*+C*+C*C*T*G*A*T*G*T*T*T*G*+A*+A*+T(A04054H)、
+T*+A*+G*T*A*A*G*C*C*C*T*G*+A*+T*+G(A04055H)、
+G*+T*+T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T*+T*+T(A04056H)、
+T*+T*+T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*+C*+T*+T(A04058H)、
+G*+G*+T*T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T*+T(A04059H)、
+G*+G*+T*T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T(A04060H)、
+G*+T*+T*T*G*T*G*T*G*A*G*A*G*C*+T(A04061H)、
+G*G*+T*T*T*G*T*G*T*G*A*G*+A*G*+C(A04062H)和它们的组合，其中+表示LNA核苷酸且*表示所述核苷酸之间的硫代磷酸酯(PTO)键。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸以纳摩尔浓度抑制CD39的表达。
6.一种药物组合物，包含权利要求1至5中任一项所述的免疫抑制恢复寡核苷酸和药用载体、赋形剂和/或稀释剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，还包含化学治疗剂如铂、吉西他滨、其他寡核苷酸、抗体和/或小分子。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，其他寡核苷酸、所述抗体和/或所述小分子抑制或刺激免疫抑制因子和/或免疫刺激因子。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述免疫抑制因子选自由以下组成的组：IDO1、IDO2、CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR,CD39、CD73、STAT3、TDO2、TIM-3、TIGIT、TGF-β、BTLA、MICA、NKG2A、KIR、CD160、Chop、Xbp1和它们的组合。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述免疫刺激因子选自由以下组成的组：4-1BB、Ox40、KIR、GITR、CD27、2B4和它们的组合。
11.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫抑制恢复寡核苷酸或根据权利要求6至10中任一项所述的药物组合物，用于预防和/或治疗其中涉及CD39失衡的疾病的方法。
12.根据权利要求11所述的用于使用的免疫抑制恢复寡核苷酸或药物组合物，其中，所述疾病是自身免疫疾病，例如自身免疫性关节炎或胃肠道自身免疫疾病如炎性肠病(IBD)或结肠炎，免疫疾病，例如由于慢性病毒感染如HIV感染引起的免疫衰竭，心血管疾病，炎性疾病，例如慢性气道炎症，细菌、病毒和/或真菌感染，例如败血症或牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)感染，肝脏疾病，慢性肾病，精神疾病和/或癌症。
13.根据权利要求12所述的用于使用的免疫抑制恢复寡核苷酸或药物组合物，其中，所述癌症是乳腺癌，肺癌，恶性黑色素瘤，淋巴瘤，皮肤癌，骨癌，前列腺癌，肝癌，脑癌，喉、胆囊、胰腺、睾丸、直肠、甲状旁腺、甲状腺、肾上腺、神经组织、头颈、结肠、胃、支气管、肾的癌症，基底细胞癌，鳞状细胞癌，转移性皮肤癌，骨肉瘤，尤文氏肉瘤，网状细胞肉瘤，脂肪肉瘤，骨髓瘤，巨细胞瘤，小细胞肺肿瘤，胰岛细胞瘤，原发性脑肿瘤，脑膜瘤，急性和慢性淋巴细胞和粒细胞瘤，急性和慢性髓性白血病，毛细胞瘤，腺瘤，增生，髓样癌，肠神经节瘤，肾母细胞瘤，精原细胞瘤，卵巢肿瘤，平滑肌瘤，宫颈非典型增生，视网膜母细胞瘤，软组织肉瘤，恶性类癌，局部皮损，横纹肌肉瘤，卡波西肉瘤，骨原性肉瘤，恶性高钙血症，肾细胞瘤，真性红细胞增多症，腺癌，间变性星形细胞瘤，多形性胶质母细胞瘤，白血病或表皮样癌。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的用于使用的免疫抑制恢复寡核苷酸或药物组合物，其中，所述寡核苷酸或所述组合物适于局部或全身给予。
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