KR20190095959A - 감소된 cd96/tigit 발현을 갖는 유전자 변형된 nk-92 세포 - Google Patents

감소된 cd96/tigit 발현을 갖는 유전자 변형된 nk-92 세포 Download PDF

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Abstract

CD96 및/또는 TIGIT의 발현을 억제하는 1개 이상의 변경을 포함하는 CD96-변형된 및 TIGIT-변형된 NK-92 세포가 제공된다. 또한 이러한 변형된 NK-92 세포를 생성하는 방법 및 변형된 NK-92 세포를 사용하여 암을 갖거나 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.

Description

감소된 CD96/TIGIT 발현을 갖는 유전자 변형된 NK-92 세포
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 1월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/443,621; 2017년 2월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 62/459,877; 및 2017년 2월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 62/459,873의 우선권 이익을 주장한다. 각각의 출원은 모든 목적상 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
세포-기반 면역요법은 암의 치료를 위한 강력한 도구이다. 키메라 항원 수용체를 발현하는 조작된 1차 T 세포 (CAR-T 세포)를 사용한, 림프성 악성종양을 갖는 환자의 치료에서의 초기 성공은 암 치료에 대한 큰 유망성을 제시하였다. 자연 킬러 (NK) 세포의 사용을 기초로 하는 면역요법이 또한 개발되고 있지만, NK 세포-기반 면역요법 분야는 T 세포를 사용한 분야만큼 진전되지 않았다.
NK-92는 비-호지킨 림프종을 앓고 있는 대상체의 혈액에서 발견되었고 이어서 생체외에서 불멸화된 세포용해 암 세포주이다. NK-92 세포는 NK 세포로부터 유래되지만, 정상 NK 세포에 의해 디스플레이되는 주요 억제 수용체가 결여되어 있는 반면에, 대부분의 활성화 수용체는 보유한다. 그러나, NK-92 세포는 정상 세포를 공격하지 않으며, 또한 그들은 인간에서 허용되지 않는 면역 거부 반응을 도출하지도 않는다. NK-92 세포주는 예를 들어 WO1998/49268 및 미국 특허 출원 번호 20020068044에 특징화되어 있다.
상기 언급된 바와 같이, 활성화된 NK-92 (aNK) 세포의 고유한 특색은 그들이 다중 활성화 수용체 (NKp30, NKp46, 2B4, NKGD, E, CD28, CD226)를 발현하지만, 현재 공지되어 있는 억제 KIR 수용체의 대부분은 결여되어 있다는 것이다 (Maki et al., J Hematother Stem Cell Res. 10:369-83, 2001). 이러한 고유한 표현형은 aNK 세포의 넓은 항종양 활성을 설명할 수 있다. DNAM1로도 공지되어 있는 활성화 수용체 CD226은 넥틴 및 넥틴-유사 패밀리 단백질에 결합하고 NK 세포-매개된 세포독성을 제어하는데 있어서 중요한 역할을 하는 수용체 패밀리에 속한다 (Shibuya et al., Immunity. 4:573-81, 1996). 이러한 패밀리는 또한 억제 수용체 CD96 및 TIGIT (Martinet et al., Nat Rev Immunol. 15:243-54, 2015)를 포함하며, 이들 또한 aNK 세포에 의해 발현된다. 모든 3종의 수용체는 공통 리간드, CD155 (또한 PVR, 소아마비 바이러스 수용체로도 공지됨)를 공유하며, 이에 상이한 친화도로 결합한다 (Martinet et al., 상기 문헌). CD155 발현은 종양 세포에서 빈번하게 상향조절되고, 그의 과다-발현은 암 침습 및 전이와 연관된다 (Hirota et al., Oncogene 24:2229-35, 2005; Sloan et al., BMC Cancer 4:73, 2004.). CD96 및 TIGIT는 또한 NK 세포에서 억제 면역 체크포인트로서 연루되어왔다 (Chan et al., Nat Immunol. 15:431-8, 2014).
NK-92 세포는 또한 특정 암의 치료에서 잠재적 치료제로서 평가되어 왔다. 본 발명은 암을 치료하기 위한 NK-92-기반 요법에서의 진전을 제공한다.
한 측면에서, 개시내용은 CD96의 발현을 억제하는 변형을 포함하는 CD96-변형된 NK-92 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, CD96-변형된 NK-92 세포는 CD96을 표적화하고 그의 발현을 억제하는 간섭 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD96-변형된 NK-92 세포에 의해 발현되는 CD96의 양은, CD96-표적화된 변경을 갖지 않는 NK-92 세포와 비교하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 80%, 또는 그 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, CD96-변형된 NK-92 세포는 NK-92 세포에서의 녹다운 또는 녹아웃에 의해 생산된다.
일부 실시양태에서, CD96-변형된 NK-92 세포는 세포 표면 상에 적어도 1개의 Fc 수용체, 또는 적어도 1개의 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 적어도 1개의 Fc 수용체 및 적어도 1개의 CAR 둘 다를 발현한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 Fc 수용체는 CD16, 또는 (위치 1로서 N-말단 메티오닌을 포함하는, 전구체 전장 인간 CD16을 참조하여 넘버링 시) 위치 176에서 발린을 갖는 CD16 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 Fc 수용체는 서열식별번호(SEQ ID NO): 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 위치 176에서 발린을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 Fc 수용체는 FcγRIII이다. 일부 실시양태에서, CAR은 FcεRIγ의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 종양-연관 항원을 표적화한다. 일부 실시양태에서, CD96-변형된 NK-92 세포는 추가로 시토카인을 발현한다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 인터류킨-2 또는 그의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 내형질 세망으로 표적화된다.
또 다른 측면에서, 개시내용은 NK-92 세포에서 CD96 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계를 포함하는, 대조군 NK-92 세포에 비해 감소된 수준의 CD96를 발현하는 NK-92 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CD96 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계는 변형시키고자 하는 NK-92 세포를 CD96을 표적화하는 간섭 RNA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD96을 표적화하는 간섭 RNA는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA 또는 단일 가닥 간섭 RNA이다.
일부 실시양태에서, CD96 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계는 CD96 유전자를 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), Tale-이펙터 도메인 뉴클레아제 (TALEN), 또는 CRIPSR/Cas 시스템으로 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD96 유전자 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계는 i) 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부-연관 (Cas) 단백질을 NK-92 세포 내로 도입하는 단계 및 ii) 1개 이상의 리보핵산을 변형시키고자 하는 NK-92 세포 내로 도입하는 단계이며, 여기서 리보핵산은 Cas 단백질이 CD96 유전자 서열의 표적 모티프에 혼성화하도록 지시하고, 여기서 표적 모티프가 절단되는 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 NK-92 세포 내로 단백질 형태로 도입된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas 핵산 코딩 서열을 도입함으로써 NK-92 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas9이다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 20개-뉴클레오티드 DNA 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 CD96 유전자 서열 (수탁 번호 NM_198196 전사체 변이체 1)의 제2 엑손에 존재하며, 이는 CD96 전사체 변이체 2 (수탁 번호 NM_005816) 및 CD96 전사체 변이체 3 (수탁 번호 NM_001318889)에 의해 공유된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 리보핵산은 서열식별번호: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 측면에서, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 CD96-변형된 NK-92 세포를 복수개 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 또한 생리학상 허용되는 부형제를 포함한다.
추가의 측면에서, 본원, 예를 들어 상기 단락에 기재된 CD96-변형된 NK-92 세포 중 임의의 것을 복수개 포함하는 변형된 NK-92 세포주가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포주의 세포는 10회 미만의 집단 배가를 거친다. 일부 실시양태에서, 세포주의 세포는 IL-2를 10 U/ml 미만으로 함유하는 배지에서 배양된다.
또 다른 측면에서, 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 본원, 예를 들어 상기 단락에 기재된 CD96-변형된 NK-92 세포주 중 임의의 것을 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 치료 항체, 예를 들어, 치료 모노클로날 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자의 체표면적 m2당 약 1x108 내지 약 1x1011개의 세포가 환자에게 투여된다.
추가 측면에서, 개시내용은 암을 치료하기 위한 키트를 추가로 제공하며, 여기서 키트는 (a) 본원, 예를 들어 상기 단락에 개시된 바와 같은, CD96-변형된 NK-92 세포 조성물, 또는 세포주 중 임의의 것, 및 (b) 사용에 대한 지침서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 생리학상 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 개시내용은 또한 TIGIT의 발현을 억제하는 변형을 포함하는 TIGIT-변형된 NK-92 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, TIGIT-변형된 NK-92 세포는 TIGIT를 표적화하고 그의 발현을 억제하는 간섭 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, TIGIT-변형된 NK-92 세포에 의해 발현되는 TIGIT의 양은, TIGIT-표적화된 변경을 갖지 않는 NK-92 세포와 비교하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 80%, 또는 그 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, TIGIT-변형된 NK-92 세포는 NK-92 세포에서 TIGIT를 녹다운 또는 녹아웃시킴으로써 생산된다.
일부 실시양태에서, TIGIT-변형된 NK-92 세포는 세포 표면 상에 적어도 1개의 Fc 수용체, 또는 적어도 1개의 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 적어도 1개의 Fc 수용체 및 적어도 1개의 CAR 둘 다를 발현한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 Fc 수용체는 CD16, 또는 (위치 1로서 N-말단 메티오닌을 포함하는, 전구체 전장 인간 CD16을 참조하여 넘버링 시) 위치 176에서 발린을 갖는 CD16 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 Fc 수용체는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 위치 176에서 발린을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 Fc 수용체는 FcγRIII이다. 일부 실시양태에서, CAR은 FcεRIγ의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 종양-연관 항원을 표적화한다. 일부 실시양태에서, TIGIT-변형된 NK-92 세포는 추가로 시토카인을 발현한다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 인터류킨-2 또는 그의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 내형질 세망으로 표적화된다.
또 다른 측면에서, NK-92 세포에서 TIGIT 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계를 포함하는, 대조군 NK-92 세포에 비해 감소된 수준의 TIGIT를 발현하는 NK-92 세포를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, TIGIT 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계는 변형시키고자 하는 NK-92 세포를 TIGIT를 표적화하는 간섭 RNA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, TIGIT를 표적화하는 간섭 RNA는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA 또는 단일 가닥 간섭 RNA이다.
일부 실시양태에서, TIGIT 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계는 TIGIT 유전자를 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), Tale-이펙터 도메인 뉴클레아제 (TALEN), 또는 CRIPSR/Cas 시스템으로 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, TIGIT 유전자 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계는 i) 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부-연관 (Cas) 단백질을 NK-92 세포 내로 도입하는 단계 및 ii) 1개 이상의 리보핵산을 변형시키고자 하는 NK-92 세포 내로 도입하는 단계이며, 여기서 리보핵산은 Cas 단백질이 TIGIT 유전자 서열의 표적 모티프에 혼성화하도록 지시하고, 여기서 표적 모티프가 절단되는 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 NK-92 세포 내로 단백질 형태로 도입된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas 핵산 코딩 서열을 도입함으로써 NK-92 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas9이다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 20개-뉴클레오티드 DNA 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 TIGIT 유전자 서열 (수탁 번호 NM_173799 전사체)의 제2 엑손에 존재한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 리보핵산은 서열식별번호: 5-8로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 측면에서, 개시내용은 본원, 예를 들어, 상기 단락에 기재된 바와 같은 TIGIT-변형된 NK-92 세포를 복수개 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 또한 생리학상 허용되는 부형제를 포함한다.
추가의 측면에서, 본원, 예를 들어 상기 단락에 기재된 바와 같은 TIGIT-변형된 NK-92 세포 중 임의의 것을 복수개 포함하는 변형된 NK-92 세포주가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포주의 세포는 10회 미만의 집단 배가를 거친다. 일부 실시양태에서, 세포주의 세포는 IL-2를 10 U/ml 미만으로 함유하는 배지에서 배양된다.
또 다른 측면에서, 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 본원, 예를 들어 상기 단락에 기재된 바와 같은 TIGIT-변형된 NK-92 세포주를 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 치료 항체, 예를 들어, 치료 모노클로날 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자의 체표면적 m2당 약 1x108 내지 약 1x1011개의 세포가 환자에게 투여된다.
추가 측면에서, 개시내용은 암을 치료하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 키트는 (a) 본원, 예를 들어 상기 단락에 개시된 바와 같은, TIGIT-변형된 NK-92 세포 조성물, 또는 세포주 중 임의의 것, 및 (b) 사용에 대한 지침서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 생리학상 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
추가 측면에서, CD96의 발현을 억제하는 변형 및 TIGIT의 발현을 억제하는 변형을 포함하는 변형된 NK-92가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 변형된 NK-92 세포는 CD96을 표적화하고 CD96의 발현을 억제하는 간섭 RNA; 및 TIGIT를 표적화하고 TIGIT의 발현을 억제하는 간섭 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포에 의해 발현되는 CD96의 양은, CD96 변형을 갖지 않는 대응물 NK-92 세포와 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 그 초과만큼 감소되고; 세포에 의해 발현되는 TIGIT의 양은, TIGIT 변형을 갖지 않는 대응물 NK-92 세포와 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 그 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 변형된 NK-92 세포는 세포에서 CD96 발현을 녹다운 또는 녹아웃시키고, TIGIT 발현을 녹다운 또는 녹아웃시킴으로써 생산된다. 추가 실시양태에서, 변형된 NK 세포는 세포 표면 상에 적어도 1개의 Fc 수용체, 또는 적어도 1개의 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 적어도 1개의 Fc 수용체 및 적어도 1개의 CAR 둘 다를 발현한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 Fc 수용체는 CD16, 또는 (위치 1로서 N-말단 메티오닌을 포함하는, 전구체 전장 인간 CD16을 참조하여 넘버링 시) 위치 176에서 발린을 갖는 CD16 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 Fc 수용체는 FcγRIII이다. 특정한 실시양태에서, 적어도 1개의 Fc 수용체는 서열식별번호: 13의 아미노산 19-254에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 서열식별번호: 13을 참조하여 넘버링 시 위치 176에서 발린을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하한다. 추가의 실시양태에서, 변형된 NK-92는 FcεRIγ의 세포질 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, CAR은 종양-연관 항원을 표적화한다. 추가 실시양태에서, 변형된 NK-92 세포는 추가로 시토카인, 예컨대 인터류킨-2 또는 그의 변이체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 시토카인, 예를 들어 IL-2는 내형질 세망으로 표적화된다.
추가 측면에서, 개시내용은 본원, 예를 들어 상기 단락에 기재된 바와 같은 저하된 CD96 및 TIGIT 발현을 갖는, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 NK-92 세포를 복수개 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 조성물은 생리학상 허용되는 부형제를 포함한다.
또 다른 측면에서, 개시내용은 저하된 CD96 및 TIGIT 발현을 갖는, 본원, 예를 들어 상기 단락에 기재된 바와 같은 변형된 NK-92 세포를 복수개 포함하는 세포주를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 10회 미만의 집단 배가를 거친다.
다른 측면에서, 개시내용은 CD96 및 TIGIT 발현을 저하시키도록 본원에 기재된 바와 같이 변형된 NK-92 세포로 암을 처리하는 키트, 조성물 및 방법을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 CD96 및 TIGIT 발현 둘 다를 저하시키도록 변형된 NK-92 세포를 포함하는 조성물 또는 세포주의 치료 유효량을 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 치료 항체, 예를 들어, 치료 모노클로날 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자의 체표면적 m2당 약 1x108 내지 약 1x1011개의 세포가 환자에게 투여된다.
추가 측면에서, 개시내용은 감소된 수준의 CD96 및 TIGIT를 발현하는 NK-92 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CD96 및 TIGIT 표적 유전자 각각의 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계는 변형시키고자 하는 NK-92 세포를 표적 유전자의 각각을 표적화하는 간섭 RNA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 표적 유전자의 각각을 표적화하는 간섭 RNA는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 또는 단일 가닥 간섭 RNA이다. 특정한 실시양태에서, CD96 및 TIGIT 표적 유전자의 각각의 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계는, 표적 유전자의 각각을 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), Tale-이펙터 도메인 뉴클레아제 (TALEN), 또는 CRIPSR/Cas 시스템으로 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자의 각각의 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계는 i) 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부-연관 (Cas) 단백질을 NK-92 세포 내로 도입하는 단계 및 ii) 1개 이상의 리보핵산을 변형시키고자 하는 NK-92 세포 내로 도입하는 단계이며, 여기서 리보핵산은 Cas 단백질이 1개 이상의 표적 유전자의 각각의 서열의 표적 모티프에 혼성화하도록 지시하고, 여기서 표적 모티프가 절단되는 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서 Cas 단백질은 NK-92 세포 내로 단백질 형태로 도입된다. 다른 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas 코딩 서열을 도입함으로써 NK-92 세포 내로 도입된다. 예시적인 Cas 단백질은 Cas9를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 20개-뉴클레오티드 DNA 서열이다. 표적 모티프는, 예를 들어, 표적 유전자의 각각의 엑손일 수 있다. 일부 실시양태에서, CD96 내의 표적 모티프에 혼성화하는 1개 이상의 리보핵산은 서열식별번호: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되고, TIGIT 내의 표적 모티프에 혼성화하는 1개 이상의 리보핵산은 서열식별번호: 5-8로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 측면에서, 개시내용은 CD226의 발현을 억제하는 변형을 포함하는 CD226-변형된 NK-92 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, CD226-변형된 NK-92 세포는 CD226을 표적화하고 그의 발현을 억제하는 간섭 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD226-변형된 NK-92 세포에 의해 발현되는 CD226의 양은, CD226-표적화된 변경을 갖지 않는 NK-92 세포와 비교하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 80%, 또는 그 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, CD226-변형된 NK-92 세포는 NK-92 세포에서 CD226을 녹다운 또는 녹아웃시킴으로써 생산된다. 일부 실시양태에서, CD226 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계는 CD226 유전자를 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), Tale-이펙터 도메인 뉴클레아제 (TALEN), 또는 CRIPSR/Cas 시스템으로 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD226 유전자 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계는 i) 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부-연관 (Cas) 단백질을 NK-92 세포 내로 도입하는 단계 및 ii) 1개 이상의 리보핵산을 변형시키고자 하는 NK-92 세포 내로 도입하는 단계이며, 여기서 리보핵산은 Cas 단백질이 CD226 유전자 서열의 표적 모티프에 혼성화하도록 지시하고, 여기서 표적 모티프가 절단되는 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 NK-92 세포 내로 단백질 형태로 도입된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas 핵산 코딩 서열을 도입함으로써 NK-92 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas9이다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 20개 뉴클레오티드 DNA 서열이다.
상기 일반적 설명 및 하기 상세한 설명은 예시적이고 설명적인 것이고, 청구된 바와 같은 본 발명의 추가의 설명을 제공하기 위한 것으로 의도된다. 다른 목적, 이점 및 신규 특색은 본 발명의 하기 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
도 1은 NK-92 세포가 활성화 CD226, 및 억제 CD96, 및 TIGIT 수용체를 발현한다는 것을 보여주는 데이터를 제공한다. NK-92 세포에서의 CD226, CD96 및 TIGIT 발현의 유동 세포측정 분석을 "물질 및 방법"에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 2는 모세포 및 녹-아웃 NK-92 세포에서의 CD226, CD96, 및 TIGIT 수용체 발현을 예시하는 데이터를 제공한다. 모 Cas9-NK-92 또는 넥틴 수용체 녹-아웃 NK-92 세포에서의 CD226, CD96 및 TIGIT 발현의 유동 세포측정 분석을 "물질 및 방법"에 기재된 바와 같이 수행하였다. 특이적 항체로 염색된 샘플에 대한 MFI (평균 형광 강도) 값을 또한 나타낸다.
도 3은 MCF-7, SKBR-3, 및 Daudi 종양 세포에서의 CD155 발현을 보여주는 데이터를 제공한다. MCF-7, SKBR-3, 및 Daudi 세포에서의 CD155 발현의 유동 세포측정 분석을 "물질 및 방법"에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 4는 CD96 및 CD96/TIGIT KO NK-92 세포가 CD155-양성 종양 표적에 대해 보다 높은 세포독성 잠재력을 갖는다는 것을 예시하는 데이터를 제공한다. 모세포 또는 넥틴 수용체 KO NK-92 세포가 CD155-양성 MCF-7 (상부) 또는 SKBR-3 (하부) 종양 세포를 사멸시키는 능력을 4시간 세포독성 검정에서 상이한 이펙터 대 표적 (E:T) 비에서 평가하였다. 각각의 막대 세트는 하기 세포 유형을 나타내며, 좌에서 우로: NK-92-WT, NK-92-Cas9, CD226-KO, CD96-KO, TIGIT-KO, CD96/TIGIT 이중 녹아웃으로 열거된다. 막대 그래프는 3개의 독립적 실험의 평균 +/- SEM을 보여준다. P-값은 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산하였다. (*)는 p<0.05를 나타내고; (**)는 p<0.01을 나타내고, 둘 다는 모 NK-92 세포에 대비한 것이다. (#)는 CD96-KO 세포 대비 p<0.05를 나타낸다.
도 5는 CD96 및 CD96/TIGIT KO NK-92 세포의 증가된 세포독성 잠재력이 넥틴 결합 수용체의 상실에 특이적이라는 것을 보여주는 데이터를 제공한다. 모세포 또는 넥틴 수용체 KO NK-92 세포가 CD155-음성 Daudi 종양 세포를 사멸시키는 능력을 4시간 세포독성 검정에서 상이한 이펙터 대 표적 (E:T) 비에서 평가하였다. 각각의 막대 세트는 하기 세포 유형을 나타내며, 좌에서 우로: NK-92-WT, NK-92-Cas9, CD226-KO, CD96-KO, TIGIT-KO, CD96/TIGIT 이중 녹아웃으로 열거된다. 막대 그래프는 4개의 독립적 실험의 평균 +/- SEM을 보여준다. P-값은 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산하였다. (*)는 모 NK-92 세포 대비 p<0.05를 나타낸다.
도 6은 NK 세포 기능에서의 TIGIT 및 CD96의 역할의 개략도이다.
한 측면에서, 본 발명은 감소된 CD96 발현을 갖는 CD96-변형된 NK-92 세포 및/또는 감소된 TIGIT 발현을 갖는 TIGIT-변형된 NK-92 세포, 및 이러한 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본 개시내용에 따른 CD96-변형된 NK-92 세포는 NK-92 세포에서 CD96-표적화된 변경을 갖고; TIGIT-변형된 NK-92 세포는 NK-92 세포에서 TIGIT-표적화된 변경을 갖는다. 본 발명은 추가로, 암의 치료를 위해 변형된 NK-92 세포를 사용하는 방법을 제공한다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 하기 청구범위에서, 하기 의미를 갖는 것으로 정의될 다수의 용어가 언급될 것이다:
본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 단수 형태는, 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다.
범위를 포함한 모든 수치 표기, 예를 들어 pH, 온도, 시간, 농도, 양, 분자량은, 적절한 경우에, 0.1 또는 1.0의 증분만큼 (+) 또는 (-) 달라지는 근사치이다. 항상 분명하게 언급되지는 않지만, 모든 수치 표기는 용어 "약"이 선행할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 항상 분명하게 언급되지는 않지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예시적인 것이고, 그의 등가물이 관련 기술분야에 공지되어 있다는 것을 이해하여야 한다.
"임의적인" 또는 "임의로"는 후속적으로 기재된 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있으며, 그러한 기재는 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않은 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만, 다른 요소를 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. "로 본질적으로 이루어진"은 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때, 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것을 지칭한다. "로 이루어진"은 언급된 미량의 다른 성분 및 실질적인 방법 단계를 넘는 것은 배제한다는 것을 의미할 것이다. 이들 전개 용어 각각에 의해 정의된 실시양태는 본 발명의 범주 내이다.
용어 "자연 킬러 (NK) 세포"는 특이적 항원 자극의 부재 하에, MHC 부류에 따른 제한 없이 표적 세포를 사멸시키는 면역계의 세포를 지칭한다. 표적 세포는 종양 세포 또는 바이러스를 보유한 세포일 수 있다. NK 세포는 CD56의 존재 및 CD3 표면 마커의 부재를 특징으로 한다.
용어 "NK-92 세포"는 원래 비-호지킨 림프종을 갖는 환자로부터 수득된 NK 세포주, NK-92를 지칭한다. 본 발명의 목적상 및 달리 나타내지 않는 한, 용어 "NK-92"는 원래의 NK-92 세포주 뿐만 아니라 NK-92 세포주, NK-92 세포의 클론, 및 (예를 들어, 외인성 유전자의 도입에 의해) 변형된 NK-92 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. NK-92 세포 및 그의 예시적이고 비제한적인 변형은 미국 특허 번호 7,618,817; 8,034,332; 및 8,313,943에 기재되어 있고, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 용어 "CD96-표적화된 변경"은 NK-92 세포 내 CD96의 DNA 또는 RNA의 구조 또는 특성에 대한 변화, 예를 들어, CD96 단백질의 수준에서의 감소로 이어지는 CD96 발현의 녹아웃 또는 녹다운을 지칭한다. 따라서, CD96-표적화된 변경은 CD96 유전자 또는 CD96 유전자 전사체를 표적화할 수 있다. 인간 CD96 단백질 서열의 예는 유니프로테인 번호 P40200 하에 입수가능하다. 인간 CD96은 염색체 3 상에 위치하고, HGNC에 의해 영역 3q13.13-q13.2에 맵핑된다. CD96은 게놈 레퍼런스 컨소시엄 휴먼 빌드 38 패치 릴리즈 7(Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 7) (GRCh38.p7) 어셈블리에 따르면 위치 Chr 3 NC_000003.12 (111542079..111665996)에 존재한다. 용어 "CD96"은 또한 CD96 유전자에 의해 코딩된, 전사체 변이체 2 및 3을 포함한 대립유전자 변이체를 포괄한다.
용어 "CD96-변형된 NK-92 세포"는 CD96 발현의 양의 감소를 발생시키는 CD96-표적화된 변경을 갖는 NK-92 세포를 지칭한다. 유전자 변형된 NK-92 세포는 추가로 다른 유전자 변경, 예를 들어, TIGIT 발현을 감소시키는 변형, 또는 자살 유전자, 및 Fc 수용체, 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 트랜스진을 가질 수 있다.
용어 "CD96-비변형된 NK-92 세포"는 CD96-표적화된 변경을 갖지 않는 NK-92 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "TIGIT-표적화된 변경"은 NK-92 세포 내 TIGIT의 DNA 또는 RNA의 구조 또는 특성에 대한 변화, 예를 들어, TIGIT 단백질의 수준에서의 감소로 이어지는 TIGIT 발현의 녹아웃 또는 녹다운을 지칭한다. 따라서, TIGIT-표적화된 변경은 TIGIT 유전자 또는 TIGIT 유전자 전사체를 표적화할 수 있다. 인간 TIGIT 단백질 서열의 예는 유니프로테인 번호 Q495A1 하에 입수가능하다. 인간 TIGIT는 염색체 3 상에 위치하고, 영역 3q13.31에 맵핑된다. TIGIT는 게놈 레퍼런스 컨소시엄 휴먼 빌드 38 패치 릴리즈 7 (GRCh38.p7) 어셈블리에 따르면 chr3 NC_000003.12 (114293986..114310288)에 존재한다. 용어 "TIGIT"는 또한 TIGIT 염색체 유전자좌의 유전자에 의해 코딩된, 예시적인 참조 서열의 대립유전자 변이체를 포괄한다.
용어 "TIGIT-변형된 NK-92 세포"는 TIGIT 발현의 양의 감소를 발생시키는 TIGIT-표적화된 변경을 갖는 NK-92 세포를 지칭한다. 유전자 변형된 NK-92 세포는 추가로 다른 유전자 변경, 예를 들어, CD96 발현을 감소시키는 변형, 또는 Fc 수용체, 자살 유전자 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 트랜스진을 가질 수 있다.
용어 "TIGIT-비변형된 NK-92 세포"는 TIGIT-표적화된 변경을 갖지 않는 NK-92 세포를 지칭한다.
용어 "비-조사된 NK-92 세포"는 조사되지 않은 NK-92 세포를 지칭한다. 조사는 세포가 성장 및 증식하지 못하게 한다. 일부 실시양태에서, 조사 및 주입 사이의 시간은 최적 활성을 보존하기 위해 4시간보다 길지 않아야 하기 때문에, 투여를 위한 NK-92 세포는 치료 시설에서 또는 환자의 치료 전에 일부 다른 시점에서 조사될 것이 고려된다. 대안적으로, NK-92 세포는 또 다른 메카니즘에 의해 불활성화될 수 있다.
본원에 사용된 NK-92 세포의 "불활성화"는 그들을 성장할 수 없게 만든다. 불활성화는 또한 NK-92 세포의 사멸과 관련될 수 있다. NK-92 세포는 그들이 치료 용도에서 병리상태와 관련된 세포의 생체외 샘플을 효과적으로 퍼징한 후에, 또는 그들이 신체 내에 존재하는 많은 또는 모든 표적 세포를 효과적으로 사멸시키기에 충분한 기간 동안 포유동물의 신체 내에 존재한 후에 불활성화될 수 있는 것으로 고려된다. 불활성화는, 비제한적인 예로, NK-92 세포가 그에 대해 감수성인 불활성제를 투여함으로써 유도될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포독성" 및 "세포용해"는, NK 세포와 같은 이펙터 세포의 활성을 기재하는데 사용될 때, 동의어인 것으로 의도된다. 일반적으로, 세포독성 활성은 임의의 다양한 생물학적, 생화학적, 또는 생물물리학적 메카니즘에 의한 표적 세포의 사멸과 관련된다. 세포용해는 보다 구체적으로 이펙터가 표적 세포의 형질 막을 용해시키며, 그에 의해 그의 물리적 완전성을 파괴하는 활성을 지칭한다. 이는 표적 세포의 사멸을 발생시킨다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, NK 세포의 세포독성 효과는 세포용해로 인한 것으로 여겨진다.
세포/세포 집단에 대한 용어 "사멸"은 해당 세포/세포 집단의 사멸에 이르게 할 임의의 유형의 조작을 포함하는 것으로 지시된다.
용어 "Fc 수용체"는 Fc 영역으로 공지되어 있는 항체의 부분에 결합함으로써 면역 세포의 보호 기능에 기여하는 특정 세포 (예를 들어, 자연 킬러 세포)의 표면 상에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 세포의 Fc 수용체 (FcR)에 대한 항체의 Fc 영역의 결합은 항체-매개 식세포작용 또는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 통해 세포의 식세포작용 또는 세포독성 활성을 자극한다. FcR은 그들이 인식하는 항체의 유형에 기초하여 분류된다. 예를 들어, Fc-감마 수용체 (FCγR)는 항체의 IgG 클래스에 결합한다. FCγRIII-A (또한 CD16으로도 명명됨)는 IgG 항체에 결합하여 ADCC를 활성화시키는 저친화도 Fc 수용체이다. FCγRIII-A는 전형적으로 NK 세포 상에서 발견된다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용되고 임의의 길이의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 그의 유사체의 중합체성 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 기지의 또는 미지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우에, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 구성성분에 의해 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대 표지화 구성성분과의 접합에 의해 중합 후 추가로 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중 및 단일 가닥 분자 둘 다를 지칭한다. 달리 명시되거나 또는 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본 발명의 임의의 실시양태는 이중 가닥 형태, 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되어 있거나 예측되는 각각의 2개의 상보적 단일 가닥 형태 둘 다를 포괄한다.
폴리뉴클레오티드는 4개의 뉴클레오티드 염기: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 티민 (T); 및 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우에 티민 대신 우라실 (U)의 특이적 서열로 구성된다. 이에 따라, 용어 "폴리뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 분자의 알파벳 표시이다.
용어 "퍼센트 동일성"은 2개의 펩티드 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 동일성을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 비교 목적상 정렬될 수 있는 각각의 서열 내 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열 내 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되는 경우에는, 분자는 해당 위치에서 동일하다. 본원에 사용된 바와 같은, 어구 "상동" 또는 "변이체" 뉴클레오티드 서열, 또는 "상동" 또는 "변이체" 아미노산 서열은, 뉴클레오티드 수준 또는 아미노산 수준에서, 적어도 명시된 백분율의 동일성을 특징으로 하는 서열을 지칭한다. 상동 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 대립유전자 변이체 및 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열의 돌연변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 상동 뉴클레오티드 서열은 인간 이외의 포유동물 종의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상동 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환을 함유하고 폴리펩티드가 동일한 결합 및/또는 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상동 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 비교 서열과 적어도 60% 이상, 예를 들어 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 적어도 85% 또는 그 초과의 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상동 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 비교 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상동 아미노산 서열은 15개 이하, 또는 10개 이하, 또는 5개 이하 또는 3개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 퍼센트 동일성은, 예를 들어, 스미스(Smith) 및 워터맨(Waterman)의 알고리즘 (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)을 사용하는, 디폴트 세팅을 사용한, 갭 프로그램 (위스콘신 서열 분석 패키지, UNIX용 버전 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 유니버시티 리서치 파크(University Research Park), 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정될 수 있다.
용어 "발현"은 RNA 또는 단백질과 같은 유전자 산물의 생산을 지칭한다. 용어 "일시적 발현"은 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 혼입되지 않은 경우의 발현을 지칭한다.
용어 "시토카인" 또는 "시토카인들"은 면역계의 세포에 영향을 미치는 생물학적 분자의 일반적인 클래스를 지칭한다. 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 예시적인 시토카인은 인터페론 및 인터류킨 (IL), 특히 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "벡터"는, 예를 들어 형질전환의 프로세스에 의해 허용 세포 내에 위치할 때 벡터가 복제될 수 있도록 무손상 레플리콘을 포함하는 비-염색체 핵산을 지칭한다. 벡터는 하나의 세포 유형, 예컨대 박테리아에서는 복제할 수 있으나, 또 다른 세포, 예컨대 포유동물 세포에서는 복제하는 능력이 제한된다. 벡터는 바이러스성 또는 비-바이러스성일 수 있다. 핵산을 전달하기 위한 예시적인 비-바이러스 벡터는 네이키드 DNA; 단독 또는 양이온성 중합체와 조합된, 양이온성 지질과 복합체화된 DNA; 음이온성 및 양이온성 리포솜; DNA-단백질 복합체 및 일부 경우에 리포솜에 함유된, 양이온성 중합체, 예컨대 이종 폴리리신, 정의된-길이의 올리고펩티드, 및 폴리에틸렌 이민과 축합된 DNA를 포함하는 입자; 및 바이러스 및 폴리리신-DNA를 포함하는 3원 복합체의 사용을 포함한다.
용어 "표적 모티프"는, 결합을 위한 충분한 조건이 존재한다면, 결합 분자가 결합할 핵산의 부분을 정의하는 핵산 서열을 지칭한다.
용어 "간섭 RNA"는, 이중 가닥 또는 단일 가닥이며 표적 유전자의 발현을 녹다운시키도록 지시된 RNA 간섭 메카니즘의 유도를 실행할 수 있는 RNA 핵산 분자를 지칭한다.
용어 "환자", "대상체", "개체" 등은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 본원에 기재된 방법에 적용가능한 임의의 동물, 또는 시험관내 또는 계내의 그의 세포를 지칭한다. 비-제한적인 특정 실시양태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다.
용어 "수용자"는, 치료 동안, 변형된 또는 비변형된 NK-92 세포가 투여된 환자를 지칭한다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체, 예컨대 인간에서 본원에 기재된 질환 또는 장애의 치료를 포괄하고, 하기를 포함한다: (i) 질환 또는 장애를 억제하는 것, 즉 그의 발생을 저지하는 것; (ii) 질환 또는 장애를 완화시키는 것, 즉 장애의 퇴행을 야기하는 것; (iii) 장애의 진행을 둔화시키는 것; 및/또는 (iv) 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상의 진행을 억제, 완화, 또는 둔화시키는 것.
용어 치료제 예컨대 NK-92 세포를 "투여하는 것" 또는 "투여"는 의도된 기능을 수행하도록 치료제를 도입 또는 전달하는 임의의 경로를 포함한다. 투여는 작용제의 전달에 적합한 임의의 경로에 의해 수행될 수 있다. 이에 따라, 전달 경로는 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하 전달을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 NK-92 세포는 종양에 직접적으로, 예를 들어, 종양 내로의 주사에 의해 투여된다.
용어 "접촉시키는" (즉, 폴리뉴클레오티드 서열을 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부-연관 (Cas) 단백질 및/또는 리보핵산과 접촉시키는)은 세포 내 Cas 단백질 및/또는 리보핵산을 함께 시험관내에서 인큐베이션하는 것 (예를 들어, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 핵산을 배양물 내 세포에 첨가하는 것)을 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 용어 "접촉시키는"은 미생물 (즉, 박테리아)에서 자연 발생할 수 있는 본원에 개시된 바와 같은 Cas 단백질 및/또는 리보핵산에 대한 세포의 생체내 노출을 포함하는 것으로는 의도되지 않는다. 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 본원에 개시된 바와 같은 Cas 단백질 및/또는 리보핵산과 접촉시키는 단계는 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포는 부착 배양물 중에서, 또는 현탁 배양물 중에서 처리될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 Cas 단백질 및/또는 리보핵산과 접촉된 세포가 또한 성장 인자 또는 다른 분화 작용제와 같은 또 다른 작용제, 또는 세포를 안정화시키거나 또는 세포를 추가로 분화시키는 환경과 동시에 또는 후속적으로 접촉될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "녹아웃"은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 방해하는 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 결실시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 녹아웃은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능적 도메인에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열 내의 결실을 유도함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 상세한 설명에 기초하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분을 녹아웃시키기 위해, 다양한 유전적 접근법, 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템, ZFN, TALEN, TgAgo를 사용하는 방법을 용이하게 인지할 것이다.
본원에 사용된 용어 "녹다운"은 발현을 저하시키는 유전자 변형을 함유하지 않는 대응물 대조군 세포 내 표적 mRNA 또는 상응하는 단백질의 발현과 비교하여 유전자 변형된 세포 내 표적 mRNA 또는 상응하는 단백질의 발현에서의 측정가능한 저하를 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 상세한 설명에 기초하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분을 녹다운시키기 위해, 다양한 유전적 접근법, 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스 RNA, 또는 다른 RNA-매개 억제 기술을 사용하는 방법을 용이하게 인지할 것이다.
용어 "감소시키다", "저하된", "저하", 및 "감소시키다"는 모두 본원에서, 참조 수준과 비교하여 적어도 10%만큼의 감소, 예를 들어 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%만큼 또는 최대 100% 및 그를 포함하는 감소 (즉 참조 샘플과 비교하여 부재하는 수준), 또는 10-100% 사이의 임의의 감소를 지칭하는 것으로 사용된다.
용어 "암"은 백혈병, 림프종, 암종 및 육종을 포함한, 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물, 또는 악성 종양을 지칭한다. 예시적인 암은 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 두경부암, 간암, 신장암, 폐암, 비소세포 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 육종, 위암, 자궁암 및 수모세포종을 포함한다. 추가적인 예는 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 마크로글로불린혈증, 원발성 뇌 종양, 암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 카르시노이드, 방광암, 전암성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신 피질암, 내분비 및 외분비 췌장의 신생물, 및 전립선암을 포함한다.
NK-92 세포
NK-92 세포주는 비-호지킨 림프종으로 진단된 50-세 남성의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 확립된 인간, IL-2-의존성 NK 세포주이다 (Gong, et al., Leukemia. 8:652-8 (1994)). NK-92 세포주는 CD56bright, CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45, 및 CD54 표면 마커를 발현하지만, CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23, 및 CD34 마커는 디스플레이하지 않는다. 정상 NK 세포와 달리, NK-92는 대부분의 킬러 세포 억제 수용체 (KIR)의 발현이 결여되어 있다 (Maki, et al., J Hematother Stem Cell Res. 10:369-83 (2001)). 모든 NK 세포에 의해 발현되는, 활성화 기능 및 억제 잠재력을 갖는 KIR 수용체인 KIR2DL4만이 NK-92 세포의 표면 상에서 검출되었다.
배양물에서의 NK-92 세포의 성장은 재조합 인터류킨 2 (rIL-2)의 존재에 의존적이며, 1 IU/mL만큼 낮은 용량은 증식을 유지하기에 충분하다. IL-7 및 IL-12는 장기간 성장을 지지하지 않으며, 또한 IL-1α, IL-6, 종양 괴사 인자 α, 인터페론 α, 및 인터페론 γ를 포함한 시험된 다른 시토카인도 그러하다. NK-92는 심지어 1:1의 낮은 이펙터:표적 (E:T) 비에서도 높은 세포독성을 갖는다. 상기 문헌 [Gong, et al.].
NK-92 세포는 예를 들어, 미국 특허 번호 7,618,817, 8,034,332, 및 8,313,943, 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0040386에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않고, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. NK92 세포는 공지되어 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 난트퀘스트, 인크.(NantKwest, Inc.)로부터 용이하게 입수가능하다. 예시적인 NK-92 세포주는 야생형 NK-92, NK-92-CD16, NK-92-CD16-γ, NK-92-CD16-ζ, NK-92-CD16(F176V), NK-92MI 및 NK-92CI를 포함한다.
CD96의 발현의 감소
본 개시내용은 CD96의 발현을 억제하는 CD96-표적화된 변경을 포함하는 CD96-변형된 NK-92 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, CD96-변형된 NK-92 세포는 CD96 유전자의 파괴에 의해 생성된다. CD96 유전자를 파괴하는 방법은 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), Tale-이펙터 도메인 뉴클레아제 (TALEN), 및 CRIPSR/Cas 시스템을 사용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
CRISPR
일부 실시양태에서, CD96의 녹아웃 또는 녹다운은 CRISPR/CAS 방법론을 사용하여 수행된다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 단백질, 및 Cas 단백질을 CD96 유전자 서열 내 표적 모티프에 대해 지시하고 그에 혼성화할 수 있는 적어도 1 내지 2개의 리보핵산을 포함한다. 이어서 Cas 단백질은 표적 모티프를 절단하고, 이중-가닥 파단 또는 단일-가닥 파단 결과를 초래한다. 세포 내 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경시킬 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 시스템이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR Cas 시스템은 CRISPR 유형 I 시스템이며, 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR 유형 II 시스템이다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR 유형 V 시스템이다.
본 발명에 사용된 Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질 또는 그의 기능적 유도체일 수 있다. "기능적 유도체"는 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩티드 및 그의 단편의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 단 그들은 상응하는 천연 서열 폴리펩티드와 공통되는 생물학적 활성을 갖는다. 본원에 고려된 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해할 수 있는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체, 공유 변형물, 및 그의 융합물 예컨대 유도체 Cas 단백질 모두를 포괄한다. Cas 폴리펩티드 또는 그의 단편의 적합한 유도체는 Cas 단백질 또는 그의 단편의 돌연변이체, 융합물, 공유 변형물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 Cas 단백질은 Cas9 또는 그의 기능적 유도체이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 것이다. Cas9는 2개의 엔도뉴클레아제 도메인, 예컨대 crRNA에 비상보적인 표적 DNA를 절단하는 RuvC-유사 도메인, 및 crRNA에 상보적인 표적 DNA를 절단하는 HNH 뉴클레아제 도메인을 함유한다. Cas9의 이중-가닥 엔도뉴클레아제 활성은 또한 표적 서열 내 표적 모티프의 3'- 바로 뒤에, 프로토스페이서-연관 모티프 (PAM)로 공지되어 있는 짧은 보존된 서열 (2-5개의 뉴클레오티드)을 필요로 한다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 폴리펩티드 형태로 NK-92 세포 내로 도입된다. 특정 실시양태에서, Cas 단백질은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 세포-관통 폴리펩티드 또는 세포-관통 펩티드에 접합 또는 융합될 수 있다. 세포-관통 펩티드의 비제한적인 예는 문헌 [Milletti F, "Cell-penetrating peptides: classes, orgin and current landscape." Drug Discov. Today 17: 850-860, 2012]에 제공된 것들을 포함하며, 그의 관련 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 경우에, 비변형된 NK-92 세포는 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질이 가이드 RNA에 의해 지시되는, 표적 유전자 내의 표적 모티프는 17 내지 23 bp 길이이다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 적어도 20 bp 길이이다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 20개-뉴클레오티드 DNA 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 20개-뉴클레오티드 DNA 서열이고, Cas 단백질에 의해 인식되는 프로토스페이서-연관 모티프 (PAM)로 공지되어 있는 짧은 보존된 서열이 바로 앞에 있다. 일부 실시양태에서, PAM 모티프는 NGG 모티프이다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자의 표적 모티프는 엑손 내에 있다.
일부 실시양태에서, 표적 모티프는 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템의 오프-표적 효과를 최소화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 그가 세포 내 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교 시 적어도 2개의 미스매치를 함유하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 그가 세포 내 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교 시 적어도 1개의 미스매치를 함유하도록 선택된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 기술을 사용하여 오프-표적 효과를 최소화하기 위해 적합한 표적 모티프 (예를 들어, 생물정보학 분석)를 선택할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
Cas 단백질을 표적 유전자 서열 내 표적 모티프에 대해 지시하고 그에 혼성화할 수 있는 리보핵산은 단일 가이드 RNA ("sgRNA")로서 지칭된다. sgRNA는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 이용된 특정한 CRISPR/Cas 시스템, 및 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 의존하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2개의 리보핵산은 또한 표적 폴리뉴클레오티드 서열 이외의 핵산 서열과의 혼성화를 최소화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2개의 리보핵산은 세포 내 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교 시 적어도 2개의 미스매치를 함유하는 표적 모티프에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2개의 리보핵산은 세포 내 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교 시 적어도 1개의 미스매치를 함유하는 표적 모티프에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2개의 리보핵산은 Cas 단백질에 의해 인식되는 데옥시리보핵산 모티프에 바로 인접한 표적 모티프에 혼성화하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2개의 리보핵산 각각은 표적 모티프 사이에 위치한 돌연변이체 대립유전자에 플랭킹된, Cas 단백질에 의해 인식되는 데옥시리보핵산 모티프에 바로 인접한 표적 모티프에 혼성화하도록 디자인된다. 가이드 RNA는 또한, 예를 들어, 웹사이트 crispr.mit.edu에서 용이하게 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 디자인될 수 있다. 하나 이상의 sgRNA는 관련 기술분야에 공지되어 있는 방법에 따라 형질감염에 의해 Cas 단백질이 존재하는 NK-92 세포 내로 형질감염될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD96을 표적화하는 sgRNA는 서열식별번호: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 sgRNA이다.
유전자 발현을 저하시키기 위해 CRISPR/Cas 시스템을 사용하는 방법은 다양한 공개물, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0170753에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)
일부 실시양태에서, CD96-표적화된 변경을 포함하는 변형된 NK-92 세포는 NK-92 세포 내 CD96을 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 사용하여 녹아웃시킴으로써 생산된다. ZFN은 FokI 엔도뉴클레아제의 비-특이적 절단 도메인 (N) 및 아연 핑거 단백질 (ZFP)을 포함하는 융합 단백질이다. 한 쌍의 ZFN은 표적 유전자 내 특이적 유전자좌를 인식하는데 수반되고 -- 하나는 변형시키고자 하는 부위의 상류 서열을 인식하고 다른 것은 하류 서열을 인식하며 -- ZFN의 뉴클레아제 부분은 특이적 유전자좌를 절단하여 표적 CD96 유전자의 녹아웃을 유발한다. 유전자 발현을 저하시키기 위해 ZFN을 사용하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 9,045,763, 및 또한 문헌 [Durai et al., "Zinc Finger Nucleases: Custom-Designed Molecular Scissors for Genome Engineering of Plant and Mamalian cells," Nucleic Acid Research 33 (18):5978-5990 (2005)]에 개시되어 있는 바와 같이 널리 공지되어 있으며, 그의 개시내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)
일부 실시양태에서, 표적화된 변경을 포함하는 CD96-변형된 NK-92 세포는 CD96을 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로 녹아웃시킴으로써 생산된다. TALEN은 그들이 게놈 부위 주위에 쌍으로서 결합하고 동일한 비-특이적 뉴클레아제, FoKI를 지시하여 특이적 부위에서 게놈을 절단하지만, DNA 삼중항을 인식하는 대신에, 각각의 도메인이 단일 뉴클레오티드를 인식한다는 점에서 ZFN과 유사하다. 유전자 발현을 저하시키기 위해 ZFN을 사용하는 방법은 또한, 예를 들어, 미국 특허 번호 9,005,973, 및 또한 문헌 [Christian et al. "Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nulceases," Genetics 186(2): 757-761 (2010)]에 개시된 바와 같이 널리 공지되어 있으며, 그의 개시내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
NK-92 세포에서의 CD96 발현의 녹다운
일부 실시양태에서, 표적화된 변경을 포함하는 CD96-변형된 NK-92 세포는 1개의 CD96을 간섭 RNA로 녹다운시킴으로써 생산된다. 간섭 RNA는, 생체내 도입될 때, 다른 단백질과 RNA-유도 침묵 복합체 ("RISC")를 형성하고, RNA 간섭 (RNAi)으로 공지되어 있는 프로세스를 개시한다. RNAi 프로세스 동안, RISC는 단일-가닥 간섭 RNA 또는 이중 가닥 간섭 RNA 중 하나의 가닥을 혼입한다. 혼입된 가닥은 RISC에 대한 주형으로서 작용하여 상보적 mRNA 전사체를 인식한다. 일단 상보적 mRNA가 식별되면, RISC 내 단백질 구성성분은 mRNA를 활성화시키고 절단하여, 표적 유전자 발현의 녹다운을 초래한다. 표적 유전자의 발현을 녹다운시키는데 사용되는 간섭 RNA 분자의 비제한적인 예는 siRNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 단일 가닥 간섭 RNA, 및 마이크로RNA (miRNA)를 포함한다. 이들 간섭 RNA를 사용하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 간섭 RNA는 siRNA이다. siRNA는 전형적으로 30개 미만의 뉴클레오티드 길이인 이중 가닥 RNA이다. siRNA에 의한 유전자 침묵은 siRNA의 하나의 가닥으로 시작하여 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)로 공지되어 있는 리보핵단백질 복합체 내로 혼입된다. RISC 내 혼입된 가닥은 혼입된 siRNA 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 mRNA 분자를 식별하고 이어서 RISC는 이들 표적 mRNA를 절단하거나 또는 그의 번역을 억제한다.
한 실시양태에서, 간섭 RNA는 마이크로RNA이다. 마이크로RNA는 소형 비-코딩 RNA 분자이며, 이는 mRNA 분자 내의 상보적 서열과 혼성화하여, mRNA의 절단, 또는 그의 폴리(A) 테일의 단축을 통한 mRNA의 탈안정화를 초래할 수 있다.
한 실시양태에서, 간섭 RNA는 단일-가닥 간섭 RNA이다. 단일 가닥은 또한, 이중-가닥 siRNA보다는 덜 효율적일지라도, 이중 가닥 siRNA와 유사한 방식으로 mRNA 침묵을 실행할 수 있다. 단일-가닥 간섭 RNA는 전형적으로 상기 기재된 이중-가닥 siRNA에 대한 것과 같이 약 19 내지 약 49개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
짧은 헤어핀 RNA 또는 소형 헤어핀 RNA (shRNA)는 세포에서 생산된 siRNA를 통해 표적 유전자 발현을 침묵시키는데 사용될 수 있는 치밀한 헤어핀 턴을 갖는 인공 RNA 분자이다. 세포 내 shRNA의 발현은 전형적으로 플라스미드의 전달에 의해 또는 바이러스 또는 박테리아 벡터를 통해 확립된다. 적합한 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. shRNA는 상대적으로 낮은 분해율 및 전환율을 갖는다는 점에서 siRNA의 유리한 매개자이다.
본원에 사용된 간섭 RNA는 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 또는 변형에 의해 자연 발생 RNA와는 상이할 수 있다. 비-뉴클레오티드 물질은 간섭 RNA에 5' 단부에서, 3' 단부에서, 또는 내부로 결합될 수 있다. 간섭 RNA가 자연 발생 RNA와 관련하여 함유할 수 있는 변형의 비제한적인 예는 미국 특허 번호 8,399,653에 개시되어 있으며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 변형은 간섭 RNA의 뉴클레아제 저항성을 증가시키도록, 세포 흡수를 개선시키도록, 세포 표적화를 증진시키도록, 간섭 RNA를 추적하는 것을 보조하도록, 안전성을 추가로 개선시키도록, 또는 인터페론 경로의 활성화에 대한 잠재력을 저하시키도록 통상적으로 디자인된다. 예를 들어, 간섭 RNA는 오버행의 단부에 퓨린 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 피롤리딘 링커에 의한 siRNA 분자의 센스 가닥의 3' 단부에 대한 콜레스테롤의 접합은, 예를 들어, 또한 siRNA에 대한 안정성을 제공한다.
본원에 사용된 간섭 RNA는 전형적으로 약 10-60개, 10-50개, 또는 10-40개 (듀플렉스) 뉴클레오티드 길이, 보다 전형적으로 약 8-15개, 10-30개, 10-25개, 또는 10-25개 (듀플렉스) 뉴클레오티드 길이, 약 10-24개 (듀플렉스) 뉴클레오티드 길이이다 (예를 들어, 이중-가닥 siRNA의 각각의 상보적 서열은 10-60개, 10-50개, 10-40개, 10-30개, 10-25개, 또는 10-25개의 뉴클레오티드 길이, 약 10-24개, 11-22개, 또는 11-23개의 뉴클레오티드 길이이고, 이중-가닥 siRNA는 약 10-60개, 10-50개, 10-40개, 10-30개, 10-25개, 또는 10-25개 염기 쌍 길이임).
RNAi에 대한 관심 유전자 내 표적 모티프를 선택하는 기술은, 예를 들어, 록펠러 유니버시티(Rockefeller University) 웹 사이트에서 이용가능한 문헌 [Tuschl, T. et al., "The siRNA User Guide," revised May 6, 2004]에 기재된 바와 같고; 암비온 인크.(Ambion Inc.)의 암비온의 웹 사이트에서의 기술 회보 #506, "siRNA 디자인 가이드라인"에 의해; 및 예를 들어, 인비트로젠(Invitrogen), 다마콘(Dharmacon), 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies), 젠스크립트(Genscript), 또는 프롤리고(Proligo) 웹 사이트에서의 다른 웹-기반 디자인 툴에 의해 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 초기 검색 파라미터는 35% 내지 55%의 G/C 함량 및 19 내지 27개의 뉴클레오티드의 siRNA 길이를 포함할 수 있다. 표적 서열은 mRNA의 코딩 영역에 또는 5' 또는 3' 비번역 영역에 위치할 수 있다. 표적 서열은 간섭 RNA 분자, 예컨대 본원에 기재된 것들을 유도하는데 사용될 수 있다.
녹아웃 또는 녹다운의 효율은 CD96 mRNA 또는 단백질의 양을 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 방법, 예를 들어, 정량적 PCR, 웨스턴 블롯, 유동 세포측정법 등을 사용하여 측정함으로써 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD96 단백질의 수준을 평가하여 녹아웃 또는 녹다운 효율을 평가한다. 특정 실시양태에서, 표적 유전자 발현의 저하의 효율은 CD96-표적화된 변경을 갖지 않는 상응하는 NK-92 세포와 비교 시 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20% , 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 그 초과이다. 특정 실시양태에서, 저하의 효율은 약 10% 내지 약 90%이다. 특정 실시양태에서, 저하의 효율은 약 30% 내지 약 80%이다. 특정 실시양태에서, 저하의 효율은 약 50% 내지 약 80%이다. 일부 실시양태에서, 저하의 효율은 약 80% 이상이다.
TIGIT의 발현의 감소
본 개시내용은 추가적으로 TIGIT의 발현을 억제하는 TIGIT-표적화된 변경을 포함하는 TIGIT-변형된 NK-92 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, TIGIT-변형된 NK-92 세포는 TIGIT 유전자의 파괴에 의해 생성된다. TIGIT 유전자를 파괴하는 방법은 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), Tale-이펙터 도메인 뉴클레아제 (TALEN), 및 CRIPSR/Cas 시스템을 사용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
CRISPR
일부 실시양태에서, TIGIT의 녹아웃 또는 녹다운은 CRISPR/CAS 방법론을 사용하여 수행된다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 단백질, 및 Cas 단백질을 TIGIT 유전자 서열 내 표적 모티프에 대해 지시하고 그에 혼성화할 수 있는 적어도 1 내지 2개의 리보핵산을 포함한다. 이어서 Cas 단백질은 표적 모티프를 절단하고, 이중-가닥 파단 또는 단일-가닥 파단 결과를 초래한다. 세포 내 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경시킬 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 시스템이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR Cas 시스템은 CRISPR 유형 I 시스템이며, 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR 유형 II 시스템이다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR 유형 V 시스템이다.
본 발명에 사용된 Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질 또는 그의 기능적 유도체일 수 있다. "기능적 유도체"는 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩티드 및 그의 단편의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 단 그들은 상응하는 천연 서열 폴리펩티드와 공통되는 생물학적 활성을 갖는다. 본원에 고려된 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해할 수 있는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체, 공유 변형물, 및 그의 융합물 예컨대 유도체 Cas 단백질 모두를 포괄한다. Cas 폴리펩티드 또는 그의 단편의 적합한 유도체는 Cas 단백질 또는 그의 단편의 돌연변이체, 융합물, 공유 변형물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 Cas 단백질은 Cas9 또는 그의 기능적 유도체이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 것이다. Cas9는 2개의 엔도뉴클레아제 도메인, 예컨대 crRNA에 비상보적인 표적 DNA를 절단하는 RuvC-유사 도메인, 및 crRNA에 상보적인 표적 DNA를 절단하는 HNH 뉴클레아제 도메인을 함유한다. Cas9의 이중-가닥 엔도뉴클레아제 활성은 또한 표적 서열 내 표적 모티프의 3'- 바로 뒤에, 프로토스페이서-연관 모티프 (PAM)로 공지되어 있는 짧은 보존된 서열 (2-5개의 뉴클레오티드)을 필요로 한다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 폴리펩티드 형태로 NK-92 세포 내로 도입된다. 특정 실시양태에서, Cas 단백질은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 세포-관통 폴리펩티드 또는 세포-관통 펩티드에 접합 또는 융합될 수 있다. 세포-관통 펩티드의 비제한적인 예는 문헌 [Milletti F, "Cell-penetrating peptides: classes, orgin and current landscape." Drug Discov. Today 17: 850-860, 2012]에 제공된 것들을 포함하며, 그의 관련 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 경우에, 비변형된 NK-92 세포는 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질이 가이드 RNA에 의해 지시되는, 표적 유전자 내의 표적 모티프는 17 내지 23 bp 길이이다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 적어도 20 bp 길이이다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 20개-뉴클레오티드 DNA 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 20개-뉴클레오티드 DNA 서열이고, Cas 단백질에 의해 인식되는 프로토스페이서-연관 모티프 (PAM)로 공지되어 있는 짧은 보존된 서열이 바로 앞에 있다. 일부 실시양태에서, PAM 모티프는 NGG 모티프이다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자의 표적 모티프는 엑손 내에 있다.
일부 실시양태에서, 표적 모티프는 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템의 오프-표적 효과를 최소화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 그가 세포 내 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교 시 적어도 2개의 미스매치를 함유하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 표적 모티프는 그가 세포 내 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교 시 적어도 1개의 미스매치를 함유하도록 선택된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 기술을 사용하여 오프-표적 효과를 최소화하기 위해 적합한 표적 모티프 (예를 들어, 생물정보학 분석)를 선택할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
Cas 단백질을 표적 유전자 서열 내 표적 모티프에 대해 지시하고 그에 혼성화할 수 있는 리보핵산은 단일 가이드 RNA ("sgRNA")로서 지칭된다. sgRNA는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 이용된 특정한 CRISPR/Cas 시스템, 및 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 의존하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2개의 리보핵산은 또한 표적 폴리뉴클레오티드 서열 이외의 핵산 서열과의 혼성화를 최소화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2개의 리보핵산은 세포 내 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교 시 적어도 2개의 미스매치를 함유하는 표적 모티프에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2개의 리보핵산은 세포 내 모든 다른 게놈 뉴클레오티드 서열과 비교 시 적어도 1개의 미스매치를 함유하는 표적 모티프에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2개의 리보핵산은 Cas 단백질에 의해 인식되는 데옥시리보핵산 모티프에 바로 인접한 표적 모티프에 혼성화하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 1 내지 2개의 리보핵산 각각은 표적 모티프 사이에 위치한 돌연변이체 대립유전자에 플랭킹된, Cas 단백질에 의해 인식되는 데옥시리보핵산 모티프에 바로 인접한 표적 모티프에 혼성화하도록 디자인된다. 가이드 RNA는 또한, 예를 들어, 웹사이트 crispr.mit.edu에서 용이하게 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 디자인될 수 있다. 하나 이상의 sgRNA는 관련 기술분야에 공지되어 있는 방법에 따라 형질감염에 의해 Cas 단백질이 존재하는 NK-92 세포 내로 형질감염될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIGIT를 표적화하는 sgRNA는 서열식별번호: 5-8로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 sgRNA이다.
유전자 발현을 저하시키기 위해 CRISPR/Cas 시스템을 사용하는 방법은 다양한 공개물, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2014/0170753에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)
일부 실시양태에서, TIGIT-표적화된 변경을 포함하는 변형된 NK-92 세포는 NK-92 세포 내 TIGIT를 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 사용하여 녹아웃시킴으로써 생산된다. ZFN은 FokI 엔도뉴클레아제의 비-특이적 절단 도메인 (N) 및 아연 핑거 단백질 (ZFP)을 포함하는 융합 단백질이다. 한 쌍의 ZFN은 표적 유전자 내 특이적 유전자좌를 인식하는데 수반되고 -- 하나는 변형시키고자 하는 부위의 상류 서열을 인식하고 다른 것은 하류 서열을 인식하며 -- ZFN의 뉴클레아제 부분은 특이적 유전자좌를 절단하여 표적 TIGIT 유전자의 녹아웃을 유발한다. 유전자 발현을 저하시키기 위해 ZFN을 사용하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 9,045,763, 및 또한 문헌 [Durai et al., "Zinc Finger Nucleases: Custom-Designed Molecular Scissors for Genome Engineering of Plant and Mamalian cells," Nucleic Acid Research 33 (18):5978-5990 (2005)]에 개시되어 있는 바와 같이 널리 공지되어 있으며, 그의 개시내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)
일부 실시양태에서, 표적화된 변경을 포함하는 TIGIT-변형된 NK-92 세포는 TIGIT를 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로 녹아웃시킴으로써 생산된다. TALEN은 그들이 게놈 부위 주위에 쌍으로서 결합하고 동일한 비-특이적 뉴클레아제, FoKI를 지시하여 특이적 부위에서 게놈을 절단하지만, DNA 삼중항을 인식하는 대신에, 각각의 도메인이 단일 뉴클레오티드를 인식한다는 점에서 ZFN과 유사하다. 유전자 발현을 저하시키기 위해 ZFN을 사용하는 방법은 또한, 예를 들어, 미국 특허 번호 9,005,973, 및 또한 문헌 [Christian et al. "Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nulceases," Genetics 186(2): 757-761 (2010)]에 개시된 바와 같이 널리 공지되어 있으며, 그의 개시내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
NK-92 세포에서의 TIGIT 발현의 녹다운
일부 실시양태에서, 표적화된 변경을 포함하는 TIGIT-변형된 NK-92 세포는 1개의 TIGIT를 간섭 RNA로 녹다운시킴으로써 생산된다. 간섭 RNA는, 생체내 도입될 때, 다른 단백질과 RNA-유도 침묵 복합체 ("RISC")를 형성하고, RNA 간섭 (RNAi)으로 공지되어 있는 프로세스를 개시한다. RNAi 프로세스 동안, RISC는 단일-가닥 간섭 RNA 또는 이중 가닥 간섭 RNA 중 하나의 가닥을 혼입한다. 혼입된 가닥은 RISC에 대한 주형으로서 작용하여 상보적 mRNA 전사체를 인식한다. 일단 상보적 mRNA가 식별되면, RISC 내 단백질 구성성분은 mRNA를 활성화시키고 절단하여, 표적 유전자 발현의 녹다운을 초래한다. 표적 유전자의 발현을 녹다운시키는데 사용되는 간섭 RNA 분자의 비제한적인 예는 siRNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 단일 가닥 간섭 RNA, 및 마이크로RNA (miRNA)를 포함한다. 이들 간섭 RNA를 사용하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 간섭 RNA는 siRNA이다. siRNA는 전형적으로 30개 미만의 뉴클레오티드 길이인 이중 가닥 RNA이다. siRNA에 의한 유전자 침묵은 siRNA의 하나의 가닥으로 시작하여 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)로 공지되어 있는 리보핵단백질 복합체 내로 혼입된다. RISC 내 혼입된 가닥은 혼입된 siRNA 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 mRNA 분자를 식별하고 이어서 RISC는 이들 표적 mRNA를 절단하거나 또는 그의 번역을 억제한다.
한 실시양태에서, 간섭 RNA는 마이크로RNA이다. 마이크로RNA는 소형 비-코딩 RNA 분자이며, 이는 mRNA 분자 내의 상보적 서열과 혼성화하여, mRNA의 절단, 또는 그의 폴리(A) 테일의 단축을 통한 mRNA의 탈안정화를 초래할 수 있다.
한 실시양태에서, 간섭 RNA는 단일-가닥 간섭 RNA이다. 단일 가닥은 또한, 이중-가닥 siRNA보다는 덜 효율적일지라도, 이중 가닥 siRNA와 유사한 방식으로 mRNA 침묵을 실행할 수 있다. 단일-가닥 간섭 RNA는 전형적으로 상기 기재된 이중-가닥 siRNA에 대한 것과 같이 약 19 내지 약 49개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
짧은 헤어핀 RNA 또는 소형 헤어핀 RNA (shRNA)는 세포에서 생산된 siRNA를 통해 표적 유전자 발현을 침묵시키는데 사용될 수 있는 치밀한 헤어핀 턴을 갖는 인공 RNA 분자이다. 세포 내 shRNA의 발현은 전형적으로 플라스미드의 전달에 의해 또는 바이러스 또는 박테리아 벡터를 통해 확립된다. 적합한 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. shRNA는 상대적으로 낮은 분해율 및 전환율을 갖는다는 점에서 siRNA의 유리한 매개자이다.
본원에 사용된 간섭 RNA는 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 또는 변형에 의해 자연 발생 RNA와는 상이할 수 있다. 비-뉴클레오티드 물질은 간섭 RNA에 5' 단부에서, 3' 단부에서, 또는 내부로 결합될 수 있다. 간섭 RNA가 자연 발생 RNA와 관련하여 함유할 수 있는 변형의 비제한적인 예는 미국 특허 번호 8,399,653에 개시되어 있으며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 변형은 간섭 RNA의 뉴클레아제 저항성을 증가시키도록, 세포 흡수를 개선시키도록, 세포 표적화를 증진시키도록, 간섭 RNA를 추적하는 것을 보조하도록, 안전성을 추가로 개선시키도록, 또는 인터페론 경로의 활성화에 대한 잠재력을 저하시키도록 통상적으로 디자인된다. 예를 들어, 간섭 RNA는 오버행의 단부에 퓨린 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 피롤리딘 링커에 의한 siRNA 분자의 센스 가닥의 3' 단부에 대한 콜레스테롤의 접합은, 예를 들어, 또한 siRNA에 대한 안정성을 제공한다.
본원에 사용된 간섭 RNA는 전형적으로 약 10-60개, 10-50개, 또는 10-40개 (듀플렉스) 뉴클레오티드 길이, 보다 전형적으로 약 8-15개, 10-30개, 10-25개, 또는 10-25개 (듀플렉스) 뉴클레오티드 길이, 약 10-24개 (듀플렉스) 뉴클레오티드 길이이다 (예를 들어, 이중-가닥 siRNA의 각각의 상보적 서열은 10-60개, 10-50개, 10-40개, 10-30개, 10-25개, 또는 10-25개의 뉴클레오티드 길이, 약 10-24개, 11-22개, 또는 11-23개의 뉴클레오티드 길이이고, 이중-가닥 siRNA는 약 10-60개, 10-50개, 10-40개, 10-30개, 10-25개, 또는 10-25개 염기 쌍 길이임).
RNAi에 대한 관심 유전자 내 표적 모티프를 선택하는 기술은, 예를 들어, 록펠러 유니버시티(Rockefeller University) 웹 사이트에서 이용가능한 문헌 [Tuschl, T. et al., "The siRNA User Guide," revised May 6, 2004]에 기재된 바와 같고; 암비온 인크.(Ambion Inc.)의 암비온의 웹 사이트에서의 기술 회보 #506, "siRNA 디자인 가이드라인"에 의해; 및 예를 들어, 인비트로젠(Invitrogen), 다마콘(Dharmacon), 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies), 젠스크립트(Genscript), 또는 프롤리고(Proligo) 웹 사이트에서의 다른 웹-기반 디자인 툴에 의해 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 초기 검색 파라미터는 35% 내지 55%의 G/C 함량 및 19 내지 27개의 뉴클레오티드의 siRNA 길이를 포함할 수 있다. 표적 서열은 mRNA의 코딩 영역에 또는 5' 또는 3' 비번역 영역에 위치할 수 있다. 표적 서열은 간섭 RNA 분자, 예컨대 본원에 기재된 것들을 유도하는데 사용될 수 있다.
녹아웃 또는 녹다운의 효율은 TIGIT mRNA 또는 단백질의 양을 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 방법, 예를 들어, 정량적 PCR, 웨스턴 블롯, 유동 세포측정법 등을 사용하여 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIGIT 단백질의 수준을 평가하여 녹아웃 또는 녹다운 효율을 평가한다. 특정 실시양태에서, 표적 유전자 발현의 저하의 효율은 TIGIT-표적화된 변경을 갖지 않는 상응하는 NK-92 세포와 비교 시 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20% , 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 그 초과이다. 특정 실시양태에서, 저하의 효율은 약 10% 내지 약 90%이다. 특정 실시양태에서, 저하의 효율은 약 30% 내지 약 80%이다. 특정 실시양태에서, 저하의 효율은 약 50% 내지 약 80%이다. 일부 실시양태에서, 저하의 효율은 약 80% 이상이다.
CD96 및 TIGIT 발현을 감소시키기 위해 변형된 NK-92 세포
추가 측면에서, CD96 발현을 저하시키거나 제거하기 위한 CD96-표적화된 변경 및 TIGIT 발현을 저하시키거나 제거하기 위한 TIGIT-표적화된 변경을 포함하는 NK-92 세포가 본원에 제공된다. 이러한 세포는 CD96-표적화된 또는 TIGIT-표적화된 변경에 대해 상기 개별적으로 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
CD226 발현을 감소시키기 위해 변형된 NK-92 세포
일부 실시양태에서, 예를 들어, 실시예 섹션에 기재된 바와 같은 비교 실험에 사용하기 위한, CD226 발현을 감소시키 위해 유전자 변형된, 변형된 NK-92 세포가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변형된 NK-92 세포는 CD226 발현을 저하시키거나 제거하기 위한 CD226-표적화된 변경을 포함한다. 이러한 세포는 CD96 또는 TIGIT 발현을 감소시키기 위해 변형된 NK-92 세포에 대해 상기 기재된 기술 중 임의의 것을 사용하여 생성될 수 있다. 예시적인 방법 및 방법을 사용하여 생산된 세포를 본 출원의 "실시예" 섹션에 제공한다.
추가의 변형
Fc 수용체
일부 실시양태에서 CD96-표적화된 변경 또는 TIGIT-표적화된 변경을 포함하는 NK-92 세포는 세포 표면 상에서 Fc 수용체를 발현하도록 추가로 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 예를 들어, 추가로 변형된 NK-92 세포가 모노클로날 항체와 함께 대상체에게 투여되는 경우에, Fc 수용체는 NK 세포가 ADCC를 통해 표적 세포를 사멸시키는 항체와 협력하여 작동하는 것을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 IgG Fc 수용체 FcγRIII이다.
Fc 수용체의 비제한적 예는 하기에 제공된다. 이들 Fc 수용체는 그의 바람직한 리간드, 친화도, 발현, 및 항체에 대한 결합 후 효과에서 상이하다.
표 1. 예시적인 Fc 수용체
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Figure pct00002
일부 실시양태에서, Fc 수용체는 CD16이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는, 서열식별번호: 13에 제공된 예시적인 인간 CD16 폴리펩티드 서열의 전구체 형태와 관련하여 넘버링된 위치 176에 발린이 존재하는, CD16의 고친화도 형태이다. 일부 실시양태에서, CD16은 서열식별번호: 13의 아미노산 19-254에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖고, 서열식별번호: 13을 참조하여 넘버링 시 위치 176에서 발린을 포함한다.
키메라 항원 수용체
일부 실시양태에서, CD96-변형된 NK-92 세포 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포는 세포 표면 상에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 추가로 조작된다. 임의적으로, CAR은 종양-특이적 항원에 특이적이다. 종양-특이적 항원은, 비-제한적 예로서, US 2013/0189268; WO 1999024566 A1; US 7098008; 및 WO 2000020460 A1에 기재되어 있으며, 그의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 종양-특이적 항원은, 비제한적으로, NKG2D, CS1, GD2, CD138, EpCAM, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, ETA, MAGE, CAGE, BAGE, HAGE, LAGE, PAGE, NY-SEO-1, GAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EGFR, FAB, WT-1, PSMA, NY-ESO1, AFP, CEA, CTAG1B, CD19 및 CD33을 포함한다. 추가적인 비-제한적 종양-연관 항원, 및 그와 연관된 악성종양은 표 2에서 찾을 수 있다.
표 2: 종양-특이적 항원 및 연관된 악성종양
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일부 실시양태에서, CAR은 CD19, CD33 또는 CSPG-4를 표적화한다. 일부 실시양태에서, CAR은 특이적 암 유형과 연관된 항원을 표적화한다. 예를 들어, 암은 백혈병 (급성 백혈병 (예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병 (골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 및 적백혈병 포함)) 및 만성 백혈병 (예를 들어, 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병) 포함), 진성 다혈구혈증, 림프종 (예를 들어, 호지킨병 및 비-호지킨병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로불린혈증, 중쇄 질환, 고형 종양 예컨대, 비제한적으로, 육종 및 암종 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담즙 관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아성 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
CAR은, 예를 들어, 특허 공개 번호 WO 2014039523; US 20140242701; US 20140274909; US 20130280285; 및 WO 2014099671에 기재된 바와 같이 조작될 수 있으며, 그의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 임의적으로, CAR은 CD19 CAR, CD33 CAR 또는 CSPG-4 CAR이다.
시토카인
일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 1종의 시토카인을 발현시키기 위해 추가로 변형된 CD96-변형된 NK-92 세포 및 TIGIT-변형된 NK-92 세포를 제공한다. 이러한 세포에서, 세포에서의 시토카인의 발현은 내형질 세망에 대해 지시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 시토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 또는 그의 변이체이다. 한 실시양태에서, 시토카인은 IL-2이다. 특정 실시양태에서 IL-2는 내형질 세망에 대해 표적화된 변이체이다.
한 실시양태에서, IL-2는 IL-2를 내형질 세망으로 지시하는 신호 서열과 함께 발현된다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, IL-2를 내형질 세망으로 지시하는 것은 자가분비 활성화에 충분한 수준의 IL-2의 발현을 가능하게 하나, IL-2를 세포외로 방출하지는 않는다. 문헌 [Konstantinidis et al "Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92 cells" Exp Hematol. 2005 Feb;33(2):159-64]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 세포의 비조절된 성장을 방지하기 위해 자살 유전자가 또한 CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포 내로 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 자살 유전자는 i카스파제 9(icaspase 9)이다.
트랜스진 발현
또한 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어, Cas 단백질, CD16, Fc 수용체, CAR, 및/또는 IL-2에 대한 유의한 서열 동일성을 공유하는 서열이 개시내용에 포괄된다. 이들 서열은 또한 비변형된 NK-92 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 그의 각각의 천연 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
트랜스진 (예를 들어 Cas 단백질, CD16, Fc 수용체, CAR, 및/또는 IL-2)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 임의의 메카니즘에 의해 발현 플라스미드 내로 조작될 수 있다. 트랜스진은 동일한 발현 플라스미드 내로 또는 상이한 발현 플라스미드 내로 조작될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 트랜스진은 동일한 플라스미드 상에서 발현된다.
트랜스진은, 예를 들어, 전기천공, 리포펙션, 뉴클레오펙션, 또는 "유전자-총"을 포함한 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 일시적 형질감염 방법을 사용하여 NK-92 세포 내로 도입될 수 있다.
임의의 수의 벡터가 이들 트랜스진을 발현하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 벡터이다. 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터 등을 포함한다.
조합 요법
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포는 치료 항체 및/또는 다른 항암제와 조합하여 사용된다. 치료 항체는 감염되거나 또는 암-연관 마커를 발현하는 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 암 치료 모노클로날 항체의 예는 표 3에 제시된다.
표 3. 예시적인 치료 모노클로날 항체
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항체는 다수의 메카니즘을 통해 암을 치료할 수 있다. 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)은 FcR을 또한 발현하는 본 개시내용의 CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK 세포와 같은 면역 세포가 Fc 수용체, 예컨대 CD16을 통해 표적 세포에 결합된 항체에 결합할 때 발생한다. 따라서, 일부 실시양태에서, FcR을 발현하는 CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포는 특이적 암-연관 단백질에 대하여 지시된 항체와 함께 환자에게 투여된다. 이러한 NK-92 세포의 투여는 모노클로날 항체의 투여와 동시에, 또는 순차적인 방식으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, NK-92 세포는 대상체가 모노클로날 항체로 치료된 후에 대상체에게 투여된다. 대안적으로, CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포는 모노클로날 항체 투여와 동시에, 예를 들어 24시간 이내에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포는 정맥내로 투여된다. 일부 실시양태에서 이러한 변형된 NK-92 세포는 골수 내로 직접적으로 주입될 수 있다.
치료
환자를 본원에 기재된 바와 같은 CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포로 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 환자는 암 또는 감염성 질환을 앓고 있다. 상기 기재된 바와 같이, CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포는 환자의 암 세포의 표면 상에서 발현된 항원을 표적화하는 CAR을 발현하도록 추가로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 설명된 바와 같이, CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포는 또한 Fc 수용체, 예를 들어, CD16을 발현할 수 있다. 본원에 개시된 추가 실시양태에서, 환자는 CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포 및 항체로 치료된다.
변형된 NK-92 세포는 개체에게 세포의 절대적인 수만큼 투여될 수 있고, 예를 들어, 상기 개체는 약 1000개의 세포/주사 내지 최대 약 100억개의 세포/주사, 예컨대 주사당 약, 적어도 약, 또는 최대 약, 1x108, 1x107, 5x107, 1x106, 5x106, 1x105, 5x105, 1x104, 5x104, 1x103, 5x103개 (등)의 NK-92 세포, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 개체는 약 1000개의 세포/주사/m2 내지 최대 약 100억개의 세포/주사/m2, 예컨대 주사당 약, 적어도 약, 또는 최대 약, 1x108/m2, 1x107/m2, 5x107/m2, 1x106/m2, 5x106/m2, 1x105/m2, 5x105/m2, 1x104/m2, 5x104/m2, 1x103/m2, 5x103/m2 (등)의 NK-92 세포, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
다른 실시양태에서, 변형된 NK-92 세포는 이러한 개체에게 세포의 상대적인 수만큼 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 개체는 개체의 킬로그램당 약 1000개의 세포 내지 최대 약 100억개의 세포, 예컨대 개체의 킬로그램당 약, 적어도 약, 또는 최대 약, 1x108, 1x107, 5x107, 1x106, 5x106, 1x105, 5x105, 1x104, 5x104, 1x103, 5x103개 (등)의 NK-92 세포, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
다른 실시양태에서, 총 용량은 체표면적 m2에 의해 계산될 수 있으며, 이는 m2당 약 1x1011, 1x1010, 1x109, 1x108, 1x107개, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위를 포함한다. 평균 사람은 약 1.6 내지 약 1.8 m2이다. 바람직한 실시양태에서, 약 10억 내지 약 30억개의 NK-92 세포가 환자에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 용량당 주사되는 NK-92 세포의 양은 체표면적 m2에 의해 계산될 수 있으며, 이는 m2당 1x1011, 1x1010, 1x109, 1x108, 1x107개를 포함한다. 평균 사람은 1.6-1.8 m2이다.
변형된 NK-92 세포, 및 임의적으로 다른 항암제는 암을 갖는 환자에게 1회 투여될 수 있거나, 또는 다수회, 예를 들어, 요법 동안 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간마다 1회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 1회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 주마다 1회, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포는 변형된 NK-92 세포 및 매질, 예컨대 인간 혈청 또는 그의 등가물을 포함하는 조성물로 투여된다. 일부 실시양태에서, 매질은 인간 혈청 알부민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 매질은 인간 혈장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 매질은 약 1% 내지 약 15% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 매질은 약 1% 내지 약 10% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 매질은 약 1% 내지 약 5% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 매질은 약 2.5% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈청은 인간 AB 혈청이다. 일부 실시양태에서, 인간 치료제에서 사용하는데 허용되는 혈청 대체물이 인간 혈청 대신에 사용된다. 이러한 혈청 대체물은 관련 기술분야에 공지되어 있을 수 있거나, 또는 미래에 개발될 수 있다. 15% 초과의 인간 혈청의 농도가 사용될 수 있지만, 약 5% 초과의 농도가 비용-제한적일 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, NK-92 세포는 NK-92 세포 및 세포 생존율을 지지하는 등장성 액체 용액을 포함하는 조성물로 투여된다. 일부 실시양태에서, NK-92 세포는 동결보존된 샘플로부터 재구성된 조성물로 투여된다.
제약상 허용되는 조성물은 다양한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 완충 염수 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균성이고 일반적으로 바람직하지 않은 물질을 함유하지 않는다. 적합한 담체 및 부형제 및 그의 제제는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005)]에 기재되어 있다. 제약상 허용되는 담체란 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하며, 즉, 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않으면서 또는 그가 함유되어 있는 제약 조성물의 다른 구성성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 대상체에게 투여된다. 대상체에게 투여되는 경우에, 담체는 활성 성분의 분해를 최소화하고 대상체에서 유해 부작용을 최소화하도록 임의적으로 선택된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 제약상 허용되는은 생리학상 허용되는 및 약리학상 허용되는과 동의어로 사용된다. 제약 조성물은 일반적으로 저장 시 완충 및 보존을 위한 작용제를 포함할 것이고, 투여 경로에 따라, 적절한 전달을 위한 완충제 및 담체를 포함할 수 있다.
생체내 또는 시험관내에서 사용하기 위한 이들 조성물은 세포에 대해 사용되는 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 가까워지도록 필요에 따라 허용가능한 보조 물질 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 독성 조정제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제제 및/또는 다른 작용제 중 세포의 농도는 달라질 수 있고 선택된 특정한 투여 방식 및 환자의 필요에 따라, 주로 유체 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 선택될 것이다.
한 실시양태에서, CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포는 치료되는 암에 대한 1종 이상의 다른 치료와 함께 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료되는 암에 대한 2종 이상의 다른 치료는, 예를 들어, 항체, 방사선, 화학요법제, 줄기 세포 이식, 또는 호르몬 요법을 포함한다.
상기 설명된 바와 같이, 한 실시양태에서, CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포는 이환 세포를 표적화하는 항체와 함께 투여된다. 한 실시양태에서, CD96-변형된 NK-92 세포 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포 및 항체는 환자에게 함께, 예를 들어, 동일한 제제 중에서; 별개로, 예를 들어, 별개의 제제 중에서, 공동으로 투여되거나; 또는 별개로, 예를 들어, 상이한 투여 스케줄로 또는 하루 중 상이한 시간에 투여될 수 있다. 별개로 투여되는 경우에, 항체는 임의의 적합한 경로, 예컨대 정맥내 또는 경구 투여로 투여될 수 있다.
키트
본원에 기재된 바와 같은 CD96-변형된 NK-92 세포 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포의 소정량을 포함하는 조성물을 사용하는 암 또는 감염성 질환의 치료를 위한 키트가 또한 개시된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 키트는 또한 적어도 1종의 모노클로날 항체를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 키트는 CD96-변형된 NK-92 또는 TIGIT-변형된 세포의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 추가적인 화합물 예컨대 치료 활성 화합물 또는 약물을 함유할 수 있다. 이러한 화합물의 예는 항체, 비타민, 미네랄, 플루드로코르티손, 이부프로펜, 리도카인, 퀴니딘, 화학요법제 등을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 키트의 사용에 대한 지침서는 암 또는 감염성 질환의 치료에서 키트 구성성분을 사용하는 것에 대한 지시사항을 포함할 것이다. 지침서는 CD96-변형된 또는 TIGIT-변형된 NK-92 세포의 취급 방법 (예를 들어, 해동 및/또는 배양)에 관한 정보를 추가로 함유할 수 있다. 지침서는 투여량 및 투여 빈도에 관한 지침을 추가로 포함할 수 있다.
개시된 방법 및 조성물에 대해 사용될 수 있거나, 그와 함께 사용될 수 있거나, 그의 제조에서 사용될 수 있거나, 또는 그의 산물인 물질, 조성물, 및 구성성분이 개시된다. 이들 및 다른 물질이 본원에서 개시되고, 이들 물질의 조합, 하위세트, 상호작용, 군 등이 개시되는 경우에 각각의 다양한 개별적 및 포괄적 조합의 구체적 참조 및 이들 화합물의 순열은 명백히 개시되지 않을 수 있으나, 각각 본원에 구체적으로 고려되고 기재되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 방법이 개시 및 논의되고 방법을 포함하여 다수의 분자에 대해 이루어질 수 있는 다수의 변형이 논의되는 경우에, 방법의 각각 및 모든 조합 및 순열, 및 가능한 변형이 달리 구체적으로 반대로 지시되지 않는 한 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 하위세트 또는 조합이 또한 구체적으로 고려되고 개시된다. 이러한 개념은 개시된 조성물을 사용하는 방법에서의 단계를 포함하나 이에 제한되지는 않는 본 개시내용의 모든 측면에 적용된다. 이에 따라, 수행될 수 있는 다양한 추가적인 단계가 존재하는 경우에, 각각의 이들 추가적인 단계가 개시된 방법의 임의의 구체적 방법 단계 또는 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있고, 각각의 이러한 조합 또는 조합의 하위세트가 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 하는 것으로 이해된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며 청구된 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 유사하게 의도된 발명을 성공적으로 수행할 수 있게 하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이용가능한 다양한 대체 기술 및 절차가 존재한다.
실시예 1.
물질 및 방법
세포 배양
NK-92 세포를 5% 인간 혈청 (밸리 바이오메디칼(Valley Biomedical), 카탈로그 # HP1022) 및 재조합 인간 IL-2 (500 IU/ml; 프로스펙(Prospec), 카탈로그 # Cyt-209)로 보충된 엑스-비보 10(X-VIVO 10) 배지 (론자(Lonza), 카탈로그 # BE04-743Q) 중에 유지시켰다. MCF-7, SKBR-3 및 Daudi 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC, 메릴랜드주 록빌)으로부터 구입하여, 10% FBS (깁코(Gibco), 카탈로그 # 10438026) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (깁코, 카탈로그 # 15070-063)으로 보충된 RPMI-1640 배지 (써모사이언티픽(ThermoScientific), 카탈로그 # 61870-127) 중에 유지시켰다.
Cas9-NK-92 세포의 생성
NK-92 모 세포를 에디트-R(Edit-R) Cas9 렌티바이러스로 감염시킴으로써 Cas9 단백질을 안정하게 발현하는 NK-92 세포를 생성하였다. 간략하게, 10 cm 페트리 디쉬당 7x106개의 293T 세포를 하기 양의 플라스미드로 형질감염시킴으로써 에디트-R Cas9 렌티바이러스 스톡을 생산하였다: 7.5 μg 에디트-R-Cas9 (다마콘(Dharmacon), 카탈로그 # CAS10138), 5 μg pCMV-ΔR8.2, 및 2.5 μg pCMV-VSV.G. 형질감염을 리포펙타민 3000 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 카탈로그 # L3000-008)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 바이러스 상청액을 형질감염 48시간 후에 수집하고, 시스템 바이오사이언시스(System Biosciences)로부터의 PEG-it 바이러스 침전 용액 (카탈로그 # LV810A-1)을 사용하여 10배 농축시켰다. 5x105개의 NK-92 세포를, 트랜스듀스(TransDux) (시스템 바이오사이언시스, 카탈로그 # LV850A-1)의 존재 하에, 24웰 플레이트에서 1 ml의 최종 배지 중에 100 μl의 농축된 바이러스로 스핀접종 (35℃에서 99분 동안 840 g)하여 감염시켰다. 형질도입 48시간 후에 Cas9-발현 세포를, 15 μg/ml의 블라스티시딘 (인비보젠(InvivoGen), 카탈로그 # ant-bl-1)의 존재 하에 세포를 성장시킴으로써 선택하였다.
pT7-가이드-IVT CD96, TIGIT, 및 CD226 sgRNA 구축물의 생성
가이드 RNA를 MIT 웹 툴 http 주소 crispr.mit.edu를 사용하여 디자인하였다. 각각의 유전자에 대한 표적 서열을 하기 나타낸다.
CD96
sgRNA는 CD96 (NM_198196, 전사체 변이체 1)의 제2 엑손을 표적화한다.
Figure pct00007
TIGIT
sgRNA는 TIGIT (NM_173799)의 제2 엑손을 표적화한다.
Figure pct00008
CD226
sgRNA는 CD226 (NM_006566, 전사체 변이체 1)의 제3 엑손을 표적화한다.
Figure pct00009
표적 부위를 pT7-가이드-IVT 플라스미드 (오리진(Origene), 카탈로그 # GE100025) 내로 클로닝하였다. 올리고를 pT7-가이드-IVT 내 2개의 BsmBI 부위를 사용하여, 제조업체의 지침에 따라 클로닝하였다. 시험관내 전사된 CD96, TIGIT, 및 CD226 sgRNA를 메가쇼트스크립트(MEGAshortscript)™ T7 키트 (라이프 테크놀로지스, 카탈로그 # AM1354)를 사용하여, 제조업체의 지침에 따라 생성하였다.
CD96, TIGIT, CD226 단일 녹-아웃 및 CD96/TIGIT 이중 녹-아웃 NK-92 세포의 생성
맥스사이트(MaxCyte) GT 전기천공기를 사용하여 전기천공에 의해 Cas9-NK-92 세포를 시험관내 전사된 sgRNA로 형질감염시켰다. 간략하게, 5x106개의 Cas9-NK-92 세포를 10 μg의 시험관내 전사된 sgRNA로 NK-92-3-OC 프로토콜을 사용하여 형질감염시켰다. 각각의 표적화된 유전자에 대해 가장 효율적인 sgRNA를 결정하기 위한 초기 실험을 수행하였다. 이들 실험에서 sgRNA 1 내지 4로 Cas9-NK-92 세포를 형질감염시키고, 형질감염 48시간 후 유동 세포측정법에 의해 표적화된 유전자의 발현을 분석함으로써 각각의 sgRNA의 녹-아웃 효율을 결정하였다.
CD96, TIGIT, 및 CD226 단일 녹-아웃 NK-92 세포를 생성하기 위해, Cas9-NK-92 세포를 각각 10 μg의 시험관내 전사된 CD96 sgRNA-2, TIGIT sgRNA-2, 및 CD226 sgRNA-1로 형질감염시켰다. 이중 녹-아웃 CD96/TIGIT NK-92 세포는 10 μg의 시험관내 전사된 CD96 sgRNA-2 및 TIGIT sgRNA-2로 공동-형질감염시켜 생성하였다. 모든 경우에, 세포를 형질감염 48시간 후 제한 희석에 의해 플레이팅하였다. 세포를 15일 동안 성장시킨 후, 개별 클론을 선택하고, 확장시키고, 표적화된 유전자의 발현을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다.
유동 세포측정법
세포 표면 단백질의 세포형광측정 분석을 하기 표에 열거된 형광단-접합된 항체를 사용한 직접 면역염색에 의해 수행하였다. 간략하게, 105개의 세포를 유동 세포측정 염색 완충제 (PBS, 1% BSA) 100 μl 중 권장량의 항체로 4℃에서 암실에서 30분 동안 염색하였다. 세포를 유동 세포측정 염색 완충제로 2회 세척하고, 유동 세포측정 염색 완충제 200 μl 중에 재현탁시켰다. 샘플을 MACS퀀트 10(MACSQuant 10) 유동 세포측정기 (밀테니(Miltenyi)) 상에서 프로세싱하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
Figure pct00010
세포독성 검정
표적 세포를 형광 염료 PKH67-GL (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스)로 제조업체의 지침에 따라 염색하였다. 표적 및 이펙터를 96-웰 플레이트 (팔콘 비디(Falcon BD), 뉴저지주 프랭클린 레이크스)에서 상이한 이펙터 대 표적 비로 조합하고, 간략하게 원심분리하고, 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 4시간 동안, 5% 인간 혈청으로 보충된 엑스-비보 10 (론자, cat # 04-743Q) 배양 배지에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 1% BSA/PBS 완충제 중에서 10 μg/ml로 아이오딘화프로피듐 (PI, 시그마-알드리치)으로 염색하고, 유동 세포측정법에 의해 바로 분석하였다. 사멸 표적 세포를 PKH67-GL 및 PI에 대한 이중 양성으로서 확인하였다. 표적 세포 및 이펙터 세포를 또한 별개로 PI로 염색하여 자발적 세포 용해를 평가하였다. 이펙터를 갖는 샘플에서의 PKH(+)/PI(+) 세포의 백분율로부터 표적 세포 단독에 대한 PKH(+)/PI(+) 세포의 백분율 (자발적 용해)을 차감함으로써 NK-매개 세포독성의 백분율을 수득하였다.
결과
CD96, TIGIT, CD226 단일 녹-아웃 및 CD96/TIGIT 이중 녹-아웃 NK-92 세포의 생성
NK-92 세포주는 비-호지킨 림프종을 갖는 50세 남성 백인 환자의 말초 혈액으로부터 확립된 자연 킬러-유사 세포주이다 (Gong et al., Leukemia 8:652-8, 1994). NK-92 세포는 CD2, CD56 및 CD57에 대해 양성이고, CD3 및 CD16에 대해 음성이다 (문헌 [Gong et al.] 참조). 그의 성장은 IL-2-의존적이고, 넓은 범위의 종양 표적에 대해 강력한 시험관내 세포독성을 발휘한다. NK-92 세포는 현재 공지되어 있는 억제 KIR 수용체의 대부분이 결여되어 있다 (Maki et al., 상기 문헌). 그러나, 이들은, 넥틴 및 넥틴-유사 단백질이 결합하고 NK 세포 기능을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하는 수용체 패밀리의 구성원인 CD226, CD96, 및 TIGIT를 발현한다 (도 1). DNAM1로도 공지되어 있는 CD226은 NK 세포 세포독성을 매개하는데 중요한 활성화 수용체인 한편 (Shibuya et al., 상기 문헌), CD96 및 TIGIT는 NK 기능적 활성을 약화시키는 억제 면역 체크포인트로서 작용하는 것으로 밝혀졌다 (Chan et al., Nat Immunol. 15:431-8, 2014; Sarhan et al., Cancer Res. 76:5696-5706, 2016). 그의 항종양 잠재력을 증가시키기 위해, 이들 억제 수용체 중 1종 이상을 결여시킨 NK-92 변이체를 생성하였다.
CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 CD96, TIGIT 또는 CD226의 발현이 결여된 NK-92 세포를 생성하였다. 단일 CD96, TIGIT, 및 CD226, 또는 이중 CD96/TIGIT 녹-아웃 NK-92 세포를 상기 "물질 및 방법"에 기재된 바와 같이 생성하였다. 도 2는 선택된 단일 또는 이중 KO 클론에서의 이들 수용체의 발현을 보여준다. 주목할 것으로, 단일 또는 이중 KO 세포 상에서의 비-표적화된 수용체의 발현은 모 NK-92 세포에 대한 것과 대등하였다 (도 2의 MFI 값 참조).
CD96 및 CD96/TIGIT 녹-아웃 NK-92 세포는 CD155-양성 종양 표적에 대해 보다 높은 세포독성 잠재력을 갖는다
활성화 CD226 및 억제 CD96 및 TIGIT 수용체는 공통 리간드, CD155 (또한 PVR, 소아마비 바이러스 수용체로도 공지됨)를 공유하며, 이에 상이한 친화도로 결합한다 (Martinet et al., 상기 문헌). CD155 발현은 종양 세포에서 빈번하게 상향조절되고, 그의 과다-발현은 암 침습 및 전이와 연관된다 (Hirota et al., Sloan et al., 둘 다 상기 문헌). 따라서, 모 및 넥틴-수용체 녹-아웃 세포의 CD155-양성 종양 표적에 대한 세포독성 능력을 먼저 시험하였다. MCF-7 및 SKBR-3은 CD155 발현에 대해 양성인 2종의 유방암 세포주이다 (도 3). 활성화 수용체로서의 CD226의 역할과 일치하게, CD226-KO NK-92 세포에 의한 MCF-7 또는 SKBR-3의 사멸은 거의 완전히 제거되었다 (도 4).
중요한 것으로, CD96-KO NK-92 세포는 모 NK-92 세포와 비교하여 10-15% 더 높은 세포독성 활성을 갖는다 (도 4). TIGIT-KO NK-92 세포는 모 NK-92 세포와, MCF-7 또는 SKBR-3 세포를 사멸시키는 그들의 능력에 있어서 유의하게 상이하지 않았지만, 이중 CD96/TIGIT KO 세포는 CD96-KO 또는 모 NK-92 세포의 것보다 더 높은 세포독성 잠재력을 가졌다 (도 4에 제시된 바와 같이, 각각 CD96-KO 또는 모 NK-92 세포보다 10-15% 및 17-29% 더 높은 세포독성 활성). 따라서 이들 데이터는 CD96이 TIGIT 발현의 결여를 보상할 수 있지만, 둘 다의 수용체가 CD226에 의해 매개되는 활성 신호를 약화시키는데 적극적으로 기여하고 종양 표적을 효율적으로 사멸시키는데 필요하다는 것을 나타낸다.
중요한 것으로, CD155-양성 종양 표적에 대한 CD96 및 CD96/TIGIT KO NK-92 세포의 보다 높은 세포독성 활성은, CD155-음성 Daudi 종양 세포에 대한 그의 세포독성 활성 (도 3)이 모 NK-92 세포의 것 (도 5)과 유의하게 상이하지 않았기 때문에, 넥틴 수용체의 상실에 특이적이고, 이들 클론의 고유의 보다 높은 세포독성 활성이 아니다. 주목할 것으로, CD226-KO NK-92 세포는 Daudi 세포를 가장 낮은 E:T 비에서 덜 효율적으로 사멸시켰고, 이는 Daudi 세포가 활성화 수용체 CD226에 의해 또한 인식되는 CD155 이외의 추가의 리간드를 발현할 수 있다는 것을 시사한다 (도 5).
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이고, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 시사될 것이며, 이는 본 출원의 취지 및 범위, 및 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 서열 수탁 번호, 특허, 및 특허 출원은 그 전문이 모든 목적상 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 CD 16 서열: 서열식별번호: 13 고친화도 변이체 이뮤노글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III-A 아미노산 서열 (전구체 형태). 전구체 형태의 위치 176은 위치 19에서 Arg로 시작하는 폴리펩티드의 성숙 형태의 위치 158에 상응한다. 위치 176의 Val은 밑줄표시된다.
Figure pct00011
SEQUENCE LISTING <110> NANTKWEST, INC. <120> GENETICALLY MODIFIED NK-92 CELLS WITH DECREASED CD96/TIGIT EXPRESSION <130> 104066-1143748-5810US <140> <141> <150> PCT/US2018/012624 <151> 2018-01-05 <150> 62/459,873 <151> 2017-02-16 <150> 62/459,877 <151> 2017-02-16 <150> 62/443,621 <151> 2017-01-06 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 gcacagtaga agccgtattg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 aggcacagta gaagccgtat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ggcacagtag aagccgtatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 acggcttcta ctgtgcctat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 tggggccact cgatccttga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 cccatccttc aaggatcgag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 ccactcgatc cttgaaggat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 gacctgggtc acttgtgccg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 gttcaagatc gggacccagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 tagagacatg ttctcggcaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 agagacatgt tctcggcaaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 aggtggagtg gttcaagatc 20 <210> 13 <211> 254 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: CD16 sequence <400> 13 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250

Claims (42)

1개 이상의 표적 유전자의 발현을 억제하는 1개 이상의 변경을 포함하는 변형된 NK-92 세포이며, 여기서 1개 이상의 표적 유전자는 CD96 및 TIGIT로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 NK-92 세포.
제1항에 있어서, CD96의 발현을 억제하기 위해 CD96 유전자가 유전자 변경된 것인 변형된 NK-92 세포.
제2항에 있어서, CD96을 표적화하고 CD96의 발현을 억제하는 간섭 RNA를 포함하는 변형된 NK-92 세포.
제2항에 있어서, 세포에서 CD96 발현을 녹다운 또는 녹아웃시킴으로써 생산된 변형된 NK-92 세포.
제2항에 있어서, 변형된 NK-92 세포에 의해 발현된 CD96의 양이 CD96 변형을 갖지 않는 대응물 NK-92 세포와 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소된 것인 변형된 NK-92 세포.
제1항에 있어서, TIGIT의 발현을 억제하기 위해 TIGIT 유전자가 유전자 변경된 것인 변형된 NK-92 세포.
제6항에 있어서, TIGIT를 표적화하고 TIGIT의 발현을 억제하는 간섭 RNA를 포함하는 변형된 NK-92 세포.
제6항에 있어서, 세포에서 TIGIT 발현을 녹다운 또는 녹아웃시킴으로써 생산된 변형된 NK-92 세포.
제6항에 있어서, 변형된 NK-92 세포에 의해 발현된 TIGIT의 양이 TIGIT 변형을 갖지 않는 대응물 NK-92 세포와 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소된 것인 변형된 NK-92 세포.
제1항에 있어서, TIGIT의 발현을 억제하기 위해 CD96 유전자 및 TIGIT 유전자 둘 다가 유전자 변경된 것인 변형된 NK-92 세포.
제10항에 있어서, CD96을 표적화하고 CD96의 발현을 억제하는 간섭 RNA; 및 TIGIT를 표적화하고 TIGIT의 발현을 억제하는 간섭 RNA를 포함하는 변형된 NK-92 세포.
제10항에 있어서, 세포에서 CD96 발현을 녹다운 또는 녹아웃시키고 TIGIT 발현을 녹다운 또는 녹아웃시킴으로써 생산된 변형된 NK-92 세포.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 NK-92 세포에 의해 발현된 CD96의 양이 CD96 변형을 갖지 않는 대응물 NK-92 세포와 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소되고; 변형된 NK-92 세포에 의해 발현된 TIGIT의 양이 TIGIT 변형을 갖지 않는 대응물 NK-92 세포와 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소된 것인 변형된 NK-92 세포.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 상에 적어도 1개의 Fc 수용체, 또는 적어도 1개의 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 적어도 1개의 Fc 수용체 및 적어도 1개의 CAR 둘 다를 발현하는 변형된 NK-92 세포.
제14항에 있어서, 적어도 1개의 Fc 수용체가 CD16, 또는 서열식별번호: 13을 참조하여 넘버링 시 위치 176에서 발린을 갖는 CD16 폴리펩티드인 변형된 NK-92 세포.
제15항에 있어서, 적어도 1개의 Fc 수용체가 서열식별번호: 13의 아미노산 19-254에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖고 서열식별번호: 13을 참조하여 넘버링 시 위치 176에서 발린을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 변형된 NK-92 세포.
제14항에 있어서, 적어도 1개의 Fc 수용체가 FcγRIII인 변형된 NK-92 세포.
제14항에 있어서, CAR이 FcεRIγ의 세포질 도메인을 포함하는 것인 변형된 NK-92 세포.
제18항에 있어서, CAR이 종양-연관 항원을 표적화하는 것인 변형된 NK-92 세포.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 시토카인을 발현하는 변형된 NK-92 세포.
제20항에 있어서, 시토카인이 인터류킨-2 또는 그의 변이체인 변형된 NK-92 세포.
제20항 또는 제21항에 있어서, 시토카인이 내형질 세망에 대해 표적화된 것인 변형된 NK-92 세포.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 복수의 변형된 NK-92 세포를 포함하는 조성물.
제23항에 있어서, 추가로 생리학상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 복수의 변형된 NK-92 세포를 포함하는 NK-92 세포주.
제25항에 있어서, 세포가 10회 미만의 집단 배가를 거친 것인 세포주.
암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제24항의 조성물 또는 제25항 또는 제26항의 세포주를 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법.
제27항에 있어서, 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제27항 또는 제28항에 있어서, 환자의 체표면적 m2당 약 1x108 내지 약 1x1011개의 세포가 환자에게 투여되는 것인 방법.
(a) 제23항 또는 제24항의 조성물; 또는 제25항 또는 제26항의 세포주를 포함하는, 암을 치료하기 위한 키트.
NK-92 세포에서 1개 이상의 표적 유전자의 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 1개 이상의 표적 유전자는 CD96 및 TIGIT로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 대조군 NK-92 세포에 비해 1개 이상의 표적 유전자를 감소된 수준으로 발현하는 NK-92 세포를 생산하는 방법.
제31항에 있어서, 1개 이상의 표적 유전자의 각각의 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계가, 변형시키고자 하는 NK-92 세포를 1개 이상의 표적 유전자의 각각을 표적화하는 간섭 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
제32항에 있어서, 1개 이상의 표적 유전자의 각각을 표적화하는 간섭 RNA가 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 또는 단일 가닥 간섭 RNA인 방법.
제31항에 있어서, 1개 이상의 표적 유전자의 각각의 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계가, 1개 이상의 표적 유전자의 각각을 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), Tale-이펙터 도메인 뉴클레아제 (TALEN), 또는 CRIPSR/Cas 시스템으로 변형시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 1개 이상의 표적 유전자의 각각의 발현을 유전자적으로 변형시키는 단계가:
i) 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부-연관 (Cas) 단백질을 NK-92 세포 내로 도입하는 단계 및
ii) 1개 이상의 리보핵산을 변형시키고자 하는 NK-92 세포 내로 도입하는 단계이며, 여기서 리보핵산은 Cas 단백질이 1개 이상의 표적 유전자의 각각의 서열의 표적 모티프에 혼성화하도록 지시하고, 여기서 표적 모티프가 절단되는 것인 단계
를 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, Cas 단백질이 NK-92 세포 내로 단백질 형태로 도입되는 것인 방법.
제35항에 있어서, Cas 단백질이 Cas 코딩 서열을 도입함으로써 NK-92 세포 내로 도입되는 것인 방법.
제35항에 있어서, Cas 단백질이 Cas9인 방법.
제35항에 있어서, 표적 모티프가 20개 뉴클레오티드 DNA 서열인 방법.
제35항에 있어서, 표적 모티프가 1개 이상의 표적 유전자의 각각의 엑손 내에 존재하는 것인 방법.
제35항에 있어서, CD96 내의 표적 모티프에 혼성화하는 1개 이상의 리보핵산이 서열식별번호: 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되고, TIGIT 내의 표적 모티프에 혼성화하는 1개 이상의 리보핵산이 서열식별번호: 5-8로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, CD96 및 TIGIT가 둘 다 표적화된 것인 방법.
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