CN108424932B - 重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用，所述重组溶瘤腺病毒载体的构建方法包括以下步骤：在腺病毒质粒中引入编码RGD肽的基因，构成靶向性骨架质粒；将shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列以及促凋亡基因PUMA的基因序列连接至第一穿梭质粒，构成第二穿梭质粒；将人端粒逆转录酶启动子连接至第二穿梭质粒，构成第三穿梭质粒；将第三穿梭质粒与靶向性骨架质粒在大肠杆菌中重组为重组溶瘤腺病毒载体；该方法构建出的重组溶瘤腺病毒载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得重组溶瘤腺病毒，从而能够有效的识别并杀死多种恶性肿瘤的肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞。

Description

重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺 病毒载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因治疗领域，特别涉及重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类生命的疾病之一，对于多数恶性肿瘤患者而言，可采用化疗、放射疗法及生物免疫治疗等方法来杀死大部分肿瘤细胞，但是却无法从根本上治愈肿瘤，最终肿瘤会复发转移，造成病人死亡，原因是这些常规化疗无法清除具有耐药性的肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)，而肿瘤干细胞又具有高致瘤性、自我更新复制和分化的能力，因此肿瘤会复发转移。
近年来肿瘤干细胞研究和在肿瘤治疗中的应用研究受到越来越多人的关注，已经在卵巢癌，乳腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、皮肤癌，甲状腺癌等多种恶性肿瘤中都成功分离出了肿瘤干细胞，并且目前乳醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)的活性已成为多种肿瘤中肿瘤干细胞最具吸引力的标志分子，这些肿瘤包括肺癌，乳腺癌，前列腺癌，甲状腺癌，头颈部癌，卵巢癌等，乳醛脱氢酶家族组成了胞浆内的同工酶类，这些同工酶类负责氧化细胞内的醛类，因此能够将视黄醇氧化为视黄酸，从而影响早期干细胞的分化，目前人类的乳醛脱氢酶超家族包括11个家族4个亚家族，共19个功能性基因，在乳醛脱氢酶庞大的家族和亚家族中，ALDH1A1在多种恶性组织中被证实为肿瘤干细胞的标志分子，ALDH1A1被敲除后肿瘤干细胞失去或降低了其生物学特性如从抗药性变为对抗肿瘤药物敏感，致瘤性显著降低等。
随着生命科学和医学研究的不断深入，基因治疗已成为癌症靶向治疗的一个重要发展方向，而溶瘤腺病毒(Oncolytic adenovectors)，又称条件复制型腺病毒载体(Conditionally replicating adenoviruses,CRADs)，介导的基因治疗则是癌症靶向治疗的一个有效策略，溶瘤腺病毒能够在肿瘤细胞中特异性复制并裂解肿瘤细胞，进而释放子代病毒，再感染周围的肿瘤细胞，通过级联放大效应最终消灭肿瘤，它虽然也能感染正常细胞,但是不能在正常细胞中复制，因此对正常细胞的毒性很弱。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用，从而能够有效的识别并杀死肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞。
为实现上述目的，本发明提供了一种重组溶瘤腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
在腺病毒质粒中引入编码RGD肽的基因，构成靶向性骨架质粒；
将shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列以及促凋亡基因PUMA的基因序列连接至第一穿梭质粒，构成第二穿梭质粒；
将人端粒逆转录酶启动子连接至第二穿梭质粒，构成第三穿梭质粒；
将第三穿梭质粒与靶向性骨架质粒在大肠杆菌中重组为重组溶瘤腺病毒载体，其中所述大肠杆菌为大肠杆菌BJ5183。
上述RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸序列的一类短肽，广泛存在于多种生物体内，是多种生物细胞外基质和血浆蛋白结构中的基本成分，此外，RGD是广泛存在于细胞间识别系统的基本单位，能够和细胞表面整合素受体特异性结合，在生理和病理过程中发挥重要作用。
PUMA/Bbc3是Bcl-2家族BH3-only亚家族成员，在p53依赖性和p53非依赖性细胞凋亡中都起到重要作用，PUMA/Bbc3、Bcl-2/Bcl-xL、Bax/Bak之间的相互作用，线粒体膜通透性的改变，促凋亡分子的释放及Caspase级联效应是PUMA/Bbc3凋亡效应的分子基础。
人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子是一个广泛的肿瘤特异性启动子，用hTERT启动子替换腺病毒原始启动子E1A从而使外源基因的表达限制在肿瘤细胞中，提高肿瘤基因治疗的靶向性，以hTERT为特异性启动子的溶瘤腺病毒能特异的识别肿瘤细胞。
优选地，上述技术方案中，所述腺病毒质粒为腺病毒质粒AdEAsy-1。
优选地，上述技术方案中，所述编码RGD肽的基因插入在腺病毒质粒的纤维基因中，优选的，所述编码RGD肽的基因插在腺病毒质粒纤维基因中HI loop的456T与457P之间，进一步优选的，所述编码RGD肽的基因为编码RGD-4C肽的基因。
优选地，上述技术方案中，所述第一穿梭质粒为pShuttle-CMV。
优选地，上述技术方案中，所述第一穿梭质粒采用由CMVp连接促凋亡基因PUMA的CDS区，再连接shRNA抗ALDH1A1的基因序列，优选的，促凋亡基因PUMA为PUMA-Alpha基因，在NCBI上的登记号为NM_014417。
上述PUMA-Alpha基因(NM_014417)的CDS区(编码序列)连接到靶向人ALDH1A1mRNA的shRNA相关序列(即，shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列)，该shRNA相关序列包括pGIPZ-shRNA载体(DharmaconTM,Cat.RHS4430-200287229)Puro基因CDS区下游(终止密码子后)至WPRE上游(MluI位点)的所有序列，实际包括了miR-30的骨架、shRNA、barcode序列，将这部分序列克隆穿梭质粒pShuttle-CMV的KpnI位点。
优选地，上述技术方案中，将包含人端粒逆转录酶启动子的溶瘤原件TERTp-E1A-E1B55K自质粒pTE-D19K中切下，连接在第二穿梭质粒pA信号序列的下游，从而用人端粒酶启动子控制腺病毒E1A基因表达，同时由E1B启动子控制表达腺病毒E1B55K基因；为了进一步提高溶瘤效率，删除E1B19K基因；并将此穿梭质粒与腺病毒骨架质粒AdEasy-1在细菌内同源重组产生重组溶瘤腺病毒质粒/载体而得到。
上述质粒pTE-D19K、穿梭质粒pShuttle-CMV、腺病毒质粒AdEAsy-1、大肠杆菌BJ5183感受态为中国疾病控制中心病毒病预防控制所洪涛院士实验室保存。
本发明还提供了上述重组溶瘤腺病毒载体的构建方法所构建出的重组溶瘤腺病毒载体，所述重组溶瘤腺病毒载体同时携带人端粒逆转录酶启动子、shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列、促凋亡基因PUMA的基因序列和编码RGD肽的基因序列，其中所述人端粒逆转录酶启动子的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述促凋亡基因PUMA的基因序列如SEQ IDNO.3所示，所述编码RGD肽的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种重组溶瘤腺病毒，由上述重组溶瘤腺病毒载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得；优选的，所述病毒包装细胞为人胚肾293细胞。
优选地，上述技术方案中，所述重组溶瘤腺病毒以肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞为双重靶向性。
本发明还提供了上述重组溶瘤腺病毒载体或上述重组溶瘤腺病毒在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明首次将抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1与以hTERT为组织特异性启动子的溶瘤腺病毒巧妙结合起来，能够有效的识别并杀死多种恶性肿瘤的肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞，从而有助于降低恶性肿瘤的复发和转移，在肿瘤治疗领域具有潜在、良好的应用前景。
附图说明
图1是根据本发明的重组溶瘤腺病毒载体(pAd5-RGD-Pumash-D19K)的基因组示意图；
图2是根据本发明的穿梭质粒(pSh5-Pumash-D19K)图谱；
图3是根据本发明的携带RGD基序和治疗基因的重组溶瘤腺病毒对多种肿瘤细胞(人皮肤成纤维细胞BJ、卵巢cisplatin(顺铂)耐药性肿瘤细胞A2780/CP25、卵巢肿瘤细胞OVCAR-3和SKOV3、肺癌细胞A549、喉癌细胞HEp-2)的杀伤作用；
图4是根据本发明的携带RGD基序和治疗基因的重组溶瘤腺病毒对多种肿瘤细胞(乳腺癌细胞SKBR-3、结肠癌细胞Caco-2和T84、肝癌细胞HepG-II、胰腺癌细胞MiaPac-2)的杀伤作用；
图5A是根据本发明的不同肿瘤细胞中ALDH1A1的表达水平：1.卵巢cisplatin敏感性肿瘤细胞A2780，2.卵巢cisplatin耐药性肿瘤细胞A2780/CP25，3.卵巢肿瘤细胞OVCAR-3，4.卵巢肿瘤细胞SKOV3，5.肺癌细胞A549，6.喉癌细胞HEp-2，7.乳腺癌细胞SKBR-3，8.结肠癌细胞Caco-2，9.结肠癌细胞T84；
图5B是根据本发明的不同感染强度的溶瘤腺病毒感染结肠癌细胞Caco-2后ALDH1A1和PUMA基因的表达水平:1.200MOI Ad-RGD-control-D19K，2.200MOI Ad-RGD-therapy gene-D19K，3.400MOI Ad-RGD-control-D19K，4.400MOI Ad-RGD-therapy gene-D19K，5.800MOI Ad-RGD-control-D19K，6.800MOI Ad-RGD-therapy gene-D19K；
图5C是根据本发明的不同感染强度的溶瘤腺病毒感染结肠癌细胞T84后ALDH1A1和PUMA基因的表达水平：1.200MOI Ad-RGD-control-D19K；2.200MOI Ad-RGD-therapygene-D19K；3.400MOI Ad-RGD-control-D19K；4.400MOI Ad-RGD-therapy gene-D19K；5.800MOI Ad-RGD-control-D19K；6.800MOI Ad-RGD-therapy gene-D19K；
图5D是根据本发明的不同感染强度的溶瘤腺病毒感染卵巢肿瘤细胞SKOV3后PUMA基因的表达水平：1.200MOI Ad-RGD-control-D19K，2.200MOI Ad-RGD-therapy gene-D19K，3.400MOI Ad-RGD-control-D19K，4.400MOI Ad-RGD-therapy gene-D19K，5.800MOIAd-RGD-control-D19K，6.800MOI Ad-RGD-therapy gene-D19K；
图6是根据本发明的携带RGD基序和治疗基因的重组溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中的复制能力。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
实验材料和主要仪器设备
1、质粒、菌株和细胞
质粒pTE-D19K、穿梭质粒pShuttle-CMV、腺病毒骨架质粒AdEAsy-1、大肠杆菌BJ5183感受态为中国疾病控制中心病毒病预防控制所洪涛院士实验室保存，大肠杆菌Top10感受态购自天根生化科技有限公司。
2、主要工具酶
限制性内切酶PacI、MfeI和PmeI以及Q5High-Fidelity DNA聚合酶购自中国NEB公司，其余的限制性内切酶、小牛肠来源的碱性磷酸酶(CIAP)、T4DNA ligase(连接酶)购自大连TaKaRa公司。
3、主要试剂和抗体
琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA分子量Markerλ/HindIII和DL2000购自大连TaKaRa公司，氯化铯(cesium chloride,CsCl)、无水乙醇、Tris-饱和平衡酚、氯仿、异戊醇、甲醇、甘油、青霉素和链霉素等均为国产试剂，shRNA抗ALDH1A1和对照shRNA购自DharmaconTM，CellTiter
Figure BDA0001596007580000071
Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒购自Promega，ALDH1A1抗体、PUMA抗体和GAPDH抗体均购自Cell Signaling，Peroxidase ConjugateAdenovirus抗体购自ViroStat，DAB显色试剂盒购自中杉金桥。
4、细胞和培养基
人皮肤成纤维细胞BJ购自美国菌种保藏中心(ATCC)，卵巢肿瘤细胞SKOV3购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，卵巢肿瘤细胞OVCAR-3、肺癌细胞A549、乳腺癌细胞SKBR-3购自中国医学科学院，胰腺癌细胞MiaPac-2购自中国典型培养物保藏中心细胞库，结肠癌细胞Caco-2和T84、喉癌细胞HEp-2、肝癌细胞HepG-II、人胚肾293细胞为中国疾病控制中心病毒病预防控制所洪涛院士实验室保存，RPMI 1640、DMEM培养基、McCoy’s5A、EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium)购自GIBCO，DMEM/High Glucose培养基购自Hyclone，胎牛血清先后购自GIBCO、Biowest和Hyclone。
5、主要仪器
紫外凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)；水平电泳系统(北京六一仪器厂)；超高速低温离心机(Beckman)；倒置显微镜(日本Olympus)；高速台式离心机和MastercyclerPCR仪(德国Eppendorf)；ELISA Plate Reader、生物安全柜和二氧化碳恒温培养箱(ThermoScientific)；洁净工作台(北京半导体设备一厂)等。
实施例1重组溶瘤腺病毒载体的构建、扩增、纯化以及颗粒滴度和感染滴度的测定
1、腺病毒骨架的改造
为了增加对萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)表达低的肿瘤细胞的感染效率，在腺病毒质粒的纤维(Fiber)基因中引入RGD-4C短肽序列，选择位置在HIloop的456T与457P之间，构建成靶向性骨架质粒pAdbone5RGD。
2、携带治疗基因shRNA以及PUMA的溶瘤腺病毒载体以及对照腺病毒载体的构建
构建策略：将目的基因(shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因以及促凋亡基因PUMA的基因)克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV的多克隆位点(该穿梭质粒含有CMVp和pA信号序列)，得到质粒pSh5-Pumash；再将溶瘤原件TERTp-E1A-E1B55K自pTE-D19K切下，放置在上述pSh5-Pumash质粒的pA信号下游，获得穿梭质粒pSh5-Pumash-D19K；线性化穿梭质粒与靶向性骨架质粒pAdbone5-RGD在大肠杆菌BJ5183中重组，获得重组溶瘤腺病毒载体pAd5-RGD-Pumash-D19K；扩增后，线性化，转染人胚肾293细胞，拯救重组病毒Ad5-RGD-Pumash-D19K，类似可获得对照腺病毒。
实施例2重组溶瘤腺病毒相关试验
一、重组(溶瘤)腺病毒扩增、纯化以及颗粒滴度和感染滴度的测定
将制备出来的重组(溶瘤)腺病毒在人胚肾293细胞内大量扩增，经过特殊的氯化铯密度梯度离心法纯化后采用消化法测腺病毒颗粒数，有限稀释法测腺病毒的感染滴度，根据颗粒滴度/感染滴度的比值判断腺病毒纯品中活病毒所占比例，以上四种重组溶瘤腺病毒的比值均<100，符合美国FDA和中国生物制品对腺病毒的要求(如表1所示)。
表1重组(溶瘤)腺病毒的颗粒滴度、感染滴度及其比值
Figure BDA0001596007580000091
二、携带与不携带RGD基序的重组溶瘤腺病毒对细胞的感染效率
具体方法:
1、将对数生长期的细胞消化，接种于24孔板；
2、次日以Ad-RGD-GFP和Ad-GFP进行感染，MOI分别为0、50、100、200、400、800VP/细胞，以不感染细胞作为阴性对照；
3、37℃5％CO2培养，感染2h后去除病毒液，加入1mL新鲜的细胞完全培养基，继续培养；
感染48h后，胰酶消化使细胞脱壁，收集细胞，用含1％FCS的PBS洗2遍，将细胞重悬于500μL 2％多聚甲醛中固定，4℃避光保存，一周内用流式细胞仪检测GFP表达效率和荧光强度。
流式细胞仪检测结果显示：携带与未携带RGD基序的重组溶瘤腺病毒对11种细胞的感染效率，结果显示携带RGD基序能够提高腺病毒对肿瘤细胞如卵巢肿瘤细胞OVCAR-3和SKOV3、肺癌细胞A549、乳腺癌细胞SKBR-3、胰腺癌细胞MiaPac-2的感染效率，而对卵巢cisplatin耐药性肿瘤细胞A2780/CP25、喉癌细胞HEp-2、结肠癌细胞Caco-2和T84、肝癌细胞HepG-II影响不显著，值得引起注意的是，携带RGD基序也能够提高腺病毒对端粒酶阴性人皮肤成纤维细胞BJ的感染效率，提示携带RGD基序的重组溶瘤腺病毒对细胞的感染效率的提高具有非特异性：既能提高对肿瘤细胞的感染效率，也能提高对正常细胞的感染效率(如表2所示)。
表2携带与未携带RGD基序的重组溶瘤腺病毒对细胞的感染效率
Figure BDA0001596007580000101
三、携带RGD基序和治疗基因的重组溶瘤腺病毒对多种肿瘤细胞的靶向杀伤作用
具体方法：
1、消化细胞，计数，将细胞浓度调整为1×105细胞/mL；
2、接种96-孔板，1×104细胞/孔，设三个平行孔；
3、第二天，吸弃原培养基，分别感染病毒Ad-GFP，Ad-RGD-control-D19K和Ad-RGD-therapy gene-D19K，MOI分别为0，50，100，200，400，800VP/细胞，每孔加入60μL相应的病毒稀释液；
4、感染病毒后第3天每孔补加100μL完全培养基；
5、感染后7天结束试验，加20μL的MTS/孔；
6、半个小时后用ELISA Plate Reader检测490nm的吸光度；
为评价Ad-RGD-control-D19K和Ad-RGD-therapy gene-D19K的特异性肿瘤杀伤效应，将病毒感染11种不同的细胞系，感染后5天，采用Promega公司的CellTiter
Figure BDA0001596007580000111
Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay，检测在不同的感染强度下对各细胞的杀伤效应，可以看出，携带治疗基因的溶瘤腺病毒对端粒酶阳性细胞如卵巢肿瘤细胞OVCAR-3和SKOV3、肺癌细胞A549、喉癌细胞HEp-2、结肠癌细胞Caco-2和T84以及肝癌细胞HepG-II均具有较强的杀伤作用，相比较而言，对端粒酶阳性细胞如卵巢cisplatin耐药性肿瘤细胞A2780/CP25以及胰腺癌细胞MiaPac-2不太敏感；高感染强度的溶瘤腺病毒对端粒酶阴性BJ细胞也具有杀伤作用，这可能与初始感染效率有关，因为溶瘤腺病毒在端粒酶阴性BJ细胞内是不能复制的；上述流式细胞仪检测结果表明感染强度为400MOI携带RGD基序的腺病毒对BJ细胞的感染效率为47.20％，而感染强度800MOI携带RGD基序的腺病毒对BJ细胞的感染效率可达到66.62％(如图3和图4所示)。
四、肿瘤细胞感染重组溶瘤腺病毒后治疗基因在其中的表达
具体方法：
1、消化细胞，计数，接种6孔板；
2、次日按照200、400、800MOI接种病毒；
3、感染2h后去除病毒液，加入3ml新鲜的细胞完全培养基，继续培养；
4、48小时后，去除培养基，用PBS洗去残留培养基(如有细胞漂浮，则需要离心收集)；
5、以预冷的已经加入蛋白酶抑制剂混合物(proteases inhibitor cocktail)&PMSF的RIPA buffer 120μL/孔在冰上裂解细胞5min，以细胞刮收集细胞至1.5ml EP管，继续冰上裂解25min，期间Vortex剧烈震荡2-3次以充分裂解细胞；
6、12000g离心5min获取裂解上清，转移至另一EP管，混匀分装，-80℃冻存；
7、Western blotting检测
为筛选出合适的肿瘤干细胞模型细胞和普通肿瘤细胞，我们利用WesternBlotting检测了多个肿瘤细胞中的肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的表达水平，结果显示肺癌细胞A549中ALDH1A1的表达水平最高，结肠癌细胞Caco-2和T84次之，卵巢肿瘤细胞OVCAR-3略表达ALDH1A1.其他细胞中未检测到ALDH1A1的表达，结合前面的感染效率检测结果以及细胞杀伤实验结果，我们选择出结肠癌细胞Caco-2和T84为肿瘤干细胞模型，卵巢肿瘤细胞SKOV3为普通肿瘤细胞模型，详见图5A。
我们将不同感染强度的溶瘤腺病毒感染结肠癌细胞Caco-2 48小时后检测了ALDH1A1和PUMA基因的表达水平，结果显示溶瘤腺病毒Ad-RGD-therapy gene-D19K携带的治疗基因shRNA抗ALDH1A1对ALDH1A1的敲除效果随着感染强度的增加而增强，另一个治疗基因PUMA在三个不同的感染强度下均有较强的表达，详见图5B。
不同感染强度的溶瘤腺病毒感染另一个结肠癌细胞T84 48小时后，800MOI的携带治疗基因的溶瘤腺病毒Ad-RGD-therapy gene-D19K对ALDH1A1具有较强的敲除效果，但是200MOI和400MOI的携带治疗基因的溶瘤腺病毒Ad-RGD-therapy gene-D19K对ALDH1A1的敲除效果不明显；而另一个治疗基因PUMA的表达随着携带治疗基因的溶瘤腺病毒Ad-RGD-therapy gene-D19K的感染强度的增加而增强，详见图5C。
由于SKOV3细胞不表达ALDH1A1,因此我们只检测了不同感染强度的溶瘤腺病毒感染该细胞48小时后PUMA基因的表达水平，结果显示治疗基因PUMA在三个不同的感染强度下在SKOV3细胞均有较强的表达，详见图5D。
五、携带RGD基序和治疗基因的重组溶瘤腺病毒的靶向复制能力的检测
为进一步分析溶瘤腺病毒的靶向复制特征，以100MOI的携带治疗基因的溶瘤腺病毒Ad-RGD-therapy gene-D19K感染人皮肤成纤维细胞BJ、肺癌细胞A549、结肠癌细胞Caco-2、结肠癌细胞T84、卵巢肿瘤细胞SKOV3，于感染后24h、48h、72h和96h收获细胞和上清，检测子代病毒的产生情况。具体方法：
1、将对数生长期的细胞消化，细胞计数，接种于24孔板，每个细胞接种4个孔；
2、次日感染病毒Ad-RGD-therapy gene-D19K 100MOI：吸弃原培养基，每孔加入200ul Ad-RGD-therapy gene-D19K病毒稀释液，37℃培养，2小时后弃病毒液，每孔加入500μL新鲜的细胞完全培养基，继续培养；
3、在感染24h，48h，72h，96h后收获细胞和培养上清，在37℃与-80℃之间反复冻融3次释放病毒，10000rpm、离心5min去细胞碎片得到含病毒的上清液，有限稀释法测上清液中病毒的感染滴度；
结果显示100MOI的携带治疗基因的溶瘤腺病毒在结肠癌细胞Caco-2中的复制能力在感染48小时最强，能达到110IU/细胞，以后逐渐减弱，详见图6。
综上所述，我们成功构建了由端粒酶启动子调控溶瘤(TERTp启动EIA表达)、由CMV启动调控PUMA基因和shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1表达的溶瘤腺病毒Ad-RGD-therapy gene-D19K，并且在该腺病毒的fiber添加了RGD基序。体外结果证实，该溶瘤腺病毒能够提高对某些肿瘤细胞的感染效率，且能够在肿瘤细胞大量复制，实现目的基因在多种肿瘤细胞中的高效表达，并且能够靶向性杀死多种恶性肿瘤的肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞。因此，该溶瘤腺病毒有望成为多种肿瘤的重要辅助治疗药物。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 北京多赢时代转化医学研究院
<120> 重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用
<130> P180108DD1F
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 449
<212> DNA
<213> Homo sapiens(SEQ ID NO.1)
<400> 1
cgcgcggccg ctggcccctc cctcgggtta ccccacagct taggccgatt cgacctctct 60
ccgctggggc cctcgctggc gtccctgcac cctgggagcg cgagcggcgc gcgggcgggg 120
aagcgcggcc cagacccccg ggtccgcccg gagcagctgc gctgtcgggg ccaggccggg 180
ctcccagtgg attcgcgggc acagacgccc aggaccgcgc ttcccacgtg gcggagggac 240
tggggacccg ggcacccgtc ctgccccttc accttccagc tccgcctcct ccgcgcggac 300
cccgccccgt cccgacccct cccgggtccc cggcccagcc ccctccgggc cctcccagcc 360
cctccccttc ctttccgcgg ccccgccctc tcctcgcggc gcgagtttca ggcagcgctg 420
cgtcctgctg cgcacgtggg aagccctgg 449
<210> 2
<211> 376
<212> DNA
<213> Homo sapiens(SEQ ID NO.2)
<400> 2
cccgagatgg agcccaatta ggtttgtttg aatgaggctt cagtacttta cagaatcgtt 60
gcctgcacat cttggaaaca cttgctggga ttacttcttc aggttaaccc aacagaaggc 120
tcgagaaggt atattgctgt tgacagtgag cgccacatgg atatagacaa agtatagtga 180
agccacagat gtatactttg tctatatcca tgtgatgcct actgcctcgg aattcaaggg 240
gctactttag gagcaattat cttgtttact aaaactgaat accttgctat ctctttgata 300
catttttaca aagctgaatt aaaatggtat aaattaaatc acttttttgg ccggccgatt 360
ccgttgtggt tcgtga 376
<210> 3
<211> 582
<212> DNA
<213> Homo sapiens(SEQ ID NO.3)
<400> 3
atggcccgcg cacgccagga gggcagctcc ccggagcccg tagagggcct ggcccgcgac 60
ggcccgcgcc ccttcccgct cggccgcctg gtgccctcgg cagtgtcctg cggcctctgc 120
gagcccggcc tggctgccgc ccccgccgcc cccaccctgc tgcccgctgc ctacctctgc 180
gcccccaccg ccccacccgc cgtcaccgcc gccctggggg gttcccgctg gcctgggggt 240
ccccgcagcc ggccccgagg cccgcgcccg gacggtcctc agccctcgct ctcgctggcg 300
gagcagcacc tggagtcgcc cgtgcccagc gccccggggg ctctggcggg cggtcccacc 360
caggcggccc cgggagtccg cggggaggag gaacagtggg cccgggagat cggggcccag 420
ctgcggcgga tggcggacga cctcaacgca cagtacgagc ggcggagaca agaggagcag 480
cagcggcacc gcccctcacc ctggagggtc ctgtacaatc tcatcatggg actcctgccc 540
ttacccaggg gccacagagc ccccgagatg gagcccaatt ag 582
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(SEQ ID NO.4)
<400> 4
tgtgactgcc gcggagactg tttctgc 27

Claims (5)

1.一种构建以肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞为双重靶向性的重组溶瘤腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
在腺病毒质粒AdEAsy-1纤维基因中HI loop的456T与457P之间引入编码RGD-4C肽的基因，构成靶向性骨架质粒；
将shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列以及促凋亡基因PUMA的基因序列连接至第一穿梭质粒pShuttle-CMV，构成第二穿梭质粒；
所述第一穿梭质粒采用由CMVp连接促凋亡基因PUMA-Alpha的CDS区，再连接shRNA抗ALDH1A1的基因序列，所述促凋亡基因PUMA-Alpha在NCBI上的登记号为NM_014417；
将包含人端粒逆转录酶启动子的溶瘤原件TERTp-E1A-E1B55K自质粒pTE-D19K中切下，连接在第二穿梭质粒pA信号序列的下游，即将人端粒逆转录酶启动子连接至第二穿梭质粒，构成第三穿梭质粒；
将第三穿梭质粒与靶向性骨架质粒在大肠杆菌中重组为重组溶瘤腺病毒载体；
将所述的重组溶瘤腺病毒载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述重组溶瘤腺病毒载体同时携带人端粒逆转录酶启动子、shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列、促凋亡基因PUMA的基因序列和编码RGD肽的基因序列，其中所述人端粒逆转录酶启动子的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述促凋亡基因PUMA的基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述编码RGD肽的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述病毒包装细胞为人胚肾293细胞。
4.由权利要求1-3任一项所述方法构建得到的重组溶瘤腺病毒。
5.权利要求4所述的重组溶瘤腺病毒在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。
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