CN110168078A - 具有降低的cd96/tigit表达的遗传修饰的nk-92细胞 - Google Patents

具有降低的cd96/tigit表达的遗传修饰的nk-92细胞 Download PDF

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Abstract

提供了包含抑制CD96和/或TIGIT的表达的一种或多种改变的CD96‑修饰的和TIGIT‑修饰的NK‑92细胞。还提供了产生这样的修饰的NK‑92细胞的方法和使用修饰的NK‑92细胞治疗患有或怀疑患有癌症的受试者的方法。

Description

具有降低的CD96/TIGIT表达的遗传修饰的NK-92细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年1月6日提交的U.S.临时申请No.62/443,621、2017年2月16日提交的U.S.临时申请No.62/459,877和2017年2月16日提交的U.S.临时申请No.62/459,873的优先权利益。各申请在此为所有目的通过引用全文并入。
背景技术
基于细胞的免疫疗法是治疗癌症的有力工具。使用表达嵌合抗原受体的工程化原代T细胞(CAR-T细胞)治疗淋巴恶性肿瘤患者的早期成功已显示出对于癌症治疗的巨大前景。尽管基于NK细胞的免疫疗法领域不像使用T细胞的免疫疗法那样先进，但基于使用天然杀伤(NK)细胞的免疫疗法也正在开发中。
NK-92是细胞溶解性癌细胞系，其在患有非霍奇金淋巴瘤的受试者的血液中发现，然后离体永生化。NK-92细胞来源于NK细胞，但缺乏正常NK细胞显示的主要抑制性受体，而保留了大部分活化受体。然而，NK-92细胞不攻击正常细胞，也不会在人体中引发不可接受的免疫排斥反应。NK-92细胞系的特征描述于例如WO1998/49268和美国专利申请号20020068044中。
如上所述，活化的NK-92(aNK)细胞的独特特征是它们表达多种活化受体(NKp30、NKp46、2B4、NKGD、E、CD28、CD226)，但缺乏大多数目前已知的抑制性KIR受体(Maki等，JHematother Stem Cell Res.10：369-83,2001)。这种独特的表型可以解释aNK细胞的广泛抗肿瘤活性。活化受体CD226，也称为DNAM1，属于与粘连蛋白和粘连蛋白样家族蛋白结合的受体家族，且在控制NK细胞介导的细胞毒性中具有至关重要的作用(Shibuya等，Immunity.4:573-81,1996)。该家族还包括抑制性受体CD96和TIGIT(Martinet等，Nat RevImmunol.15:243-54,2015)，其也由aNK细胞表达。所有三种受体共有共同的配体CD155(也称为PVR，脊髓灰质炎病毒受体)，它们以不同的亲和力与该配体结合(Martinet等，同上)。CD155表达通常在肿瘤细胞中上调，并且其过表达与癌症侵袭性和转移相关(Hirota等，Oncogene 24:2229-35,2005；Sloan等，BMC Cancer 4:73,2004)。CD96和TIGIT也被认为是NK细胞中的抑制性免疫检查点(Chan等，Nat Immunol.15:431-8,2014)。
NK-92细胞也已被评估为治疗某些癌症的潜在治疗剂。本发明提供了治疗癌症的基于NK-92的疗法的进展。
发明内容
在一个方面，本公开提供了CD96-修饰的NK-92细胞，其包含抑制CD96表达的修饰。在一些实施方案中，CD96-修饰的NK-92细胞包含靶向CD96并抑制其表达的干扰RNA。在一些实施方案中，与没有CD96靶向的改变NK-92细胞相比，CD96-修饰的NK-92细胞表达的CD96的量降低至少20％、至少30％、至少50％、至少60％或至少80％或更多。在一些实施方案中，CD96-修饰的NK-92细胞通过在NK-92细胞中敲低或敲除来产生。
在一些实施方案中，CD96-修饰的NK-92细胞在细胞表面上表达至少一种Fc受体，或至少一种嵌合抗原受体(CAR)，或至少一种个Fc受体和至少一种CAR两者。一些实施方案中，至少一种Fc受体是CD16或在位置176处(参考前体全长人CD16编号，包括作为位置1的N-末端甲硫氨酸)具有缬氨酸的CD16多肽。在一些实施方案中，至少一种Fc受体包含编码与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸序列，并且在176位包含缬氨酸。在一些实施方案中，至少一种Fc受体是FcγRIII。在一些实施方案中，CAR包含FcεRIγ的胞质结构域。在一些实施方案中，CAR靶向肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，CD96-修饰的NK-92细胞进一步表达细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是白介素-2或其变体。在一些实施方案中，细胞因子靶向于内质网。
另一方面，本公开提供了产生NK-92细胞的方法，该细胞相对于对照NK-92细胞表达降低水平的CD96，该方法包括遗传修饰NK-92细胞中的CD96表达。在一些实施方案中，遗传修饰CD96表达的步骤包括使待修饰的NK-92细胞与靶向CD96的干扰RNA接触。在一些实施方案中，靶向CD96的干扰RNA是siRNA、shRNA、微RNA或单链干扰RNA。
在一些实施方案中，遗传修饰CD96表达的步骤包括用锌指核酸酶(ZFN)、Tale效应域核酸酶(TALEN)或CRIPSR/Cas系统修饰CD96基因。在一些实施方案中，遗传修饰CD96基因表达包括：i)将成簇规则间隔短回文重复相关(Cas)蛋白引入NK-92细胞中，和ii)在待修饰的NK-92细胞中引入一个或多个核糖核酸，其中核糖核酸指导Cas蛋白与CD96基因序列的靶基序杂交，并且其中靶基序被切割。在一些实施方案中，Cas蛋白以蛋白质形式引入NK-92细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白通过引入Cas核酸编码序列而引入NK-92细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas9。在一些实施方案中，靶基序是20-核苷酸的DNA序列。在一些实施方案中，靶基序位于CD96基因序列(登录号NM_198196转录物变体1)的第二外显子中，其是CD96转录物变体2(登录号NM_005816)和CD96转录物变体3(登录号NM_001318889)共有的。在一些实施方案中，一个或多个核糖核酸选自SEQ ID NO.1-4。
在另一方面，本文提供了包含多个CD96-修饰的NK-92细胞(例如，如上所述)的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
在另外的方面，本文提供修饰的NK-92细胞系，其包含多个本文所述的任何CD96-修饰的NK-92细胞，例如在前面的段落中。在一些实施方案中，细胞系的细胞经历少于10次群体倍增。在一些实施方案中，细胞系的细胞在含有少于10U/ml的IL-2的培养基中培养。
在另一个方面，本文提供了治疗需要的患者的癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述(例如，在前面的段落中)的任何CD96-修饰的NK-92细胞系，从而治疗癌症。在一些实施方案中，该方法还包括施用治疗性抗体，例如治疗性单克隆抗体。在一些实施方案中，向患者施用约1×108至约1×1011个细胞/平方米患者体表面积。
在进一步的方面，本公开还提供了用于治疗癌症的试剂盒，其中所述试剂盒包括(a)如本文所公开的(例如，在前面的段落中)任何CD96-修饰的NK-92细胞组合物或细胞系，和(b)使用说明。在一些实施方案中，试剂盒还包括药学上可接受的赋形剂。
在另一个方面，本公开还提供了TIGIT-修饰的NK-92细胞，其包含抑制TIGIT表达的修饰。在一些实施方案中，TIGIT-修饰的NK-92细胞包含靶向TIGIT并抑制其表达的干扰RNA。在一些实施方案中，与没有TIGIT靶向的改变的NK-92细胞相比，由TIGIT-修饰的NK-92细胞表达的TIGIT的量降低至少20％、至少30％、至少50％、至少60％或至少80％或更多。在一些实施方案中，TIGIT-修饰的NK-92细胞通过敲低或敲除NK-92细胞中的TIGIT而产生。
在一些实施方案中，TIGIT-修饰的NK-92细胞在细胞表面上表达至少一种Fc受体，或至少一种嵌合抗原受体(CAR)，或至少一种Fc受体和至少一种CAR两者。在一些实施方案中，至少一种Fc受体是CD16或在位置176处(参考前体全长人CD16编号，包括作为位置1的N-末端甲硫氨酸)具有缬氨酸的CD16多肽。在一些实施方案中，至少一种Fc受体包含编码与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸序列，并且在位置176处包含缬氨酸。在一些实施方案中，至少一种Fc受体是FcγRIII。在一些实施方案中，CAR包含FcεRIγ的胞质结构域。在一些实施方案中，CAR靶向肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，TIGIT-修饰的NK-92细胞进一步表达细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是白介素-2或其变体。在一些实施方案中，细胞因子靶向于内质网。
另一方面，本文提供了产生相对于对照NK-92细胞表达降低水平的TIGIT的NK-92细胞的方法，该方法包括遗传修饰NK-92细胞中的TIGIT表达。在一些实施方案中，遗传修饰TIGIT表达的步骤包括使待修饰的NK-92细胞与靶向TIGIT的干扰RNA接触。在一些实施方案中，靶向TIGIT的干扰RNA是siRNA、shRNA、微RNA或单链干扰RNA。
在一些实施方案中，遗传修饰TIGIT表达的步骤包括用锌指核酸酶(ZFN)、Tale效应域核酸酶(TALEN)或CRIPSR/Cas系统修饰TIGIT基因。在一些实施方案中，遗传修饰TIGIT基因表达包括：i)将成簇规则间隔短回文重复相关(Cas)蛋白引入NK-92细胞中和ii)在待修饰的NK-92细胞中引入一个或多个核糖核酸，其中该核糖核酸指导Cas蛋白与TIGIT基因序列的靶基序杂交，并且其中靶基序被切割。在一些实施方案中，Cas蛋白以蛋白质形式引入NK-92细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白通过引入Cas核酸编码序列而引入NK-92细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas9。在一些实施方案中，靶基序是20-核苷酸的DNA序列。在一些实施方案中，靶基序在TIGIT基因序列(登录号NM_173799转录物)的第二外显子中。在一些实施方案中，一个或多个核糖核酸选自SEQ ID NO.5-8。
在进一步的方面，本发明还提供了包含多个如本文所述的(例如，在前述段落中)TIGIT-修饰的NK-92细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
另一方面，本文提供修饰的NK-92细胞系，其包含多个如本文所述的(例如，在前面的段落中)任何TIGIT-修饰的NK-92细胞。在一些实施方案中，细胞系的细胞经历少于10次群体倍增。在一些实施方案中，细胞系的细胞在含有少于10U/ml的IL-2的培养基中培养。
在另一个方面，本公开还提供了治疗需要的患者的癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的如本文所述的(例如，在前面的段落中)TIGIT-修饰的NK-92细胞系，从而治疗癌症。在一些实施方案中，该方法还包括施用治疗性抗体，例如治疗性单克隆抗体。在一些实施方案中，向患者施用约1×108至约1×1011个细胞/平方米患者体表面积。
在进一步的方面，本发明提供了用于治疗癌症的试剂盒，其中所述试剂盒包括(a)如本文所公开的(例如，在前面的段落中)任何TIGIT-修饰的NK-92细胞组合物或细胞系，以及(b)使用说明。在一些实施方案中，试剂盒还包括药学上可接受的赋形剂。
在进一步的方面，本文提供了修饰的NK-92，其包含抑制CD96表达的修饰和抑制TIGIT表达的修饰。在一些实施方案中，修饰的NK-92细胞包含靶向CD96并抑制CD96表达的干扰RNA；和靶向TIGIT并抑制TIGIT的表达的干扰RNA。在一些实施方案中，与不具有CD96修饰的对应NK-92细胞相比，细胞表达的CD96的降低至少50％、至少60％、至少70％或至少80％或更高；且与不具有TIGIT修饰的对应NK-92细胞相比，细胞表达的TIGIT的量降低至少50％、至少60％、至少70％或至少80％或更多。在一些实施方案中，修饰的NK-92细胞通过敲低或敲除细胞中的CD96表达，并敲除或敲除TIGIT表达而产生。在进一步的实施方案中，修饰的NK细胞在细胞表面上表达至少一种Fc受体，或至少一种嵌合抗原受体(CAR)，或至少一种Fc受体和至少一种CAR两者。在一些实施方案中，至少一种Fc受体是CD16或在位置176处(参考前体全长人CD16编号，包括作为位置1的N-末端甲硫氨酸)具有缬氨酸的CD16多肽。在一些实施方案中，至少一种Fc受体是FcγRIII。在具体的实施方案中，至少一种Fc受体包含编码与SEQ ID NO：13的氨基酸19-254具有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸序列，并且包含参照SEQ ID NO：13编号的位置176处的缬氨酸。在另外的实施方案中，修饰的NK-92表达包含FcεRIγ的胞质结构域的CAR。在一些实施方案中，CAR靶向肿瘤相关抗原。在进一步的实施方案中，修饰的NK-92细胞进一步表达细胞因子，例如白介素-2或其变体。在一些实施方案中，细胞因子例如IL-2靶向于内质网。
在另一方面，本公开提供了包含如本文所述的多个修饰的NK-92细胞的组合物，其具有如本文所述的(例如，在前面的段落中)降低的CD96和TIGIT表达。在一些实施方案中，这种组合物包含药学上可接受的赋形剂。
在另一个方面，本公开提供了包含多个如本文所述的(例如，在前面的段落中)修饰的NK-92细胞的细胞系，其具有降低的CD96和TIGIT表达。在一些实施方案中，细胞经历少于10次群体倍增。
在其他方面，本公开提供了用如本文所述修饰以减少CD96和TIGIT表达的NK-92细胞治疗癌症的试剂盒，组合物和方法。因此，在一些实施方案中，本文提供了治疗需要的患者的癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的包含经修饰以减少CD96和TIGIT表达的NK-92细胞的组合物或细胞系，从而治疗癌症。在一些实施方案中，该方法还包括施用治疗性抗体，例如治疗性单克隆抗体。在一些实施方案中，向患者施用约1×108至约1×1011个细胞/平方米患者体表面积。
在进一步的方面，本公开提供了一种产生表达降低水平的CD96和TIGIT的NK-92细胞的方法。在一些实施方案中，遗传修饰CD96和TIGIT靶基因各自的表达的步骤包括使待修饰的NK-92细胞与靶向每种靶基因的干扰RNA接触。在一些实施方案中，靶向一种或多种靶基因中的每一种的干扰RNA是siRNA、shRNA、微RNA或单链干扰RNA。在特定实施方案中，遗传修饰CD96和TIGIT靶基因各自的表达的步骤包括用锌指核酸酶(ZFN)、Tale效应域核酸酶(TALEN)或CRIPSR/Cas系统修饰每种靶基因。在一些实施方案中，遗传修饰每种靶基因的表达包括：i)将成簇规则间隔短回文重复相关(Cas)蛋白引入NK-92细胞中，和ii)在待修饰的NK-92细胞中引入一个或多个核糖核酸，其中该核糖核酸指导Cas蛋白与一种或多种靶基因各自的序列的靶基序杂交，并且其中靶基序被切割。在一些实施方案中，Cas蛋白以蛋白质形式引入NK-92细胞中。在其他实施方案中，Cas蛋白通过引入Cas编码序列而引入NK-92细胞中。示例性Cas蛋白包括Cas9。在一些实施方案中，靶基序是20-核苷酸的DNA序列。靶基序可以是，例如，每个靶基因的外显子。在一些实施方案中，与CD96中的靶基序杂交的一个或多个核糖核酸选自SEQ ID NO.1-4中，且与TIGIT中的靶基序杂交的一个或多个核糖核酸选自SEQ ID NO.5-8。
在进一步的方面，本公开提供CD226-修饰的NK-92细胞，其包含抑制CD226表达的修饰。在一些实施方案中，CD226-修饰的NK-92细胞包含靶向CD226并抑制其表达的干扰RNA。在一些实施方案中，与没有CD226靶向的改变的NK-92细胞相比，CD226-修饰的NK-92细胞表达的CD226的量降低至少20％、至少30％、至少50％、至少60％或至少80％或更多。在一些实施方案中，CD226-修饰的NK-92细胞通过敲低或敲除NK-92细胞中的CD226而产生。在一些实施方案中，遗传修饰CD226表达的步骤包括用锌指核酸酶(ZFN)、Tale效应域核酸酶(TALEN)或CRIPSR/Cas系统修饰CD226基因。在一些实施方案中，遗传修饰CD226基因表达包括：i)将成簇规则间隔短回文重复相关(Cas)蛋白引入NK-92细胞中和ii)在待修饰的NK-92细胞中引入一个或多个核糖核酸，其中该核糖核酸指导Cas蛋白与CD226基因序列的靶基序杂交，并且其中靶基序被切割。在一些实施方案中，Cas蛋白以蛋白质形式引入NK-92细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白通过引入Cas核酸编码序列而引入NK-92细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas9。在一些实施方案中，靶基序是20-核苷酸的DNA序列。
前面的一般性描述和以下的详细描述是示例性和说明性的，并且旨在提供对要求保护的本发明的进一步说明。从以下对本发明的详细描述，本领域技术人员将容易明白其他目的、优点和新颖特征。
附图说明
图1提供了显示NK-92细胞表达活化CD226及抑制性CD96和TIGIT受体的数据。如“材料和方法”中所述进行NK-92细胞中CD226、CD96和TIGIT表达的流式细胞术分析。
图2提供了说明亲本和敲除NK-92细胞中CD226、CD96和TIGIT受体表达的数据。如“材料和方法”中所述进行亲本Cas9-NK-92或粘连蛋白受体敲除NK-92细胞中CD226、CD96和TIGIT表达的流式细胞术分析。还显示了用特异性抗体染色的样品的MFI(平均荧光强度)值。
图3提供了显示MCF-7、SKBR-3和Daudi肿瘤细胞中的CD155表达的数据。如“材料和方法”中所述进行MCF-7、SKBR-3和Daudi细胞中CD155表达的流式细胞术分析。
图4提供了说明CD96和CD96/TIGIT KO NK-92细胞对于CD155阳性肿瘤靶标具有较高细胞毒性潜能的数据。以不同效应-靶细胞(E:T)比率在4小时细胞毒性测定中评估亲本或粘连蛋白受体KO NK-92细胞杀死CD155阳性MCF-7(上图)或SKBR-3(下图)肿瘤细胞的能力。每组条形代表从左到右列出的以下细胞类型：NK-92-WT、NK-92-Cas9、CD226-KO、CD96-KO、TIGIT-KO、CD96/TIGIT双重敲除。小棒图形表示三次独立实验的平均值+/-SEM。使用Student's t-检验计算P值。相对于亲本NK-92细胞，(*)，表示p<0.05；(**)，表示p<0.01。(#)表示相对于CD96-KO细胞p<0.05。
图5提供了显示CD96和CD96/TIGIT KO NK-92细胞的增加的细胞毒性潜能对于粘连蛋白结合受体的丧失是特异性的数据。以不同效应-靶细胞(E:T)比率在4小时细胞毒性测定中评估亲本或粘连蛋白受体KO NK-92细胞杀死CD155阴性Daudi肿瘤细胞的能力。每组条形代表从左到右列出的以下细胞类型：NK-92-WT、NK-92-Cas9、CD226-KO、CD96-KO、TIGIT-KO、CD96/TIGIT双重敲除。小棒图形表示四个独立实验的平均值+/-SEM。使用Student's t-检验计算P值。(*)表示相对于亲本NK-92细胞p<0.05。
图6是TIGIT和CD96在NK细胞功能中的作用的示意图。
具体实施方式
在一个方面，本发明提供具有降低的CD96表达的CD96-修饰的NK-92细胞和/或具有降低的TIGIT表达的TIGIT-修饰的NK-92细胞和产生这种细胞的方法。根据本发明的CD96-修饰的NK-92细胞在NK-92细胞中具有CD96靶向的改变；和TIGIT-修饰的NK-92细胞在NK-92细胞中具有TIGIT靶向的改变。本发明还提供了使用修饰的NK-92细胞治疗癌症的方法。
术语
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
在本说明书和随后的权利要求中，将参考许多术语，其应被定义为具有以下含义：
本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明。如这里所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。
所有数字表示(例如pH、温度、时间、浓度、量、分子量)，包括范围，在适当的情况下是以0.1或1.0的增量变化(+)或(-)的近似值。应理解，尽管并非总是明确说明，但所有数字表示之前可以有术语“约”。还应理解，尽管并非总是明确说明，但本文所描述的试剂仅仅是示例性的并且这些试剂的等同物是本领域已知的。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，并且该描述包括其中事件或情况发生的事例和其中不发生的事例。
术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由......组成”是指指定的材料或步骤以及不会实质上影响要求保护的本发明的基本和新颖特征的那些材料或步骤。“由......组成”是指排除多于痕量的其他成分和所述的实质方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
术语“天然杀伤(NK)细胞”是指在不存在特异性抗原刺激的情况下杀死靶细胞的免疫系统的细胞，并且没有根据MHC类的限制。靶细胞可以是肿瘤细胞或携带病毒的细胞。NK细胞的特征在于CD56的存在和CD3表面标志物的缺失。
术语“NK-92细胞”是指NK细胞系NK-92，其最初从患有非霍奇金淋巴瘤的患者获得。为了本发明的目的且除非另有说明，术语“NK-92”意指原始NK-92细胞系以及已被修饰(例如，通过引入外源基因)的NK-92细胞系、NK-92细胞克隆和NK-92细胞。NK-92细胞及其示例性和非限制性的修饰描述于美国专利号7,618,817、8,034,332和8,313,943中；这些专利全部引入本文作为参考。
如本文所用，术语“CD96靶向的改变”是指NK-92细胞中CD96的DNA或RNA的结构或性质的改变，例如，敲除或敲低CD96表达，其导致CD96蛋白水平的降低。因此，CD96靶向的改变可以靶向CD96基因或CD96基因转录物。人CD96蛋白质序列的实例可在Uniprotein编号P40200下获得。人CD96位于染色体3上，并由HGNC定位于区域3q13.13-q13.2。根据GenomeReference Consortium Human Build 38补丁版本7(GRCh38.p7)套装，CD96位于Chr 3NC_000003.12(111542079..111665996)。术语“CD96”还包括由CD96基因编码的等位基因变体，包括转录物变体2和3。
术语“CD96-修饰的NK-92细胞”是指具有CD96靶向的改变(其导致CD96表达量的降低)的NK-92细胞。遗传修饰的NK-92细胞可以进一步包括其他遗传改变，例如降低TIGIT表达的修饰，或编码自杀基因和Fc受体或嵌合抗原受体(CAR)的转基因。
术语“CD96-未修饰的NK-92细胞”是指不具有CD96靶向的改变的NK-92细胞。
本文所用的术语“TIGIT靶向的改变”是指NK-92细胞中TIGIT的DNA或RNA的结构或性质的改变，例如，敲除或敲低TIGIT表达，其导致TIGIT蛋白质水平降低。因此，TIGIT靶向的改变可靶向TIGIT基因或TIGIT基因转录物。人TIGIT蛋白质序列的实例可在Uniprotein编号Q495A1下获得。人TIGIT位于3号染色体上，并定位到3q13.31区域。根据GenomeReference Consortium Human Build 38补丁版本7(GRCh38.p7)套装，TIGIT位于chr3 NC_000003.12(114293986..114310288)。术语“TIGIT”还包括由TIGIT染色体基因座处的基因编码的示例性参考序列的等位基因变体。
术语“TIGIT-修饰的NK-92细胞”是指具有TIGIT靶向的改变(其导致TIGIT表达量的降低)的NK-92细胞。遗传修饰的NK-92细胞可以进一步包括其他遗传改变，例如降低CD96表达的修饰，或编码Fc受体、自杀基因或嵌合抗原受体(CAR)的转基因。
术语“TIGIT-未修饰的NK-92细胞”是指不具有TIGIT靶向的改变的NK-92细胞。
术语“非照射的NK-92细胞”是指未经照射的NK-92细胞。照射使细胞不能生长和增殖。在一些实施方案中，设想用于施用的NK-92细胞在治疗患者之前在治疗机构或某个其他地点进行照射，因为照射和输注之间的时间应不长于4小时以便保持最佳活性。或者，NK-92细胞可以通过另一种机制灭活。
如本文所用，NK-92细胞的“失活”使它们不能生长。灭活还可能与NK-92细胞的死亡有关。设想NK-92细胞可以在其已经有效地清除与治疗应用中的病理学相关的细胞的离体样品之后，或者在它们已经在哺乳动物体内驻留足以有效地杀灭体内驻留的许多或所有靶细胞的时间段之后被灭活。作为非限制性实例，可以通过施用NK-92细胞对其敏感的灭活剂诱导灭活。
如本文所用，术语“细胞毒性的”和“细胞裂解性的”当用于描述效应细胞例如NK细胞的活性时，旨在是同义的。通常，细胞毒性活性涉及通过各种生物、生物化学或生物物理机制中的任一种杀灭靶细胞。细胞裂解更具体地涉及其中效应物裂解靶细胞的质膜、从而破坏其物理完整性的活性。这导致杀灭靶细胞。不希望受到理论的束缚，据信NK细胞的细胞毒性作用是由于细胞溶解引起的。
关于细胞/细胞群体的术语“杀灭”旨在包括将导致该细胞/细胞群体死亡的任何类型的操作。
术语“Fc受体”是指在某些细胞(例如自然杀伤细胞)的表面上发现的蛋白质，其通过结合到称为Fc区的抗体部分而导致免疫细胞的保护功能。抗体的Fc区与细胞的Fc受体(FcR)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。FcR基于其识别的抗体类型进行分类。例如，Fc-γ受体(FCγR)结合IgG类抗体。FCγRIII-A(也称为CD16)是结合IgG抗体并激活ADCC的低亲和力Fc受体。FCγRIII-A通常在NK细胞上发现。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，不管是脱氧核糖核苷酸或是核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，核苷酸结构的修饰则可以在多核苷酸组装之前或之后施加。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子二者。除非另有规定或要求，本发明的任何实施方案中多核苷酸包括双链形式和已知或预期构成双链形式的两条互补单链形式中的任一条。
多核苷酸由四种核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；和当多核苷酸是RNA时替代胸腺嘧啶的尿嘧啶(U)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。
术语“同一性百分比”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列同一性。同一性百分比可以通过比较可以为比较目的而对准的每个序列中的位置而确定。当比较序列中的位置被相同碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是相同的。如本文所用，短语“同源”或“变体”核苷酸序列或者“同源”或“变体”氨基酸序列是指特征为至少规定百分比的核苷酸水平或氨基酸水平的同一性的序列。同源核苷酸序列包括编码本文所述的核苷酸序列的天然存在的等位基因变体和突变的那些序列。同源核苷酸序列包括编码除人以外的哺乳动物物种的蛋白质的核苷酸序列。同源氨基酸序列包括含有保守氨基酸置换和其多肽具有相同结合和/或活性的那些氨基酸序列。在一些实施方式中，同源核苷酸或氨基酸序列与比较序列相比具有至少60％或更大、例如至少70％、或至少80％、或至少85％或更大的同一性。在一些实施方式中，同源核苷酸或氨基酸序列与比较序列相比具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，同源氨基酸序列具有不超过15个，不超过10个，不超过5个或不超过3个保守氨基酸置换。同一性百分比可以通过例如使用默认设置的Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，UNIX第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，Madison Wis.)测定，其使用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489)。
术语“表达”是指基因产物如RNA或蛋白质的产生。术语“瞬时表达”是指来自未掺入细胞的基因组中的多核苷酸的表达。
术语“细胞因子”或“多种细胞因子”是指影响免疫系统的细胞的一般类别的生物分子。用于实施本发明的示例性细胞因子包括但不限于干扰素和白介素(IL)，特别是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。
术语“载体”是指包含完整复制子的非染色体核酸，使得载体当例如通过转化方法被置于受纳细胞内时可以复制。载体可以在一种细胞类型(如细菌)中复制，但是在另外的细胞(如哺乳动物细胞)中具有有限的复制能力。载体可以是病毒的或非病毒的。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸DNA；与阳离子脂质复合的DNA(单独或与阳离子聚合物组合)；阴离子和阳离子脂质体；DNA-蛋白复合物和包含与阳离子聚合物(如异质聚赖氨酸、限定长度的寡肽和聚乙烯亚胺)缩合的DNA的颗粒，在一些情况下被包含在脂质体中；以及使用包含病毒和聚赖氨酸-DNA的三元复合物。
术语“靶基序”是指限定结合分子将与其结合的核酸部分的核酸序列，条件是存在用于结合的充分条件。
术语“干扰RNA”是指RNA核酸分子，其是双链或单链的，并且能够实现针对敲低靶基因表达的RNA干扰机制的诱导。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且无论是体外还是原位，是指可适用于本文所述的方法的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人。
术语“受体(recipient)”是指在治疗期间施用NK-92细胞(无论是修饰的还是未经修饰的)的患者。
术语“治疗”或“处理”包括在受试者如人中治疗本文所述的疾病或病症，并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发生；(ii)缓解疾病或病症，即引起病症消退；(iii)减缓疾病的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。
术语“施用”或“给予”治疗剂如NK-92细胞包括引入或递送治疗剂以执行预期功能的任何途径。可以通过适合于递送药剂的任何途径进行施用。因此，递送途径可包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下递送。在一些实施方案中，NK-92细胞直接施用于肿瘤，例如，通过注射到肿瘤中。
术语“接触”(即，使多核苷酸序列与成簇规则间隔短回文重复相关(Cas)蛋白和/或核糖核酸接触)旨在包括在体外细胞中将Cas蛋白和/或核糖核酸一起孵育(例如，将Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸添加到培养的细胞)。在一些实施方案中，术语“接触”不意图包括细胞体内暴露于本文公开的Cas蛋白和/或核糖核酸，其可以天然存在于微生物(即，细菌)中。使靶多核苷酸序列与本文公开的Cas蛋白和/或核糖核酸接触的步骤可以以任何合适的方式进行。例如，细胞可以在贴壁培养中或在悬浮培养中处理。应当理解，与本文公开的Cas蛋白和/或核糖核酸接触的细胞也可以同时或随后与另一药剂(如生长因子或其他分化剂或环境)接触以稳定细胞或进一步分化细胞。
如本文所用的术语“敲除”包括以干扰靶多核苷酸序列的功能的方式删除靶多核苷酸序列的全部或一部分。例如，可以通过在靶多核苷酸序列的功能结构域中诱导靶多核苷酸序列的缺失来改变靶多核苷酸序列而实现敲除。本领域技术人员将容易理解如何使用各种遗传方法，例如CRISPR/Cas系统、ZFN、TALEN、TgAgo，以基于本文所述的细节敲除靶多核苷酸序列或其部分。
如本文所用，术语“敲低”是指与不包含减少表达的遗传修饰的对应对照细胞中靶mRNA或相应蛋白质的表达相比，遗传修饰细胞中靶mRNA或相应蛋白质表达的可测量的降低。本领域技术人员将容易理解如何使用各种遗传方法，例如siRNA、shRNA、微RNA、反义RNA或其他RNA介导的抑制技术，以基于本文所述细节敲低靶多核苷酸序列或其部分。
本文中使用的术语“降低”、“减少”、“减小”和“缩减”均指与参考水平相比降低至少10％，例如降低至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或多至且包括100％的降低(即与参考样品相比不存在的水平)，或与参考水平相比在10-100％之间的任何降低。
术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、肿瘤或恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、癌瘤和肉瘤。示例性癌症包括脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和成神经管细胞瘤。其他实例包括霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰腺胰岛瘤(pancreatic insulanoma)、恶性类癌瘤、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺的肿瘤以及前列腺癌。
NK-92细胞
NK-92细胞系是从诊断患有非霍奇金淋巴瘤的一名50岁男性的外周血单核细胞(PBMC)建立的一种人IL-2依赖性NK细胞系(Gong等人，Leukemia.8：652-8(1994))。NK-92细胞系表达CD56亮、CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45和CD54表面标志物，但不呈现CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23和CD34标志物。与正常NK细胞不同，NK-92缺乏大多数杀伤细胞抑制性受体(KIR)的表达(Maki等，J Hematother Stem Cell Res.10：369-83(2001))。在NK-92细胞的表面上仅检测到KIR2DL4，一种由所有NK细胞表达的具有激活功能和抑制潜能的KIR受体。
NK-92细胞在培养物中的生长依赖于重组白介素2(rIL-2)的存在，其中低至1IU/mL的剂量足以维持增殖。IL-7和IL-12不支持长期生长，所测试的其他细胞因子(包括IL-1α、IL-6、肿瘤坏死因子α、干扰素α和干扰素γ)也不支持。NK-92即使在1:1的低效应:靶细胞(E:T)比率下也具有高细胞毒性。Gong等，同上。
NK-92细胞包括但不限于例如美国专利号7,618,817、8,034,332和8,313,943，美国专利申请公开号2013/0040386中描述的那些，所有这些均通过引用全文并入本文。NK92细胞是本领域普通技术人员已知的并且容易从NantKwest，Inc.获得。说明性NK-92细胞系包括野生型NK-92、NK-92-CD16、NK-92-CD16-γ、NK-92-CD16-ζ、NK-92-CD16(F176V)、NK-92MI和NK-92CI。
降低CD96的表达
本公开提供了CD96-修饰的NK-92细胞，其包含抑制CD96表达的CD96靶向的改变。在一些实施方案中，CD96-修饰的NK-92细胞通过破坏CD96基因而产生。用于破坏CD96基因的方法包括但不限于使用锌指核酸酶(ZFN)、Tale效应域核酸酶(TALEN)和CRIPSR/Cas系统的方法。
CRISPR
在一些实施方案中，使用CRISPR/CAS方法进行CD96的敲除或敲低。CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白和至少一至两个能够指导Cas蛋白至CD96基因序列中的靶基序并与之杂交的核糖核酸。然后Cas蛋白切割靶基序并导致双链断裂或单链断裂结果。可以使用能够改变细胞中的靶多核苷酸序列的任何CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR Cas系统是CRISPR I型系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是CRISPR II型系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是CRISPR V型系统。
用于本发明的Cas蛋白可以是天然存在的Cas蛋白或其功能衍生物。“功能衍生物”包括但不限于天然序列的片段和天然序列多肽及其片段的衍生物，条件是它们具有与相应的天然序列多肽共同的生物学活性。本文考虑的生物活性是功能衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”包括多肽的氨基酸序列变体、共价修饰和其融合物，例如衍生物Cas蛋白。合适的Cas多肽或其片段的衍生物包括但不限于Cas蛋白或其片段的突变体、融合物、共价修饰。
在一些实施方案中，本发明中使用的Cas蛋白是Cas9或其功能衍生物。在一些实施方案中，Cas9蛋白来自化脓性链球菌。Cas 9含有2个核酸内切酶结构域，包括切割与crRNA不互补的靶DNA的RuvC样结构域，以及切割与crRNA互补的靶DNA的HNH核酸酶结构域。Cas9的双链核酸内切酶活性还需要短的保守序列(2-5个核苷酸)(称为原型间隔区相关基序(PAM))紧接着靶序列中靶基序的-3'侧。
在一些实施方案中，将Cas蛋白以多肽形式引入NK-92细胞中。在某些实施方案中，Cas蛋白可以与本领域熟知的细胞穿透多肽或细胞穿透肽缀合或融合。细胞穿透肽的非限制性实例包括Milletti F，“Cell-penetrating peptides:classes,orgin and currentlandscape”Drug Discov.Today 17：850-860,2012中提供的那些，其相关公开内容通过引用整体并入本文。在某些情况下，对未修饰的NK-92细胞进行基因工程改造以产生Cas蛋白。
在一些实施方案中，Cas蛋白由指导RNA引导到的靶基因中的靶基序长度为17至23bp。在一些实施方案中，靶基序的长度为至少20bp。在一些实施方案中，靶基序是20-核苷酸的DNA序列。在一些实施方案中，靶基序是20-核苷酸的DNA序列，并且紧接在被Cas蛋白识别的称为原型间隔区相关基序(PAM)的短保守序列之前。在一些实施方案中，PAM基序是NGG基序。在一些实施方案中，靶基因的靶基序在外显子内。
在一些实施方案中，可以选择靶基序以最小化本发明的CRISPR/Cas系统的脱靶效应。在一些实施方案中，选择靶基序使得当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列比较时，其含有至少两个错配。在一些实施方案中，选择靶基序使得当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列比较时，其含有至少一个错配。本领域技术人员将理解，可以使用多种技术来选择合适的靶基序以最小化脱靶效应(例如，生物信息学分析)。
能够将Cas蛋白引导至靶基因序列中的靶基序并与之杂交的核糖核酸被称为单指导RNA(“sgRNA”)。可以根据所用的特定CRISPR/Cas系统和靶多核苷酸的序列来选择sgRNA，如本领域技术人员所理解的。在一些实施方案中，还可以选择一至两个核糖核酸以最小化与除靶多核苷酸序列之外的核酸序列的杂交。在一些实施方案中，该一至两个核糖核酸与当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列比较时含有至少两个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，该一至两个核糖核酸与当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列比较时含有至少一个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，该一至两个核糖核酸设计为与紧邻Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交。在一些实施方案中，该一至两个核糖核酸中的每一个设计与紧邻由Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序(其侧邻位于靶基序之间的突变等位基因)紧邻的靶基序杂交。指导RNA也可以使用容易获得的软件设计，例如，在网站crispr.mit.edu可得的。根据本领域已知的方法，可以将一种或多种sgRNA转染到NK-92细胞中，其中Cas蛋白通过转染存在。在一些实施方案中，靶向CD96的sgRNA是选自SEQ ID NO：1-4的一种或多种sgRNA。
在各种出版物中描述了使用CRISPR/Cas系统来降低基因表达的方法，例如美国专利申请公开号2014/0170753，其公开内容通过引用整体并入本文。
锌指核酸酶(ZFN)
在一些实施方案中，通过使用锌指核酸酶(ZFN)敲除NK-92细胞中的CD96产生包含CD96靶向的改变的修饰NK-92细胞。ZFN是融合蛋白，其包含FokI内切核酸酶的非特异性切割结构域(N)和锌指蛋白(ZFP)。一对ZNF涉及识别靶基因中的特定基因座-一个识别上游序列和另一个识别待修饰位点下游的序列-并且ZFN的核酸酶部分在特定基因座处切割并导致靶CD96基因的敲除。使用ZFN减少基因表达的方法是众所周知的，例如，如美国专利号9,045,763及Durai等人，“Zinc Finger Nucleases:Custom-Designed Molecular Scissorsfor Genome Engineering of Plant and Mamalian cells”Nucleic Acid Research 33(18)：5978-5990(2005)中所公开的，其公开内容通过引用整体并入本文。
转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)
在一些实施方案中，通过用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)敲除CD96产生包含靶向改变的CD96-修饰的NK-92细胞。TALEN类似于ZFN，因为它们成对结合在基因组位点周围并指导相同的非特异性核酸酶FoKI在特定位点切割基因组，而不是识别DNA三联体，每个结构域识别单个核苷酸。使用ZFN减少基因表达的方法也是众所周知的，例如，如美国专利号9,005,973和Christian等，“Targeting DNA Double-Dtrand Breaks with TALEffector Nulceases”，Genetics 186(2)：757-761(2010)中公开的，其公开内容通过引用整体并入。
敲低NK-92细胞中的CD96表达
在一些实施方案中，通过用干扰RNA敲低一个CD96产生包含靶向的改变的CD96-修饰的NK-92细胞。当在体内引入时，干扰RNA与其他蛋白质形成RNA诱导沉默复合物(“RISC”)并启动称为RNA干扰(RNAi)的过程。在RNAi过程中，RISC合并单链干扰RNA或双链干扰RNA的一条链。并入的链充当RISC识别互补的mRNA转录物的模板。一旦确定互补mRNA，RISC中的蛋白质组分激活并切割mRNA，导致靶基因表达的敲低。用于敲低靶基因表达的干扰RNA分子的非限制性实例包括siRNA、短发夹RNA(shRNA)、单链干扰RNA和微RNA(miRNA)。使用这些干扰RNA的方法是本领域技术人员公知的。
在一个实施方案中，干扰RNA是siRNA。siRNA是双链RNA，其通常小于30个核苷酸长。通过siRNA的基因沉默开始于siRNA的一条链并入称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的核糖核蛋白复合物中。并入RISC中的链识别与并入的siRNA链至少部分互补的mRNA分子，且然后RISC切割这些靶mRNA或抑制它们的翻译。
在一个实施方案中，干扰RNA是微RNA。微RNA是小的非编码RNA分子，其可以与mRNA分子内的互补序列杂交，从而导致mRNA的切割，或通过缩短其聚(A)尾巴使mRNA失稳定。
在一个实施方案中，干扰RNA是单链干扰RNA。单链还可以以与双链siRNA类似的方式实现mRNA沉默，尽管效率低于双链siRNA。单链干扰RNA通常具有约19至约49个核苷酸的长度，同样对于上述双链siRNA。
短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA)是具有紧密发夹转角的人工RNA分子，其可用于通过其在细胞中产生的siRNA沉默靶基因表达。shRNA在细胞中的表达通常通过质粒的递送或通过病毒或细菌载体来实现。合适的载体包括但不限于腺相关病毒(AAV)、腺病毒和慢病毒。shRNA是siRNA的有利介质，因为它具有相对低的降解和转换率。
本文使用的干扰RNA可以通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代或修饰而与天然存在的RNA不同。非核苷酸物质可以在5'末端、3'末端或内部与干扰RNA结合。干扰RNA可以包含的相对于天然存在RNA的修饰的非限制性实例公开于美国专利号8,399,653中，其通过引用整体并入本文。这些修饰通常设计用于增加干扰RNA的核酸酶抗性，改善细胞摄取，增强细胞靶向，帮助追踪干扰RNA，进一步改善稳定性，或降低干扰素途径活化的可能性。例如，干扰RNA可以在突出端的末端包含嘌呤核苷酸。例如，借助于吡咯烷接头将胆固醇缀合到siRNA分子的有义链的3'末端也为siRNA提供稳定性。
本文使用的干扰RNA通常长度为约10-60、10-50或10-40个(双链体)核苷酸，更通常长度为约8-15、10-30、10-25或10-25个(双链体)核苷酸，长度为约10-24个(双链体)核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列长度为10-60、10-50、10-40、10-30、10-25或10-25个核苷酸，长度为约10-24、11-22或11-23个核苷酸，且双链siRNA长度为约10-60、10-50、10-40、10-30、10-25或10-25个碱基对)。
用于选择RNAi的目的基因中的靶基序的技术是本领域技术人员已知的，例如，如Tuschl，T等，“The siRNA User Guide”，2004年5月6日修订中所公开的，其可在洛克菲勒大学网站上找到；Ambion网站上的Technical Bulletin#506，“siRNA Design Guidelines”，Ambion Inc.；以及其他基于网页的设计工具，例如，Invitrogen、Dharmacon、IntegratedDNA Technologies、Genscript或Proligo网站。初始检索参数可包括35％至55％之间的G/C含量和19至27个核苷酸之间的siRNA长度。靶序列可位于mRNA的编码区中或者5'或3'非翻译区中。靶序列可用于衍生干扰RNA分子，例如本文所述的那些。
可以通过使用本领域熟知的方法测量CD96mRNA或蛋白质的量来评估敲除或敲低的效率，例如，定量PCR、蛋白质印迹、流式细胞术等和类似技术。在一些实施方案中，评估CD96蛋白的水平以评价敲除或敲低效率。在某些实施方案中，靶基因表达降低的效率为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少60％或至少80％，或至少90％或更高，如与不具有CD96靶向的改变的相应NK-92细胞相比的。在某些实施方案中，降低效率为约10％至约90％。在某些实施方案中，降低效率为约30％至约80％。在某些实施方案中，降低效率为约50％至约80％。在一些实施方案中，降低效率大于或等于约80％。
降低TIGIT的表达
本公开另外提供了TIGIT-修饰的NK-92细胞，其包含抑制TIGIT表达的TIGIT靶向的改变。在一些实施方案中，TIGIT-修饰的NK-92细胞通过破坏TIGIT基因而产生。用于破坏TIGIT基因的方法包括但不限于使用锌指核酸酶(ZFN)、Tale效应域核酸酶(TALEN)和CRIPSR/Cas系统的方法。
CRISPR
在一些实施方案中，使用CRISPR/CAS方法进行TIGIT的敲除或敲低。CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白和能够将Cas蛋白引导至TIGIT基因序列中的靶基序并与之杂交的至少一至两个核糖核酸。然后Cas蛋白切割靶基序并导致双链断裂或单链断裂结果。可以使用能够改变细胞中的靶多核苷酸序列的任何CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，CRISPR Cas系统是CRISPR I型系统。在一些实施方案中，CRISPR/Ca系统是CRISPR II型系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是CRISPR V型系统。
用于本发明的Cas蛋白可以是天然存在的Cas蛋白或其功能衍生物。“功能衍生物”包括但不限于天然序列的片段和天然序列多肽及其片段的衍生物，条件是它们具有与相应的天然序列多肽共同的生物学活性。本文考虑的生物活性是功能衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”包括多肽的氨基酸序列变体、共价修饰和其融合物，例如衍生物Cas蛋白。Cas多肽或其片段的合适的衍生物包括但不限于Cas蛋白或其片段的突变体、融合物、共价修饰。
在一些实施方案中，本发明中使用的Cas蛋白是Cas9或其功能衍生物。在一些实施方案中，Cas9蛋白来自化脓性链球菌。Cas9含有2个核酸内切酶结构域，包括切割与crRNA不互补的靶DNA的RuvC样结构域和切割与crRNA互补的靶DNA的HNH核酸酶结构域。Cas9的双链核酸内切酶活性还需要短的保守序列(2-5个核苷酸)(称为原型间隔区相关基序(PAM))紧接着靶序列中靶基序的-3'侧。
在一些实施方案中，将Cas蛋白以多肽形式引入NK-92细胞中。在某些实施方案中，Cas蛋白可以与本领域熟知的细胞穿透多肽或细胞穿透肽缀合或融合。细胞穿透肽的非限制性实例包括Milletti F，“Cell-penetrating peptides:classes,orgin and currentlandscape”Drug Discov.Today 17：850-860,2012中提供的那些，其相关公开内容通过引用整体并入本文。在某些情况下，对未修饰的NK-92细胞进行基因工程改造以产生Cas蛋白。
在一些实施方案中，Cas蛋白质由指导RNA引导至的靶基因中的靶基序长度为17至23bp。在一些实施方案中，靶基序的长度为至少20bp。在一些实施方案中，靶基序是20-核苷酸的DNA序列。在一些实施方案中，靶基序是20-核苷酸的DNA序列且紧接在被Cas蛋白识别的称为原型间隔区相关基序(PAM)的短保守序列之前。在一些实施方案中，PAM基序是NGG基序。在一些实施方案中，靶基因的靶基序在外显子内。
在一些实施方案中，可以选择靶基序以最小化本发明的CRISPR/Cas系统的脱靶效应。在一些实施方案中，选择靶基序使得当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列比较时，其含有至少两个错配。在一些实施方案中，选择靶基序使得当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列比较时，其含有至少一个错配。本领域技术人员将理解，可以使用多种技术来选择合适的靶基序以最小化脱靶效应(例如，生物信息学分析)。
能够将Cas蛋白引导至靶基因序列中的靶基序并与其杂交的核糖核酸被称为单指导RNA(“sgRNA”)。可以根据所用的特定CRISPR/Cas系统和靶多核苷酸的序列来选择sgRNA，如本领域技术人员所理解的。在一些实施方案中，该一至两个核糖核酸还可以选择为最小化与除靶多核苷酸序列之外的核酸序列的杂交。在一些实施方案中，该一至两个核糖核酸与当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列比较时含有至少两个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，该一至两个核糖核酸与当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列比较时含有至少一个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，该一至两个核糖核酸设计为与紧邻Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交。在一些实施方案中，该一至两个核糖核酸中的每一个设计为与紧邻由Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序(其侧邻位于靶基序之间的突变等位基因)的靶基序杂交。也可以使用易于获得的软件设计指导RNA，例如，在crispr.mit.edu网站上。根据本领域已知的方法，可以将一种或多种sgRNA转染到NK-92细胞中，其中Cas蛋白通过转染而存在。在一些实施方案中，靶向TIGIT的sgRNA是选自SEQ IDNO：5-8的一种或多种sgRNA。
在各种出版物(例如US专利公开号2014/0170753)中描述了使用CRISPR/Cas系统来降低基因表达的方法，其公开内容通过引用整体并入本文。
锌指核酸酶(ZFN)
在一些实施方案中，通过使用锌指核酸酶(ZFN)敲除NK-92细胞中的TIGIT来产生包含TIGIT靶向的改变的修饰的NK-92细胞。ZFN是融合蛋白，其包含FokI内切核酸酶的非特异性切割结构域(N)和锌指蛋白(ZFP)。一对ZNF涉及识别靶基因中的特定基因座-一个识别待修饰位点上游的序列和另一个识别下游的序列-并且ZFN的核酸酶部分在特定基因座处切割并导致目标TIGIT基因的敲除。使用ZFN减少基因表达的方法是众所周知的，例如，如美国专利号9,045,763及Durai等，“Zinc Finger Nucleases:Custom-Designed MolecularScissors for Genome Engineering of Plant and Mamalian Cells”Nucleic AcidResearch 33(18):5978-5990(2005)中所公开的，其公开内容通过引用整体并入本文。
转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)
在一些实施方案中，通过用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)敲除TIGIT产生包含靶向的改变的TIGIT-修饰的NK-92细胞。TALEN类似于ZFN，因为它们成对结合在基因组位点周围并指导相同的非特异性核酸酶FoKI在特定位点处切割基因组，而不是识别DNA三联体，每个结构域识别单个核苷酸。使用ZFN减少基因表达的方法也是众所周知的，例如，如美国专利号9,005,973及Christian等“Targeting DNA Double-Dtrand Breaks withTAL Effector Nulceases”，Genetics 186(2):757-761(2010)中所公开的，其公开内容通过引用整体并入。
高低NK-92细胞中的TIGIT表达
在一些实施方案中，通过用干扰RNA敲低一个TIGIT产生包含靶向的改变的TIGIT-修饰的NK-92细胞。当在体内引入时，干扰RNA与其他蛋白质形成RNA诱导沉默复合物(“RISC”)并启动称为RNA干扰(RNAi)的过程。在RNAi过程中，RISC合并单链干扰RNA或双链干扰RNA的一条链。并入的链充当RISC识别互补的mRNA转录物的模板。一旦识别互补mRNA，RISC中的蛋白质组分激活并切割mRNA，从而导致靶基因表达的敲低。用于敲低靶基因表达的干扰RNA分子的非限制性实例包括siRNA、短发夹RNA(shRNA)、单链干扰RNA和微RNA(miRNA)。使用这些干扰RNA的方法是本领域技术人员公知的。
在一个实施方案中，干扰RNA是siRNA。siRNA是双链RNA，其通常小于30个核苷酸长。siRNA的基因沉默开始于siRNA的一条链并入称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的核糖核蛋白复合物中。并入RISC中的链识别与并入的siRNA链至少部分互补的mRNA分子，然后RISC切割这些靶mRNA或抑制它们的翻译。
在一个实施方案中，干扰RNA是微RNA。微RNA是小的非编码RNA分子，其可以与mRNA分子内的互补序列杂交，从而导致mRNA的切割，或通过缩短其聚(A)尾使mRNA失稳定。
在一个实施方案中，干扰RNA是单链干扰RNA。单链也可以以与双链siRNA类似的方式实现mRNA沉默，尽管效率低于双链siRNA。单链干扰RNA通常具有约19至约49个核苷酸的长度，同样对于上述双链siRNA。
短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA)是具有紧密发夹转角的人工RNA分子，其可用于通过其在细胞中产生的siRNA沉默靶基因表达。shRNA在细胞中的表达通常通过质粒的递送或通过病毒或细菌载体来实现。合适的载体包括但不限于腺相关病毒(AAV)、腺病毒和慢病毒。shRNA是siRNA的有利介质，因为它具有相对低的降解和转换率。
本文使用的干扰RNA可以通过添加、缺失、取代或修饰一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同。非核苷酸物质可以在5'末端、3'末端或内部与干扰RNA结合。干扰RNA可以包含的相对于天然存在RNA的修饰的非限制性实例公开于美国专利号8,399,653中，其全部内容通过引用并入本文。这些修饰通常设计用于增加干扰RNA的核酸酶抗性，改善细胞摄取，增强细胞靶向，帮助追踪干扰RNA，进一步改善稳定性或降低干扰素途径活化的可能性。例如，干扰RNA可以在突出端的末端包含嘌呤核苷酸。例如，借助于吡咯烷接头将胆固醇与siRNA分子的有义链的3'末端缀合也为siRNA提供稳定性。
本文使用的干扰RNA通常长度为约10-60、10-50或10-40个(双链体)核苷酸，更通常长度为约8-15、10-30、10-25或10-25个(双链体)为核苷酸，长度为约10-24个(双链体)核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列长度为10-60、10-50、10-40、10-30、10-25或10-25个核苷酸，长度为约10-24、11-22或11-23个核苷酸，且双链siRNA长度为约10-60、10-50、10-40、10-30、10-25或10-25个碱基对)。
用于选择RNAi的目标基因中的靶基序的技术是本领域技术人员已知的，例如，如Tuschl，T等，“The siRNA User Guide”，2004年5月6日修订的，可在洛克菲勒大学网站上获得；Ambion网站上的Technical Bulletin#506，“siRNA Design Guidelines”，AmbionInc.；及其他基于网页的设计工具，例如，Invitrogen、Dharmacon、Integrated DNATechnologies、Genscript或Proligo网站。初始检索参数可包括35％至55％之间的G/C含量和19至27个核苷酸之间的siRNA长度。靶序列可位于mRNA的编码区中或者5'或3'非翻译区中。靶序列可用于衍生干扰RNA分子，例如本文所述的那些。
可以通过使用本领域熟知的方法测量TIGIT mRNA或蛋白质的量来评估敲除或敲低的效率，例如，定量PCR、蛋白质印迹、流式细胞术等和类似技术。在一些实施方案中，评估TIGIT蛋白的水平以评价敲除或敲低效率。在某些实施方案中，靶基因表达降低的效率为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少60％或至少80％，或至少90％或更高，如与不具有TIGIT靶向的改变的相应NK-92细胞相比的。在某些实施方案中，降低效率为约10％至约90％。在某些实施方案中，降低效率为约30％至约80％。在某些实施方案中，降低效率为约50％至约80％。在一些实施方案中，降低效率大于或等于约80％。
经修饰以降低CD96和TIGIT表达的NK-92细胞
另一方面，本文提供了包含减少或消除CD96表达的CD96靶向的改变和减少或消除TIGIT表达的TIGIT靶向的改变的NK-92细胞。如上所述，这些细胞可以如以上单独针对CD96靶向或TIGIT靶向的改变所述的产生。
经修饰以降低CD226表达的NK-92细胞
在一些实施方案中，本文提供经遗传修饰以降低CD226表达的修饰的NK-92细胞，例如用于如实施例部分中所述的比较实验中。在一些实施方案中，这种修饰的NK-92细胞包含减少或消除CD226表达的CD226靶向的改变。这样的细胞可以使用上文针对降低CD96或TIGIT表达的修饰的NK-92细胞描述的任何技术产生。使用这些方法产生的说明性方法和细胞提供在本申请的“实施例”部分中。
另外的修饰
Fc受体
在一些实施方案中，包含CD96靶向的改变或TIGIT靶向的改变的NK-92细胞进一步修饰以在细胞表面上表达Fc受体。例如，在一些实施方案中，例如，其中将进一步修饰的NK-92细胞与单克隆抗体一起施用于受试者，Fc受体允许NK细胞与通过ADCC杀死靶细胞的抗体协同地起作用。在一些实施方案中，Fc受体是IgG Fc受体FcγRIII。
以下提供Fc受体的非限制性实例。这些Fc受体在其优选配体、亲和力、表达和与抗体结合后的效应方面不同。
表1.说明性Fc受体
在一些实施方案中，Fc受体是CD16。在一些实施方案中，Fc受体是CD16的高亲和力形式，其中缬氨酸存在于176位，相对于SEQ ID NO：13中提供的前体形式的说明性人CD16多肽序列编号。在一些实施方案中，CD16与SEQ ID NO：13的氨基酸19-254具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的同一性，并且在176位包含缬氨酸，如参照SEQ ID NO：13编号的。
嵌合抗原受体
在一些实施方案中，CD96-修饰的NK-92细胞或TIGIT-修饰的NK-92细胞进一步工程化以在细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)。任选地，CAR对肿瘤特异性抗原具有特异性。作为非限制性实例，在US2013/0189268、WO1999024566A1、US7098008和WO2000020460A1中描述了肿瘤特异性抗原，其每一个通过引用整体并入本文。肿瘤特异性抗原包括但不限于NKG2D、CS1、GD2、CD138、EpCAM、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、ETA、MAGE、CAGE、BAGE、HAGE、LAGE、PAGE、NY-SEO-1、GAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAB、WT-1、PSMA、NY-ESO1、AFP、CEA、CTAG1B、CD19和CD33。另外的非限制性肿瘤相关抗原及其相关的恶性肿瘤可见于表2中。
表2:肿瘤特异性抗原和相关恶性肿瘤
在一些实施方案中，CAR靶向CD19、CD33或CSPG-4。在一些实施方案中，CAR靶向与特定癌症类型相关的抗原。例如，癌症可以选自白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌瘤如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、血管瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
CAR可以如例如专利公开号WO2014039523、US20140242701、US20140274909、US20130280285和WO2014099671中所述进行工程化，其各自通过引用整体并入本文。任选地，CAR是CD19 CAR、CD33 CAR或CSPG-4 CAR。
细胞因子
在一些实施方案中，本发明提供了CD96-修饰的NK-92细胞和TIGIT-修饰的NK-92细胞，其进一步被修饰以表达至少一种细胞因子。在这样的细胞中，细胞中细胞因子的表达可以针对内质网。在一些实施方案中，至少一种细胞因子是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或其变体。在一个实施方案中，细胞因子是IL-2。在某些实施方案中，IL-2是靶向内质网的变体。
在一个实施方案中，IL-2与引导IL-2对内质网的信号序列一起表达。不受理论束缚，将IL-2引导向内质网允许IL-2以足以进行自分泌活化的水平表达，但没有细胞外IL-2释放。参见Konstantinidis等“Targeting IL-2to the endolasmic reticulum confinesautocrine growth stimulation to NK-92cells”Exp Hematol.2005年2月；33(2)：159-64。
在一些实施方案中，也可以将自杀基因插入CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞中以防止细胞的不受调节的生长。在一些实施方案中，自杀基因是icaspase 9。
转基因表达
本公开还包括与上述多核苷酸或多肽具有显著序列同一性的序列，例如Cas蛋白、CD16、Fc受体、CAR和/或IL-2。这些序列也可以引入未修饰的NK-92细胞中。在一些实施方案中，序列与它们各自的天然序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少88％、至少95％、或至少98％或至少99％的序列同一性。
可以通过本领域技术人员已知的任何机制将转基因(例如Cas蛋白、CD16、Fc受体、CAR和/或IL-2)工程化到表达质粒中。转基因可以被工程化到相同的表达质粒或不同的表达质粒中。在优选的实施方案中，转基因在相同的质粒上表达。
可以使用本领域已知的任何瞬时转染方法将转基因引入NK-92细胞中，包括例如电穿孔、脂质转染、核转染或“基因枪”。
多种载体可以用于表达这些转基因。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，载体是质粒载体。可以使用的其他病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体等。
联合疗法
在一些实施方案中，本公开的CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞与治疗性抗体和/或其他抗癌剂组合使用。治疗性抗体可用于靶向被感染或表达癌症相关标志物的细胞。癌症治疗性单克隆抗体的实例显示在表3中。
表3.说明性治疗单克隆抗体
FDA-批准的治疗性单克隆抗体的实例
抗体可通过许多机制治疗癌症。当也表达FcR的免疫细胞(例如本公开的CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK细胞)与通过Fc受体(如CD16)与靶细胞结合的抗体结合时，发生抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。因此，在一些实施方案中，将表达FcR的CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞与针对特定癌症相关蛋白的抗体一起施用于患者。这种NK-92细胞的施用可以与单克隆抗体的施用同时进行，或者依次进行。在一些实施方案中，在用单克隆抗体治疗受试者后将NK-92细胞施用于受试者。或者，CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞可以在单克隆抗体的同时(例如24小时内)施用。
在一些实施方案中，静脉内施用CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞。在一些实施方案中，这种修饰的NK-92细胞可以直接输注到骨髓中。
治疗
还提供了用如本文所述的CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞治疗患者的方法。在一些实施方案中，患者患有癌症或传染病。如上所述，可以进一步修饰CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞以表达靶向在患者癌细胞表面上表达的抗原的CAR。在一些实施方案中，如上所述，CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞也可以表达Fc受体，例如CD16。在本文公开的其他实施方案中，患者用CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞和抗体治疗。
修饰的NK-92细胞可以按照细胞的绝对数量施用于个体，例如，所述个体可以施用约1000个细胞/注射至多达约100亿个细胞/注射，例如大约、至少约或至多约1×108、1×107、5×107、1×106、5×106、1×105、5×105、1×104、5×104、1×103、5×103(依此类推)个NK-92细胞/注射，或任何两个数字之间的任何范围(包括端点)。
在其他实施方案中，所述个体可以施用约1000个细胞/注射/m2至最多约100亿个细胞/注射/m2，例如大约、至少约或至多约1×108/m2、1×107/m2、5×107/m2、1×106/m2、5×106/m2、1×105/m2、5×105/m2、1×104/m2、5×104/m2、1×103/m2、5×103/m2(依此类推)个NK-92细胞/注射，或任何两个数字之间的任何范围(包括端点)。
在其他实施方案中，修饰的NK-92细胞可以按照细胞的相对数量施用于这样的个体，例如，所述个体可以施用约1000个细胞至多达约100亿个细胞/千克个体，例如大约、至少约或至多约1×108、1×107、5×107、1×106、5×106、1×105、5×105、1×104、5×104、1×103、5×103(依此类推)个NK-92细胞/千克个体，或任何两个数字之间的任何范围(包括端点)。
在其他实施方案中，总剂量可以通过体表面积的m2计算，包括约1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107每平方米或任何两个数字之间的任何范围(包括端点)。一般人为约1.6至约1.8平方米。在优选的实施方案中，向患者施用约10亿至约30亿个NK-92细胞。在其他实施方案中，每剂量注射的NK-92细胞的量可以通过体表面积的m2计算，包括1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107每平方米。一般人是1.6-1.8平方米。
修饰的NK-92细胞和任选地其他抗癌剂可以一次施用于患有癌症的患者，或者可以在治疗期间多次施用，例如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时一次，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周一次，或任何两个数字之间的任何范围(包括端点)。
在一些实施方案中，CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞在包含修饰的NK-92细胞和培养基(例如人血清或其等同物)的组合物中施用。在一些实施方案中，培养基包含人血清白蛋白。在一些实施方案中，培养基包含人血浆。在一些实施方案中，培养基包含约1％至约15％的人血清或人血清等同物。在一些实施方案中，培养基包含约1％至约10％的人血清或人血清等同物。在一些实施方案中，培养基包含约1％至约5％的人血清或人血清等同物。在优选的实施方案中，培养基包含约2.5％的人血清或人血清等同物。在一些实施方案中，血清是人AB血清。在一些实施方案中，使用可接受用于人治疗剂的血清替代物代替人血清。这种血清替代物可以是本领域已知的，或将来开发的。尽管可以使用超过15％的人血清浓度，但是预期大于约5％的浓度是成本过高的。在一些实施方案中，NK-92细胞在包含NK-92细胞和支持细胞存活力的等渗液体溶液的组合物中施用。在一些实施方案中，NK-92细胞以已经从冷冻保存的样品重构的组合物中施用。
药学上可接受的组合物可以包含各种载体和赋形剂。可以使用各种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，并且通常没有不期望的物质。合适的载体和赋形剂及其制剂在Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，David B.Troy编，Lippicott Williams&Wilkins(2005)中描述。药学上可接受的载体是指在生物学上或其它方面不是不期望的材料，即，材料被施用于受试者而不引起不期望的生物效应，或者不以有害的方式与含有其的药物组合物的其它组分相互作用。如果被施用于受试者，载体被任选地选择以最小化活性成分的降解和最小化受试者的不利副作用。如本文所用，术语药学上可接受的与生理学上可接受的和药理学上可接受的同义地使用。取决于施用途径，药物组合物通常将包含在储存中用于缓冲和保存的试剂，并且可以包含用于适当的递送的缓冲剂和载体。
用于体内或体外的这些组合物可以通过用于细胞的灭菌技术灭菌。组合物可以含有接近生理条件所需的可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。在这些制剂和/或其他药剂中的细胞浓度可以变化，并将根据所选特定施用方式和受试者需要，主要基于流体体积、粘度、体重等而选择。
在一个实施方案中，CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞与一种或多种治疗癌症的其他疗法一起施用于患者。在一些实施方案中，对所治疗的癌症的两种或更多种其他治疗包括例如抗体、放射、化疗、干细胞移植或激素疗法。
如上所述，在一个实施方案中，CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞与靶向患病细胞的抗体结合施用。在一个实施方案中，CD96-修饰的NK-92细胞或TIGIT-修饰的NK-92细胞和抗体一起施用于患者，例如，在相同的制剂中；单独地，例如，在单独的制剂中，同时施用于患者；或者可以单独地施用，例如，按照不同的给药方案中或在一天的不同时间。当单独施用时，抗体可以以任何合适的途径施用，例如静脉内或口服施用。
试剂盒
还公开了使用包含一定量的如本文所述的CD96-修饰的NK-92细胞或TIGIT-修饰的NK-92细胞的组合物治疗癌症或传染病的试剂盒。在一些实施方案中，本公开的试剂盒还可包含至少一种单克隆抗体。
在某些实施方案中，试剂盒可以含有另外的化合物，例如治疗活性化合物或药物，其在CD96-修饰的NK-92或TIGIT-修饰的细胞施用之前、同时或之后施用。这些化合物的实例包括抗体、维生素、矿物质、氟氢可的松、布洛芬、利多卡因、奎尼丁、化疗剂等。
在各种实施方案中，试剂盒的使用说明书将包括在癌症或传染病治疗中使用试剂盒组分的说明。说明书还可以包含关于如何处理CD96-修饰的或TIGIT-修饰的NK-92细胞(例如，解冻和/或培养)的信息。说明书还可以包括关于施用剂量和频率的指导。
本文公开了材料、组合物和组分，其可以用于所公开的方法和组合物，可以与所公开的方法和组合物结合使用，可以用于制备所公开的方法和组合物，或者是所公开的方法和组合物的产品。这些和其他材料在本文中公开，并且应理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，尽管可能没有明确地公开这些化合物的各个不同个体和集体组合和排列的具体引用，但是其每个在本文中均被具体地预期和描述。例如，如果公开和讨论了方法，并且可以对包括该方法的大量分子进行大量修改，则该方法的各个和每个组合和排列以及可能的修改都被具体地涵盖，除非特别地有相反指示。同样地，这些的任何子集或组合也被具体地预期和公开。这个概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以实施的各种附加步骤，应理解这些附加步骤中的每一个可以与所公开的方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合一起实施，并且每个这样的组合或组合的子集被具体地预期且应被认为被本文公开。
实施例
以下实施例仅用于说明目的，不应解释为对要求保护的发明的限制。本领域技术人员可以使用各种替代技术和程序，它们类似地允许人们成功地执行预期的本发明。
实施例1.
材料和方法
细胞培养物
将NK-92细胞维持在补充有5％人血清(Valley Biomedical，目录号HP1022)和重组人IL-2(500IU/ml；Prospec，目录号Cyt-209)的X-VIVO 10培养基(Lonza，目录号BE04-743Q)中。MCF-7、SKBR-3和Daudi细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)，并保存在补充有10％FBS(Gibco，目录#10438026)和1％青霉素/链霉素(Gibco，目录号15070-063)的RPMI-1640培养基(ThermoScientific，目录号61870-127)中。
Cas9-NK-92细胞的产生
通过用Edit-R Cas9慢病毒感染NK-92亲本细胞产生稳定表达Cas9蛋白的NK-92细胞。简而言之，Edit-R Cas9慢病毒原种通过用以下量的质粒转染每10cm培养皿7x106个293T细胞来产生：7.5μg Edit-R-Cas9(Dharmacon，目录号CAS10138)，5μg pCMV-ΔR8.2和2.5μg pCMV-VSV.G。使用Lipofectamine 3000(Life Technologies，目录号L3000-008)按照制造商的说明进行转染。转染后48小时收集病毒上清液，并使用来自SystemBiosciences的PEG-it病毒沉淀溶液(目录号LV810A-1)浓缩10倍。在TransDux(SystemBiosciences，目录号LV850A-1)的存在下，通过旋转接种(840g，在35℃下99分钟)在24孔板中用1ml最终培养基的100μl浓缩病毒感染5x105个NK-92细胞。转导后48小时，通过在15μg/ml杀稻瘟素(InvivoGen，目录号号ant-bl-1)存在下生长细胞来选择表达Cas9的细胞。
pT7-指导-IVT CD96、TIGIT和CD226 sgRNA构建体的产生
使用MIT网页工具http地址crispr.mit.edu设计指导RNA。以下表示每种基因的靶序列。
CD96
sgRNA靶向CD96(NM_198196，转录物变体1)的第二外显子。
TIGIT
sgRNA靶向TIGIT(NM_173799)的第二外显子。
CD226
sgRNA靶向CD226(NM_006566,转录物变体1)的第三外显子。
将靶位点克隆到pT7-指导-IVT质粒(Origene，目录号GE100025)中。寡核苷酸使用pT7-指导-IVT中的两个BsmBI位点，并遵循制造商的说明书进行克隆。使用MEGAshortscriptTM T7试剂盒(Life Technologies，目录号AM1354)按照制造商的说明书产生体外转录的CD96、TIGIT和CD226 sgRNA。
CD96、TIGIT、CD226单敲除和CD96/TIGIT双重敲除NK-92细胞的产生
使用MaxCyte GT电穿孔仪通过电穿孔将体外转录的sgRNA转染到Cas9-NK-92细胞中。简而言之，使用NK-92-3-OC方案，用10μg体外转录的sgRNA转染5x106个Cas9-NK-92细胞。进行初始实验以确定每种靶向的基因的最有效sgRNA。在这些实验中，将sgRNA 1至4转染到Cas9-NK-92细胞中，并且在转染后48小时通过流式细胞术分析靶向的基因的表达来确定每种sgRNA的敲除效率。
为了产生CD96、TIGIT和CD226单敲除NK-92细胞，分别用10μg体外转录的CD96sgRNA-2、TIGIT sgRNA-2和CD226 sgRNA-1转染Cas9-NK-92细胞。双重敲除CD96/TIGIT NK-92细胞通过共转染10μg体外转录的CD96 sgRNA-2和TIGIT sgRNA-2产生。在所有情况下，细胞在转染后48小时通过有限稀释平板接种。在细胞生长15天后，选择单个克隆、扩增并通过流式细胞术确定靶向的基因的表达。
流式细胞术
使用下表中列出的荧光团偶联的抗体通过直接免疫染色进行细胞表面蛋白的细胞荧光测定分析。简而言之，在100μl流式细胞术染色缓冲液(PBS，1％BSA)中，在4℃下黑暗中用推荐量的抗体对105个细胞染色30分钟。用流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞两次，并重悬于200μl流式细胞术染色缓冲液中。在MACSQuant 10流式细胞仪(Miltenyi)上处理样品，并使用FlowJo软件分析数据。
抗体 供应商 目录#
APC小鼠IgG1,κ同种型对照 BD Biosciences 555751
人CD96v2APC-偶联的 R&D Systems Fab6199A
AF647小鼠IgG1,κ同种型对照 BD Pharmingen 557714
AF647小鼠抗-人CD226 BD Biosciences 564797
抗-人TIGIT PE偶联的 eBioscience 12-9500-42
mIgG1-PE同种型 BioLegend 400114
APC抗-人CD155(PVR)抗体 BioLegend 337618
细胞毒性分析
根据制造商的说明书，用荧光染料PKH67-GL(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO)染色靶细胞。将靶和效应物在96孔板(Falcon BD，Franklin Lakes，NJ)中以不同的效应-靶比率组合，短暂离心，并在5％CO2培养箱中补充有5％人血清的X-VIVO 10(Lonza，目录号04-743Q)培养基中在37℃下孵育4小时。孵育后，将细胞用在1％BSA/PBS缓冲液中10μg/ml的碘化丙啶(PI，Sigma-Aldrich)染色，并立即通过流式细胞术分析。死亡的靶细胞被识别为PKH67-GL和PI双阳性的。还单独用PI对靶细胞和效应细胞进行染色以评估自发细胞裂解。通过从具有效应细胞的样品中PKH(+)/PI(+)细胞的百分比减去单独的靶细胞(自发裂解)的PKH(+)/PI(+)细胞百分比获得NK介导的细胞毒性的百分比。
结果
CD96、TIGIT、CD226单敲除和CD96/TIGIT双重敲除NK-92细胞的产生
NK-92细胞系是自然杀伤样细胞系，其是由患有非霍奇金淋巴瘤的50岁男性白种人患者的外周血建立的(Gong等，Leukemia 8：652-8,1994)。NK-92细胞对CD2、CD56和CD57是阳性的，对CD3和CD16是阴性的(参见Gong等)。它们的生长是IL-2依赖性的，并且它们对广泛的肿瘤靶标发挥有效的体外细胞毒性。NK-92细胞缺乏大多数目前已知的抑制性KIR受体(Maki等，同上)。然而，它们表达CD226、CD96和TIGIT(图1)，这些是结合粘连蛋白和粘连蛋白样蛋白的受体家族的成员，并且在调节NK细胞功能中起关键作用。CD226，也称为DNAM1，是对于介导NK细胞细胞毒性关键的活化受体(Shibuya等，同上)，而CD96和TIGIT已被证明可作为抑制NK功能活性的抑制性免疫检查点(Chan等，Nat Immunol.15：431-8,2014；Sarhan等，Cancer Res.76：5696-5706,2016)。产生了缺乏一种或多种这些抑制性受体的NK-92变体以提高其抗肿瘤潜力。
CRISPR/Cas9系统用于产生缺乏CD96、TIGIT或CD226的表达的NK-92细胞。如上文“材料和方法”中所述的产生单CD96、TIGIT和CD226或双重CD96/TIGIT敲除的NK-92细胞。图2显示了这些受体在选择的单或双KO克隆中的表达。值得注意的是，单或双KO细胞上的非靶向受体的表达与亲本NK-92细胞的表达相当(参见图2中的MFI值)。
CD96和CD96/TIGIT敲除NK-92细胞针对CD155-阳性肿瘤靶标具有较高细胞毒性潜 能
活化CD226及抑制性CD96和TIGIT受体共享共同的配体CD155(也称为PVR，脊髓灰质炎病毒受体)，它们以不同的亲和力与其结合(Martinet等，同上)。CD155表达通常在肿瘤细胞中上调，并且其过表达与癌症侵袭性和转移相关(Hirota等，Sloan等，同上)。因此，首先测试亲本和粘连蛋白受体敲除细胞对CD155阳性肿瘤靶标的细胞毒性。MCF-7和SKBR-3是两种乳腺癌细胞系，其对CD155表达呈阳性(图3)。与CD226作为活化受体的作用一致，CD226-KO NK-92细胞对MCF-7或SKBR-3的杀伤几乎被完全消除(图4)。
重要的是，与亲本NK-92细胞相比，CD96-KO NK-92细胞具有高10-15％的细胞毒性活性(图4)。尽管TIGIT-KO NK-92细胞在杀伤MCF-7或SKBR-3细胞的能力方面与亲本NK-92细胞没有显著差异，但双CD96/TIGIT KO细胞具有比CD96-KO或亲本NK-92细胞更高的细胞毒性潜能(分别比CD96-KO或亲本NK-92细胞高10-15％和17-29％的细胞毒性活性，如图4所示)。因此，这些数据表明，尽管CD96可以补偿TIGIT表达的缺乏，但两种受体都有效地导致降低由CD226介导的活化信号，并且是有效杀死肿瘤靶标所需要的。
重要的是，CD96和CD96/TIGIT KO NK-92细胞对CD155阳性肿瘤靶标的较高细胞毒性活性对于粘连蛋白受体的缺失是特异性的，而不是对这些克隆固有的较高细胞毒性活性，因为它们对CD155阴性Daudi肿瘤细胞的细胞毒性活性(图3)与亲本NK-92细胞的活性没有显著差异(图5)。值得注意的是，CD226-KO NK-92细胞在最低E:T比率下杀死Daudi细胞的效率较低，这表明Daudi细胞可能表达CD155以外的其他配体，其也被活化受体CD226识别(图5)。
应理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且在此基础上本领域技术人员会想到对其进行各种修改或改变，并且包括在本申请和所附权利要求的精神和范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请均通过引用整体并入本文。
说明性CD 16序列：SEQ ID NO:13高亲和力变体免疫球蛋白γFc区受体III-A氨基酸序列(前体形式)。前体形式的位置176对应于以位置19处的Arg开始的多肽成熟形式的位置158。位置176处的Val加下划线。
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala GlyMet Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr ArgVal Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu AspAsn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser TyrPhe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn LeuSer Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu GlnAla Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser TrpLys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys TyrPhe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly SerTyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn IleThr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly TyrGln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu TyrPhe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys PheLys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys

Claims (42)

1.一种修饰的NK-92细胞，其包含抑制一种或多种靶基因的表达的一种或多种改变，其中所述一种或多种靶基因选自CD96和TIGIT。
2.如权利要求1的修饰的NK-92细胞，其中CD96基因被遗传改变以抑制CD96的表达。
3.如权利要求2的修饰的NK-92细胞，其包含靶向CD96并抑制CD96的表达的干扰RNA。
4.如权利要求2的修饰的NK-92细胞，其中所述细胞通过敲低或敲除所述细胞中的CD96表达来产生。
5.如权利要求2的修饰的NK-92细胞，其中与不具有该CD96修饰的对应NK-92细胞相比，由所述细胞表达的CD96的量降低至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
6.如权利要求1的修饰的NK-92细胞，其中TIGIT基因被遗传改变以抑制TIGIT的表达。
7.如权利要求6的修饰的NK-92细胞，其包含靶向TIGIT并抑制TIGIT的表达的干扰RNA。
8.如权利要求6的修饰的NK-92细胞，其中所述细胞通过敲低或敲除所述细胞中的TIGIT表达来产生。
9.如权利要求6的修饰的NK-92细胞，其中与不具有该TIGIT修饰的对应NK-92细胞相比，由所述细胞表达的TIGIT的量降低至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
10.如权利要求1的修饰的NK-92细胞，其中CD96基因和TIGIT基因两者被遗传改变以抑制TIGIT的表达。
11.如权利要求10的修饰的NK-92细胞，其中所述修饰的NK-92细胞包含靶向CD96并抑制CD96的表达的干扰RNA和靶向TIGIT并抑制TIGIT的表达的干扰RNA。
12.如权利要求10的修饰的NK-92细胞，其中所述修饰的NK-92细胞通过敲低或敲除所述细胞中的CD96表达和敲低或敲除TIGIT表达来产生。
13.如权利要求10、11或12的修饰的NK-92细胞，其中与不具有该CD96修饰的对应NK-92细胞相比，由所述细胞表达的CD96的量降低至少50％、至少60％、至少70％或至少80％；且与不具有该TIGIT修饰的对应NK-92细胞相比，所述细胞表达的TIGIT的量降低至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
14.如权利要求1-13任一项的修饰的NK-92细胞，其中所述修饰的NK-92细胞在细胞表面上表达至少一种Fc受体或至少一种嵌合抗原受体(CAR)，或者至少一种Fc受体和至少一种CAR两者。
15.如权利要求14的修饰的NK-92细胞，其中所述至少一种Fc受体是CD16或在位置176处具有缬氨酸的CD16多肽，参照SEQ ID NO:13编号。
16.如权利要求15的修饰的NK-92细胞，其中所述至少一种Fc受体包含编码与SEQ IDNO:13的氨基酸19-254具有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸序列且包含参照SEQ IDNO:13编号的位置176处的缬氨酸。
17.如权利要求14的修饰的NK-92细胞，其中所述至少一种Fc受体是FcγRIII。
18.如权利要求14的修饰的NK-92细胞，其中所述CAR包含FcεRIγ的胞质结构域。
19.如权利要求18的修饰的NK-92细胞，其中所述CAR靶向肿瘤相关抗原。
20.如权利要求1-19任一项的修饰的NK-92细胞，其中所述细胞还表达细胞因子。
21.如权利要求20的修饰的NK-92细胞，其中所述细胞因子是白介素-2或其变体。
22.如权利要求20或21的修饰的NK-92细胞，其中所述细胞因子靶向于内质网。
23.一种组合物，包含多个如权利要求1-22任一项的修饰的NK-92细胞。
24.如权利要求23的组合物，还包含药学上可接受的赋形剂。
25.一种NK-92细胞系，包含多个如权利要求1-22任一项的修饰的NK-92细胞。
26.如权利要求25的细胞系，其中所述细胞经历少于10次群体倍增。
27.一种治疗需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求24的组合物或者权利要求25或26的细胞系，从而治疗所述癌症。
28.如权利要求27的方法，其中所述方法还包括施用抗体。
29.如权利要求27或28的方法，其中约1x108-约1x1011个细胞/m2患者体表面积施用于所述患者。
30.一种用于治疗癌症的试剂盒，其中所述试剂盒包括(a)权利要求23或24的组合物或者权利要求25或26的细胞系。
31.一种用于产生相对于对照NK-92细胞表达降低水平的一种或多种靶基因的NK-92细胞的方法，该方法包括遗传修饰所述NK-92细胞中所述一种或多种靶基因的表达，其中所述一种或多种靶基因选自CD96和TIGIT。
32.如权利要求31的方法，其中遗传修饰所述一种或多种靶基因的每一种的表达的步骤包括使待修饰的NK-92细胞与靶向所述一种或多种靶基因的每一种的干扰RNA接触。
33.如权利要求32的方法，其中靶向所述一种或多种靶基因的每一种的所述干扰RNA是siRNA、shRNA、微RNA或单链干扰RNA。
34.如权利要求31的方法，其中遗传修饰所述一种或多种靶基因的每一种的表达的步骤包括用锌指核酸酶(ZFN)、Tale-效应域核酸酶(TALEN)或CRIPSR/Cas系统修饰所述一种或多种靶基因的每一种。
35.如权利要求1的方法，其中遗传修饰所述一种或多种靶基因的每一种的表达包括：
i)将成簇规律间隔短回文重复相关(Cas)蛋白引入所述NK-92细胞中，和
ii)将一个或多个核糖核酸引入待修饰的NK-92细胞中，其中所述核糖核酸指导所述Cas蛋白与所述一种或多种靶基因的每一种的序列的靶基序杂交，且其中所述靶基序被切割。
36.如权利要求35的方法，其中所述Cas蛋白以蛋白质形式引入所述NK-92细胞中。
37.如权利要求35的方法，其中所述Cas蛋白通过引入Cas编码序列而引入所述NK-92细胞中。
38.如权利要求35的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9。
39.如权利要求35的方法，其中所述靶基序是20-核苷酸的DNA序列。
40.如权利要求35的方法，其中所述靶基序是在所述一种或多种靶基因的每一种的外显子中。
41.如权利要求35的方法，其中与CD96中的靶基序杂交的所述一个或多个核糖核酸选自SEQ ID NO:1-4和与TIGIT中的靶基序杂交的所述一个或多个核糖核酸选自SEQ ID NO:5-8。
42.如权利要求31-41任一项的方法，其中CD96和TIGIT两者被靶向。
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