ES2533581T3 - ETS2 y Mesp1 generadores de progenitores cardíacos a partir de fibroblastos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de preparación de una célula progenitora cardiaca inducida, comprendiendo el procedimiento la suministro de un factor de reprogramación que comprende dos genes heterólogos a una célula somática, caracterizado porque los genes heterólogos son ETS2 y Mesp1.

Description

ETS2 y Mesp1 generadores de progenitores cardíacos a partir de fibroblastos

Campo de la invención

La presente solicitud reivindica prioridad respecto de la Solicitud de Patente Provisional US número de serie 61/339.509, presentada el 5 de marzo de 2010, titulada ETS2 AND MESP1 GENERATE CARDIAC PROGENITORS FROM FIBROBLASTS, de la que todo el contenido se incorpora en la presente memoria por referencia.

Un aspecto de la presente invención se refiere, en general, al campo de la diferenciación celular y, más específicamente, a una estrategia para la regeneración de tejido cardiovascular a través del aislamiento, renovación y diferenciación dirigida, de fibroblastos en tipos de células cardíacas maduras específicas, de marcapasos, musculares lisas y endoteliales.

Antecedentes

El daño a los tejidos del corazón de mamíferos frecuentemente resulta en la pérdida de un gran número de células cardiacas, incluyendo células maduras cardiacas, células del marcapasos, musculares lisas y células endoteliales. Aunque hay alguna indicación de que las células cardíacas se pueden regenerar en los seres humanos (Bergmann et al., 2009), el mecanismo no se entiende bien y el proceso no parece proceder con la suficiente rapidez para reparar tipos comunes de daño cardíaco, tal como isquemia, infarto , traumatismo o lesión debido a toxinas o infecciones virales. Por lo tanto, un objetivo central de la medicina cardiaca experimental ha sido el desarrollo de un medio para la regeneración de células cardiacas que se han perdido debido al daño cardíaco. Se han realizado estudios de los mecanismos detrás de la cardiogénesis embrionaria, con el objetivo de replicar la cardiogénesis in vitro o in vivo para los fines de la regeneración de tejido dañado.

Investigaciones recientes han identificado células progenitoras cardiovasculares multipotentes (MICP) (ISL1 +), que son capaces de diferenciarse para formar el tejido cardíaco maduro. Las células MICP derivadas de células madre embrionarias (ES), que pueden dar lugar a células endoteliales, cardiacas, y musculares lisas, se han aislado (Moretti et al., 2006). Los estudios genéticos han demostrado que estas células MICP expresan Isl1, Nkx2.5 y Flkl.

Los sistemas modelo para la investigación de cardiogénesis incluyen la ascidia Ciona intestinalis (Beh et al., 2007). Los estudios de linaje han demostrado que el corazón Ciona adulto se deriva de dos células fundadoras que expresan Ci-Mesp, un factor de transcripción hélice-bucle-hélice básico (bHLH), y también Ci-Etsl/2 (Imai et al., 2004; Satou et al., 2004). Además, se expresan ortólogos de ascidia de genes de especificación de corazón conservado NK4 (tinman Nkx2.5), GATAa (pannier / GATA4 / 5/6), Hand and Hand-like (Imai et al., 2003; Davidson, 2007; Davidson and Levine, 2003; Satou et al., 2004). Los embriones konckdown-Ci-Mesp no desarrollaron primordios de corazón, y la inhibición diana de la actividad de Ets1/ 2 también bloqueó la especificación cardíaca y la expansión del campo del corazón. Del mismo modo, los homólogos murinos de Ci-Mesp, Mesp1 y Mesp2 se expresan en el mesodermo temprano destinado a convertirse en mesodermo cráneo-cardíaco (Saga et al., 2000). Sólo el ratón doble-knockout Mesp1/Mesp2 carecía de cualquier mesodermo cardíaco (Saga et al, 1999;.. Kitajima et al, 2000), lo que indica un papel para estos genes en la dirección de la aparición de progenitores cardíacos en vertebrados superiores. Las repeticiones de los genes Mesp han hecho que otros estudios en embriones sean una tarea de enormes proporciones.

Lo que se necesita en la técnica es un procedimiento para inducir la cardiogénesis con el fin de regenerar las células cardiacas para el uso en el tratamiento de tejido cardiaco dañado. La reprogramación de células somáticas humanas en células pluripotentes por un número limitado de factores de transcripción importantes para el mantenimiento de la autorrenovación y pluripotencia ha sido reportada por los grupos de Yamanaka, Thomson and Daley (Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007; Park et al., 2008). Un aspecto de la presente invención proporciona un medio para la reprogramación de las células somáticas y diferenciación dirigida en células progenitoras cardíacas. Por lo tanto, una realización de la presente solicitud proporciona una forma de probar un paradigma regulador único que ETS2 y Mesp1 son transformadoras y, a diferencia de NKX2.5 e ISL1, convierten los fibroblastos no embrionarios normales humanos dérmicos (NHDF) en progenitores cardíacos primarios. Otro aspecto de la presente solicitud fue dilucidar el papel de Mesp1 en la jerarquía reguladora que dirige la aparición de progenitores cardíacos.

Sumario

La presente invención proporciona un procedimiento de preparación de una célula progenitora cardiaca de acuerdo con la reivindicación 1.

También se describe la modulación de las capacidades de diferenciación celular utilizando la expresión génica heteróloga. Algunas realizaciones de la invención se refieren a un procedimiento para inducir una célula progenitora cardíaca mediante la entrega de un factor de reprogramación a la célula, en el que el factor de reprogramación comprende ETS2 o una combinación de ETS2 y Mesp1.

El procedimiento proporciona una célula progenitora cardiaca que ha sido inducida mediante la reprogramación de una célula somática, en el que la reprogramación comprende la entrega de un factor de reprogramación que comprende el gen ETS2 a la célula somática, la célula somática es un fibroblasto dérmico humano normal (NHDF), y el factor de reprogramación puede ser ETS2 o Mesp1, o una combinación de los mismos.

También se describe un procedimiento de reprogramación de una célula somática para producir una célula progenitora cardiaca, en el que la reprogramación comprende la entrega de un factor de reprogramación que comprende el gen ETS2 a la célula somática. La célula somática puede ser una NHDF, y el factor de reprogramación puede ser ETS2 o Mesp1, o una combinación de los mismos.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

La FIGURA 1 muestra un mapa esquemático de lentivirus con la inserción de secuencias de codificación de ADN de longitud completa de ETS2 y ELK4. Elementos funcionales y abreviaturas: promotor alfa Ef-1 constitutivo, múltiples sitios de clonación (MCS), sitio de entrada al ribosoma independiente (IRES) del virus de la poliomielitis humana, secuencia de codificación para una mejora en la proteína verde fluorescente (EGFP), elemento regulador posterior a la transcripción del virus de hepatitis de la marmota (WPRE), dominio de activación (AD), dominio ETS de unión al ADN. Estos plásmidos se generaron mediante técnicas de clonación de ADN recombinante estándar y luego se utilizaron para hacer los lentivirus para infectar fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF);

La FIGURA 2 muestra (panel superior) NHDF tratados con lentivirus vacíos (pWPI-GFP), lentivirus pWPI-ELK4-GFP,

o lentivirus pWPI-ETS2-GFP, y (panel inferior) niveles de expresión de GAPDH, NANOG, OCT3/4, Sox2 en células infectadas con virus vacío, virus portador de ETS2, virus portador de ELK4, o paso NHDF no infectado 3 (NHDF-P3);

La FIGURA 3 muestra la tinción de inmunofluorescencia con anticuerpo a un marcador de células madre NANOG en células NHDF-P3 infectadas con lentivirus que porta ETS2, pero no ELK4 o vector vacío (panel superior). Una transferencia de proteína usando anticuerpo anti-ETS2 reveló la expresión de ETS2 en NHDF infectados con lentivirus que porta ETS2 durante 4 semanas, mientras que NHDF infectados con lentivirus vacío no mostraron ninguna expresión (panel inferior izquierdo). La tinción de inmunofluorescencia con anticuerpo anti-ETS2 confirmó la expresión inducida en las células infectadas con lentivirus ETS2 (panel inferior derecho);

La FIGURE 4 muestra la inducción de marcadores de células madre NANOG, OCT3/4, SOX2, REX1 y c-MYC en colonias similares a células madre después de 4 semanas de cultivo. Los colores fluorescentes (colores no representados en las figuras) son los siguientes: DAPI (azul), GFP (verde), NANOG y OCT3/4 (rojo), una mezcla de los tres colores se observa en los paneles de "fusión". Las imágenes de colores fluorescentes están disponibles bajo petición;

La FIGURA 5 muestra la citometría de flujo que demuestra el porcentaje de células madre embrionarias humanas H9 (A), NHDF no infectados (b), o células infectadas con ETS2 (C) que se tiñeron para el marcador de superficie de células madre SSEA-3. Controles negativos, líneas negras; tinción de SSEA-3, líneas grises;

La FIGURA 6 muestra la citometría de flujo que demuestra el porcentaje de células madre embrionarias humanas H9 (A), NHDF no infectados (B), o células infectadas con ETS2 (C) que se tiñeron para el marcador de superficie de células madre Tra-1-81. . Controles negativos, líneas negras; tinción de Tra-1-81, líneas grises;

La FIGURA 7 muestra imágenes de células EPS después de la infección con lentivirus Mesp1. Las células se tiñeron con DAPI para visualizar los núcleos (paneles de la izquierda) y con anticuerpos específicos contra ISL1, NKX2.5, GATA4, MEF2C, TNT y MHC3 para visualizar las proteínas progenitoras cardíacas indicadas (paneles de la derecha). Los paneles del medio muestran imágenes de contraste de fase de células. Los colores fluorescentes son los siguientes: DAPI (azul), tinción específica de la proteína (rojo). Las imágenes con colores fluorescentes están disponibles a solicitud;

La FIGURA 8 muestra que la expresión de NKX2.5, ISL1, GATA4, MEF2C, TBX5, MHC3, TNT, MLC2, CX43 y CX45, detectada mediante RT-PCR, sólo se indujo por la combinación de ETS2 y Mesp1. Ni ETS2 o Mesp1 solos son capaces de inducir estos genes cardiogénicos en NHDF;

La FIGURA 9 muestra la inducción del programa de progenitores cardiacos de novo secuencial. NHDF fueron infectados con lentivirus ETS2, se hicieron crecer durante 4 semanas, fueron infectados con lentivirus Mesp1 y se cultivaron durante 7 días, luego fueron agregados por el procedimiento de caída de presión y se colocaron en una placa revestida con gelatina;

La FIGURA 10 muestra la activación de la expresión génica del programa de progenitores cardíacos, medida por fluorescencia de la proteína indicadora Rojo-Tomate que se expresa sólo cuando se expresa el factor progenitor cardíaco NKX2.5. Los colores fluorescentes (colores no mostrados en las figuras) son los siguientes: GFP (verde), Red (rojo), una mezcla de los dos colores se observa en el panel de "fusión";

La FIGURA 11 muestra la citometría de flujo de células progenitoras cardiacas obtenidas de NHDF por la infección con lentivectores ETS2 y Mesp1 y fueron clasificados, ya sea por GFP o GFP y proteína indicadora Rojo-Tomate;

La FIGURA 12 muestra la visualización de marcadores de superficie de células endoteliales y cardíacas CD31, CD34 y CD144 en células progenitoras cardíacas después de 9 días en cultivo; y

La FIGURA 13 muestra los datos de ritmo cardíaco en las células progenitoras cardíacas reprogramadas. Las células EPS fueron infectadas con lentivirus Mesp1, así como con el virus que lleva un promotor de cadena pesada de miosina que dirige el gen de resistencia a la puromicina. Para seleccionar las células progenitoras cardíacas resistentes a los antibióticos, las células fueron tratadas con 50 ug/ml de puromicina. Después de 9 días, se observó el ritmo cardíaco en los cultivos celulares y fueron capturados por microscopía de vídeo y convertidos en vídeos MPEG. Los golpes por agregado cultivado por placa se contaron durante 20 segundos y luego se multiplicaron por 3, dando como resultado latidos por un minuto. Se realizaron tres mediciones independientes por agregado en una placa o pocillo de cultivo de tejido.

Descripción detallada de realizaciones preferentes

Una realización de la presente invención se refiere a la modulación de la diferenciación celular utilizando la expresión génica heteróloga. Algunas realizaciones de la invención se refieren a un procedimiento para inducir una célula progenitora cardíaca mediante la entrega de un factor de reprogramación a la célula, en el que el factor de reprogramación comprende ETS2 o una combinación de ETS2 y Mesp1.

Una realización de la presente invención proporciona un procedimiento para inducir una célula progenitora cardiaca por la reprogramación de una célula somática, en el que la reprogramación comprende la entrega de un factor de reprogramación que comprende un solo gen heterólogo a la célula somática. La célula somática puede ser un fibroblasto, preferiblemente un fibroblasto dérmico humano normal. El gen heterólogo puede ser ETS2. El gen heterólogo puede comprender la secuencia de codificación de ETS2 humana (SEC ID NO: 9) o el gen ETS2 (SEC ID NO: 7), o el gen heterólogo puede codificar la secuencia de la proteína ETS2 humana (SEC ID NO: 8). La célula similar a las células madres inducida puede exhibir características de cardiogénesis o de otro tipo de células progenitoras cardíacas como consecuencia de la programación, incluyendo la expresión de factores progenitores cardiacos tales como NKX2.5, ISL1, MEF2C, dHAND and GATA4, o ritmo cardíaco.

Otra realización de la presente invención proporciona un procedimiento para inducir una célula progenitora cardíaca mediante la reprogramación de una célula somática, en el que la reprogramación comprende la entrega de un factor de reprogramación que comprende dos genes heterólogos a la célula somática. La célula somática puede ser un fibroblasto, preferiblemente un fibroblasto dérmico humano normal. Los genes heterólogos pueden ser ETS2 y Mesp1. Los genes heterólogos pueden comprender la secuencia de codificación de ETS2 humana (SEC ID NO: 9), el gen ETS2 (SEC ID NO: 7), o una secuencia de ADN que codifica la secuencia de la proteína ETS2 humana (SEC ID NO: 8) y la secuencia de codificación de Mesp1 de ratón (SEC ID NO: 6), el gen Mesp1 de ratón (SEC ID NO: 4),

o una secuencia de ADN que codifica la secuencia de la proteína Mesp1 de ratón (SEC ID NO: 5). La célula similar a las células madres inducida puede exhibir características de cardiogénesis o de otro tipo de células progenitoras cardíacas como consecuencia de la programación, incluyendo la expresión de factores progenitores cardiacos tales como NKX2.5, ISL1, MEF2C, dHAND y GATA4, o ritmo cardíaco.

Aún otra forma de realización de la presente invención, la reprogramación de una célula somática, puede lograrse mediante la entrega de un factor de reprogramación a la célula somática utilizando un vector recombinante. El factor de reprogramación también se puede suministrar usando un sistema de transducción lentiviral para expresar el factor de reprogramación en la célula somática. En estas realizaciones, el factor de reprogramación puede ser ETS2 y Mesp1.

Otra forma de realización de la presente invención proporciona una célula somática que ha sido reprogramada, en la que la reprogramación comprende la entrega de un factor de reprogramación que comprende un único gen heterólogo o múltiples genes heterólogos a la célula somática. La célula somática puede ser un fibroblasto, preferiblemente un fibroblasto dérmico humano normal. Los genes heterólogos pueden ser ETS2 o múltiples genes heterólogos pueden ser ETS2 y Mesp1. La célula similar a las células madres inducida puede exhibir características de cardiogénesis o de otro tipo otros de células progenitoras cardíacas como consecuencia de la programación, incluyendo la expresión de factores progenitores cardiacos tales como NKX2.5, ISL1, MEF2C, dHAND y GATA4, o ritmo cardíaco.

Ejemplo 1

Selección del factor de reprogramación Se observó que el dominio ETS (Fig. 1), un dominio de unión a ADN altamente conservado, es capaz de unirse a un motivo central de ADN 5’-GGA(A/T)-3’ encontrado en los promotores de muchos genes marcadores de células madre. La expresión de ETS2 está vinculada a la inmortalización de las células, la mediación de la oncogénesis, y mejora de la actividad de la telomerasa.

ETS2 y ELK4, un gen de la familia ETS homólogo a ETS2 en su región de unión al ADN, fueron transducidos usando vectores lentivirales en NHDF-P3. En una semana, los fibroblastos transducidos con vectores lentivirales que contenían ETS2 fueron sustituidos por células redondeadas pequeñas de altamente proliferativas. Estas células altamente proliferativas no se observaron en los controles transducidos con lentivirus vacío, o en los fibroblastos transducidos con vectores lentivirales que contenían ELK4 (Fig. 2-3).

Ejemplo 2

Sistema de transducción lentiviral

La figura 1 muestra un mapa esquemático de lentivirus con la inserción de ETS2 (SEC ID NO: 9): y secuencias de codificación de ADN de ELK4 (SEC ID NO 3). Obsérvese que sólo ETS2 tiene un dominio indicado. Estos plásmidos se utilizan para hacer que los lentivirus infecten NHDF. La secuencia de longitud completa ETS2 (SEC ID NO: 7) comprende una secuencia de codificación de ETS2 (SEC ID NO: 9) que codifica una secuencia de la proteína ETS2 (SEC ID NO: 8). La secuencia de longitud completa de ELK4 (SEC ID NO: 1) comprende una secuencia de codificación de ELK4 (SEC ID NO: 3) que codifica una secuencia de proteína (SEC ID NO: 2).

El vector vacío de lentivirus pWPI-EGFP fue un regalo del doctor D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Suiza). El ADNc para clonar los genes ETS2 y ELK4 humanos (ID de Clon 3852274 y 4364006) se obtuvieron de Open Biosystems, mientras que el ADNc Mesp1 fue un regalo del Dr. Y. Saga (Instituto Nacional de Genética, Mishima, Japón). La secuencia de consenso Kozak para la iniciación de la traducción de proteínas y el epítopo HA-tag se añadieron respectivamente a los extremos 5 ' y 3' de las secuencias de codificación ETS2, ELK4 y Mesp1 mediante clonación por PCR.

El embalaje e infección de lentivirus procedió de la siguiente manera: Las células 293 FT sembradas en placas de 6 cm fueron transfectadas con pWPI-eGFP, o pWPI-ELK4-eGFP (secuencia de codificación de ELK4 humana, SEC ID NO: 3), o pWPI-ETS2-eGFP (secuencia de codificación de ETS2 humana, SEC ID NO: 9), o pWPI-Mespl-eGFP (secuencia de MesP1 de ratón, SEC ID NO: 6), o SMPU-alphaMHC/puro-Rex1/Blast (regalo del Dr. M. Mercola, Instituto de Investigación Médica Burnham, La Jolla, CA). 4,5 ug de cualquier construcción se mezcló en una solución de 458 ul de medio de Eagle modificado por Dulbecco libre de suero (DMEM) y 27,5 ul de Fugene (Roche), 2,8 ug de vector de embalaje psPAX2 y 1,9 ug de vector envolvente pMD2.G durante 25 minutos a temperatura ambiente. Después la mezcla se añadió a células 293FT cultivadas en DMEM, libre de rojo fenol (Invitrogen) suplementado con FBS al 10% (inactivado por calor), aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM, piruvato de sodio 1 mM y L-glutamato 6 mM. Después de 24-26 horas de cultivo, se recogió el medio con partículas virales durante 3 días y se utilizó para la infección.

El medio recogido se utilizó para infectar NHDF cultivados en medio basal de fibroblastos (FBM, Lonza) hasta 80% de confluencia. Antes de la transfección, las células se volvieron a sembrar en placas de Petri de 6 cm a una densidad de2.5x106 células / placa, el medio se cambió a StemPro y se añadieron las partículas virales y polibreno (8 ug / ml de concentración final). Para aumentar la eficacia de la infección, se repitió el procedimiento dentro de las 48 horas. Todas las células se cultivaron a 37 °C y 5% de CO2.

Ejemplo 3

Expresión génica en células reprogramadas

Fig. La figura 2 muestra que los lentivirus ETS2 pero no los lentivirus ELK4 indujeron la aparición de células madre y la inducción de proteínas marcadoras de células madre, NANOG, OCT3/4 y Sox2 dentro de los 7 días de cultivo. El panel superior de la figura. 2 muestra NHDF (Lonza, EE.UU., cc-2509) cultivadas bajo FBM, suplementadas (suplementos proporcionados por Lonza) con hFGF-beta, insulina, gentamicina / anfotericina y FBS al 2%, a una confluencia de aproximadamente 80% antes de la infección viral. Los lentivirus pWPI-EGFP y pWIELK4-EGFP y pWPI-ETS2-EGFP vacíos se utilizaron para infectar NHDF-P3 en forma separada. Las células NHDF-P3 no infectadas e infectadas se cultivaron en medio pluripotente inducido humano StemPro hES SFM (Invitrogen) en placas de Petri recubiertas con colágeno durante 7 días. La proteína fluorescente verde clonada en los vectores lentivirales se expresó en las células infectadas, como lo revela la microscopía de fluorescencia verde. Durante este período de cultivo, se observaron cambios morfológicos en los que los NHDF infectados con ETS2 cambiaron su apariencia de formas fibroblásticas pleomórficas alargadas a "células similares a las células madre" redondeadas. En comparación, los NHDF infectados con vectores lentivirales ELK4 o vacíos no alteraron la forma celular.

El panel inferior de la figura. 2 muestra el análisis de PCR de transcripción inversa (RT-PCR), de células reprogramadas.

Las células se lavaron en PBS frío y el ARN se aisló con el Kit Qiagen RNeasy. El ARN se transcribió utilizando transcriptasa inversa MMLV (Invitrogen), y la amplificación por PCR (30 ciclos) se realizó para GAPDH, NANOG, OCT3/4, SOX2 (remitirse a la Tabla 1 para los conjuntos de cebadores) utilizando mezcla de polimerasa LA16. Esta mezcla de enzimas se preparó utilizando 15 ul de KlenTaq1 (25 unidades / ul, Ab Peptides, St Louis, MO) y 1 ul de Pfu (2,5 unidades / ul, Stratagene, La Jolla, CA). Las muestras de ADN amplificadas fueron entonces sometidas a electroforesis en un gel de agarosa al 2% y la tinción con bromuro de etidio reveló la expresión inducida de genes marcadores de células madre NANOG, Oct3/4 y Sox2 en células infectadas con ETS2 pero no en NHDF-P3 o células infectadas ya sea con ELK4 o lentivirus vacío.

Tabla 1. Cebadores para el estudio de progenitores cardíacos

Ejemplo 4

Proteínas marcadoras de células madre en células reprogramadas

5 La figura 3 muestra la tinción de inmunofluorescencia de NHDF-P3 infectados con el anticuerpo contra el marcador de células madre NANOG. La tinción inducida por NANOG se revela en las células infectadas con ETS2 pero no en las células infectadas con vector vacío o ELK4. Además, una transferencia de proteína usando anticuerpo específico de ETS2 reveló su expresión en células infectadas con lentivirus ETS2 pero no en NHDF infectados con lentivirus vacíos.

10 La Fig. 4 muestra colonias similares a células madre inducidas por lentivirus ETS2 y la inducción de las proteínas marcadoras de células madre NANOG, OCT3/4, SOX2, REX1 y c-MYC después de 4 semanas de cultivo. El panel superior izquierdo muestra que los NHDF infectados con el virus ETS2 convertidos en colonias de pequeñas células redondeadas recuerda mucho a células madre de embriones humanos y murinos. Obsérvese que las colonias fueron etiquetadas con GFP a través de la infección por lentivirus ETS2. Los fibroblastos no infectados no lograron

15 redondearse y no se tiñeron por GFP o no formaron colonias celulares.

El panel superior derecho de la figura 4 muestra la expresión de genes marcadores de células madre NANOG, OCT3/4, Sox2, REX1, KLF4 y c-myc en colonias celulares inducidas con ETS2 analizadas por RT-PCR. Debajo está la representación gráfica de RT-PCR cuantitativa para NANOG, OCT3/4, Sox2 y c-MYC en las células infectadas con ETS2.

20 Los paneles inferiores de la Fig. 4 confirman la presencia de proteínas NANOG y Oct3/4 en colonias celulares inducidas con ETS2 por tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos.

Ejemplo 5

Características de las células transducidas con ETS2

La Fig. 5 muestra que aproximadamente el 97% de las células madre embrionarias humanas H9 se mancharon por el marcador de superficie de células madre SSEA-3 (Panel A). Más del 60% de las células infectadas con ETS2 también mostraron marcador de superficie SSEA-3 (Panel C), en comparación con la tinción de menos del 2% de los NHDF infectados con lentivirus vacío (Panel B). Por lo tanto, ETS2 convirtió de manera eficiente los NHDF en células con marcador de superficie SSEA-3 semejando las células madre embrionarias humanas.

La citometría de flujo se realizó utilizando un analizador de BD Biosciences LSR II. Las células formadoras de colonias confluentes se disociaron por tripsina, se lavaron con PBS y se diluyeron hasta una concentración de 5x106 células/ml de PBS en 8 muestras (100 ul de cada una). A partir de entonces se utilizaron 10 ul de suero humano normal para el bloqueo durante 5 minutos. Los anticuerpos contra SSEA-3-PE (Becton Dickinson) se diluyeron y se añadieron de acuerdo a las especificaciones del fabricante, y se incubaron durante 1 hora a 4 °C. A continuación, se añadieron 400 ul de PBS y la mezcla se centrifugó y la mitad del sobrenadante se retiró y se añadieron 200 ul de PBS y se analizó por citometría de flujo.

La Fig. 6 muestra la citometría de flujo de células teñidas por el marcador de superficie de células madre Tra-1-81 realizado como para SSEA-3. Aproximadamente el 45% de las células madre embrionarias humanas H9 se tiñeron por Tra-1-81 (Panel A). No se detectó ninguna tinción de Tra-1-81 (Panel B) por NHDF infectados con lentivirus vacío (no lleva un gen heterólogo). La infección con el virus ETS2 dio lugar a aproximadamente 39% de células que mostraron marcador de células madre embrionarias Tra-1-81 (Panel C). Esto indica que ETS2 eficientemente convirtió los NHDF en células con el marcador de superficie Tra-1-81 semejando las células madre embrionarias humanas.

Las transcripciones de genes OCT3/4, NANOG y Sox2 se observaron sólo después de que NHDF-P3 fueron transducidos con el vector lentiviral que contenía ETS2 pero no después de la transducción con lentivirus vacío o vector que contenía ELK4. Las transcripciones de OCT3/4, NANOG y SOX2 se visualizaron (Fig. 2) y la inducción de NANOG se visualizó mediante inmunofluorescencia (Fig. 3).

La transducción lentiviral de células HNDF-P3 con ETS2 dio lugar a poblaciones enteras que mostraron expresión robusta de ETS2 durante 4 semanas visualizada mediante transferencias de proteína (Fig. 3). Estas células transducidas con ETS2 formaron grandes colonias fluorescentes verdes similares a aquellas de células madre (iPS) pluripotentes inducidas y/o ES pluripotentes.

La reprogramación de fibroblastos con ETS2 resultó en una fuerte expresión de los genes marcadores pluripotentes NANOG, OCT3/4, SOX2 y c-Myc medidos por RT-PCR y PCR cuantitativa e inmunotinción. Además, la citometría de flujo muestra que ETS2 convirtió de manera eficiente los NHDF en células con marcadores de superficie SSEA-3 y Tra1-81 semejando las células madre embrionarias humanas. Por lo tanto, estas células de fibroblastos humanos tratados con ETS2 se asemejan a las células iPS en su capacidad para expresar proteínas marcadoras de células madre pluripotentes. Por tanto, estas células fueron nombradas células "EPS".

Ejemplo 6

La combinación de ETS2 y Mesp1 induce el programa de progenitores cardiacos de novo en fibroblastos

A continuación, las células EPS se sometieron a transducción lentiviral con Mesp1 de ratón. Las células EPS resultantes que expresaban Mesp1 pudieron ser inducidas para formar cuerpos embrioides utilizando protocolos para la formación de cuerpos embrioides a partir de células ES. Los agregados celulares en placas fueron tratados además con activina y BMP4 durante 4 días y luego se examinaron a los 10 días. La expresión constitutiva de marcadores de células madre continuó incluso después de la transducción con Mesp1 y la adición de morfógenos del factor de crecimiento.

La inducción robusta de los factores progenitores cardiacos ISL1, NKX2.5, GATA4, MEF2C, TNT y MHC se observó por inmunotinción sólo en las células EPS infectadas con lentivirus que expresaban Mesp1. La figura 7 muestra células teñidas con DAPI para visualizar los núcleos (paneles de la izquierda), imágenes de contraste de fase (medio) y células teñidas con anticuerpos específicos para visualizar las proteínas indicadas (paneles de la derecha).

La figura 8 muestra que la infección con MesP1 de las células EPS induce el programa de progenitores cardiacos de novo en la célula que era originalmente NHDF. Las células progenitoras cardíacas posteriores a la agregación se colocaron en placas durante una semana y después fueron llevadas para el aislamiento de ARN. El ARN se transcribió utilizando transcriptasa inversa MMLV y la amplificación por PCR de 30 ciclos se realizó para GAPDH, NKX2.5, ISLI, GATA4, MEF2C, TBX5, MHC3, TNT, MLC2, CX43 y CX45 (remitirse a la Tabla 1 para los conjuntos de cebadores), utilizando la mezcla de polimerasas LA-16.

La Fig. 8 muestra que en EPS, las células crecieron durante 4 semanas, fueron agregadas y colocadas en placas por 7 días, no se observaron transcripciones de los marcadores del desarrollo del corazón temprano por RT-PCR. Del mismo modo, no se detectó expresión apreciable de los marcadores de desarrollo de corazón tempranos después de la infección de NHDF con Mesp1 solo. Sin embargo, la adición de Mesp1 a células EPS indujo la expresión robusta de marcadores progenitores mesodermos cardíacos incluyendo NKX2.5, ISLI, GATA4, MEF2C, TBX5, y la expresión de genes de proteínas cardiacas contráctiles incluyendo alfa MHC y troponina T.

La figura 9 muestra que la infección con MesP1de las células EPS indujo el programa de progenitores cardiacos de novo secuencial según lo determinado por RT-PCR. Las células NHDF-P3 fueron infectadas con lentivirus ETS2, se hicieron crecer durante 4 semanas, luego fueron infectadas con lentivirus Mesp1, fueron agregadas y colocadas en placa durante 7 días. Se aisló el ARN diariamente y se analizó por RT-PCR en cuanto a la expresión de genes cardiogénicos.

La Fig. 10 muestra que la infección con MesP1 de las células EPS indujo la expresión génica del programa cardiaco de novo, como se muestra por la aparición de la tinción de fluorescencia de color Rojo-Tomate a partir de la construcción indicadora NKX2.5-Rojo Tomate. El potenciador NKX2.5/Smad/GATA, que se activa en progenitores cardiacos, estaba relacionado con el promotor mínimo Hsp68 adyacente al gen de resistencia a puromicina y una secuencia IRES y el poderoso indicador td-tomate (ADNc fue un regalo del doctor R. Tsien, Universidad de California, San Diego). Como puede observarse más arriba, la tinción de GFP resultó de la infección con lentivirus ETS2 y Mesp1 de los NHDF. La fluorescencia de color rojo tomate es consistente con la conversión impulsada por ETS2 / Mesp1 a progenitores cardíacos por la inducción de la expresión génica de NKX2.5. Obsérvese el aspecto de muchas células triangulares y rectangulares que aparecen que son altamente similares en forma a los miocitos cardíacos.

Fig. 11, el Panel A muestra un resumen de la clasificación FACS de células progenitoras cardíacas obtenidas a partir de tratamiento secuencial de NHDF con lentivirus ETS2 y después de las resultantes células EPS con lentivirus Mesp1. La citometría de flujo se realizó utilizando un analizador de BD Biosciences LSR II. Las células formadoras de colonias confluentes se disociaron con tripsina, se lavaron con PBS y se diluyeron hasta una concentración de 5x106 células/ml de PBS en 8 muestras. El panel A muestra células teñidas con GFP que representan la infección con lentivirus total, ya que cada virus es etiquetado con GFP. El panel B muestra que aproximadamente el 19% de las células infectadas con ETS2 y Mesp1 estaban manchadas por GFP y Rojo-Tomate (área sombreada). Como lo demuestra la activación de un indicador cardiogénico clave NKX2.5 Rojo-Tomate, ETS2 y Mesp1 convierten eficientemente NHDF en células con características muy parecidas a los progenitores cardíacos.

La Fig. 12 muestra que aproximadamente el 10 a 40% de células NHDF infectadas con ETS2 y Mesp1 mostraron marcadores de superficie de células endoteliales y cardíacos, CD31, CD34 y CD144 después de 9 días en cultivo. Esta es una línea adicional de evidencia de que ETS2 y Mesp1 convierten de manera eficiente NHDF en células con características muy parecidas a los miocitos cardíacos y endoteliales embrionarios.

Ejemplo 7

Propiedades cardíacas de células reprogramadas

La transducción lentiviral de un sistema seleccionable de puromicina usando un promotor de cadena pesada de alfa-miosina específica cardíaca lentiviral (alfa-MHC) y potenciador unido al gen de resistencia a puromicina dio lugar a un enriquecimiento de las células progenitoras cardíacas y la posterior observación de un ritmo cardíaco de las células transducidas, similares a las observadas en los miocitos cardíacos.

Un promotor de cadena pesada de miosina que impulsa la construcción del gen seleccionable de puromicina se transdujo en NHDF que fueron luego secuencialmente transducidos con ETS2 y Mesp1. Los agregados celulares obtenidos durante la formación de cuerpos embrioides de caída de presión se trataron entonces con 50 ug/ml de puromicina para seleccionar células resistentes a la puromicina y por lo tanto con el promotor específico cardíaco activo alfa-MHC.

Después de 9 días se observó latido en cultivos celulares y se capturaron utilizando microscopía de vídeo y se convirtieron en vídeos MPEG. Se contó el latido por agregado cultivado por placa durante 20 segundos y luego se multiplicó por 3 para latidos por un minuto (Fig. 13). Se realizaron tres mediciones independientes por agregado en una placa de cultivo de tejido o pocillo.

La reprogramación de células EPS con Mesp1 resultó en una fuerte expresión de genes progenitores cardíacos según lo determinado por RT-PCR y la inmunotinción. Además, la citometría de flujo mostró que Mesp1 eficientemente convirtió las células EPS en células con marcadores de superficie CD31, CD34 y CD144 semejando células cardíacas humanas. Finalmente, el ritmo cardíaco se observó en los cultivos celulares. Esto completó la conversión de fibroblastos de piel a células cardiogénicas terminalmente diferenciadas.

REFERENCIAS CITADAS

DOCUMENTOS PATENTE ESTADOUNIDENSES

Publicación de patente Estadounidense No. 2009/0227032 para S.Yamanaka.

REFERENCIAS NO PATENTES

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LISTADO DE SECUENCIAS

10 5

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un procedimiento de preparación de una célula progenitora cardiaca inducida, comprendiendo el procedimiento la suministro de un factor de reprogramación que comprende dos genes heterólogos a una célula somática,

   caracterizado porque los genes heterólogos son ETS2 y Mesp1.

2. 2.

   Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la célula somática es una célula normal de fibroblastos dérmicos humanos.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el gen ETS2 comprende la secuencia de codificación de ETS2 (SEC ID NO: 9), el gen ETS2 (SEC ID NO: 7) o codifica la secuencia de proteínas ETS2 humanas (SEC ID NO: 8)

4. 4.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el gen Mesp1 comprende la secuencia de codificación Mesp1 de ratón (SEC ID NO: 6), el gen Mesp1 de ratón (SEC ID NO: 4) o codifica la secuencia de proteínas Mesp1 de ratón (SEC ID NO: 5)

5. 5.

   El procedimiento según lo reivindicado en cualquier reivindicación precedente en el que el factor de programación es suministrado a la célula utilizando un vector recombinante.

6. 6.

   Un procedimiento según lo reivindicado en la reivindicación 5, en el que el factor de programación es suministrado a la célula utilizando el sistema de transducción lentiviral.