JP7160855B2 - 多能性細胞の誘導法 - Google Patents
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Description
本出願は、2009年10月16日提出の米国特許仮出願第61/252,548号の35 U.S.C. § 1.119(e)の下での恩典を主張し、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)の生成における最近の進歩(Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007)(非特許文献1);Yu, J. et al., Science 318, 1917-20 (2007) (非特許文献2);Muller, L.U.W., et al., Mol. Ther. 17, 947-53 (2009) (非特許文献3))により、生物医学的研究および臨床適用におけるそれらの有用性について希望が高まってきた。しかし、iPSC生成はまだ、不均質な細胞集団を生じる、非常に遅く(約4週間)、非効率的(<0.01%(Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007) (非特許文献1);Yu, J. et al., Science 318, 1917-20 (2007) (非特許文献1))プロセスである。そのような混合物から完全に再プログラム化されたiPSCを同定することは冗長で、ヒト多能性細胞培養における特定の専門技術を必要とする。
哺乳動物細胞;
TGFβ受容体/ALK5阻害剤;
MEK阻害剤;および
Rho GTPアーゼ/ROCK経路阻害剤
を含む。
環Aは置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
環Bは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
L1は-C(O)-NR2-または-C(O)-NR2-であり;
L2は結合、置換もしくは非置換アルキレンまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキレンであり;かつ
R1およびR2は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
式中、yは0から3の整数であり;zは0から5の整数であり;Xは-N=、-CH=または-CR5=であり;R3、R4およびR5は独立にCN、S(O)nR6、NR7R8、C(O)R9、NR10-C(O)R11、NR12-C(O)-OR13、-C(O)NR14R15、-NR16S(O)2R17、-OR18、-S(O)2NR19、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここでnは0から2の整数であり、ここでzが1よりも大きい場合、2つのR3部分は、一緒になって置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成していてもよく;かつR6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18およびR19は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
少なくともいくつかの細胞を多能性幹細胞にするよう誘導するのに十分な条件下で、非多能性細胞を、
TGFβ受容体/ALK5阻害剤;
MEK阻害剤;および
ROCK阻害剤
と接触させる段階
を含む。
環Aは置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
環Bは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
L1は-C(O)-NR2-または-C(O)-NR2-であり;
L2は結合、置換もしくは非置換アルキレンまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキレンであり;かつ
R1およびR2は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
式中、yは0から3の整数であり;zは0から5の整数であり;Xは-N=、-CH=または-CR5=であり;R3、R4およびR5は独立にCN、S(O)nR6、NR7R8、C(O)R9、NR10-C(O)R11、NR12-C(O)-OR13、-C(O)NR14R15、-NR16S(O)2R17、-OR18、-S(O)2NR19、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここでnは0から2の整数であり、ここでzが1よりも大きい場合、2つのR3部分は、一緒になって置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成していてもよく;かつR6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18およびR19は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
TGFβ受容体/ALK5阻害剤;
MEK阻害剤;および
ROCK阻害剤
を含む。
環Aは置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
環Bは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
L1は-C(O)-NR2-または-C(O)-NR2-であり;
L2は結合、置換もしくは非置換アルキレンまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキレンであり;かつ
R1およびR2は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
式中、yは0から3の整数であり;zは0から5の整数であり;Xは-N=、-CH=または-CR5=であり;R3、R4およびR5は独立にCN、S(O)nR6、NR7R8、C(O)R9、NR10-C(O)R11、NR12-C(O)-OR13、-C(O)NR14R15、-NR16S(O)2R17、-OR18、-S(O)2NR19、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここでnは0から2の整数であり、ここでzが1よりも大きい場合、2つのR3部分は、一緒になって置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成していてもよく;かつR6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18およびR19は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
「Octポリペプチド」とは、転写因子の八量体ファミリーの天然メンバー、または最も近い関連する天然ファミリーメンバーと比較して類似の(少なくとも50%、80%、または90%の活性の範囲内)転写因子活性を維持しているその変異体、または少なくとも天然ファミリーメンバーのDNA結合ドメインを含むポリペプチドのいずれかを指し、転写活性化ドメインをさらに含みうる。例示的なOctポリペプチドには、Oct-1、Oct-2、Oct-3/4、Oct-6、Oct-7、Oct-8、Oct-9、およびOct-11が含まれる。例えば、Oct3/4(本明細書において「Oct4」と呼ぶ)は、Pit-1、Oct-1、Oct-2、およびuric-86中に保存されている150アミノ酸配列である、POUドメインを含む。Ryan, A.K. & Rosenfeld, M.G. Genes Dev. 11, 1207-1225 (1997)を参照されたい。いくつかの態様において、変異体は、上に挙げたものまたはGenbankアクセッション番号NP_002692.2(ヒトOct4)またはNP_038661.1(マウスOct4)に挙げられているものなどの天然Octポリペプチドファミリーメンバーと比較して、その配列全体にわたって少なくとも85%、90%、または95%のアミノ酸配列同一性を有する。Octポリペプチド(例えば、Oct3/4)はヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、または他の動物由来でありうる。一般に、操作する細胞の種と同じ種のタンパク質を用いる。
(A)-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、および
(B)下記から選択される少なくとも1つの置換基で置換されているアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール:
(i)オキソ、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、および
(ii)下記から選択される少なくとも1つの置換基で置換されているアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール:
(a)オキソ、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、および
(b)オキソ、-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、および非置換ヘテロアリールから選択される少なくとも1つの置換基で置換されているアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール。
[本発明1001]
哺乳動物細胞;
TGFβ受容体/ALK5阻害剤;
MEK阻害剤;および
ROCK阻害剤
を含む、混合物。
[本発明1002]
細胞の少なくとも99%が非多能性細胞である、本発明1001の混合物。
[本発明1003]
基本的にすべての細胞が非多能性細胞である、本発明1001の混合物。
[本発明1004]
細胞がヒト細胞である、本発明1001の混合物。
[本発明1005]
TGFβ受容体/ALK5阻害剤がSB431542である、本発明1001の混合物。
[本発明1006]
MEK阻害剤がPD0325901である、本発明1001の混合物。
[本発明1007]
ROCK阻害剤が以下の式を有する化合物である、本発明1001の混合物:
式中、
環Aは置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
環Bは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
L1は-C(O)-NR2-または-C(O)-NR2-であり;
L2は結合、置換もしくは非置換アルキレンまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキレンであり;かつ
R1およびR2は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
[本発明1008]
ROCK阻害剤が以下の式を有する、本発明1001の混合物:
式中、
yは0から3の整数であり;
zは0から5の整数であり;
Xは-N=、-CH=または-CR5=であり;
R3、R4およびR5は独立に-CN、-S(O)nR6、-NR7R8、-C(O)R9、-NR10-C(O)R11、-NR12-C(O)-OR13、-C(O)NR14R15、-NR16S(O)2R17、-OR18、-S(O)2NR19、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここでnは0から2の整数であり、ここでzが1よりも大きい場合、2つのR3部分は、一緒になって置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成していてもよく;かつ
R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18およびR19は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
[本発明1009]
ROCK阻害剤が以下の式を有する、本発明1001の混合物:
。
[本発明1010]
ROCK阻害剤が以下である、本発明1001の混合物:
。
[本発明1011]
阻害剤の濃度が、誘導多能性幹細胞への細胞の変換を誘導するのに十分な条件に混合物を供した場合に、混合物中の非多能性細胞の、誘導多能性幹細胞への誘導の効率を、少なくとも10%改善するのに十分である、本発明1001の混合物。
[本発明1012]
GSK3阻害剤をさらに含む、本発明1001の混合物。
[本発明1013]
少なくともいくつかの細胞を多能性幹細胞にするよう誘導するのに十分な条件下で、非多能性細胞を、
TGFβ受容体/ALK5阻害剤;
MEK阻害剤;および
ROCK阻害剤
と接触させる段階を含む、非多能性哺乳動物細胞を誘導多能性幹細胞へと誘導する方法。
[本発明1014]
条件が、少なくとも1つの外因性転写因子を非多能性細胞に導入することを含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
少なくとも1つの外因性転写因子がOctポリペプチドであり、細胞をヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤とさらに接触させる、本発明1014の方法。
[本発明1016]
転写因子が、Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドからなる群より選択される、本発明1014の方法。
[本発明1017]
Octポリペプチド、Klfポリペプチド、Mycポリペプチド、およびSoxポリペプチドからなる群より選択される少なくとも2つ、3つ、または4つの外因性転写因子を非多能性細胞に導入することを含む、本発明1014の方法。
[本発明1018]
少なくとも1つの転写因子が、ポリヌクレオチドを非多能性細胞に導入することにより導入され、該ポリヌクレオチドは該少なくとも1つの外因性転写因子をコードし、それにより細胞内で該転写因子を発現する、本発明1014の方法。
[本発明1019]
少なくとも1つの転写因子が、外因性ポリペプチドを非多能性細胞に接触させることにより導入され、該ポリペプチドは該転写因子のアミノ酸配列を含み、該導入は該ポリペプチドを該細胞に導入する条件下で実施される、本発明1014の方法。
[本発明1020]
ポリペプチドが、細胞膜を越える輸送を増強するアミノ酸配列を含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
細胞がヒト細胞である、本発明1013の方法。
[本発明1022]
TGFβ受容体/ALK5阻害剤がSB431542である、本発明1013の方法。
[本発明1023]
MEK阻害剤がPD0325901である、本発明1013の方法。
[本発明1024]
ROCK阻害剤が以下の式を有する化合物である、本発明1013の方法:
式中、
環Aは置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
環Bは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
L1は-C(O)-NR2-または-C(O)-NR2-であり;
L2は結合、置換もしくは非置換アルキレンまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキレンであり;かつ
R1およびR2は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
[本発明1025]
ROCK阻害剤が以下の式を有する化合物である、本発明1013の方法:
式中、
yは0から3の整数であり;
zは0から5の整数であり;
Xは-N=、-CH=または-CR5=であり;
R3、R4およびR5は独立に-CN、-S(O)nR6、-NR7R8、-C(O)R9、-NR10-C(O)R11、-NR12-C(O)-OR13、-C(O)NR14R15、-NR16S(O)2R17、-OR18、-S(O)2NR19、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここでnは0から2の整数であり、ここでzが1よりも大きい場合、2つのR3部分は、一緒になって置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成していてもよく;かつ
R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18およびR19は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
[本発明1026]
ROCK阻害剤が以下の式を有する化合物である、本発明1013の方法:
。
[本発明1027]
ROCK阻害剤が以下である、本発明1013の方法:
。
[本発明1028]
阻害剤の濃度が、誘導多能性幹細胞への細胞の変換を誘導するのに十分な条件に混合物を供した場合に、混合物中の非多能性細胞の、誘導多能性幹細胞への誘導の効率を、少なくとも10%改善するのに十分である、本発明1013の方法。
[本発明1029]
混合物がGSK3阻害剤をさらに含む、本発明1013の方法。
[本発明1030]
TGFβ受容体/ALK5阻害剤;
MEK阻害剤;および
ROCK阻害剤
を含む、非多能性哺乳動物細胞において多能性を誘導するためのキット。
[本発明1031]
TGFβ受容体/ALK5阻害剤がSB431542である、本発明1030のキット。
[本発明1032]
MEK阻害剤がPD0325901である、本発明1030のキット。
[本発明1033]
ROCK阻害剤が以下の式を有する化合物である、本発明1030のキット:
式中、
環Aは置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
環Bは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
L1は-C(O)-NR2-または-C(O)-NR2-であり;
L2は結合、置換もしくは非置換アルキレンまたは置換もしくは非置換ヘテロアルキレンであり;かつ
R1およびR2は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
[本発明1034]
ROCK阻害剤が以下の式を有する化合物である、本発明1030のキット:
式中、
yは0から3の整数であり;
zは0から5の整数であり;
Xは-N=、-CH=または-CR5=であり;
R3、R4およびR5は独立に-CN、-S(O)nR6、-NR7R8、-C(O)R9、-NR10-C(O)R11、-NR12-C(O)-OR13、-C(O)NR14R15、-NR16S(O)2R17、-OR18、-S(O)2NR19、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここでnは0から2の整数であり、ここでzが1よりも大きい場合、2つのR3部分は、一緒になって置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成していてもよく;かつ
R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18およびR19は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
[本発明1035]
ROCK阻害剤が以下の式を有する化合物である、本発明1030のキット:
。
[本発明1036]
ROCK阻害剤が以下である、本発明1030のキット:
。
[本発明1037]
GSK3阻害剤および/またはヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤をさらに含む、本発明1030のキット。
I. 序論
本発明は、ALK5阻害剤、MEK阻害剤、およびROCK阻害剤の組み合わせが、4つの転写因子で形質転換された非多能性哺乳動物細胞において、多能性誘導の効率を大きく改善するという驚くべき発見に基づいている。したがって、本発明は、非多能性哺乳動物細胞において多能性を誘導する方法であって、非多能性細胞を少なくともTGFβ受容体/ALK5阻害剤と、好ましくはMEK/ERK経路阻害剤との、および特定の態様においてはRho GTPアーゼ/ROCK阻害剤との組み合わせで接触させる段階を含む方法を提供する。
アクチビン受容体様キナーゼ5(ALK-5)はTGF-βに対する細胞応答を仲介する主要なTGFβ受容体である(Massague J. Annu Rev Biochem 67:753-791 (1998);Massague J, Chen YG. Genes Dev 14:627-644 (2000);Franzen P, et al., Cell 75:681-692 (1993))。リガンド結合後、構成性に活性なTβRIIキナーゼはALK-5をリン酸化し、これは次いで下流のシグナル伝達カスケードを活性化する。ALK-5により活性化されるSmad2およびSmad3リン酸化は最も顕著な経路である(Massague J, Chen YG. Genes Dev 14:627-644 (2000))。いったん活性化されると、Smad2/3はSmad4と会合して核に移行し、ここで複合体は標的遺伝子発現を転写的に調節する。
MEK/ERK経路とは、シグナル伝達経路の一部を構成するMEKおよびERKセリン/トレオニンキナーゼを指す。一般に、活性化RasはRAFキナーゼのタンパク質キナーゼ活性を活性化する。RAFキナーゼはMEKをリン酸化して活性化し、これは次いでマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)をリン酸化して活性化する。MAPKは元は「細胞外シグナル調節キナーゼ」(ERK)および微小管結合タンパク質キナーゼ(MAPK)と呼ばれていた。したがって、「ERK」および「MAPK」は同義に用いられる。
本発明は、Rho-GTPアーゼ/ROCK経路の阻害剤の使用およびそれらを含む組成物を提供する。この経路は下流タンパク質ミオシンIIを含み、これはROCKのさらに下流である(Rho-ROCK-ミオシンIIは経路/軸を形成する)。したがって、本明細書に記載の効果を達成するために、Rho GTPアーゼ阻害剤、ROCK阻害剤、またはミオシンII阻害剤のいずれか、またはすべてを用いることができる。当業者であれば、Rho-GTPアーゼ/ROCK経路阻害剤の濃度はどの特定の阻害剤を用いるかに依存することを理解するであろう。さらなる態様において、2つまたはそれ以上の異なるRho-GTPアーゼ/ROCK経路阻害剤の組み合わせを用いることもできる。
式(I)において、環Aは置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。環Bは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
式(II)において、yは0から3の整数であり、かつzは0から5の整数である。Xは-N=、-CH=または-CR4=である。R1およびL2は式(I)の定義において上で定義したとおりである。
様々な態様において、1つまたは複数のGSK3阻害剤が本発明の方法、混合物およびキットに含まれうる。発明者らは、GSK3阻害剤を少なくともTGFβ受容体/ALK5阻害剤と共に、好ましくはMEK/ERK経路阻害剤と組み合わせて、特定の態様においてはRho GTPアーゼ/ROCK阻害剤と組み合わせて含むことを見いだした。GSK3の阻害剤には、GSK3に結合する抗体、GSK3のドミナントネガティブ変異体、ならびにGSK3を標的とするsiRNA、microRNA、アンチセンス核酸、および他のポリヌクレオチドが含まれうる。GSK3阻害剤の具体例には、ケンパウロン、1-アザケンパウロン、CHIR99021、CHIR98014、AR-A014418(例えば、Gould, et al., The International Journal of Neuropsychopharmacology 7:387-390 (2004)参照)、CT 99021(例えば、Wagman, Current Pharmaceutical Design 10:1105-1137 (2004)参照)、CT 20026(Wagman、上記参照)、SB216763(例えば、Martin, et al., Nature Immunology 6:777-784 (2005)参照)、AR-A014418(例えば、Noble, et al., PNAS 102:6990-6995 (2005)参照)、リチウム(例えば、Gould, et al., Pharmacological Research 48: 49-53 (2003)参照)、SB 415286(例えば、Frame, et al., Biochemical Journal 359:1-16 (2001)参照)およびTDZD-8(例えば、Chin, et al., Molecular Brain Research, 137(1-2):193-201 (2005)参照)が含まれるが、それらに限定されない。Calbiochemから入手可能なさらなる例示的なGSK3阻害剤(例えば、Dalton, et al., WO2008/094597を参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる)には、BIO (2'Z,3'£)-6-ブロモインジルビン-3'-オキシム(GSK3阻害剤IX);BIO-アセトキシム (2'Z,3'E)-6-ブロモインジルビン-3'-アセトキシム(GSK3阻害剤X);(5-メチル-1H-ピラゾール-3-イル)-(2-フェニルキナゾリン-4-イル)アミン(GSK3阻害剤XIII);ピリドカルバゾール-シクロペナジエニルルテニウム錯体(GSK3阻害剤XV);TDZD-8 4-ベンジル-2-メチル-1,2,4-チアジアゾリジン-3,5-ジオン(GSK3β阻害剤I);2-チオ(3-ヨードベンジル)-5-(1-ピリジル)-[1,3,4]-オキサジアゾール(GSK3β阻害剤II);OTDZT 2,4-ジベンジル-5-オキソチアジアゾリジン-3-チオン(GSK3β阻害剤III);α-4-ジブロモアセトフェノン(GSK3β阻害剤VII);AR-AO 14418 N-(4-メトキシベンジル)-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾル-2-イル)尿素(GSK-3β阻害剤VIII);3-(1-(3-ヒドロキシプロピル)-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル]-4-ピラジン-2-イル-ピロール-2,5-ジオン(GSK-3β阻害剤XI);TWS1 19 ピロロピリミジン化合物(GSK3β阻害剤XII);L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2(SEQ ID NO:47)またはそのミリストイル化型(GSK3β阻害剤XIII);2-クロロ-1-(4,5-ジブロモ-チオフェン-2-イル)-エタノン(GSK3β阻害剤VI);AR-AO144-18;SB216763;およびSB415286が含まれるが、それらに限定されない。阻害剤と相互作用するGSK3bの残基が同定されている。例えば、Bertrand et al., J. Mol Biol. 333(2): 393-407 (2003)参照。GSK3阻害剤は、例えば、Wnt/β-カテニン経路を活性化することができる。β-カテニン下流遺伝子の多くは多能性遺伝子ネットワークを同時調節する。例えば、GSK阻害剤はcMyc発現を活性化し、ならびにそのタンパク質安定性および転写活性を増強する。したがって、いくつかの態様において、GSK3阻害剤を細胞内の内因性MYCポリペプチドを刺激するために用いることができ、それにより多能性を誘導するためにMYC発現の必要性をなくす。
今日までに、非多能性哺乳動物細胞を誘導多能性幹細胞(iPSC)へと誘導するための多くの異なる方法およびプロトコルが確立されている。本明細書に記載の物質は、iPSCを生成するための基本的に任意のプロトコルとの組み合わせで用い、それによりプロトコルの効率を改善することができると考えられる。したがって、本発明は、iPSC細胞を生成するための任意のプロトコルと組み合わせての、非多能性細胞の、少なくともTGFβ受容体/ALK5阻害剤とのインキュベーション、好ましくはMEK/ERK経路阻害剤、および特定の態様において、Rho GTPアーゼ/ROCK阻害剤と組み合わせてのインキュベーションを提供する。プロトコルの選択を以下に記載し、それぞれはプロトコルの効率を改善するために本発明の物質と組み合わせることができると考えられる。
本発明は、組換え遺伝学の分野における慣行的技術を用いる。本発明における使用の一般的方法を開示している基本の教科書には、Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual (3rd ed. 2001);Kriegler, Gene Transfer and Expression: A laboratory Manual (1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))が含まれる。
特定の態様において、宿主細胞を形質転換するのに用いるために、プラスミドベクターが企図される。一般に、宿主細胞と適合性の種由来のレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターを、これらの宿主と関連して用いる。ベクターは複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を担持することができる。
特定のウイルスが持つ、受容体仲介エンドサイトーシスを介して細胞に感染する、または細胞に侵入する能力、および宿主細胞ゲノムに組み込まれて、ウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力により、それらのウイルスは外来核酸を細胞(例えば、哺乳動物細胞)に導入するための魅力的な候補となっている。本発明の核酸を送達するために用いうるウイルスベクターの非限定例を以下に記載する。
核酸送達のための特定の方法はアデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターはゲノムDNAに組み込まれる能力が低いことが公知であるが、この特徴はこれらのベクターが提供する高効率の遺伝子導入によって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」は、(a)構築物のパッケージングを支持し、かつ(b)最終的にその中でクローン化された組織または細胞特異的構築物を発現するのに十分な、アデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。遺伝的構成またはアデノウイルス、すなわち約36kbの直鎖、二本鎖DNAウイルスの知識があれば、大きいアデノウイルスDNA片の7kbまでの外来配列による置換が可能である(Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2):535-546, 1992))。
アデノウイルス補助形質移入を用いて核酸を細胞に導入してもよい。形質移入効率の増大がアデノウイルス結合システムを用いた細胞システムで報告されている(Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994;Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992;Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994.)。アデノ随伴ウイルス(AAV)は高頻度の組み込みを有し、非分裂細胞に感染しうるため、魅力的なベクターシステムであり、したがって、例えば、組織培養中(Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992)またはインビボで哺乳動物細胞に遺伝子を送達するのに有用となる。rAAVベクターの生成および使用に関する詳細は米国特許第5,139,941号および第4,797,368号に記載されており、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来遺伝物質を導入し、広範囲の種および細胞型に感染する能力、および特定の細胞株にパッケージングされる能力があるため、遺伝子送達ベクターとして見込みがある(Miller et al., Am. J. Clin. Oncol., 15(3):216-221, 1992)。
送達する核酸を、特異的結合リガンドを発現するよう操作された感染性ウイルス内に収容してもよい。したがって、ウイルス粒子は標的細胞の同種の受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。レトロウイルスベクターの特異的ターゲティングを可能にするよう設計された新規アプローチが、ウイルスエンベロープに乳糖残基を化学的に付加することによるレトロウイルスの化学的改変に基づいて開発された。この改変は、シアロ糖タンパク質受容体を介しての肝細胞の特異的感染を可能にしうる。
本発明により用いるための細胞、組織または生物の形質転換のための適切な核酸送達法は、本明細書に記載のとおり、または当業者には公知であるとおり、核酸(例えば、DNA)を細胞、組織または生物に導入しうる、実質的に任意の方法を含むと考えられる。そのような方法には、任意でFugene6(Roche)またはLipofectamine(Invitrogen)を用いた、エクスビボ形質移入(Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel and Baltimore, Nature 326:711-713, 1987)、微量注入(Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985;米国特許第5,789,215号、参照により本明細書に組み入れられる)を含む注入(米国特許第5,994,624号、第5,981,274号、第5,945,100号、第5,780,448号、第5,736,524号、第5,702,932号、第5,656,610号、第5,589,466号および第5,580,859号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる);電気穿孔法(米国特許第5,384,253号、参照により本明細書に組み入れられる;Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986;Potter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984);リン酸カルシウム沈澱(Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973;Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987;Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990);DEAE-デキストランと、続くポリエチレングリコールの使用(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985);直接音波ローディング(Fechheimer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987);リポソーム仲介形質移入(Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982;Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979;Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987;Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980;Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989;Kato et al., J Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991)および受容体仲介形質移入(Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988;Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987);ならびにそのような方法の任意の組み合わせなどによるDNAの直接送達が含まれるが、それらに限定されるわけではなく、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、iPSC生成の効率を改善する混合物を提供する。例えば、本発明は、TGFβ受容体/ALK5阻害剤、MEK/ERK経路阻害剤、Rho GTPアーゼ/ROCK阻害剤の混合物を、特定の態様において、哺乳動物細胞と共に提供する。例えば、混合物は、細胞と共に、または細胞なしで、細胞培養の培地に含まれうる。細胞培養培地の内容は一般に当技術分野において公知である。例示的な細胞培養培地は実施例において詳細に記載する。一般に、哺乳動物細胞および本発明の物質(TGFβ受容体/ALK5阻害剤、MEK/ERK経路阻害剤、およびRho GTPアーゼ/ROCK阻害剤)を含む細胞培養物は、最初はすべて、または実質的にすべて非多能性の細胞を含む。しかし、経時的に、特に本明細書に記載のプロトコルの条件下で、細胞の一部は多能性(すなわちiPSC)となる。
本発明は、例えば、誘導多能性幹細胞の生成において用いるためのキットも提供する。そのようなキットは、本明細書に記載のTGFβ受容体/ALK5阻害剤、MEK/ERK経路阻害剤、および/またはRho GTPアーゼ/ROCK阻害剤を含むが、それらに限定されない、本明細書に記載の試薬のいずれか、またはすべてを含みうる。これらの3つの物質、またはそのサブセットは、別々のバイアル中で、または混合物として一緒に、キットに含まれうる。本発明のキットは、HDAC阻害剤、GSK3阻害剤、またはL型Caチャネルアゴニストの1つまたは複数;cAMP経路の活性化因子;DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)阻害剤;および核受容体リガンドも含みうる。
本発明は、予防的または治療的使用を含むが、それらに限定されない、幹細胞技術のさらなる試験および開発を可能にする。例えば、いくつかの態様において、本発明の細胞(多能性細胞または望まれる細胞の運命にそって分化するよう誘導された細胞のいずれか)を、器官、組織、または細胞型の再生を必要としている個体を含むが、それらに限定されない、それを必要としている個体に導入する。いくつかの態様において、細胞は元は個体からの生検で得て;本明細書に記載のとおり多能性へと誘導し、任意で分化するよう誘導し(例えば、特定の所望の前駆細胞へと)、次いで個体に移植し戻す。いくつかの態様において、細胞を個体への導入の前に遺伝子改変する。
「4因子」(OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYC;以後4TF)で再プログラム化した間葉型線維芽細胞は、明確な細胞極性、境界および細胞-細胞相互作用を有するiPSCを生じる、劇的な形態変化を起こした。再プログラム化した細胞は、ヒト胚幹細胞(hESC)においても高度に発現される、上皮細胞のマーカーであるE-カドヘリンを発現した(Hay, E.D., Acta Anat. (Basel) 154, 8-20 (1995))。発明者らは、TGFβ経路アンタゴニストなどの間葉-上皮転換(MET)を促進する因子は再プログラム化プロセスに対して直接の影響を有するであろうと推論した。加えて、MEK-ERK経路阻害は以前、再プログラム化の様々な段階において重要な役割を果たすことが示された(Chen, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 10482-87 (2007);Shi, Y. et al., Cell Stem Cell 2, 525-8 (2008))。さらに、細胞の生存を促進する因子も、再プログラム化効率を改善する上で有益でありうる。したがって、低分子は生物学的プロセスを試験する上で多くの利点を有し(Feng, B. et al., Cell Stem Cell 4, 301-12 (2009);Shi, Y. et al., Cell Stem Cell 2, 525-8 (2008);Xu, Y. et al., Nature 453, 338-44 (2008))、遺伝子操作よりも安全な選択肢であるため、発明者らはこれら3つのプロセスおよび経路を調節しうる低分子に焦点を合わせた。ここで、発明者らは、はるかに速く、効率的なプロセスによる、線維芽細胞からの完全に再プログラム化されたヒトiPSCの生成を実質的に促進する単純な化学的プラットフォームを記載する。
細胞培養
初代皮膚線維芽細胞CRL2097およびBJ(新生児包皮)をATCCから購入した。すべての細胞培養培地はInvitrogen Corporation, CAから購入した。細胞を、10%FBS(10439-024)、1×MEM可欠アミノ酸(11140-050)、1×Glutamax(35050-061)、10mM Hepes(15630-080)および0.11mM 2-メルカプトエタノール(21985-023)を含むDMEM(10313-021)中で維持した。細胞を、0.05%(1×)トリプシン-EDTA(25300-054)を用いて1:5で継代した。
以前に記載された(Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007))、OCT4、SOX2、c-MYCおよびKLF4のヒトcDNAをコードするpMXベクターは、ADDGENEから入手した。マウスSlc7a1 ORFをpWPXLD(Addgene)に、以前に記載のとおりに(Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007))クローン化した。
OCT4、NANOG、SOX2およびLIN28を担持するレンチウイルスを以前に記載のとおりに(Yu, J. et al., Science 318, 1917-20 (2007))生成した。レトロウイルス作製のために、PLAT-Eパッケージング細胞を6穴プレートに1×106細胞/ウェルで播種した。24時間後、細胞に、OCT4、SOX2、c-MYCおよびKLF4 cDNAを担持するpMXベクターを、Fugene 6形質移入試薬(Roche)を製造者の指示通りに用いて形質移入した。形質移入の24時間後、培地を新鮮培地で置き換え、プレートをレトロウイルス作製のために32℃に移した。48時間および72時間の時点でウイルスを回収し、形質導入の前に0.45μmフィルターでろ過した。
アルカリ性ホスファターゼ染色を、ALP検出キット(カタログ番号:SCR004、Chemicon)を製品説明書通りに用いて実施した。免疫細胞化学のために、細胞を4%パラホルムアルデヒド中で固定し(10分、室温)、PBSで2回洗浄し、5%正常ロバ血清(Chemicon)および0.1%TritonX-100を用いてブロックし(15分、室温)、次いで一次抗体により4℃で終夜処理した。用いた一次抗体は抗NANOG(カタログ番号:AB9220、Chemicon、1:1,000);抗OCT4(カタログ番号:sc-5279、Santa Cruz biotech、1:200)、抗SSEA 4(カタログ番号:mab4304、Chemicon、1:500)、抗Tra-1-81(カタログ560123、BD Biosciences、1:100)、抗Tra-1-81(mAb 4381、Chemicon、1:500)、抗βIIIチューブリン(カタログ番号:MMS-435P、Covance Research Products Inc、1:1000)、抗PDX 1(1:500)(Dr. C. Wrightから供与)、抗ブラキュリ(カタログ番号:AF2085、R&D、最終濃度0.2μg/ml)であった。細胞をPBSで2回洗浄し、次いで二次抗体により室温で1時間処理した。用いた二次抗体はAlexa fluor 488ロバ抗ウサギまたは抗マウスIgG(Invitrogen、1:1,000)およびAlexa fluor 555ロバ抗ウサギまたは抗マウスIgG(Invitrogen、1:1,000)であった。核を0.5μg/ml DAPI(Sigma)で染色した。画像を測光CoolSnap HQ2カメラを備えたNikon Eclipse TE2000-U/X-cite 120 EXFO顕微鏡を用いて捕捉した。
胚様体の生成およびインビトロ分化を他所(Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007))に記載のとおりに実施した。奇形腫アッセイのために、300~500万細胞をSCIDマウスの腎被膜下に注射した。31日後、腫瘍を摘出し、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、TSRI組織学中心施設で組織学的に解析した。SCIDマウスの使用はUCSD動物研究委員会によって承認された。
全RNAを細胞からRNeasyミニキット(Qiagen)を用いて抽出した。cDNAを製品説明書に従い、superscript III第一鎖合成キット(Invitrogen)を用いて合成した。2マイクロリットルの反応産物を、それぞれのプライマーを用いた24~28 PCRサイクルのために用いた。プライマーの配列は他所に記載する(Takahashi, K. et al., Cell 131, 861-72 (2007))。
フローサイトメトリー解析のために、培養物をゆるやかにトリプシン処理し、6穴プレートから回収した。細胞を洗浄し、FACS緩衝液(PBS、2mM EDTA、2mM HEPES、1% FBS)に懸濁し、FACS Calibur血球計算器(Becton Dickinson, San Jose, CA)でCellQuestプログラムにより解析した。
n-ブタノール(10mL)中に2,4-ジクロロピリミジン(372mg、2.5mmol)、6-メトキシ-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン(489mg、3mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(0.52mL、3mmol)を含む反応フラスコを40℃で終夜加熱した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィで精製して、2-クロロ-4-(6-メトキシ-3,4-ジヒドロキノリン-1(2H)-イル)ピリミジン(551mg、80%)を得た。次いで、この中間体(250mg、0.91mmol)をジクロロメタンに溶解し、BBr3(ジクロロメタン中1M)(1mL、1mmol)により-78℃で処理した。反応混合物を室温までゆっくり加温して1時間撹拌し、水に加え、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機物を無水Na2SO4で乾燥して濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィで精製して、2-クロロ-4-(6-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロキノリン-1(2H)-イル)ピリミジン(154mg、65%)を得た。DMF(0.5mL)中の2-クロロ-4-(6-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロキノリン-1(2H)-イル)ピリミジン(29mg、0.11mmol)および4-アミノ-N-(シクロプロピルメチル)ベンゼンスルホンアミド(27mg、0.12mmol)の溶液を撹拌しながら、これにp-トルエンスルホン酸(ジオキサン中2M)(55μL、0.11mmol)を加えた。反応混合物を90℃で終夜撹拌し、次いでHPLCで精製して、表題化合物(27mg、56%)を得た。
ここで発明者らは、OCT4だけの外因性発現によるiPSCへのヒト初代体細胞の再プログラム化を可能にする新規低分子カクテルを報告する。
正常ヒト表皮角化細胞(Lonza)を角化細胞培養培地(KCM、Lonza)中で維持した。ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC、Millipore)をEndoGRO-VEGF Complete Medium(HCM、CHEMICON)中で維持した。ヒトESCおよびhiPSCを通常のヒトESC培養培地(hESCM:DMEM/F12、15%ノックアウト血清代替物、1%Glutamax、1%可欠アミノ酸、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.1mMβ-メルカプトエタノールおよび10ng/ml bFGF)中のMEFフィーダー細胞上で培養した。すべての細胞培養製品は、特に記載がないかぎり、Invitrogen/Gibco BRLからのものである。
レンチウイルス上清を以前に記載のとおりに作製して回収した(Yu, J. et al., Science 318:1917-1920 (2007))。レンチウイルス作製に用いたプラスミドには、pSin-EF2-Puro-hOCT4、pSin2-EF2-Puro-hSOX2、pLove-mKlf4、pLove-mMyc、パッケージングプラスミドpsPAX2およびエンベロープ-コーディングプラスミドpMD2.Gが含まれる(Yu, J. et al., Science 318:1917-1920 (2007)およびLi, W. et al., Stem Cells 27:2992-3000 (2009))。
NHEKを100mm組織培養皿で培養し、新しく作製したレンチウイルス上清で3回形質導入(各形質導入に3~4時間)した。1,000,000個の形質導入NHEKを100mm皿のx線照射不活化CF1 MEFフィーダー細胞上に播種し、KCM中で培養し、5μM PS48、0.25mM NaB(Stemgent)および0.5μM A-83-01(Stemgent)で2週間と、続いて培地の半量をhESCMに替え、5μM PS48、0.25mM NaBおよび0.5μM A-83-01を補足してさらに2週間処理した。次いで、細胞培養培地をhESCMに替え、5μM PS48、0.25mM NaB、0.5μM A-83-01および0.5μM PD0325901(Stemgent)を補足してさらに4週間処理した。化学物質なしの培地中で培養した同じOCT4感染角化細胞を対照として用いた。培養物をAccutase(Millipore)により分割し、分割後第1日に1μMチアゾビビン(Stemgent)で処理した。Alexa Fluor 555 Mouse抗ヒトTRA-1-81抗体(BD Pharmingen)により陽性染色されたiPSCコロニーを、hESCM中のフィーダー細胞上で増殖させるために回収し、慣行的に培養した。
HUVECを100mm組織培養皿で培養し、新しく作製したレンチウイルス上清で2回形質導入(各形質導入に4~6時間)した。200,000個の形質導入HUVECをゼラチンコーティングした100mm皿上に播種し、HCM中で培養し、5μM PS48、0.25mM NaBおよび0.5μM A-83-01で2週間と、続いて培地の半量をhESCMに替え、5μM PS48、0.25mM NaBおよび0.5μM A-83-01を補足してさらに2週間処理した。次いで、細胞培養培地をhESCMに替え、5μM PS48、0.25mM NaB、0.5μM A-83-01および0.5μM PD0325901を補足してさらに1~2週間処理した。Alexa Fluor 555 Mouse抗ヒトTRA-1-81抗体により陽性染色されたiPSCコロニーを、hESCM中のフィーダー細胞上で増殖させるために回収し、慣行的に培養した。培養物をAccutaseにより分割し、分割後第1日に1μMチアゾビビンで処理した。
hiPSCのインビトロでの分化を、標準の胚体(EB)法により実施した。簡単に言うと、hiPSCをAccutase(Millipore)により解離させ、超低接着6穴プレートで8日間培養し、次いでMatrigelコーティングした6穴プレートの分化培地中に移した。8日後に、細胞を免疫細胞化学解析のために固定するか、またはRT-PCR試験のために回収した。分化培地:DMEM/F12、10%FBS、1%Glutamax、1%可欠アミノ酸、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.1mMβ-メルカプトエタノール。
アルカリ性ホスファターゼ染色をAlkaline Phosphatase Detection Kit(Stemgent)を用い、製造者のプロトコルに従って実施した。標準の免疫細胞化学アッセイを以前に報告したとおりに行った(Li, W. et al., Stem Cells 27:2992-3000 (2009))。用いた一次抗体を表3に示す。二次抗体はAlexa Fluor 488ロバ抗マウスまたは抗ウサギIgG(1:1000)(Invitrogen)であった。核をDAPI(Sigma-Aldrich)染色により可視化した。画像をNikon Eclipse TE2000-U顕微鏡を用いて捕捉した。
RT-PCRおよびqRT-PCR解析のために、RNeasy Plus Mini KitをQIAshredder(Qiagen)との組み合わせで用いて、全RNAをヒトiPSCから抽出した。第一鎖逆転写を2μg RNAによりiScript(商標)cDNA Synthesis Kit(BioRad)を用いて実施した。多能性マーカーの発現を、Platinum PCR SuperMix(Invitrogen)を用いてRT-PCRにより解析した。分化後の系統特異的マーカーの発現をiQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)を用いてqRT-PCRにより解析した。プライマーを表2に示す。
ヒトRef-8_v3発現Beadchip(Illumina, CA, USA)を、NHEK、hiPSCおよびhES細胞の網羅的遺伝子発現を調べるために、マイクロアレイハイブリダイゼーションに用いた。ビオチン-16-UTP標識cRNAを500ngの全RNAから、Illumina TotalPrep RNA増幅キット(Ambion AMIL1791, Foster City, CA, USA)を用いて合成した。750ngの標識した増幅cRNAを含むハイブリダイゼーション混合物をIllumina BeadStation 500x System Manual(Illumina, San Diego, CA, USA)に従い、供給された試薬およびGE Healthcare Streptavidin-Cy3染色溶液を用いて調製した。Illumina Human Ref-8_v3発現BeadchipへのハイブリダイゼーションはBeadChip Hyb Wheel上、55℃で18時間であった。アレイをIllumina BeadArray Readerを用いてスキャンした。すべての試料を2つの生物学的複製に調製した。マイクロアレイデータの処理および解析をIllumina BeadStudioソフトウェアで実施した。データは背景を差し引き、ランク不変オプションを用いて規格化した。
ゲノムDNAをNon Organic DNA Isolation Kit(Millipore)を用いて単離し、次いでEZ DNA Methylation-Gold Kit(Zymo Research Corp., Orange, CA)で処理した。次いで、処理DNAを鋳型として用い、関心対象の配列を増幅した。OCT4およびNANOGプロモーター断片増幅に用いたプライマーを表2に示す。得られた断片をシーケンシングのためのTOPO TA Cloning Kit(Invitrogen)を用いてクローン化し、シーケンシングした。
hiPSC株の遺伝子型解析を、特異的プライマー(表2;Yu, J. et al., Science 318:1917-1920 (2007)およびLi, W. et al., Stem Cells 27:2992-3000 (2009))を使用したゲノムDNAのRT-PCRを用いて実施した。
hiPSC株を、0.05%トリプシン-EDTAを用いて回収した。5,000,000個の細胞をSCIDマウス(n=3)の腎被膜下に注射した。4~6週間後、十分に発生した奇形腫を回収し、固定し、次いでTSRI組織学中心施設で組織学的に解析した。
Claims (20)
- 哺乳動物の非多能性細胞から再プログラム化された誘導多能性幹細胞;ならびに
Rhoキナーゼ(ROCK)阻害剤、ALK5阻害剤、およびMEK阻害剤を含む組成物
を含み、
前記ROCK阻害剤が、非多能性細胞を誘導多能性幹細胞に再プログラム化する効率を増強するのに有効な量で存在する、組成物。 - ROCK阻害剤が、以下の構造、またはそのラセミ体、ジアステレオマー、互変異性体、もしくは幾何異性体、またはその薬学的に許容される塩を有する、請求項1に記載の組成物:
式中、
L2は置換または非置換C1-C10アルキレンであり;
yは0から3の整数であり;
zは0から5の整数であり;
Xは-N=、-CH=または-CR5=であり;
R1は水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
R3、R4およびR5は独立に-CN、-S(O)nR6、-NR7R8、-C(O)R9、-NR10-C(O)R11、-NR12-C(O)-OR13、-C(O)NR14R15、-NR16S(O)2R17、-OR18、-S(O)2NR19、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここでnは0から2の整数であり、ここでzが1よりも大きい場合、2つのR3部分は、一緒になって置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成していてもよく;かつ
R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18およびR19は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。 - L2がメチレンであるか;
XがN=もしくはCH=であるか;
R1が水素であるか;または
yおよびzが0である、
請求項2記載の組成物。 - L2がメチレンであり;
XがN=またはCH=であり;
R1が水素であり;かつ
yおよびzが0である、
請求項2記載の組成物。 - 前記哺乳動物の細胞がヒト細胞である、請求項1記載の組成物。
- 前記組成物が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK3)阻害剤をさらに含む、請求項1記載の組成物。
- 前記組成物が、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤をさらに含む、請求項1記載の組成物。
- ALK5阻害剤がA-83-01またはSB431542である、請求項1記載の組成物。
- MEK阻害剤がPD0325901である、請求項1記載の組成物。
- 前記誘導多能性幹細胞が、再プログラム化を開始するために、哺乳動物の非多能性細胞に、外因性Oct4をコードするポリヌクレオチドおよび外因性Klfをコードするポリヌクレオチドを導入することによって再プログラム化されたものである、請求項1記載の組成物。
- 誘導多能性幹細胞の製造における組成物の使用であって、該組成物が、
Rhoキナーゼ(ROCK)阻害剤;
ALK5阻害剤;および
MEK阻害剤
を含み、
該ROCK阻害剤が、非多能性細胞を誘導多能性幹細胞に再プログラム化する効率を増強するのに有効な量で存在する、使用。 - ROCK阻害剤が、以下の構造、またはそのラセミ体、ジアステレオマー、互変異性体、もしくは幾何異性体、またはその薬学的に許容される塩を有する、請求項12に記載の使用:
式中、
L2は置換または非置換C1-C10アルキレンであり;
yは0から3の整数であり;
zは0から5の整数であり;
Xは-N=、-CH=または-CR5=であり;
R1は水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり;
R3、R4およびR5は独立に-CN、-S(O)nR6、-NR7R8、-C(O)R9、-NR10-C(O)R11、-NR12-C(O)-OR13、-C(O)NR14R15、-NR16S(O)2R17、-OR18、-S(O)2NR19、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、ここでnは0から2の整数であり、ここでzが1よりも大きい場合、2つのR3部分は、一緒になって置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールを形成していてもよく;かつ
R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18およびR19は独立に水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。 - L2がメチレンであるか;
XがN=もしくはCH=であるか;
R1が水素であるか;または
yおよびzが0である、
請求項13記載の使用。 - L2がメチレンであり;
XがN=またはCH=であり;
R1が水素であり;かつ
yおよびzが0である、
請求項13記載の使用。 - 前記組成物が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK3)阻害剤をさらに含む、請求項12記載の使用。
- 前記組成物が、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤をさらに含む、請求項12記載の使用。
- ALK5阻害剤がA-83-01またはSB431542である、請求項12記載の使用。
- MEK阻害剤がPD0325901である、請求項12記載の使用。
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EP3770252A1 (en) | 2015-01-26 | 2021-01-27 | Fate Therapeutics, Inc. | Cells with increased immuno-regulatory properties and methods for their use and manufacture |
EP3272858A4 (en) * | 2015-03-18 | 2018-08-08 | ONO Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for producing naïve pluripotent stem cells |
BR112018001232A2 (pt) | 2015-07-21 | 2018-09-25 | The Children's Medical Center Corporation | pd-l1 que expressa células-tronco hematopoéticas e usos |
CN117737124A (zh) | 2015-10-16 | 2024-03-22 | 菲特治疗公司 | 用于诱导和维护基态多能性的平台 |
AU2016349504B2 (en) | 2015-11-04 | 2023-02-09 | Fate Therapeutics, Inc. | Genomic engineering of pluripotent cells |
US10858628B2 (en) | 2015-11-04 | 2020-12-08 | Fate Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation |
ES2908707T3 (es) | 2016-01-08 | 2022-05-03 | Evia Life Sciences Inc | Procedimiento para producir células madre/precursoras hepáticas a partir de células hepáticas maduras utilizando un compuesto de bajo peso molecular |
JP7134416B2 (ja) * | 2016-10-28 | 2022-09-12 | 国立研究開発法人国立がん研究センター | ヒト肝前駆細胞の調製方法 |
KR102107602B1 (ko) * | 2017-05-29 | 2020-05-08 | 한양대학교 산학협력단 | 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물 |
CN110832069B (zh) * | 2017-05-31 | 2023-06-20 | 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 | 用于化学诱导的谱系重编程的方法 |
CN107326007B (zh) * | 2017-08-07 | 2020-06-12 | 南开大学 | 利用巴豆酸激活Zscan4等二细胞期基因并延长端粒,提高化学诱导重编程效率的方法 |
WO2019060708A1 (en) | 2017-09-22 | 2019-03-28 | The Children's Medical Center Corporation | TREATMENT OF TYPE 1 DIABETES AND AUTOIMMUNE DISEASES OR DISORDERS |
CN108251377B (zh) * | 2018-01-16 | 2021-08-27 | 内蒙古大学 | 利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF制备饲养层细胞的方法 |
JPWO2019151386A1 (ja) | 2018-01-31 | 2021-01-07 | 富士フイルム株式会社 | 細胞の製造方法 |
CA3116184A1 (en) * | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Cynity Co., Ltd. | Method for producing stem/precursor cells, by using low molecular weight compound, from cells derived from endodermal tissue or organ |
JPWO2020213725A1 (ja) * | 2019-04-17 | 2020-10-22 | ||
US11801304B2 (en) | 2020-02-19 | 2023-10-31 | Nammi Therapeutics, Inc. | Formulated and/or co-formulated liposome compositions containing TFGB antagonist prodrugs useful in the treatment of cancer and methods thereof |
WO2022072883A1 (en) * | 2020-10-02 | 2022-04-07 | Fate Therapeutics, Inc. | Improved reprogramming, maintenance and preservation for induced pluripotent stem cells |
EP4170018A1 (en) * | 2021-10-20 | 2023-04-26 | Roslin Technologies Limited | Ipsc induction and progeny derivation |
WO2023067090A1 (en) * | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Roslin Technologies Limited | Ipsc induction and progeny derivation |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007069666A1 (ja) | 2005-12-13 | 2007-06-21 | Kyoto University | 核初期化因子 |
WO2008035110A1 (en) | 2006-09-22 | 2008-03-27 | Riken | Stem cell culture medium and method |
WO2008089351A1 (en) | 2007-01-17 | 2008-07-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Improved culture of stem cells |
WO2009006422A1 (en) | 2007-06-29 | 2009-01-08 | Stem Cell Products, Inc. | Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture |
WO2009007852A2 (en) | 2007-06-15 | 2009-01-15 | Izumi Bio, Inc | Multipotent/pluripotent cells and methods |
WO2009061442A1 (en) | 2007-11-06 | 2009-05-14 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells |
JP2009215191A (ja) | 2008-03-07 | 2009-09-24 | Keio Gijuku | 神経損傷治療剤及び神経損傷治療方法 |
WO2009117439A2 (en) | 2008-03-17 | 2009-09-24 | The Scripps Research Institute | Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells |
JP2019110912A (ja) | 2009-10-16 | 2019-07-11 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 多能性細胞の誘導法 |
Family Cites Families (91)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5384253A (en) | 1990-12-28 | 1995-01-24 | Dekalb Genetics Corporation | Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes |
AU2515992A (en) | 1991-08-20 | 1993-03-16 | Genpharm International, Inc. | Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs |
EP0641781B1 (en) | 1991-09-06 | 2000-07-26 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. | 4-amino(alkyl)cyclohexane-1-carboxamide compound and use thereof |
US5702932A (en) | 1992-07-20 | 1997-12-30 | University Of Florida | Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA |
EP0710283A4 (en) * | 1993-07-22 | 1997-07-02 | Merck & Co Inc | THE EXPRESSION OF HUMAN INTERLEUKIN-1-g (b) IN A TRANSGENIC ANIMAL |
US5656610A (en) | 1994-06-21 | 1997-08-12 | University Of Southern California | Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue |
US5736524A (en) | 1994-11-14 | 1998-04-07 | Merck & Co.,. Inc. | Polynucleotide tuberculosis vaccine |
US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US6013516A (en) | 1995-10-06 | 2000-01-11 | The Salk Institute For Biological Studies | Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells |
US5780448A (en) | 1995-11-07 | 1998-07-14 | Ottawa Civic Hospital Loeb Research | DNA-based vaccination of fish |
US20030059913A1 (en) | 1995-11-20 | 2003-03-27 | Walter Weyler | Novel Microorganisms with ability to degrade indole and novel enzymes therefrom |
GB9807935D0 (en) | 1998-04-14 | 1998-06-10 | Univ Edinburgh | Lineage specific cells and progenitor cells |
US5945100A (en) | 1996-07-31 | 1999-08-31 | Fbp Corporation | Tumor delivery vehicles |
SI0956865T2 (sl) | 1996-08-12 | 2011-04-29 | Mitsubishi Pharma Corp | Zdravila, ki obsegajo inhibitor Rho-kinaze |
US5981274A (en) | 1996-09-18 | 1999-11-09 | Tyrrell; D. Lorne J. | Recombinant hepatitis virus vectors |
CA2292339A1 (en) | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Ludwig Institute For Cancer Research | Smad6 and uses thereof |
US5994624A (en) | 1997-10-20 | 1999-11-30 | Cotton Incorporated | In planta method for the production of transgenic plants |
US5994136A (en) | 1997-12-12 | 1999-11-30 | Cell Genesys, Inc. | Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors |
US20060263382A1 (en) | 1998-06-20 | 2006-11-23 | Richard Hotchkiss | Membrane-permeant peptide complexes for treatment of sepsis |
AU773012B2 (en) | 1998-07-24 | 2004-05-13 | Carnegie Institution Of Washington | Method for maintenance and propagation of germline stem cells using members of the TGF-beta family of growth factors |
WO2000078351A1 (fr) | 1999-06-18 | 2000-12-28 | Mitsubishi Pharma Corporation | Promoteurs de l'osteogenese |
US6730293B1 (en) | 1999-08-24 | 2004-05-04 | Cellgate, Inc. | Compositions and methods for treating inflammatory diseases of the skin |
AU6865100A (en) | 1999-09-02 | 2001-04-10 | Mitsubishi Pharma Corporation | Osteogenesis promoting agents |
US20020142457A1 (en) | 1999-12-28 | 2002-10-03 | Akihiro Umezawa | Cell having the potentiality of differentiation into cardiomyocytes |
JP2002184539A (ja) | 2000-12-14 | 2002-06-28 | Auto Network Gijutsu Kenkyusho:Kk | コネクタ |
AR035791A1 (es) | 2001-03-23 | 2004-07-14 | Bayer Corp | Compuesto n,n-diheterociclico de amina, inhibidor de la rho-quinasa, su uso para la fabricacion de un medicamento y proceso para la preparacion del compuesto |
AU2002245709A1 (en) | 2001-03-23 | 2002-10-08 | Bayer Corporation | Rho-kinase inhibitors |
JP2003097552A (ja) | 2001-09-21 | 2003-04-03 | Nsk Ltd | 摩擦付加装置および直動案内装置 |
US20030062225A1 (en) | 2001-10-03 | 2003-04-03 | Stucky Paul A. | Elevator load bearing assembly having a detectable element that is indicative of local strain |
KR20100013352A (ko) | 2001-10-31 | 2010-02-09 | 알콘, 인코퍼레이티드 | 뼈 형태발생 단백질(bmp), bmp 수용체 및 bmp 결합 단백질 및 녹내장 진단 및 치료에서 그의 용도 |
ATE554169T1 (de) | 2001-11-02 | 2012-05-15 | Giuliani Int Ltd | Smad7-inhibitoren zur behandlung von krankheiten des zns |
AU2003202263A1 (en) | 2002-01-10 | 2003-07-30 | Bayer Healthcare Ag | Roh-kinase inhibitors |
US6943172B2 (en) | 2002-01-23 | 2005-09-13 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Rho-kinase inhibitors |
CA2473510A1 (en) | 2002-01-23 | 2003-07-31 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Pyrimidine derivatives as rho-kinase inhibitors |
AU2003220935A1 (en) | 2002-04-03 | 2003-10-13 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited. | Benzamide derivatives |
GB0210539D0 (en) | 2002-05-08 | 2002-06-19 | Univ Edinburgh | Control of es cell self renewal and lineage specification, and medium therefor |
US20040039796A1 (en) | 2002-08-08 | 2004-02-26 | Virtual Radio, Inc. | Personalized cyber disk jockey and Internet radio advertising |
EP1562935B1 (de) | 2002-10-28 | 2006-09-06 | Bayer HealthCare AG | Heteroaryloxy-substituierte phenylaminopyrimidine als rho-kinaseinhibitoren |
JP2006517234A (ja) | 2003-02-10 | 2006-07-20 | アムジエン・インコーポレーテツド | バニロイド受容体リガンドおよび治療におけるこれらのリガンドの使用 |
AU2003901099A0 (en) | 2003-03-11 | 2003-03-27 | Es Cell International Pte Ltd. | Methods of inducing differentiation of stem cells |
US20070010008A1 (en) | 2005-06-29 | 2007-01-11 | Tissuetech, Inc. | Ex vivo expansion of primary animal cells |
WO2005084158A2 (en) | 2003-06-20 | 2005-09-15 | The Regents Of The University Of California | Polypeptide transduction and fusogenic peptides |
US7727762B2 (en) | 2003-10-03 | 2010-06-01 | Keiichi Fukuda | Method of inducing the differentiation of stem cells into myocardial cells |
JP4110324B2 (ja) | 2003-10-15 | 2008-07-02 | 宇部興産株式会社 | 新規インダゾール誘導体 |
WO2005038010A2 (en) | 2003-10-16 | 2005-04-28 | The University Court Of The University Of Edinburgh | Control of es cell self-renewal and lineage specification, and medium therefor |
AU2004291559B2 (en) | 2003-11-19 | 2008-10-16 | Australian Stem Cell Centre Limited | Methods for producing blood products from pluripotent cells in cell culture |
US20070269412A1 (en) | 2003-12-02 | 2007-11-22 | Celavie Biosciences, Llc | Pluripotent cells |
EP1713775A4 (en) | 2004-01-30 | 2009-08-12 | Smithkline Beecham Corp | CHEMICAL COMPOUNDS |
AU2005241009A1 (en) | 2004-04-21 | 2005-11-17 | Mcmaster University | Myosin light chain kinase inhibitors and their use |
US20060024634A1 (en) | 2004-07-28 | 2006-02-02 | 3M Innovative Properties Company | Self-ligating orthodontic appliance with clip |
EP1791952A4 (en) | 2004-08-13 | 2008-06-11 | Univ Georgia Res Found | COMPOSITIONS AND METHODS OF SELF-RENEWAL AND DIFFERENTIATION IN HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS |
US20080268533A1 (en) | 2004-08-25 | 2008-10-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells |
US20060182724A1 (en) | 2005-02-15 | 2006-08-17 | Riordan Neil H | Method for expansion of stem cells |
CN101313065A (zh) | 2005-08-01 | 2008-11-26 | 纽珀滕索有限公司 | 具有恢复的潜能的重编程序细胞的生产 |
CA2621161A1 (en) | 2005-09-08 | 2007-03-15 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Sec Retary Of The Department Of Health And Human Services | Methods for promoting stem cell proliferation and survival |
GB0523039D0 (en) * | 2005-11-11 | 2005-12-21 | Univ Edinburgh | Reprogramming and genetic modification of cells |
US20090227032A1 (en) | 2005-12-13 | 2009-09-10 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells |
JPWO2007088651A1 (ja) | 2006-02-01 | 2009-06-25 | 国立大学法人 東京大学 | TGF−βシグナル阻害剤と抗腫瘍剤の組み合せ使用 |
US7541186B2 (en) | 2006-02-22 | 2009-06-02 | University Of Washington | Method of generating human retinal progenitors from embryonic stem cells |
EP1999249B8 (en) | 2006-03-30 | 2012-02-15 | The University Court Of The University of Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitors. and uses thereof |
GB0615327D0 (en) | 2006-03-30 | 2006-09-13 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof |
US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
US20070259423A1 (en) | 2006-05-02 | 2007-11-08 | Jon Odorico | Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage |
CA2656398A1 (en) | 2006-06-30 | 2008-01-10 | Schering Corporation | Substituted piperidines that increase p53 activity and the uses thereof |
JP4960450B2 (ja) | 2006-07-14 | 2012-06-27 | ノバルティス アーゲー | Alk−5阻害剤としてのピリミジン誘導体 |
GB0622395D0 (en) | 2006-11-09 | 2006-12-20 | Univ Cambridge Tech | Methods relating to pluripotent cells |
US20100172883A1 (en) | 2007-01-19 | 2010-07-08 | Bruneau Benoit Gaetan | Methods of generating cardiomyocytes |
CN101641436A (zh) | 2007-01-30 | 2010-02-03 | 佐治亚大学研究基金会 | 用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞(mmc)的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群 |
WO2008105630A1 (en) | 2007-02-27 | 2008-09-04 | Procell Therapeutics Inc. | Combined use of cell permeable nanog and oct4 for increasing self-renewal and suppressing differentiation of stem cells |
EP2131840B1 (en) | 2007-03-07 | 2018-10-17 | MEI Pharma, Inc. | Combination of benzimidazole anti-cancer agent and a second anti-cancer agent |
WO2008126932A2 (en) | 2007-04-09 | 2008-10-23 | Riken | Epigenetical regulation of brain plasticity |
US8648069B2 (en) * | 2007-06-08 | 2014-02-11 | Abbvie Inc. | 5-substituted indazoles as kinase inhibitors |
WO2009032456A2 (en) | 2007-08-01 | 2009-03-12 | Primegen Biotech Llc | Non-viral delivery of transcription factors that reprogram human somatic cells into a stem cell-like state |
MX2010002242A (es) | 2007-08-31 | 2010-06-01 | Whitehead Biomedical Inst | Estimulación de ruta wnt en reprogramacion de celulas somaticas. |
WO2009057831A1 (ja) | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Kyoto University | 核初期化方法 |
JP4604076B2 (ja) | 2007-11-07 | 2010-12-22 | 国立大学法人静岡大学 | 燃料電池用電解質膜 |
WO2009073523A2 (en) | 2007-11-29 | 2009-06-11 | Children's Hospital Of Orange County | De-differentiation of human cells |
EP2227241A1 (en) | 2007-11-30 | 2010-09-15 | Cytomatrix PTY LTD | Methods of inducing pluripotency involving sox2 protein |
US20110190730A1 (en) | 2007-11-30 | 2011-08-04 | Cytomatrix Pty Ltd | Methods of inducing pluripotency involving oct4 protein |
US8298825B1 (en) * | 2008-08-25 | 2012-10-30 | The General Hospital Corporation | TGF-beta receptor inhibitors to enhance direct reprogramming |
SG196784A1 (en) | 2008-12-03 | 2014-02-13 | Scripps Research Inst | Stem cell cultures |
US8906677B2 (en) | 2008-12-17 | 2014-12-09 | The Scripps Research Institute | Generation and maintenance of stem cells |
US20120122212A1 (en) | 2009-03-06 | 2012-05-17 | Marica Grskovic | Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells |
US9005975B2 (en) * | 2009-05-29 | 2015-04-14 | Kyoto University | Method for selecting clone of induced pluripotent stem cells |
ES2726766T3 (es) * | 2009-08-07 | 2019-10-09 | Univ Kyoto | Método para el desarrollo eficiente de células madre pluripotentes inducidas |
ES2533581T3 (es) | 2010-03-05 | 2015-04-13 | Texas Heart Institute | ETS2 y Mesp1 generadores de progenitores cardíacos a partir de fibroblastos |
CA2800498C (en) | 2010-03-31 | 2021-11-16 | The Scripps Research Institute | Reprogramming cells |
US9905105B1 (en) | 2016-12-01 | 2018-02-27 | General Electric Company | Method of increasing sensing device noticeability upon low battery level |
-
2010
- 2010-10-15 ES ES17173120T patent/ES2938049T3/es active Active
- 2010-10-15 CN CN202110535275.5A patent/CN113621576A/zh active Pending
- 2010-10-15 CA CA3194845A patent/CA3194845A1/en active Pending
- 2010-10-15 WO PCT/US2010/052896 patent/WO2011047300A1/en active Application Filing
- 2010-10-15 EP EP17173120.1A patent/EP3235901B1/en active Active
- 2010-10-15 US US13/500,373 patent/US9005968B2/en active Active
- 2010-10-15 MX MX2012004283A patent/MX337982B/es active IP Right Grant
- 2010-10-15 CN CN201610220657.8A patent/CN105861446B/zh active Active
- 2010-10-15 ES ES10824189.4T patent/ES2638464T3/es active Active
- 2010-10-15 CA CA2777720A patent/CA2777720C/en active Active
- 2010-10-15 CA CA3091210A patent/CA3091210C/en active Active
- 2010-10-15 EP EP10824189.4A patent/EP2488630B1/en active Active
- 2010-10-15 EP EP22205835.6A patent/EP4206319A1/en active Pending
- 2010-10-15 JP JP2012534403A patent/JP5808331B2/ja active Active
- 2010-10-15 AU AU2010306627A patent/AU2010306627B2/en active Active
- 2010-10-15 BR BR112012008848A patent/BR112012008848A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-10-15 RU RU2012117719/10A patent/RU2012117719A/ru not_active Application Discontinuation
- 2010-10-15 CN CN201080056597.1A patent/CN102741394B/zh active Active
-
2012
- 2012-04-12 MX MX2021014919A patent/MX2021014919A/es unknown
-
2013
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-
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-
2022
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Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007069666A1 (ja) | 2005-12-13 | 2007-06-21 | Kyoto University | 核初期化因子 |
WO2008035110A1 (en) | 2006-09-22 | 2008-03-27 | Riken | Stem cell culture medium and method |
JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
WO2008089351A1 (en) | 2007-01-17 | 2008-07-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Improved culture of stem cells |
WO2009007852A2 (en) | 2007-06-15 | 2009-01-15 | Izumi Bio, Inc | Multipotent/pluripotent cells and methods |
WO2009006422A1 (en) | 2007-06-29 | 2009-01-08 | Stem Cell Products, Inc. | Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture |
WO2009061442A1 (en) | 2007-11-06 | 2009-05-14 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells |
JP2009215191A (ja) | 2008-03-07 | 2009-09-24 | Keio Gijuku | 神経損傷治療剤及び神経損傷治療方法 |
WO2009117439A2 (en) | 2008-03-17 | 2009-09-24 | The Scripps Research Institute | Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells |
JP2019110912A (ja) | 2009-10-16 | 2019-07-11 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 多能性細胞の誘導法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
Cell Stem Cell,2009年01月,vol.4, no.1,pp.16-19 |
Cell Stem Cell,2009年04月,vol.4, no.4,pp.301-312 |
EMBO Rep.,2009年07月,vol.10, no.7,pp.714-721 |
Mol. Reprod. Dev.,2009年08月,vol.76, no.8,pp.722-732 |
Nature,2008年,vol.451, no.7175,pp.141-146 |
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