KR101723144B1 - 줄기 세포의 생성 및 유지 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ALK5 억제제의 존재하에서 세포를 배양함으로써 만능성 세포를 생성 및 유지시키는 것을 제공한다.

Description

줄기 세포의 생성 및 유지{GENERATION AND MAINTENANCE OF STEM CELLS}
1981년 이래 배아 줄기 세포(ESC: embryonic stem cell)가 마우스로부터 확립되어 왔지만, 그의 대응물을, 래트를 비롯한 각종의 다른 포유동물로부터 얻고자 했던 시도는 성공을 거두지 못했다. 최근, 마우스 및 래트의 착상 후 난원통 단계의 배반엽상층으로부터 유래된 만능성 줄기 세포를 얻었다(문헌 ([Brons et al., Nature 448, 191-195 (2007)]; [Tesar et al., Nature 448, 196-199 (2007)])). 이러한 신규의 줄기 세포를 배반엽상층 줄기 세포(EpiSC: Epiblast stem cell)로 명명하였다. EpiSC는 콜로니 형태와, 만능성을 유지하는 데 필요한 배양/신호 전달 조건에 있어서 인간 배아 줄기 세포(hESC: human embryonic stem cell)와 유사성이 높게 일치하는 것처럼 보이지만, 마우스 ES 세포(mESC: mouse ES cell)와는 표현형 및 신호 전달 반응에서 매우 다양하게 상당한 차이를 보인다.
백혈병 억제 인자(LIF: leukemia inhibitory factor)는 JAK-STAT3 경로를 통해 혈청의 존재하에서 mESC의 만능성을 유지시키는 데 필수적이다(문헌 [Niwa et al., Genes Dev 12, 2048-2060 (1998)]). 그러나, 무혈청 배지 중에서는 분화(Id) 단백질 발현의 억제제를 유도함으로써(문헌 [Ying et al., Cell 115, 281-292 (2003)]) 및 ERK 활성화를 억제시킴으로써(문헌 [Qi et al., Proc Natl Acad Sci . USA 101, 6027-6032 (2005)]) mESC 자가 재생을 유지시키기 위해서는 LIF와 함께 BMP4도 또한 요구된다. mESC와는 대조적으로, LIF는 EpiSC/hESC를 지지할 수 없으며, 상기 줄기 세포들은 전형적으로 장기간의 자가 재생을 위해 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF: basic fibroblast growth factor)/액티빈 A를 필요로 한다. 미분화 hESC는 bFGF 신호 전달을 통해 ERK의 고수준의 기초 활성을 나타낸다(문헌 [Dvorak et al., Stem Cells 23, 1200-1211 (2005)]). BMP4 역시 EpiSC/hESC 자가 재생을 지지하지는 않지만, 대신 EpiSC/hESC가 영양막 또는 원시 내배엽으로 분화되도록 유도한다(문헌 ([Brons et al., Nature 448, 191-195 (2007)]; [Tesar et al., Nature 448, 196-199 (2007)]; [Xu et al., Nat Biotechnol 20, 1261-1264 (2002)])). bFGF 이외에도, 액티빈 A/Nodal 신호 전달이 hESC/EpiSC의 미분화 상태를 지지하는 것으로 밝혀진 바 있으며(문헌 ([Brons et al., Nature 448, 191-195 (2007)]; [Sato et al., Dev Biol 260, 404-413 (2003)]; [Tesar et al., Nature 448, 196-199 (2007)])), mESC에는 없어도 된다. 이러한 결과는 EpiSC와 hESC가 본질적으로 유사하다는 개념을 강력하게 지지하며, mESC 및 EpiSC/hESC가 각각 착상 전 내세포괴(ICM: inner cell mass)를 나타내는 mESC 유사 상태 및 후기 배반엽상층 세포를 나타내는 EpiSC 유사 상태라는 2가지 다른 만능 상태를 나타낸다는 흥미로운 가설을 제기한다.
mESC는 보통 영양세포층 기반 세포 배양 조건을 사용하여 특정 마우스 균주로부터 유래될 수 있다(문헌 [Martin, G. R., Proc Natl Acad Sci USA 78, 7634-7638 (1981)]). 그러나, 유사한 조건하에서 래트로부터 유래되는 진정 ES 세포를 수득하기는 어려운 것으로 입증된 바 있다. 래트 ESC 유사 세포의 확립이 보고된 바 있지만(문헌 ([Demers et al., Cloning Stem Cells 9, 512-522 (2007)]; [Ruhnke et al., Stem Cells 21, 428-436 (2003)]; [Schulze et al., Methods Mol. Biol 329, 45-58 (2006)]; [Ueda et al., PLoS ONE 3, e2800 (2008)])), 이러한 세포는 안정적으로 유지될 수 없거나, 또는 실제로 생체내 만능성이 부족하다(예컨대, 기형종을 형성하지 못하거나, 키메라 현상에 전혀/거의 기여하지 않는다). 유사하게, (시험관내) 만능 래트 EpiSC가 유래되었더라도, 래트 및 마우스 EpiSC 둘 모두 착상 전 배아로 재도입될 수 있으며 키메라에 기여할 수 있는 능력은 거의 또는 전혀 없는 것으로 보인다(문헌 [Brons et al., Nature 448, 191-195 (2007)]; [Tesar et al., Nature 448, 196-199 (2007)])).
최근, 정의된 유전적 형질도입에 의해 마우스 및 인간 체세포, 둘 모두로부터 생성된 유도 만능성 줄기 세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)가 많은 관심을 불러 일으키고 있다(문헌 ([Dimos et al., Science 321, 1218-1221 (2008)]; [Han, J., and Sidhu, K. S Curr Stem Cell Res Ther 3, 66-74 (2008)]; [Takahashi et al., Cell 131, 861-872 (2007)]; [Takahashi, K., and Yamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006)]; [Yu et al., Science 318, 1917-1920 (2007)])).
본 발명의 간단한 요약
본 발명은 적어도 1번의 세포 분열을 거쳐 만능성 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 세포 만능성을 유지시키면서 적어도 1번의 세포 분열이 일어날 수 있도록 하는 데 충분한 시간 동안 충분한 양의:
a. ALK5 억제제(또는 다른 TGFβ/액티빈 경로 억제제), 및
b. MEK 억제제, Erk 억제제, p38 억제제, 및 FGF 수용체 억제제 중 하나 이상으로부터 선택되는 제2 화합물; 및
c. 충분한 영양소
의 존재하에서 만능성 동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 배양 단계는 추가로 일정량의 GSK3β 억제제의 존재하에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, GSK3β 억제제는 CHIR99021이다.
일부 실시양태에서, 제2 화합물이 MEK 억제제이다. 일부 실시양태에서, MEK 억제제가 PD0325901이다.
일부 실시양태에서, 제2 화합물이 Erk 억제제이다.
일부 실시양태에서, 배양 단계는 백혈병 억제 인자(LIF)의 추가 존재하에서 수행된다.
일부 실시양태에서, ALK5 억제제는 A-83-01이다. 일부 실시양태에서, ALK5 억제제는 SB431542이다.
일부 실시양태에서, 세포 만능성을 유지시키면서 적어도 5번의 세포 분열을 거쳐 만능성 세포를 배양한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 추가로 이종성 핵산을 만능성 세포 내로 도입하는 단계, 및 세포 만능성을 유지시키면서 적어도 1회에 걸쳐 추가의 세포 분열을 할 수 있도록 생성된 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산을 동물 세포 내로 도입한 후, 만능성을 유도하고, 이어서, 배양 단계에 사용한다.
일부 실시양태에서, 세포가 래트 또는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포가 영장류, 양, 소, 고양이, 개 또는 돼지 세포이다.
일부 실시양태에서, 만능성 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 만능성 세포는 유도 만능성 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포가 비인간 동물 세포이고, 본 방법은 추가로 만능성 세포를, 상기 세포와 동일한 종의 동물로부터 유래된 포배로 도입하는 단계, 및 배반포를 동일한 종의 동물의 자궁 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 만능성 세포로부터의 핵산의 존재 여부에 기초하여 상기 동물의 키메라 자손을 선별하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 만능성 포유동물 세포의 배양물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 배양물은 세포 만능성을 유지시키면서 적어도 1번의 세포 분열이 일어날 수 있도록 하는 데 충분한 양의:
a. ALK5 억제제(또는 다른 TGFβ/액티빈 경로 억제제), 및
b. MEK 억제제, Erk 억제제, p38 억제제, 및 FGF 수용체 억제제 중 하나 이상으로부터 선택되는 제2 화합물
을 포함한다.
일부 실시양태에서, 배양물은 추가로 LIF를 포함한다.
일부 실시양태에서, 배양물은 추가로 일정량의 GSK3β 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, GSK3β 억제제는 CHIR99021이다.
일부 실시양태에서, 제2 화합물이 MEK 억제제이다. 일부 실시양태에서, MEK 억제제가 PD0325901이다.
일부 실시양태에서, 제2 화합물이 Erk 억제제이다. 일부 실시양태에서, ALK5 억제제는 A-83-01이다. 일부 실시양태에서, ALK5 억제제는 SB431542이다.
일부 실시양태에서, 세포가 래트 또는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포가 영장류, 양, 소, 고양이, 개 또는 돼지 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포가 유도 만능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포이다.
본 발명은 또한 세포 배양 배지를 제공한다. 일부 실시양태에서, 배지는 만능성 세포를 배지 중에서 배양할 때 세포 만능성을 유지시키면서 적어도 1번의 세포 분열이 일어날 수 있도록 하는 데 충분한 양의:
a. ALK5 억제제(또는 다른 TGFβ/액티빈 경로 억제제), 및
b. MEK 억제제, Erk 억제제, p38 억제제, 및 FGF 수용체 억제제 중 하나 이상으로부터 선택되는 제2 화합물
을 포함한다.
일부 실시양태에서, 배지는 추가로 LIF를 포함한다.
일부 실시양태에서, 배지는 추가로 일정량의 GSK3β 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, GSK3β 억제제는 CHIR99021이다.
일부 실시양태에서, 제2 화합물이 MEK 억제제이다. 일부 실시양태에서, MEK 억제제가 PD0325901이다.
일부 실시양태에서, 제2 화합물이 Erk 억제제이다. 일부 실시양태에서, ALK5 억제제는 A-83-01이다. 일부 실시양태에서, ALK5 억제제는 SB431542이다.
일부 실시양태에서, 배지는 미리 포장된 밀봉 용기 안에 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 DMEM 또는 인간, 래트, 마우스 또는 다른 동물 세포의 성장에 적합성을 띠는 다른 배지를 포함한다.
본 발명은 또한 백혈병 억제 인자(LIF) 및 골 형성 단백질(BMP: bone morphogenic protein)의 존재하에서, 또는 TGFβ 및 액티빈 신호전달 경로의 억제, MAPK 신호전달 경로의 억제, 및 임의로 FGF 경로의 억제하에서 복제가능하고, 만능성을 유지하는 단리된 만능성 동물 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 만능성 동물 세포는 뮤린 배아 줄기 세포(mESC: murine embryonic stem cell)가 아니다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 배아 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 iPS 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 래트 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 래트 배아 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포가 래트 iPS 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 ALK5 및 MEK의 억제하에서 만능성을 유지한다. 일부 실시양태에서, 세포는 선별가능한 또는 검출가능한 마커(예컨대, 알칼리성 포스파타제)를 코딩하는 발현 카세트를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이종성 발현 카세트를 포함한다 .
본 발명의 단리된 만능성 세포는 종래의 방식으로 배양된 hESC, 배반엽상층 줄기 세포 및 인간 유도 만능성 세포와 비교하였을 때 더 높은 수준으로 E 카드헤린을 발현한다. 예를 들어, 단리된 만능성 동물 세포는 종래의 방식으로 배양된 hESC, EpiSC 및 인간 유도 만능성 세포와 비교하였을 때 2배 더 높은 수준으로 E 카드헤린을 발현한다. 일부 실시양태에서, 단리된 만능성 동물 세포는 종래의 방식으로 배양된 hESC, 배반엽상층 줄기 세포 및 인간 유도 만능성 세포와 비교하였을 때 더 높은 수준으로 마커를 발현하는데, 여기서, 마커는 Gbx2, Dppa3, Klf4, 및 Rex1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 만능성 세포를 ALK5 억제제, MEK 억제제, Erk 억제제, p38 억제제, 및 FGF 수용체 억제제로부터 선택되는 제2 화합물의 존재하에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 세포를 ALK5 억제제, MEK 억제제, Erk 억제제, p38 억제제, 및 FGF 수용체 억제제로부터 선택되는 제2 화합물의 존재하에서 배양함으로써 본 발명의 단리된 만능성 세포를 수득하거나, 수득할 수 있다. 예를 들어, 종래의 방식으로 배양된 hESC, EpiSC, 래트 ESC, 또는 영장류 ESC를 배양함으로써 본 발명의 단리된 만능성 세포를 수득하거나, 수득할 수 있다.
본 발명은 또한 부분적으로 만능인 포유동물 세포의 만능성을 보다 전체적으로 만능성인 세포로 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 (a) 부분적으로 만능성인 세포를, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 히스톤 H3K4 탈메틸화의 억제제, 또는 H3K4 메틸화의 활성제로부터 선택되는 후생유전적 개질제와 접촉시키는 단계;
(b) 단계 (a) 수행 후, 세포를 (i) ALK5 억제제, (ii) MEK 억제제, Erk 억제제, 또는 p38 억제제, 및 (iii) FGF 수용체 억제제 중 2개 이상과 함께, 후생유전적 개질제의 부재하에서 배양함으로써 부분적으로 만능인 포유동물 세포와 비교하였을 때 보다 전체적으로 만능성인 세포를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 추가로 (c) 단계 (b) 수행 후, 부분적으로 만능인 포유동물 세포를 (i) ALK5 억제제, (ii) MEK 억제제, Erk 억제제, 또는 p38 억제제, 및 (iii) FGF 수용체 억제제 및 (iv) GSK3 억제제와 함께 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 배양 단계 (a) 및/또는 (b) 및/또는 (c)는 부분적으로 만능인 포유동물 세포를 추가로 백혈병 억제 인자(LIF)의 존재하에서 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 부분적으로 만능성인 세포는 배반엽상층 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 부분적으로 만능성인 세포는 Oct4, 나노그(Nanog), SSEA1, 및 REX1로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커를 발현하지 못하며, 보다 전체적으로 만능성인 세포는 상기 마커 중 하나 이상 또는 그들 모두를 발현한다.
일부 실시양태에서, 부분적으로 만능성인 세포는 ALP 1을 발현하지 못하지만, 보다 전체적으로 만능성인 세포는 ALP 1을 발현한다.
일부 실시양태에서, 후생유전적 개질제는 발프로산 또는 파네이트이다.
도 1. mESC 유사 riPSC는 레트로바이러스에 의한 Oct4, Sox2, 및 Klf4 형질도입 후, 래트 WB-F344 세포로부터 생성될 수 있으며, LIF, 0.5 μM PD0325901, 0.5 μM A-83-01 및 3 μM CHIR99021의 조합하에 포획/유지될 수 있었다. 형질도입 후 10일째 ESC 유사 콜로니가 관찰되었지만(A), 종래의 mESC 배양 조건하에서는 유지되지 못했다(B). 0.5 μM PD0325901 및 3 μM CHIR99021의 존재하에서, riPSC는 배양물 중에서 단기간 동안은 유지될 수 있었지만, 광범위하게 자발적인 분화를 나타내었다(C). 0.5 μM PD0325901, 3 μM CHIR99021 및 0.5 μM A-83-01의 조합물을 사용한 경우, riPSC는 장기간 동안 동종으로 자가 재생을 할 수 있었고(D), 배양물 중에서 mESC 유사 반구형 콜로니를 형성하였다(E). 면역세포화학법을 통해 riPSC는 전형적인 mESC 마커, 예컨대, Oct4(F), Sox2(G), SSEA1(H, 녹색), 및 나노그(H 적색)를 발현시키는 것으로 밝혀졌다. 4개의 클로날 riPSC 세포주에 대해 RT-PCR 분석을 수행함으로써 내인성의 전형적인 만능성 마커가 발현되었지만(I), 바이러스를 통해 형질도입된 유전자는 대체로 침묵화되었다는 것을 확인하였다. riPSC 클론의 Oct4 프로모터는 탈메틸화 패턴을 나타내었고, 이는 모체 WB-F344 세포의 것과는 달랐다(J).
도 2. riPSC는 시험관내 및 생체내에서 만능 발생능을 가졌다. 시험관내에서 riPSC가 내배엽(알부민 및 Pdx1)(A 및 B), 신경외배엽(βIII 튜불린, Tuj1)(C) 및 중배엽(브라큐리(Brachyury))(D) 유도체로 분화될 수 있다는 것이 면역염색법을 통해 나타났다. 또한, riPSC는 SCID 마우스에서 3개의 배엽층 모두로 구성된 기형종을 형성하였다(E~H). 추가로, 브라운 노르웨이(Brown-Norway) 래트 배반포로 주사된 후, WB-F344 배경을 가진 riPSC는 키메라 래트를 생산할 수 있었다. 상대적인 확대 배율: A-E (100x), F~H 및 J~Q(200x).
도 3. 신규한 "mESC 유사" hiPSC의 생성. 렌티바이러스에 의해 Oct4, Sox2, 나노그, 및 Lin28을 IMR90 인간 섬유아세포에 형질도입시켰다. 형질도입 후 3주째 hiPSC 콜로니가 관찰되었고(A), 형질도입 후 4주째 이를 채취하였고, hLIF, 0.5 μM PD0325901, 0.5 μM A-83-01, 및 3 μM CHIR99021로 이루어진 칵테일하에서 안정적으로 유지시켰다. 상기 hiPSC는 mESC와 유사한 반구형 콜로니를 형성하였다(B). 상기 조건하에서, hiPSC는 ALP(C) 및 다른 전형적인 만능성 마커(D~I)에 대하여 양성을 띠었다. 4개의 클로날 hiPSC 세포주에 대해 RT-PCR 분석을 수행함으로써 내인성인 만능성 유전자가 발현되었지만(J), 바이러스를 통해 형질도입된 유전자는 대체로 침묵화되었다는 것을 확인하였다. hiPSC 클론의 Oct4 프로모터는 종래의 방식으로 배양된 인간 ES 세포와 유사한 탈메틸화 패턴을 나타내었지만, 이는 모체 IMR90 섬유아세포의 것과는 달랐다(K). hiPSC의 핵형을 분석한 것을 제공한다(L).
도 4. hiPSC가 시험관내에서 내배엽(알부민)(A), 신경외배엽(βIII-튜불린, Tuj1)(B) 및 중배엽(브라큐리)(C) 유도체로 효과적으로 분화될 수 있다는 것이 면역염색법을 통해 밝혀졌다. hiPSC는 SCID 마우스 내로 이식된 후, 신경상피 유사 구조(외배엽)(D), 관 유사 구조(내배엽)(D), 연골 유사 구조(중배엽)(E)를 비롯한 3개의 배엽층 모두로 구성된 기형종을 형성하였다. 상대적인 확대 배율: A(100x), B~E(200x).
도 5. 상이한 소형 분자의 조합이 배양물 중 riPSC의 만능성을 유지시키는 데 미치는 효과. riPSC를 트립신으로 처리하며 단일 세포로 만들고, 웰당 103개 세포인 밀도로 6개의 웰 플레이트내 시딩하고, 상이한 억제제 조합물로 처리하였다. 5일 경과 후, riPSC 콜로니를 시각화하기 위해 ALP 염색법을 수행하였다(A). 10개의 무작위 40 x 시야로부터 각 조건에 대한 ALP 양성 콜로니를 계수하고, 상대적인 콜로니 개수를 B에 요약해 놓았다.
도 6. EpiSC는 mESC 성장 조건에서는 분화되었지만, ICM/mESC 유사 상태로는 쉽게 전환되지 못했다. (A) 뮤린 ESC R1은 LIF로 보충된 종래의 mESC 성장 배지 중에서 조밀한 반구형 콜로니로 성장하였고, 콜로니는 양성 ALP 활성을 나타내었다(좌측 상단). EpiSC는 bFGF로 보충된 종래의 hESC 배양 배지 중에서 큰 편평한 콜로니로 성장하였고, 콜로니는 음성 ALP 활성을 나타내었다(우측 상단). EpiSC는 LIF로 보충된 종래의 mESC 성장 배지에서 분화되었고(좌측 하단); EpiSC는 LIF 및 0.5 μM MEK 억제제 PD0325901, 0.1 μM FGFR 억제제 PD173074 및 3 μM GSK3 억제제 CHIR99021(m/MFGi)로 보충된 종래의 mESC 성장 배지에서 분화되었다(우측 하단). (B) 전환된 세포 생성을 위한 개략도. EpiSC를 트립신으로 처리하며 단일 세포로 만들고, 명시된 화학적 화합물이 보충된, mESC 자가 재생 조건하에 약 4일 동안 피더 세포상에 플레이팅하여 전환을 유도한 후, 추가로 4일이 경과한 후, 선별하였다. 이어서, 배양물을 다시 플레이팅하고, 추가로 선별하고, 추가로 2주 동안 확장시켰는데, 상기 시간 동안 안정한 클론을 채취하였다. (C) 선택적 ALK4/5/7 억제제 A-83-01(0.5 μM)에 의한 TGFβ 신호 전달 억제는 EpiSC가, ALP를 발현하는 보다 조밀한 반구형 콜로니를 형성하도록 유도하였다. (D) 이들 콜로니를 LIF 및 0.5 μM A-83-01, 0.5 μM PD0325901, 0.1 μM PD173074 및 3 μM CHIR99021(mAMFGi)로 보충된 mESC 성장 배지 중에서 추가로 안정하게 확장시킬 수 있었다. (E) LSD 억제제 파네이트는 EpiSC가, ALP를 발현하는 보다 조밀한 반구형 콜로니를 형성하도록 유도하였다. 이들 콜로니를 mMFGi, 또는 (F) mAMFGi 조건에서 추가로 안정하게 확장시킬 수 있었다. mESC 유사 반구형 콜로니 및 양성 ALP 활성에 주목한다. 스케일바, 50 ㎛.
도 7. 파네이트 및 ALK4/5/7, MEK, FGFR 및 GSK3의 억제제로 처리하면 EpiSC는 ICM/mESC 유사 상태로 전환된다. (A) 3가지 유형의 화합물로 처리된 세포로부터 키메라 현상이 일어나는 생성율. (B) 응집된 배아가 상상 임신한 마우스 내로 이식된 후, 파네이트/mAMFGi 조건에 의해 EpiSC로부터 전환된 안정한 mESC 유사 세포는 성체 마우스에서의 키메라 현상에 기여하였다. 아고티(Agouti) 외피 색상은 파네이트/mAMFGi 세포로부터 기원하였다. (C) 다중 성체 조직 중 GFP 통합의 존재 여부에 관한 PCR 유전자형 분석. (D) GFP로 표지된 파네이트/mAMFGi 세포로부터의 기여에 대하여 E13.5 배아를 형광에 의해 조사하고, 배아의 다중 조직에서 GFP 양성 세포를 관찰하였다(보다 고배율의 사진이 도 10A에 제시되어 있다). (E) FACS에 의해 생식샘에서 GFP/SSEA1 이중 양성인 세포를 단리시키고, 실시간 PCR에 의해 생식선 마커에 관하여 조사하였다. 그 결과, 파네이트/mAMFGi 세포가 기여한 생식선 계통에서 생식선 마커인 블림프(Blimp) 1 및 스텔라(Stella)의 특이적인 발현이 입증되었다. 바:±STDV.
도 8. 전환된 파네이트/mAMFGi 세포의 분자 특징 규명. (A) 면역세포화학법을 통해 파네이트/mAMFGi 세포에서의 만능성 마커인 Oct4(녹색), 나노그(적색), 및 SSEA1(적색)의 동종 발현이 나타났다. (B) 반정량적 RT-PCR에 의해 mESC, EpiSC, 및 파네이트/mAMFGi 세포에서 특이적인 ICM 마커 유전자(REX1, Pecam1, Dax 1, Dppa5, Esrrb, Fgf4, 및 Fbxo15), 생식선 적격 관련 마커 유전자(스텔라 및 Stra8), 및 배반엽상층 유전자(fgf5)의 발현을 분석하였다. 대조군으로서 GADPH를 사용하였다. (C) 파네이트/mAMFGi 세포가 EpiSC보다는 mESC와 더욱더 유사하다는 것이 mESC, EpiSC, 및 파네이트/mAMFGi 세포의 전사체 분석을 통해 밝혀졌다. 3가지 세포 유형 모두에 대하여 2개의 생물학상 부본을 사용하였다. (D) 중아황산염 게놈 서열분석에 의한 스텔라 및 Fgf4 프로모터의 메틸화 분석. 흰색 원(○)및 검은색 원(●) 기호는 각각 메틸화되지 않은 CpG 및 메틸화된 CpG를 나타낸다. (E) 각종 세포에서 스텔라 유전자좌에서의 명시된 히스톤 변형에 관한 ChIP-Q PCR 분석. 피더없이 배양된 EpiSC, R1 mESC, 및 파네이트/mAMFGi 세포로부터의 게놈 DNA를 명시된 항체를 사용하여 면역침전시킨 후, 스텔라를 코딩하는 내인성 게놈 유전자좌에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 Q-PCR 분석을 수행하였다. 히스톤 변형 수준을 입력율(%)로서 나타내었다. IgG가 비항체 대조군으로서 작용하였다.
도 9. 전환된 파네이트/mAMFGi 세포의 기능적 특징 규명. (A) 파네이트/mAMFGi 세포는 mESC와 유사한 성장율을 가졌다. R1 mESC 및 파네이트/mAMFGi 세포를 매 3일마다 계대접종하고, 매 24 hr마다 세포 개수를 계수하였다. (B) 파네이트/mAMFGi 세포는 시험관내에서 특징적인 신경 세포(βIII-튜불린 및 MAP2ab 양성), 심근 세포(심장 트로포닌 및 MHC 양성), 및 내배엽 세포(Sox 17 또는 알부민 양성)를 비롯한, 3개의 배엽층 중의 세포로 효과적으로 분화될 수 있다. 핵을 DAPI로 염색하였다. (D) BMP4는 EpiSC, mESC, 및 파네이트/mAMFGi 세포에서 중배엽 마커(브라큐리), 영양막 마커(Cdx2), 및 원시 내배엽 마커(Gata6) 발현의 유도에 대하여 차별적인 효과를 가졌다. (E) 단일층 및 화학적으로 규명된 조건하에서의 지정된 단계별 심근세포 분화를 통해, 파네이트/mAMFGi 세포가 R1 mESC와 유사한 분화 반응을 공유하나, EpiSC와는 상이하다는 것이 입증되었다. CT3 염색법 및 박동 표현형을 사용하여 세포의 특징을 규명하였다.
도 10. 파네이트/mAMFGi 세포는 키메라 마우스에 효율적으로 기여하였다. (A) 키메라 배아로부터의 조직. 파네이트/mAMFGi 세포가 기여한 GFP 양성 세포가 생식샘, 뇌, 심장, 장, 폐, 및 신장에서 관찰되었다. (B) 키메라 성체 마우스의 GFP 유전자형 분석. 5마리의 마우스를 무작위로 선별하여, 5개의 상이한 조직, 즉, 심장, 폐, 간, 뇌, 및 비장에서의 GFP 통합에 대하여 게놈 PCR에 의해 분석하였다. 2마리의 성체 마우스에서는 5개의 조직 모두에서, 3마리의 마우스에서는 4개의 조직에서 GFP 통합에 관해 양성으로 검출되었는데, 이를 통해 파네이트/mAMFGi 세포가 생체내에서 3개의 배엽층(중배엽, 내배엽 및 외배엽)에 기여할 수 있다는 것을 확인하였다.
도 11. 피더 세포가 있는 배양 조건 또는 피더가 없는 배양 조건하에 전환된 파네이트/mAMFGi 세포에서 만능성 마커의 동종 발현. (A) 파네이트/mAMFGi 세포를 GFP로 표지하고, 피더 상에서 증식시켰다. 면역염색 결과, GFP 및 만능성 마커 Oct4(적색), 나노그(적색), 및 SSEA1(적색)의 동종 발현이 나타났다. (B) 미분화된 Oct4-양성 콜로니는 단일 OG2-ES 세포로부터인 것 만큼 효율적으로 단일 파네이트/mAMFGi 세포로부터 발생하였다. 피더가 없는 N2B27-화학적으로 규명된 조건에서 단일 세포를 시딩한 후 수회에 걸친 계대접종을 위해 콜로니를 확장시켰다. 스케일바, 50 ㎛. (C) LIF의 부재하에서 파네이트/mAMFGi 세포는 분화되었고, Oct4 발현을 상실하였다. 파네이트/mAMFGi 세포를 피더가 없는 N2B27-화학적으로 규명된 조건에서 단일 세포를 시딩한 후 확장시켰다; 성장 인자 보충물은 명시되어 있다.
도 12. EpiSC를 제외한, 전환된 파네이트/mAMFGi 세포 및 R1 mESC 세포에서 스텔라의 발현이 검출되었다. 면역염색 결과, STELLA, 및 DAPI이 발현된 것으로 나타났다.
정의
"만능" 또는 "만능성"이라는 용어는 적절한 조건하에서 3개의 배아층(내배엽, 중배엽, 및 외배엽) 모두로부터의 세포 계통과 관련된 특징들을 총괄적으로 나타내는 세포 유형으로 분화될 수 있는 자손을 발생시킬 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 만능성 줄기 세포는 출생전, 출생후 또는 성체 동물의 조직 다수 또는 모든 조직에 기여할 수 있다. 예컨대, 8-12주령된 SCID 마우스에서 기형종을 형성할 수 있는 능력에 관한 테스트와 같은, 당업계에서 허용되는 표준 테스트가 세포 군집의 만능성을 확립시키기는 데 사용될 수 있지만, 만능성 세포를 검출하는 데 각종의 만능성 줄기 세포 특징들을 확인하는 것도 사용될 수 있다. 세포 만능성은 배아의 모든 세포를 적절히 형성할 수 있는 완전하게 만능성인 세포, 예컨대, 배아 줄기 세포 및 iPSC에서부터, 3개의 배아층 모두의 세포를 형성할 수 있지만, 예를 들어, 생식선 전달 또는 전체 유기체를 생성할 수 있는 능력과 같은, 완전하게 만능성인 세포의 특징들 모두를 나타낼 수는 없는, 불완전하게 또는 부분적으로 만능성인 세포까지의 범위에 이르는 연속체이다. 특성 실시양태에서, 세포의 만능성은 불완전하게 또는 부분적으로 만능성인 세포로부터 보다 만능성인 세포로, 또는 특성 실시양태에서, 완전하게 만능성인 세포로 증가한다. 만능성은 예를 들어, 기형종 형성, 생식선 전달, 및 4배수체 배아 상보에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원 어디에서나 논의되는 바와 같은 만능성 유전자 또는 만능성 마커의 발현은 세포의 만능성을 평가하는 데 사용될 수 있다.
"만능성 줄기 세포의 특징"이란 만능성 줄기 세포를 다른 세포와 구별지어 주는 세포의 특징을 의미한다. 적절한 조건하에서 3개의 배아층(내배엽, 중배엽, 및 외배엽) 모두로부터의 세포 계통과 관련된 특징들을 총괄적으로 나타내는 세포 유형으로 분화될 수 있는 자손을 발생시킬 수 있는 능력이 만능성 줄기 세포의 특징이 된다. 분자 마커의 특정 조합물의 발현 또는 비발현 또한 만능성 줄기 세포의 특징이 된다. 예를 들어, 인간 만능성 줄기 세포는 하기의 비제한적인 리스트: SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E 카드헤린, UTF-1, Oct4, Rex1, 및 나노그로부터의 마커들 중 적어도 일부, 및 임의로는 그들 모두를 발현한다. 만능성 줄기 세포와 관련된 세포 형태 또한 만능성 줄기 세포의 특징이 된다.
"라이브러리"라는 용어는 당업계에서 그의 통상 용법에 따라 개별 구성원이 확인될 수 있는 방식으로 임의로 조직화 및/또는 분류된 분자 집단을 의미하기 위해 사용된다. 라이브러리는 조합 화합물 라이브러리, 천연물 라이브러리 및 펩티드 라이브러리를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
"재조합" 폴리뉴클레오티드는 그 본래 상태가 아닌 폴리뉴클레오티드이고, 예컨대, 폴리뉴클레오티드는 자연에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 폴리뉴클레오티드는 문맥상 자연에서 발견되지 않는, 예를 들면 전형적으로 자연에서 근접한 뉴클레오티드 서열로부터 분리된 것, 또는 전형적으로 근접하지 않은 인접한(또는 이웃한) 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들면, 해당 서열은 벡터로 클로닝될 수 있거나, 그렇지 않으면 하나 이상의 추가 핵산과 재조합될 수 있다.
"발현 카세트"는 프로모터 또는 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 다른 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"프로모터" 및 "발현 제어 서열"이라는 용어는 본원에서 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열의 어레이를 의미하기 위해 사용된다. 본원에서 사용되는 바, 프로모터는 전사 개시 부위에 가까운 위치에 필수적인 핵산 서열을 포함하며, 예를 들면, 폴리머라제 II형 프로모터의 경우, TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 또한 임의로 원위부에 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함하며, 이는 전사 개시 부위로부터 수천 개의 염기쌍 만큼 떨어진 곳에 위치할 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 및 발생 조건하에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 발생 조절하에 활성인 프로모터이다. "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 핵산 발현 제어 서열(예컨대, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하며, 여기서, 상기 발현 제어 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본원에서 사용되는 바, "이종성 서열" 또는 "이종성 핵산"은 특정 숙주 세포에 외래인 공급원으로부터 기원한 것, 또는 동일한 공급원으로부터 기원한 것인 경우, 그 본래 형태로부터 변형된 것이다. 따라서, 세포내 이종성 발현 카세트는 예를 들면, 염색체 DNA보다는 발현 벡터로부터의 뉴클레오티드 서열에 연결됨으로써, 이종성 프로모터에 연결됨으로써, 리포터 유전자 등에 연결됨으로써 특정 숙주 세포에 내인성이 아닌 발현 카세트이다.
"제제" 또는 "테스트 화합물"이라는 용어는 본원에 기술된 스크리닝 분석에 유용한 임의의 화합물을 의미한다. 제제는 예를 들면, 유기 화합물, 폴리펩티드(예컨대, 펩티드 또는 항체), 핵산(예컨대, DNA, RNA, 더블 스트랜드, 싱글 스트랜드, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 RNA, 소형 억제 RNA, 마이크로 RNA, 리보자임 등), 올리고당, 지질일 수 있다. 일반적으로, 본 스크리닝 방법에서 사용되는 제제는 분자량이 10,000 달톤 미만, 예컨대, 8,000, 6,000, 4,000, 2,000 달톤 미만, 예컨대, 50-1,500, 500-1,500, 200-2,000, 500-5,000 달톤이다. 테스트 화합물은 테스트 화합물의 라이브러리, 예컨대, 테스트 화합물은 충분한 범위의 다양성을 제공하는 조합 또는 무작위 라이브러리 형태일 수 있다. 테스트 화합물은 임의로 융합 파트너, 예컨대, 표적 화합물, 구제 화합물, 이합체화 화합물, 안정화 화합물, 어드레스 지정가능 화합물 및 다른 기능 부분에 연결될 수 있다. 통상적으로, 예컨대, 본원에 기술된 특정 조건하에 만능성을 유도할 수 있는 능력과 같은 몇몇 바람직한 특성 또는 활성을 가진 테스트 화합물(소위 "리드 화합물")을 확인하고, 상기 리드 화합물의 변이체를 생성하고, 상기 변이체 화합물의 특성 및 활성을 평가함으로써 유용한 특성을 갖는 신규한 화학물질 엔티티를 생성할 수 있다. 종종, 이러한 분석을 위해 고속 스크리닝(HTS: high throughput screening) 방법이 이용된다.
"핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 싱글 스트랜드 또는 더블 스트랜드 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 의미하며, 본원에서는 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 것이며, 합성, 천연적으로 발생된 및 비천연적으로 발생된 것인, 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 계통을 함유하는 핵산을 포함한다. 상기 유사체의 예로는 제한없이, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄 메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA: peptide-nucleic acid)을 포함한다.
달리 명시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명확하게 명시된 서열 뿐만 아니라, 그의 보존적으로 변형된 변이체(예컨대, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적 서열을 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 축퇴성 코돈 치환이 달성될 수 있다(문헌 ([Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol . Chem. 260:2605-2608 (1985)]; [Rossolini et al., Mol Cell. Probes 8:91-98 (1994)])).
발현 또는 활성의 "억제제," "활성제," 및 "조절제"는 기술된 표적 단백질(또는 코딩 폴리뉴클레오티드), 예컨대, 리간드, 효현제, 길항제 및 그의 동족체 및 모사체의 발현 또는 활성에 대해 시험관내 및 생체내 분석을 이용하여 확인된, 각각 억제, 활성, 또는 조절 분자를 의미하는 데 사용된다. "조절제"라는 용어는 억제제 및 활성제를 포함한다. 억제제는 예컨대, 발현을 억제하거나, 그에 결합하거나, 자극 또는 프로테아제 억제 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 기술된 표적 단백질의 활성을 감소시키거나, 막거나, 지연 활성화시키거나, 불활성화시키거나, 탈감작하거나, 하향 조절하는, 예컨대, 길항제와 같은 제제이다. 활성제는 예컨대, 기술된 표적 단백질의 발현을 유도하거나, 활성화시키거나, 그에 결합하거나, 활성화 또는 프로테아제 억제 활성를 자극시키거나, 증가시키거나, 개시시키거나, 활성화시키거나, 촉진하거나, 증대시키거나, 기술된 표적 단백질(또는 코딩 폴리뉴클레오티드)의 활성을 감작하거나, 상향 조절하는, 예컨대, 효현제와 같은 제제이다. 조절제로는 천연적으로 발생된 리간드 및 합성 리간드, 길항제 및 효현제(예컨대, 소형 화학 분자, 항체 및 효현제 또는 길항제 중 어느 1종으로 작용하는 것 등)를 포함한다. 예컨대, 억제제 및 활성제에 대한 분석은 예컨대, 기술된 표적 단백질을 발현하는 세포에 추정 조절제 화합물을 적용시킨 후, 상기 기술된 바와 같이, 상기 기술된 표적 단백질 활성에 미치는 기능 효과를 측정하는 것을 포함한다. 효과의 정도를 조사하기 위해 잠재적 활성제, 억제제, 또는 조절제로 처리된 기술된 표적 단백질을 포함하는 샘플 또는 분석을 활성제, 억제제, 또는 조절제를 포함하지 않는 대조군 샘플과 비교한다. (조절제로 처리되지 않은) 대조군 샘플을 100%의 상대 활성 값으로 지정한다. 상기 대조군에 대해 상대적인 활성 값이 약 80%, 임의로 50% 또는 25%, 10%, 5% 또는 1%일 때, 상기 기술된 표적 단백질의 억제가 달성된 것으로 본다. 상기 대조군에 대해 상대적인 활성 값이 110%, 임의로 150%, 임의로 200, 300%, 400%, 500% 또는 1000-3000% 이상일 때, 상기 기술된 표적 단백질의 활성화가 달성된 것으로 본다.
"Oct 폴리펩티드"는 전사 인자의 팔합체 패밀리의 천연적으로 발생된 구성원, 또는 가장 밀접하게 관련된 천연적으로 발생된 패밀리 구성원과 비교하여 (적어도 50%, 80%, 또는 90% 활성 내에서) 유사한 전사 인자 활성을 유지하는 상기 천연적으로 발생된 구성원의 변이체, 또는 상기 천연적으로 발생된 패밀리 구성원의 적어도 DNA 결합 도메인, 및 추가로 전사 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 것을 의미한다. Oct 폴리펩티드의 예로는 Oct-1, Oct-2, Oct-3/4, Oct-6, Oct-7, Oct-8, Oct-9, 및 Oct-11을 포함한다. 예컨대, (본원에서 "Oct4"로 언급되는) Oct3/4는, Pit-1, Oct-1, Oct-2, 및 uric-86 사이에서 보존되는 150개의 아미노산 서열인 POU 도메인을 포함한다. 문헌 [Ryan, A.K. & Rosenfeld, M.G. Genes Dev. 11, 1207-1225 (1997)]을 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 천연적으로 발생된 Oct 폴리펩티드 패밀리 구성원, 예컨대, 상기 열거된 것, 또는 예컨대, 진뱅크 수탁 번호 NP_002692.2(인간 Oct4) 또는 NP_038661.1(마우스 Oct4)에 열거된 것과 비교하여 그의 전체 서열에 걸쳐 적어도 85%, 90%, 또는 95%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. Oct 폴리펩티드(예컨대, Oct3/4)는 인간, 마우스, 래트, 소, 돼지, 또는 다른 동물로부터 유래된 것일 수 있다. 일반적으로, 조작되는 세포 종과 동일한 종의 단백질이 사용될 것이다.
"Klf 폴리펩티드"는 초파리 배아 패턴 조절인자 크루펠의 서열과 유사한 아미노산 서열을 포함하는 아연 핑거 단백질인 크루펠 유사 인자(Klf; Krueppel like factor) 패밀리의 천연적으로 발생된 구성원, 또는 가장 밀접하게 관련된 천연적으로 발생된 패밀리 구성원과 비교하여 (적어도 50%, 80%, 또는 90% 활성 내에서) 유사한 전사 인자 활성을 유지하는 상기 천연적으로 발생된 구성원의 변이체, 또는 상기 천연적으로 발생된 패밀리 구성원의 적어도 DNA 결합 도메인, 및 추가로 전사 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 것을 의미한다. 문헌 [Dang, D.T., Pevsner, J. & Yang, V. W. Cell Biol. 32, 1103-1121 (2000)]을 참조할 수 있다. Klf 패밀리 구성원의 예로는 Klf1, Klf2, Klf3, Klf-4, Klf5, Klf6, Klf7, Klf8, Klf9, Klf10, Klf11, Klf12, Klf13, Klf14, Klf15, Klf16, 및 Klf17을 포함한다. Klf2 및 Klf4는 마우스에서 iPS 세포를 생성할 수 있는 인자인 것으로 밝혀졌으며, 관련 유전자인 Klf1 및 Klf5 역시, 비록 효율은 낮지만, 마우스에서 iPS 세포를 생성할 수 있었다. 문헌 [Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26:101-106 (2007)]을 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 천연적으로 발생된 Klf 폴리펩티드 패밀리 구성원, 예컨대, 상기 열거된 것, 또는 예컨대, 진뱅크 수탁 번호 CAX16088(마우스 Klf4) 또는 CAX14962(인간 Klf4)에 열거된 것과 비교하여 그의 전체 서열에 걸쳐 적어도 85%, 90%, 또는 95%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. Klf 폴리펩티드(예컨대, Klf1, Klf4, 및 Klf5)는 인간, 마우스, 래트, 소, 돼지, 또는 다른 동물로부터 유래된 것일 수 있다. 일반적으로, 조작되는 세포 종과 동일한 종의 단백질이 사용될 것이다. Klf 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 정도로, 에스트로겐 관련 수용체 베타(Essrb) 폴리펩티드로 대체될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 각 Klf 폴리펩티드 실시양태에 대해, Klf4 폴리펩티드 대신 Essrb가 사용된 상응하는 실시양태도 동일하게 기술한다.
"Myc 폴리펩티드"는 Myc 패밀리의 천연적으로 발생된 구성원(예컨대, 문헌 [Adhikary, S. & Eilers, M. Nat . Rev . Mol . Cell Biol. 6:635-645 (2005)] 참조), 또는 가장 밀접하게 관련된 천연적으로 발생된 패밀리 구성원과 비교하여 (적어도 50%, 80%, 또는 90% 활성 내에서) 유사한 전사 인자 활성을 유지하는 상기 천연적으로 발생된 구성원의 변이체, 또는 상기 천연적으로 발생된 패밀리 구성원의 적어도 DNA 결합 도메인, 및 추가로 전사 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 것을 의미한다. Myc 폴리펩티드의 예로는 예컨대, c-Myc, N-Myc 및 L-Myc를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 천연적으로 발생된 Myc 폴리펩티드 패밀리 구성원, 예컨대, 상기 열거된 것, 또는 예컨대, 진뱅크 수탁 번호 CAA25015(인간 Myc)에 열거된 것과 비교하여 그의 전체 서열에 걸쳐 적어도 85%, 90%, 또는 95%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. Myc 폴리펩티드(예컨대, c-Myc)는 인간, 마우스, 래트, 소, 돼지, 또는 다른 동물로부터 유래된 것일 수 있다. 일반적으로, 조작되는 세포 종과 동일한 종의 단백질이 사용될 것이다.
"Sox 폴리펩티드"는 고이동도 군(HMG: high-mobility group) 도메인의 존재를 특징으로 하는 SRY 관련 HMG 박스(Sox) 전사 인자의 천연적으로 발생된 구성원, 또는 가장 밀접하게 관련된 천연적으로 발생된 패밀리 구성원과 비교하여 (적어도 50%, 80%, 또는 90% 활성 내에서) 유사한 전사 인자 활성을 유지하는 상기 천연적으로 발생된 구성원의 변이체, 또는 상기 천연적으로 발생된 패밀리 구성원의 적어도 DNA 결합 도메인, 및 추가로 전사 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드 중 어느 것을 의미한다. 예컨대, 문헌 [Dang, D.T., et al., Int . J. Biochem . Cell Biol. 32:1103-1121 (2000)]을 참조할 수 있다. Sox 폴리펩티드의 예로는 예컨대, Sox1, Sox2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, Sox1O, Sox11, Sox12, Sox13, Sox14, Sox15, Sox17, Sox18, Sox21, 및 Sox30을 포함한다. Sox1은 Sox2와 유사한 효율로 iPS 세포를 생산하는 것으로 나타났고, 유전자 Sox3, Sox15, 및 Sox18 또한, 비록 그 효율은 Sox2보다는 다소 작지만, iPS 세포를 생성하는 것으로 나타났다. 문헌 [Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26: 101-106 (2007)]을 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 천연적으로 발생된 Sox 폴리펩티드 패밀리 구성원, 예컨대, 상기 열거된 것, 또는 예컨대, 진뱅크 수탁 번호 CAA83435(인간 Sox2)에 열거된 것과 비교하여 그의 전체 서열에 걸쳐 적어도 85%, 90%, 또는 95%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. Sox 폴리펩티드(예컨대, Sox1, Sox2, Sox3, Sox15, 또는 Sox18)는 인간, 마우스, 래트, 소, 돼지, 또는 다른 동물로부터 유래된 것일 수 있다. 일반적으로, 조작되는 세포 종과 동일한 종의 단백질이 사용될 것이다.
본 발명의 상세한 설명
I. 도입
본 발명은, ALK5 억제제가 세포에서 만능성의 유지, 및 임의로는 유도를 현저하게 개선시킨다는 놀라운 발견에 기초한다. ALK5의 억제제와 MAPK 억제제(예컨대, MEK 억제제, Erk 억제제 또는 p38 억제제)의 조합, 또는 ALK5 억제제와 FGF 경로 억제제(예컨대, FGF 수용체 억제제)의 조합을 통해
하기 정의되어 있으며, 이전에 (예컨대, 미국 특허 번호 제5,843호; 제6,200,806호; 및 제7,029,913호에) 기술된 종래의 인간 배아 줄기 세포 또는 유도 만능성 줄기 세포와는 현저하게 상이하고, mESC와는 보다 더 유사한 신규한 기능적 특성을 가지고 있으며;
(예컨대, GSK3 및 MEK 억제제를 포함하는(WO2008/015418 참조)) 앞서 공지된 만능성 유지 방법과 비교하였을 때, 세포의 효율과 안정성이 크게 개선된 세포의 만능성을 유지할 수 있다. 실제로, 현재까지 본 분야에서는 만능성을 자극시키기 위하여 TGFβ 경로를 길항시키는 것이 아니라, 효현화시키는 것에 초점을 맞추었었기 때문에, ALK5의 억제제가 부분적으로 만능성의 유지를 개선시키는 데 있어 효과적이라는 것은 놀라운 사실이다. 예컨대, WO 2008/056173 참조할 수 있다.
본 발명은 부분적으로는, ALK5 억제제(또는 다른 TGFβ/액티빈 경로 억제제) 및 MAPK 억제제 또는 FGF 신호전달 경로 억제제를 포함하고, 임의로는 이미 만능이거나, 또는 억제제의 존재하에서 만능성인 것으로 유도시키고자 하는 것이거나 또는 만능성으로 유도된 것인 포유동물 세포를 포함하는, 세포 배양물을 제공한다. 임의로, 세포 배양물은 또한 GSK3β 억제제 및/또는 백혈병 억제 인자(LIF)를 포함할 수 있다. 다른 배지 성분 및 조건 또한 일반적으로 당업계에 공지된 것과 같을 수 있고, 이는 예컨대, 기초 배지 성분, 비타민, 미네랄 등을 포함할 수 있다.
만능성인 상태로 세포를 유지시킬 수 있는 능력을 통해 다르게는 불가능할 수도 있는 여러 가지 방법으로 상기 세포에 대해 연구할 수 있고, 상기 세포를 사용할 수 있다. 예를 들어, 다수의 만능성 줄기 세포는 배양물 중에서 빠르게 분화되거나, 사멸하게 되는 바, 이에 스크리닝 분석법, 유전공학법이 불가능하고, 및 특정 기간 동안, 또는 다회에 걸친 다중 세포 계대접종(예컨대, 세포 분열)을 통해 만능성을 유지하는 것이 필요하거나 편리한 경우에도 다르게 사용될 수 없다. 본 발명을 통해 상기와 같은 문제들을 해소할 수 있다.
II . 배양물
포유동물 세포의 만능성을 유도 또는 유지시키기 위해, 임의로 MAPK(예컨대, MEK 또는 Erk 또는 p38 억제제) 또는 FGF 신호전달 경로 억제제(예컨대, FGF 수용체 억제제)와 함께 ALK5 억제제(또는 다른 TGFβ/액티빈 경로 억제제)를 포함하는 세포 배양물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 배양물과 함께 배양된 세포는 배양물 중에서의 반구형 콜로니 형성, ESC 마커(예컨대, Oct4, Sox2, 및 나노그) 발현, Oct4 프로모터의 거의 완전한 탈메틸화, (예컨대, 착상 후 단계의 배반엽상층 및 EpiSC에는 존재하지 않는 ESC 및 조기 배반엽상층 마커인) REX1 및 ALP의 발현, 시험관내에서 내배엽, 신경외배엽, 및 중배엽으로 분화될 수 있는 능력 뿐만 아니라, 생체내 만능성 특징, 예컨대, (예컨대, SCID 마우스에서) 기형종을 형성할 수 있는 능력, 및 비인간 세포의 경우, 배반포 내로 주사된 후, 수용 자궁 내로 이식되었을 때 키메라 자손을 형성할 수 있는 능력을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 본 실시예에 기술된 특징을 가진다. 또한, 일부 실시양태에서, 배양물 중 세포는 동일한 배양 조건하에 있는 동안 다회에 걸친 다중 세포 계대접종 동안, 예컨대, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, 30회 이상의 계대접종 동안 상기 특징들을 유지한다.
세포 배양물은 또한 임의로 GSk3β 억제제 및 LIF 중 하나 또는 그 둘 모두를 포함할 수 있다. 본 실시예에서 설명되는 바와 같이, 일부 실시양태에서, LIF가 존재하면 만능성 세포는 (예컨대, 10회 초과의 계대접종에 걸쳐) 장기간 동안의 유지는 개선될 수 있고, 이로써 충분한 양의 LIF가 배양물 중에 포함됨으로써 만능성은 장기간 동안 유지될 수 있다. 추가로, LIF를 포함하거나, 또는 포함하지 않는 경우, 충분한 양의 GSK3β 억제제 또한 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, GSK3β 억제제의 양은 배양물의 효율, 즉, 형성되는 양성 만능 콜로니의 개수를 개선시키기에 충분하다.
각 억제제의 양은 정확한 배양 조건, 사용되는 특정 억제제, 및 배양되는 세포 유형에 따라 달라질 수 있고, 최적의 이점을 얻기 위해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 배양물은 0.05-10 μM, 예컨대, 0.1-1 μM, 예컨대, 0.5 μM의 ALK5 억제제(예컨대, A-83-01, 및 0.1~20 μM, 예컨대, 2~10 μM의 SB431542)를 포함한다. 본 발명자들은, TGF-β RI 키나제 억제제 II [2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘]이 예를 들어, 약 1.5 μM의 농도로 본원에 기술된 바와 같은 ALK5 억제제로서 사용될 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 배양물은 0.05-20 μM, 예컨대, 0.1-10 μM의 TGF-β RI 키나제 억제제 II를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 배양물은 10 nM-5μM, 예컨대, 50 nM-1 μM의 FGF 경로 억제제(예컨대, PD173074)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 배양물은 0.05-50 μM, 예컨대, 0.1-5 μM, 예컨대, 0.5 μM의 MEK 억제제(예컨대, PD0325901)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 배양물은 0.05-20 μM, 예컨대, 0.5-5 μM, 예컨대, 3 μM의 GSK3β 억제제(예컨대, CHIR99021)를 포함한다.
TGF β 수용체(예컨대, ALK5) 억제제로는 TGF β 수용체(예컨대, ALK5)에 대한 항체, TGF β 수용체(예컨대, ALK5)의 우성 음성 변이체 및 TGF β 수용체(예컨대, ALK5)를 표적으로 하는 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. TGFβ 수용체/ALK5 억제제의 예로는 SB431542(예컨대, 문헌 [Inman, et al, Molecular Pharmacology 62(1):65-74 (2002)] 참조), A-83-01(또한, 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카르보티오아미드로도 공지)(예컨대, 문헌 [Tojo, et al, Cancer Science 96(11):791-800 (2005)] 참조, 및 예컨대, Toicris Bioscience로부터 상업적으로 이용가능); TGF-β RI 키나제 억제제 II [2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘]; 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘, Wnt3a/바이오(BIO)(예컨대, WO2008/094597(Dalton 등)(본원에서 참고로 포함된다) 참조), BMP4(문헌 [Dalton, 상기 문헌 동일] 참조), GW788388 (-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]피리딘-2-일}-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)벤즈아미드)(예컨대, 문헌 [Gellibert, et al, Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210-2221 (2006)] 참조), SM16(예컨대, 문헌 [Suzuki, et al, Cancer Research 67(5):2351-2359 (2007)] 참조), IN-1130(3-((5-(6-메틸피리딘-2-일)-4-(퀴녹살린-6-일)-1H-이미다졸-2-일)메틸)벤즈아미드)(예컨대, 문헌 [Kim, et al., Xenobiotica 38(3):325-339 (2008)] 참조), GW6604(2-페닐-4-(3-피리딘-2-일-1H-피라졸-4-일)피리딘)(예컨대, 문헌 [de Gouville, et al, Drug News Perspective 19(2):85-90 (2006)] 참조), SB-505124(2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-t-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드)(예컨대, 문헌 [DaCosta, et al, Molecular Pharmacology 65(3):744-752 (2004)] 참조) 및 피리미딘 유도체(예컨대, WO2008/006583(Stiefl 등)(본원에서 참고로 포함된다)에 열거되어 있는 것)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니지만, ALK5 억제제는 중간엽의 상피 전환/전이(MET: epithelial conversion/transition) 과정에 영향을 주는 것으로 판단된다. TGFβ/액티빈 경로는 상피의 중간엽 전이(EMT: epithelial to mesenchymal transition)에 대한 구동자이다. 그러므로, TGFβ/액티빈 경로를 억제시키면 MET(즉, 리프로그래밍) 과정을 촉진시킬 수 있다.
ALK5를 억제시키는 효과를 제시한, 본원의 데이터로부터 비추어 볼 때, TGFβ/액티빈 경로의 억제가 유사한 효과를 가질 것으로 판단된다. 따라서, TGFβ/액티빈 경로의 (예컨대, 상향 또는 하향) 임의의 억제제를 본원 각 문단에서 기술된 것과 같은 ALK5 억제제와 함께 조합하여, 또는 그를 대신하여 사용할 수 있다. TGFβ/액티빈 경로 억제제의 예로는 TGFβ 수용체 억제제, SMAD 2/3 인산화의 억제제, SMAD 2/3 및 SMAD 4의 상호작용의 억제제, 및 SMAD 6 및 SMAD 7의 활성제/효현제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 하기 기술하는 분류화는 단지 조직화하고자 하는 것이 목적이 아니며, 당업자는 화합물이 경로 내의 하나 이상의 지점에 영향을 줄 수 있으며, 이로써 화합물은 정의된 부류 중 1 초과에서 작용할 수 있음을 알 것이다.
TGFβ 수용체 억제제로는 TGFβ 수용체에 대한 항체, TGFβ 수용체의 우성 음성 변이체 및 TGFβ 수용체를 표적으로 하는 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. 억제제에 대한 구체적인 예로는 SU5416; 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-t-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드(SB-505124); 레르델리무맙(CAT-152); 메텔리무맙(CAT-192); GC-1008; ID11; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; Ki26894; SB-203580; SD-093; 글리벡(Gleevec); 3,5,7,2',4'-펜타하이드록시플라본(Morin); 액티빈-M108A; P144; 가용성 TBR2-Fc; 및 TGFβ 수용체를 표적하는 안티센스 형질감염된 종양 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다(예컨대, 문헌 [Wrzesinski, et al., Clinical Cancer Research 13(18):5262-5270 (2007)]; [Kaminska, et al., Acta Biochimica Polonica 52(2):329-337 (2005)]; 및 [Chang, et al, Frontiers in Bioscience 12:4393-4401 (2007)]) 참조).
SMAD 2/3 인산화의 억제제로는 SMAD2 또는 SMAD3에 대한 항체, SMAD2 또는 SMAD3의 우성 음성 변이체 및 SMAD2 또는 SMAD3을 표적으로 하는 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. 억제제의 구체적인 예로는 PD169316; SB203580; SB-431542; LY364947; A77-01; 및 3,5,7,2',4'-펜타하이드록시플라본(Morin)을 포함한다(예컨대, 문헌 ([Wrzesinski, 상기 문헌 동일]; [Kaminska, 상기 문헌 동일]; [Shimanuki, et al., Oncogene 26:3311-3320 (2007)]; 및 EP1992360(Kataoka 등)(본원에서 참고로 포함된다)) 참조).
SMAD 2/3 및 smad4의 상호작용의 억제제로는 SMAD2, SMAD3 및/또는 smad4에 대한 항체, SMAD2, SMAD3 및/또는 smad4의 우성 음성 변이체 및 SMAD2, SMAD3 및/또는 smad4를 표적으로 하는 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. SMAD 2/3 및 SMAD4의 상호작용의 억제제에 대한 구체적인 예로는 Trx-SARA, Trx-xFoxH1b 및 Trx-Lef1을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(예컨대, 문헌 ([Cui, et al, Oncogene 24:3864-3874 (2005)] 및 [Zhao, et al, Molecular Biology of the Cell, 17:3819- 3831 (2006)]) 참조).
MEK의 억제제로는 MEK에 대한 항체, MEK의 우성 음성 변이체 및 MEK를 표적으로 하는 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. MEK 억제제에 대한 구체적인 예로는 PD0325901(예컨대, 문헌 [Rinehart, et al, Journal of Clinical Oncology 22: 4456-4462 (2004)] 참조), PD98059(예컨대, Cell Signaling Technology로부터 이용가능), U0126(예를 들어, Cell Signaling Technology로부터 이용가능), SL 327(예컨대, Sigma-Aldrich로부터 이용가능), ARRY-162(예컨대, Array Biopharma로부터 이용가능), PD184161(예컨대, 문헌 [Klein, et al, Neoplasia 8:1-8 (2006)] 참조), PD184352(CI-1040)(예컨대, 문헌 [Mattingly, et al, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316:456-465 (2006)] 참조), 수니티닙(예컨대, US2008004287(Voss 등)(본원에서 참고로 포함된다)), 소라페닙(문헌 [Voss, 상기 문헌 동일] 참조), 밴데타닙(문헌 [Voss, 상기 문헌 동일] 참조), 파조파닙(예컨대, 문헌 [Voss, 상기 문헌 동일] 참조), 악시티닙(문헌 [Voss, 상기 문헌 동일] 참조) 및 PTK787(문헌 [Voss, 상기 문헌 동일] 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
현재, 수개의 MEK 억제제가 임상 시험 평가 중에 있다. CI-1040은 암에 대해 제I상 및 제II상 임상 시험에서 평가받았다(예컨대, 문헌 [Rinehart, et al., Journal of Clinical Oncology 22(22):4456-4462 (2004)] 참조). 임상 시험에서 평가받은 다른 MEK 억제제로는 PD 184352(예컨대, 문헌 [English, et al., Trends in Pharmaceutical Sciences 23(1):40-45 (2002)] 참조), BAY 43-9006(예컨대, 문헌 [Chow, et al, Cytometry ( Communications in Clinical Cytometry) 46:72-78 (2001)] 참조), PD-325901(또한 PD0325901), GSK1120212, ARRY-438162, RDEA119, AZD6244(또한, ARRY-142886 또는 ARRY-886), RO5126766, XL518 및 AZD8330(또한, ARRY-704)을 포함한다(예컨대, National Institutes of Health(World Wide Web at clinicaltrials.gov)의 정보 뿐만 아니라, Nation Cancer Institute(World Wide Web at cancer.gov/clinicaltrials)의 정보 참조).
p38(CSBP, mHOG1, RK 및 SAPK2로도 공지되어 있음) 억제제로는 p38에 대한 항체, p38의 우성 음성 변이체 및 p38을 표적으로 하는 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. 본 억제제의 구체적인 예로는 SB203580(4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸설피닐페닐)-5-(4-피리딜)1H-이미다졸); SB202190(4-(4-플루오로페닐)-2-(4-하이드록시페닐)-5(4-피리딜)-1H-이미다졸); SB 220025; N-(3-t-부틸-1-메틸-5-피라졸릴)-N'-(4-(4-피리디닐메틸)페닐)우레아; RPR 200765A; UX-745; UX-702; UX-850; SCIO-469; RWJ-67657(RW Johnson Pharmaceutical Research Institute); RDP-58(SangStat Medical Corp.(Genzyme Corp.)이 인수)); Scios-323(SCIO 323; Scios Inc.); Scios-469(SCIO-469; Scios Inc.); MKK3/MKK6 억제제(Signal Research Division); p38/MEK 조절제(Signal Research Division); SB-210313 유사체; SB-238039; HEP-689(SB 235699); SB-239063; SB-239065; SB-242235(SmithKline Beecham Pharmaceuticals); VX-702 및 VX-745(Vertex Pharmaceuticals Inc.); AMG-548(Amgen Inc.); Astex p38 키나제 억제제(Astex Technology Ltd.); RPR-200765 유사체(Aventis SA); 바이엘(Bayer) p38 키나제 억제제(Bayer Corp.); BIRB-796(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc.); 셀테크(Celltech) p38 MAP 키나제 억제제(Celltech Group pic); FR-167653(Fujisawa Pharmaceutical Co. Ltd.); SB-681323 및 SB-281832(GlaxoSmithKline pic); LEO 파마슈티칼즈(LEO Pharmaceuticals) MAP 키나제 억제제(LEO Pharma AJS); 머크 코포레이션(Merck Co.) p38 MAP 키나제 억제제(Merck research Laboratories); SC-040 및 SC-XX906(Monsanto Co.); 아데노신 A3 길항제(Novartis AG); p38 MAP 키나제 억제제(Novartis Pharma AG); CNI-1493(Picower Institute for Medical Research); RPR-200765A(Rhone-Poulenc Rorer Ltd.); 및 로슈(Roche) p38 MAP 키나제 억제제(예컨대, RO3201195 및 RO4402257; Roche Bioscience)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 문헌 ([Roux, et al, Microbiology and Molecular Biology Reviews 68(2):320-344 (2004)]; [Engelman, et al, Journal of Biological Chemistry 273(48):32111-32120 (1998)]; [Jackson, et al, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 284(2):687-692 (1998)]; [Kramer, et al, Journal of Biological Chemistry 271(44):27723-27729 (1996)]; 및 US20080193504(Menko 등))을 참조할 수 있다.
p38의 추가의 억제제로는 1,5-디아릴-치환된 피라졸 및 치환된 피라졸 화합물(US6509361 and US6335336); 치환된 피리딜 화합물(US20030139462); 퀴나졸린 유도체(US6541477, US6184226, US6509363 및 US6635644); 아릴 우레아 및 헤테로아릴 유사체 (US6344476); 헤테로사이클릭 우레아 (WO 1999/32110); 다른 우레아 화합물(WO 1999/32463, WO1998/52558, WO1999/00357 및 WO 1999/58502); 및 치환된 이미다졸 화합물 및 치환된 트리아졸 화합물(US6560871 및 US6599910)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
Erk의 억제제는 Erk에 대한 항체, Erk의 우성 음성 변이체 및 Erk를 표적으로 하는 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. Erk 억제제의 구체적인 예로는 PD98059(예컨대, 문헌 [Zhu, et al, Oncogene 23:4984-4992 (2004)] 참조), UO126(문헌 [Zhu, 상기 문헌 동일] 참조), FR180204(예컨대, 문헌 [Ohori, Drug News Perspective 21(5):245-250 (2008)] 참조), 수니티닙(예컨대, US2008004287(Ma 등)(본원에서 참고로 포함된다)), 소라페닙(문헌 [Ma, 상기 문헌 동일] 참조), 밴데타닙(문헌 [Ma, 상기 문헌 동일] 참조), 파조파닙(문헌 [Ma, 상기 문헌 동일] 참조), 악시티닙(문헌 [Ma, 상기 문헌 동일] 참조) 및 PTK787(문헌 [Ma, 상기 문헌 동일] 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. Erk 억제제는 Erk만을 단독으로 억제하거나, 또는 제2 표적도 또한 억제시키는 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, Erk 억제제는:
Figure 112011054290499-pct00001
및 그의 N 옥시드 유도체, 프로드럭 유도체, 보호된 유도체, 각개의 이성체, 및 이성체들의 혼합물; 및 상기 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염 및 용해화물(예컨대, 수화물), 또는 다르게는 WO 06/135824에 기술된 것이다:
상기 식에서,
R1은 수소, C1 - 6알킬, C2 - 6알케닐, C6 - 10아릴-C0 - 4알킬, C5 - 10헤테로아릴-C0 - 4알킬, C3-10사이클로알킬-C0 - 4알킬 및 C3 - 10헤테로사이클로알킬-C0 - 4알킬로부터 선택되고; 여기서, R1의 임의의 알킬 또는 알케닐은 할로, 하이드록시, C1 - 6알킬 및 -NR2R3으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 라디칼에 의해 임의로 치환되고; 여기서, R1의 임의의 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬은 할로, 하이드록시, 시아노, C1 - 6알킬, C1 - 6알콕시, C2 - 6알케닐, 할로 치환된 알킬, 할로 치환된 알콕시, -XNR2R3, -XOXNR2R3, -XNR2S(O)0-2R3, -XC(O)NR2R3, -XNR2C(O)XOR2, - XNR2C(O)NR2R3, -XNR2XNR2R3, -XC(O)NR2XNR2R3, -XNR2XOR2, -XOR2, -XNR2C(=NR2)NR2R3, -XS(O)0-2R4, -XNR2C(O)R2, -XNR2C(O)XNR2R3, -XNR2C(O)R4, -XC(O)R4, -XR4, -XC(O)OR3 및 -XS(O)0-2NR2R3으로부터 선택되는 1 내지 3개의 라디칼에 의해 임의로 치환되고; 여기서, X는 결합 또는 C1 - 4알킬렌이고; R2 및 R3은 독립적으로 수소, C1 - 6알킬 및 C3 -12사이클로알킬로부터 선택되고; R4는 C1 - 6알킬, - XNR2R3, -XNR2XNR2R2, XNR2XOR2 및 -XOR2로부터 선택되는 1 내지 3개의 라디칼에 의해 임의로 치환된 C3 - 10헤테로사이클로알킬이고; 여기서, X, R2 및 R3은 하기 기술된 바와 같다.
FGF 신호전달 경로의 억제제로는 FGF 수용체 억제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. FGF 수용체(FGFR: FGF receptor) 억제제로는 FGFR에 대한 항체, FGFR의 우성 음성 변이체 및 FGFR을 표적으로 하는 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. FGFR 억제제의 구체적인 예로는 SU6668(예컨대, 문헌 [Klenke, BMC Cancer 7:49 (2007)] 참조), SU5402(3-[3-(2-카르복시에틸)-4-메틸피롤-2-메틸리데닐]-2-인돌리논) 및 PD 173074(예컨대, 문헌 [Bansal, et al., J. Neuro . Res. 74(4):486-493 (2003)] 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
GSK3의 억제제로는 GSK3에 대한 항체, GSK3의 우성 음성 변이체 및 GSK3을 표적으로 하는 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. GSK3 억제제의 구체적인 예로는 CHIR99021, CHIR98014, AR-A014418(예컨대, 문헌 [Gould, et al, International Journal of Neuropsychopharmacology 7:387-390 (2004)] 참조), CT 99021(예컨대, 문헌 [Wagman, Current Pharmaceutical Design 10:1105-1137 (2004)] 참조), CT 20026(문헌 [Wagman, 상기 문헌 동일] 참조), SB216763(예컨대, 문헌 [Martin, et al, Nature Immunology 6:777-784 (2005)] 참조), AR-A014418(예컨대, 문헌 [Noble, et al, PNAS 102:6990-6995 (2005)] 참조), 리튬(예컨대, 문헌 [Gould, et al, Pharmacological Research 48: 49-53 (2003)] 참조), SB415286(예컨대, 문헌 [Frame, et al, Biochemical Journal 359:1-16 (2001)] 참조) 및 TDZD-8(예컨대, 문헌 [Chin, et al, Molecular Brain Research, 137(1-2): 193-201 (2005)] 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 칼바이오케(Calbiochem)으로부터 이용가능한 추가의 예시적인 GSK3 억제제(예컨대, WO2008/094597(Dalton 등)((본원에서 참고로 포함된다) 참조)로는 바이오(2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심(GSK3 억제제 IX); 바이오 아세트옥심(2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-아세트옥심(GSK3 억제제 X); (5-메틸-1H-피라졸-3-일)-(2-페닐퀴나졸린-4-일)아민(GSK3 억제제 XIII); 피리도카르바졸-사이클로페나디에닐루테늄 복합체(GSK3 억제제 XV); TDZD-8 4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온(GSK3베타 억제제 I); 2-티오(3-요오도벤질)-5-(1-피리딜)-[1,3,4]-옥사디아졸(GSK3베타 억제제 II); OTDZT 2,4-디벤질-5-옥소티아디아졸리딘-3-티온(GSK3베타 억제제 III); 알파-4-디브로모아세토페논(GSK3베타 억제제 VII); AR-A014418 N-(4-메톡시벤질)-N'-(5-니트로-1,3-티아졸-2-일)우레아(GSK-3베타 억제제 VIII); 3-(1-(3-히드록시프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-디온(GSK-3베타 억제제 XI); TWS1 19 피롤로피리미딘 화합물(GSK3베타 억제제 XII); L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2(서열번호 1) 또는 그의 미리스토일화된 형태(GSO베타 억제제 XIII); 2-클로로-1-(4,5-디브로모-티오펜-2-일)-에타논(GSK3베타 억제제 VI); AR-A014418; SB216763; 및 SB415286을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 억제제와 상호작용하는 GSK3b 잔기가 확인되었다. 예컨대, 문헌 [Bertrand et al., J Mol.Biol. 333(2): 393-407 (2003)]을 참조할 수 있다.
특정 유전자 생성물의 억제제가 본원에 기술되어 있는 경우, 억제제는 상기 유전자 생성물을 코딩하는 유전자를 표적하는 siRNA로 대체될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명은 ALK5 억제제 대신 ALK5의 발현을 억제시키는 siRNA를 사용하는 것을 제공한다. 유사하게, MEK 억제제, Erk 억제제, p38 억제제, FGF 수용체 억제제 및 GSK3β 억제제는 각각 MEK siRNA, Erk siRNA, p38 siRNA, FGF 수용체 siRNA 및 GSK3β siRNA로 대체될 수 있다. 추가로, 억제성 항체(예컨대, 인간화된 항체 또는 키메라 항체)가 ALK5, MEK, Erk, p38, FGF 수용체, 및 GSK3β의 억제제로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 먼저 세포를 후생유전적 개질제와 함께 배양한 후, 상기 개질제는 포함하지 않고, 본원에 기술된 억제제(예컨대, AKL5 억제제, MEK 억제제, Erk 억제제, p38 억제제, FGF 수용체 억제제 및 GSK3β 억제제, 백혈병 억제 인자(LIF) 등)를 포함하는 단계로 배양할 수 있다. 후생유전적 개질제의 예로는 히스톤 H3K4 탈메틸화 억제제 또는 H3K4 메틸화 활성제를 포함한다. 후생유전적 개질제의 예로는 예컨대, 히스톤 데메틸라제 억제제, 예컨대, LSD1 억제제(예컨대, 파네이트) 또는 MAO 억제제를 포함한다.
"히스톤 데아세틸라제 억제제," "히스톤 데아세틸라제의 억제제" 및 "HDAC 억제제"라는 용어는 히스톤 데아세틸라제와 상호작용할 수 있고, 그의 효소 활성을 억제시킬 수 있는 화합물을 지칭한다. "히스톤 데아세틸라제 효소 활성을 억제시킨다"는 것은 히스톤으로부터 아세틸기를 제거할 수 있는 히스톤 데아세틸라제의 능력을 감소시킨다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 상기와 같은 히스톤 데아세틸라제 활성 감소는 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게, 적어도 약 75%, 및 더욱더 바람직하게, 적어도 약 90% 이루어진다. 다른 바람직한 실시양태에서, 히스톤 데아세틸라제 활성은 적어도 95% 만큼 및 더욱 바람직하게, 적어도 99% 만큼 감소된다.
일부 대표적인 HDAC 억제제로는 부티르산, MS-27-275, SAHA, 트리코스타틴 A, 아피시딘, 옥삼플라틴, FK228, 및 트라폭신을 포함한다. 이러한 억제제는 그의 구조체 기초하여 여러 부류로 분류될 수 있으며, 이는 단쇄 지방산(부티레이트 및 발프로산), 히드록삼산(트리코스타틴 A 및 SAHA), 사이클릭 테트라펩티드(뎁시펩티드), 벤즈아미드(MS-27-275), 및 에폭시드 함유 제제(트라폭신)를 포함한다. 비가역적으로 HDAC를 알킬화시킬 수 있는 에폭시드기를 소지한 트라폭신을 제외하면, 상기 억제제 대부분은 가역적인 방식으로 HDAC를 억제시킨다. 가역성 억제제는 일반적으로 HDAC 결합 포켓 바닥에 위치하는 활성 아연 중심과 상호작용하는 친핵성 말단, 예컨대, -SH 또는 -OH를 포함하나는 장쇄 지방족 꼬리를 갖고 있다. 다른 HDAC 억제제는 열거한 구조의 변형을 통해 최근 출현되고 있다. 신규 제제들 대부분은 히드록삼산의 유도체로서, 이는 트리코스타틴 A(TSA)의 아미드 유사체 및 티오/인 기반 SAHA를 포함한다. MS-27-275 구조체에서 아미드 결합을 술폰아미드로 대체함으로써 새로운 부류의, 강력한 효능을 가진 HDAC 억제제를 발견하게 되었다. 임상 시험에 들어간 유망한 HDAC 억제제로는 히드록삼산 유도체 LAQ824, 부티르산 유도체 티탄(Titan), 발프로산, MS-27-275, SAHA, 및 뎁시펩티드 FK228을 포함한다.
히스톤 데메틸라제 억제제로는 리신 특이 데메틸라제 I(LSD1: lysine-specific demethylase I; 리신 특이 히스톤 데메틸라제로도 공지되어 있음, BHC110 및 KIAA0601)에 대한 억제제를 포함한다. 국제 특허 출원 WO 2006/071608은 진핵성 히스톤 데메틸라제 활성을 모니터링하는 방법, 메틸화된, 히스톤 활성화된 유전자를 상향 및 하향조절하는 방법, 및 히스톤 데메틸라제 단백질 또는 활성 수준을 조절하여 질환(예컨대, 과증식성 질환, 예컨대, 암)을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 유전자 조절의 중요성, 및 LSD1을 억제 또는 조절함으로써 유전자 조절에 영향을 줄 수 있는 능력에 비추어 볼 때, 효소의 억제제가 중요한 치료학적 잠재능을 가질 수 있으며(문헌 [Bi, X. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16:3229-3232 (2006)]), 국제 특허 출원 번호 WO2007/021839 및 WO2008/127734에는 LSD1의 억제제로서 유용한 특정 화합물이 기술되어 있다.
본 발명은 또한 세포의 만능성을 유지시키기 위한 배양 배지를 제공한다. 세포 배양 배지는 임의로 세포를 포함하지 않는다. 배양 배지는, 비록 세포를 포함하는 것이기는 하지만, 상기 기술된 배양 배지 성분을 포함할 수 있다. 상기 배지는 상기 기술된 세포를 배양하는 데 유용하다.
본원 어디에서나 제공되는 바와 같이, 배양물 중의 세포는 배아 줄기 세포(예컨대, 인간 배아 줄기 세포(hESC), 영장류 배아 줄기 세포, 래트 배아 줄기 세포, 또는 다른 동물로부터의 배아 줄기 세포, 임의로 마우스가 아닌 동물로부터의 배아 줄기 세포)로부터 선택될 수 있다. 별법으로, 세포는 유도 만능성 줄기 세포(iPSC)를 포함한다. 일부 실시양태에서, iPSC는 인간, 영장류, 래트, 또는 마우스, 또는 마우스가 아닌 동물로부터의 것이다. iPSC는 이전 세포 분열까지만 해도 비만능성인 세포로부터 생성될 수 있거나, 또는 별법으로, 세포는 iPSC와 같이 이전 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20회 이상의 세포 분열 또는 계대접종 동안 유지될 수 있다. 다시 말해, 세포 배양물은 이전에 (예컨대, 몇주, 몇개월 또는 그보다 더 오래 기간 이전에) 형성된 iPSC를 함유할 수 있다. 본원에서 제공하는 소형 분자 조합물이 가진 한가지 이점은 리프로그래밍에 사용되는 것 이외에도 및 그와는 별개로, 무기한인 것처럼 보이는 기간 동안 원하는 만능성을 유지시킬 수 있다는 점이다.
본 발명은 본원에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 억제제와 함께 혼합된 혼합물 중의 만능성 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 만능성을 유도하거나, 만능성으로의 유도율을 개선시키기에 충분한 농도의 혼합물로 존재한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 화합물의 농도는 적어도 0.1 nM, 예컨대, 적어도 1, 10, 100, 1,000, 10,000, 또는 100,000 nM, 예컨대, 0.1 nM 내지 100,000 nM 사이, 예컨대, 1 nM 내지 10,000 nM 사이, 예컨대, 10 nM 내지 10,000 nM 사이, 0.01 μM 내지 5 μM 사이, 0.1 μM 내지 5 μM 사이이다. 예를 들어, A-83-01은 약 0.1 μM 내지 약 0.5 μM, 예컨대, 0.25 μM 내지 약 0.5 μM의 농도로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, A-83-01의 농도는 0.25 μM이다. 일부 실시양태에서, A-83-01의 농도는 0.5 μM이다. CHIR99021은 약 3 μM의 농도로 사용될 수 있다. PD325901은 약 0.5 μM의 농도로 사용될 수 있다. PD173074는 약 0.1 μM의 농도로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 합성 베쓸(예컨대, 시험관, 페트리 디쉬 등)에 존재한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 세포는 (동물의 일부분이 아닌) 단리된 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포를 동물(인간 또는 비인간)로부터 단리시키고, 베쓸에 넣고, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 화합물과 접촉시킨다. 이어서, 세포를 배양할 수 있고, 임의로 세포가 특정 세포 유형 또는 계통이 되도록 자극시킨 후에, 이를 동일 또는 다른 동물 내로 다시 삽입할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포가 Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드, Sox 폴리펩티드 및 Klf 폴리펩티드 중 적어도 하나 이상의 이종성 발현을 위한 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 Oct, Myc, Sox 또는 Klf 폴리펩티드 중 어느 것을 발현하는 발현 카세트를 포함하지 않는다. 그러한 발현 카세트를 포함하거나, 포함하지 않는 세포가 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 스크리닝 방법에 유용하다.
III . 세포
세포는 본 발명의 억제제와의 최초 접촉 이전에 만능성일 수 있거나, 세포는 본 발명의 하나 이상의 억제제와의 접촉 이후에 (예컨대, 적절한 전사 인자의 도입에 의해 및/또는 만능성을 유도하는 적절한 소형 분자와의 접촉에 의해) 만능성인 것으로 유도될 수 있다
본 발명의 방법에 임의의 동물 세포가 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포가 포유동물 세포이다. 포유동물 세포의 예로는 인간 세포 또는 래트, 마우스 (예컨대, SCID 또는 다른 마우스), 돼지, 소, 양, 개, 고양이, 및 영장류(예컨대, 레서스 원숭이, 침팬지 등)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 비인간 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 따라 사용되는 만능성 세포는 천연적으로 발생된 줄기 세포일 수 있거나, 유도 만능성 세포일 수 있다. 천연적으로 발생된 줄기 세포의 예로는 예컨대, 배아 줄기 세포를 포함한다. 배아 줄기 세포를 단리시키는 방법은 주지되어 있다. 예컨대, 문헌 ([Matsui et al., Cell 70:841, 1992]; 미국 특허 번호 제5,843,780호(Thomson 등); [Thomson et al., Science 282:114, 1998]; [Shamblott et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 95:13726, 1998]; 미국 특허 번호 제6,090,622호(Shamblott 등); [Reubinoff et al., Nat . Biotech. 18:399, 2000]; PCT WO00/27995, [Iannaccone et al., Dev . Biol. 163:288, 1994]; PCT WO99/27076(Loring 등), [Pain et al., Development 122:2339, 1996]; 미국 특허 번호 제5,340,740호; 미국 특허 번호 제5,656,479호, [Wheeler et al., Reprod . Fertil. Dev . 6:563, 1994]; [Shim et al., Biol . Reprod . 57:1089, 1997])을 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포를 배반포로부터 유도(예컨대, 배반포로부터 수득)하고, 이어서, 적어도 ALK5 억제제 및 Erk 또는 MEK 억제제의 존재하에서, 임의로는 본원에 기술된 바와 같은 다른 억제제를 사용함으로써 배양한다.
세포에서 만능성을 유도하는 데 사용될 수 있는 방법 다수가 보고되어 있다. 예를 들어, 전사 인자를 도입하거나, 또는 다르게는 특정 전사 인자의 발현을 유도 또는 모사함으로써 만능성을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하기 전사 인자들 중 하나 이상이 (예컨대, 하나 이상의 전사 인자를 발현하는 이종성 발현 카세트의 도입에 의해) 내인성 방법에 의해 또는 재조합적으로 발현된다. 만능성을 도입하는 기술의 예로는 H3K9 메틸화를 억제시키는 제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 소형 분자, 예컨대, G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 예컨대, BIX01294를 임의로 사용하여, Oct3/4, Sox2, c-Myc, 및 Klf4 중 적어도 하나를 발현시키기 위한 적어도 하나 이상의 발현 카세트를 도입하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(예컨대, 문헌 [Takahashi, Cell 131(5):861-872 (2007); Cell Stem Cell 2, 10-12 (2008)] 참조). 예컨대, 문헌 [Kubicek, et al., Mol . Cell 473-481 (2007)]을 참조할 수 있다.
본 발명의 만능성 세포는 여러 가지 기준을 특징으로 할 수 있다. 유전자 발현, 메틸화, 및 본원에 기술된 시험관내 및 생체내 특징들 이외에도, 본 발명의 만능성 세포는 백혈병 억제 인자(LIF) 및 골 형성 단백질(BMP)의 존재하에서, 또는 별법으로, TGF β 및 액티빈 신호전달 경로의 억제, MAPK 신호전달 경로의 억제, 및 임의로 FGF 경로의 억제하에서 적어도 1회(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20회 등) 이상의 세포 분열까지 내내 만능성을 유지할 것이다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, ALK5 억제제 및 MEK 억제제와 접촉하였던 동물 세포(예컨대, 인간 및 래트 세포)는 다회에 걸친 분열을 거쳐도 만능성을 유지하였다. 추가로, 본원에 기술된 바와 같이, MEK, FGFR 및 GSK3의 억제와 함께 TGFβ 및 액티빈 신호전달 경로(예컨대, TGFβ 신호 전달)을 억제시키면 강력한 리프로그래밍 활성을 갖게 되고, EpiSC로부터 mESC 유사 상태로의 부분적인 전환이 촉진될 수 있다. 대조적으로, 종래의 조건하에서 배양된 종래의 hESC, 배반엽상층 줄기 세포(EpiSC) 및 인간 유도 만능성 세포는 ALK5 억제제와 접촉하였을 때 분화된다. 예컨대, 문헌 [Saha, et al., Biophys. J. 94: 4123-4133 (2008)]을 참조할 수 있다. 종래의 조건하에서 배양된 종래의 hESC, EpiSC 및 인간 유도 만능성 세포는 자가 재생을 위한 MAPK, FGF, 및 TGFβ/액티빈/Nodal 경로 활성에 의존하는 것처럼 보이고, MEK, FGFR 및/또는 ALK4/5/7 억제제 처리시 신속하게 분화된다고 보고된 바 있다(문헌 ([Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007]; [Li et al., Differentiation 75, 299-307, 2007]; [Peerani et al., EMBO J 26, 4744-4755, 2007]; [Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007])). 추가로, 본 발명자들은 본 발명의 세포(실시예에 기술되어 있는 바와 같이 배양된 인간 또는 래트 세포)가 FGF 신호전달 경로 억제제(예컨대, PD173074)의 존재하에서 만능성을 유지한다(즉, 분화되지 않는다)는 것을 발견하게 되었다. 대조적으로, 종래의 조건하에서 배양된 hESC, EpiSC 및 인간 유도 만능성 세포는 PD173074와의 접촉시 분화된다. 특히, mESC는 PD173074와의 접촉시 분화되지 않는다. 따라서, (예컨대, 본원에 기술된 바와 같이 배양된) 본 발명의 세포는 그 상태가 종래의 방식으로 배양된 hESC, EpiSC 및 인간 유도 만능성 세포보다는 mESC와더 유사하다. mESC와 유사하게, 본 발명의 세포는 이는 보다 조밀하고, 반구형인 콜로니 형태를 갖고 있는 반면, 종래의 방식으로 배양된 hESC, EpiSC 및 인간 유도 만능성 세포는 편평한 콜로니 형태를 갖고 있다. mESC와 유사하게, 본 발명의 세포는 시험관내에서 모든 세포 유형을 발생시킬 수 있는 능력을 갖고 있고, 다시 배반포로 되돌려지게 되면, 생식선을 비롯한, 생체내 동물 전체에 기여할 수 있다. 대조적으로, 종래의 방식으로 배양된 hESC, EpiSC 및 인간 유도 만능성 세포는 내세포괴(ICM)로 도입될 수 없고, 키메라 현상에 기여할 수 없다. 래트 및 인간 이외의 유사한 특징을 갖는 다른 동물 세포도 본워에 기술된 방법을 사용하여 생성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 추가의 동물 세포에 대한 예로는 예컨대, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 원숭이, 및 침팬지를 포함한다.
특정 마커는 종래의 방식으로 배양된 hESC, EpiSC 및 인간 유도 만능성 세포로부터 본 발명의 세포를 구별짓는 데 도움이 된다. 예를 들어, Stra8, Dppa3, Gbx2, Pecam1, 및 Klf4는 종래의 방식으로 배양된 hESC, epiSCs 및 인간 유도 만능성 세포에서의 그의 발현 수준과 비교하였을 때, 본 발명의 인간 세포에서 고수준으로 발현된다. 대조적으로, 다수의 계통 특이 유전자, 예컨대, Foxa2, Otx2, Lefty1, Gata6, Sox17, Cer1은 본 발명의 세포에서의 그의 발현 수준과 비교하였을 때, epiSC 및 종래의 인간 ES 세포에서 고수준으로 발현된다. 종래의 방식으로 배양된 인간 iPSC 또는 ESC 세포는 MEK, FGFR 및/또는 ALK4/5/7 억제제로 처리되었을 때, 분화된다(문헌 ([Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007]; [Li et al., Differentiation 75, 299-307, 2007]; [Peerani et al., EMBO J26, 4744-4755, 2007]; [Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007])).
특히, Gbx2, Dppa3 및 Klf4는 본 발명의 만능성 동물 세포의 특징을 규명하는 데 유용한 마커이다. 이러한 마커는 본 발명의 만능성 세포에서 고도로 발현된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포는 종래의 방식으로 배양된 hESC, EpiSC 및 인간 유도 만능성 세포, 예컨대, Hues9 세포(하버드대 hES 시설, http://mcb.harvard.edu/melton/hues/)에서의 그의 수준의 적어도 2배가 되는 수준으로 상기 마커를 발현시킨다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 만능성 세포에서의 이들 마커의 발현 수준은 적어도 2배, 2.5배, 3배, 4배, 5배 또는 그보다 높다. 다른 유용한 마커로는 ICM 마커 Rex1을 포함한다.
일부 실시양태에서, Gbx2는 Hues9 세포에서의 수준의 적어도 5배가 되는 수준으로 본 발명의 만능성 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, Klf4는 Hues9 세포에서의 수준의 적어도 2.5배가 되는 수준으로 본 발명의 만능성 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, Dppa3은 Hues9 세포에서의 수준의 적어도 2배가 되는 수준으로 본 발명의 만능성 세포에서 발현된다.
본 발명의 만능성 세포에 대해 유용한 또 다른 마커는 E 카드헤린이다. 본 발명의 범주를 제한하고자 하지 않으면서, E 카드헤린은 본 발명의 세포의 만능성에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 일부 실시양태에서, E 카드헤린은 Hues9 세포에서의 수준의 2배가 되는 수준으로 본 발명의 만능성 세포에서 발현된다.
예컨대, Oct4, Sox2, 나노그, SSEA1, SSEA3, SSEA4, TRA-1-61, TRA-1-81, 및 알칼리성 포스파타제(ALP: alkaline phosphatase)와 같은 다른 전형적인 만능 마커가 본 발명의 세포의 특징을 규명하는 데 사용될 수 있다. 이러한 전형적인 만능 마커, 또는 그의 서브세트가 종래의 방식으로 배양된 hESC, EpiSC 및 인간 유도 만능성 세포로부터 본 발명의 만능성 세포를 구별짓는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 세포의 특징을 규명하는 데 당업계에 공지된 방법이 사용될 수 있다. 유전자 발현 수준은 예컨대, 실시간 PCR 또는 실시간 RT-PCR(예컨대, mRNA 검출용)에 의해, 및/또는 웨스턴 블롯 또는 다른 단백질 검출 기법에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 만능성 세포는 BMP 처리에 대한 반응으로 중배엽 계통쪽으로 분화된다. 대조적으로, 종래의 방식으로 배양된 hESC, EpiSC 및 인간 유도 만능성 세포는 영양막 또는 원시 내배엽 세포를 생성한다(문헌 ([Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007]; [D'Amour et al., Nat Biotechnol 23, 1534-1541, 2005]; [Xu et al., Nat Biotechnol 20, 1261-1264, 2002])).
IV . 형질전환
(예컨대, iPSC를 생성하는 데, 또는 원하는 단백질 또는 핵산을 발현시키는 데) 형질전환된 세포가 바람직할 경우, 본 발명의 억제제(예컨대, ALK5 억제제, MAPK 억제제, FGF 경로 억제제, 및 임의로 GSK3β 억제제)와 접촉시키는 세포를 접촉 이전에 형질전환시킬 수 있고/거나, 접촉 이후에 형질전환시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한가지 이점은 다회에 걸친 다중 세포 계대접종을 통해 만능성 세포를 유지할 수 있고, 이로써 세포의 만능 특징을 유지시키면서 자손을 조작하고 이어서 선별할 수 있다는 점이다. 이는 특히, 본원에 기술된 바와 같이, 서열 특이 재조합 이벤트를 통해 넉 아웃 동물을 생성하는 것과 같이, 트랜스제닉 동물을 생성하는 데 있어 유용하다.
본 발명은 재조합 유전학 분야의 통상적인 기법에 의존한다. 본 발명에서의 일반 사용 방법을 개시하는 기본 교재로는 문헌 ([Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds., 1994)]))을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질의 양성 발현이 바람직한 경우, 발현시키고자 하는 단백질 및 세포 종은 동일한 것이 된다. 예를 들어, 마우스 세포가 사용된다면, 마우스 오솔로그를 세포 내로 도입한다. 인간 세포가 사용된다면, 인간 오솔로그를 세포 내로 도입한다.
2개 이상의 단백질을 세포내에서 발현시키고자 하는 경우, 하나 또는 다중의 발현 카세트가 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 하나의 발현 카세트가 다중의 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 것일 경우, 폴리시스트론성 발현 카세트가 사용될 수 있다.
A. 플라스미드 벡터
특정 실시양태에서, 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용하기 위한 것으로서 플라스미드 벡터가 주시된다. 일반적으로, 숙주 세포와 화합성인 종으로부터 유래된 제어 서열 및 레플리콘을 포함하는 플라스미드 벡터가 상기 숙주와 관련하여 사용된다. 상기 벡터는 레플리콘 부위를 보유할 뿐만 아니라, 형질전환된 세포에서 표현형에 의해 선별될 수 있도록 하는 마킹 서열을 보유할 수 있다.
B. 바이러스 벡터
세포를 감염시키거나, 또는 수용체 매개 세포내이입을 통해 세포내로 진입할 수 있고, 숙주 세포 게놈 내로 통합되어 바이러스 유전자를 안정하고 효율적으로 발현시킬 수 있는 특정 바이러스의 능력을 통해 해당 바이러스는 외래 핵산을 세포(예컨대, 포유동물 세포) 내로 전달할 수 있는 관심을 끄는 후보 물질이 되었다. 본 발명의 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있는 바이러스 벡터에 대한 비제한적인 예를 하기에 기술한다.
ⅰ. 아데노바이러스 벡터
핵산을 전달하는 특별한 방법은 아데노바이러스 발현 벡터를 사용하는 것을 포함한다. 아데노바이러스 벡터가 게놈 DNA 내로의 통합에 대한 낮은 능력을 갖는 것으로 알려져 있지만, 이러한 특징은 이 벡터에 의해 제공되는 고효율의 유전자 전달에 의해 상쇄된다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (ａ) 구성물의 팩키징을 지원하는 데 충분하고, (ｂ) 조직 또는 세포 내에서 클로닝된 조직 또는 세포 특이 구성물을 궁극적으로 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 구성물을 포함한다는 것을 의미한다. 유전자 구조 또는 아데노바이러스, ~36 kb, 선형, 더블 스트랜드 DNA 바이러스에 관한 지식을 통해 큰 아데노바이러스 DNA 조각을 7 kb 이하의 외래 서열로 치환시킬 수 있다(문헌 [Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2): 535-546, (1992)]).
ⅱ. AAV 벡터
아데노바이러스 보조 형질감염을 사용하여 핵산을 세포로 도입할 수 있다. 아데노바이러스 커플링 시스템을 이용하는 세포 시스템에서 형질감염 효율이 증가된 것이 보고된 바 있다(문헌 ([Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6): 1110-7, 1994]; [Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13): 6094-6098, 1992]; [Curiel, Nat Immun , 13(2-3): 14164, 1994])). 아데노 보조 바이러스(AAV: Adeno-associated virus)는 그의 통합 빈도가 높고, 비분할 세포를 감염시킴으로써 예를 들면, 조직 배양물 중에서 (문헌 [Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992]) 또는 생체내에서 유전자의 포유동물 세포로의 전달이 유용하게 만들기 때문에 관심을 끄는 벡터 시스템이다. rAAV 벡터의 생성 및 사용에 관한 상세한 설명은 미국 특허 번호 제5,139,941호 및 제4,797,368호(이들 각각이 본원에서 참고로 포함된다)에 기재되어 있다.
ⅲ. 레트로바이러스 벡터
레트로바이러스는 그의 유전자를 숙주 게놈으로 통합시켜 대량의 외래 유전 물질을 전달함으로써 특수 세포주에서 팩키징되는 광범위한 범위의 종 및 세포 유형을 감염시킬 수 있는 그의 능력에 기인하여 유전자 전달 벡터로서 유망하다(문헌 [Miller et al., Am . J. Clin . Oncol, 15(3):216-221, 1992]).
레트로바이러스 벡터를 구성하기 위해, 특정 바이러스 서열 대신에 핵산(예컨대, 관심의 대상이 되는 유전자를 코딩하는 것)을 바이러스 게놈 내로 삽입하여 복제 결함인 바이러스를 제조한다. 비리온을 제조하기 위해, gag, pol, 및 env 유전자는 함유하지만, LTR 및 팩키징 성분은 함유하지 않는 팩키징 세포주를 구성한다(문헌 [Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983]). 레트로바이러스 LTR 및 팩키징 서열과 함께, cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드를 (예컨대, 인산칼슘 침전에 의해) 특수 세포주 내로 도입하면, 팩키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자내로 팩키징될 수 있게 하고, 이어서 이는 배양 배지로 분비된다(문헌 ([Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988]; [Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986]; [Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983])). 이어서, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전달을 위해 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 광범위하게 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정한 발현은 전형적으로 숙주 세포의 분열을 수반한다(문헌 [Paskind et al., Virology, 67:242-248, 1975]).
렌티바이러스는 통상의 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 이외에, 조절상 또는 구조상의 기능을 갖는 다른 유전자를 함유하는 복합 레트로바이러스이다. 렌티바이러스 벡터는 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, 문헌 ([Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996]; [Zufferey et al., Nat Biotechnol , 15(9):871-875, 1997]; [Blomer et al., J Virol , 71(9):6641-6649, 1997]; 미국 특허 번호 제6,013,516호 및 제5,994,136호)). 렌티바이러스의 몇몇 예로는 인간 면역결핍 바이러스: HIV-1, HIV-2 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV: Simian Immunodeficiency Virus)를 포함한다. HIV 병독성 유전자, 예를 들어, 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef를 복합적으로 약독화시켜 상기 유전자가 결실된 렌티바이러스 벡터를 생성하고, 이를 통해 상기 벡터가 생물학상 안정적인 벡터가 되도록 만든다.
재조합 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 핵산 서열의 발현, 둘 모두에 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 숙주 세포가 팩키징 기능, 즉, gag, pol 및 env, 및 rev 및 tat를 보유하는 2종 이상의 벡터에 의해 형질감염된 것인, 비분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스는 미국 특허 번호 제5,994,136호(본원에서 참고로 포함된다)에 기재되어 있다. 특정 세포 유형의 수용체에 표적화시키기 위해 외피 단백질을 항체 또는 특정 리간드와 결합시킴으로써 재조합 바이러스를 표적화할 수 있다. 특이적인 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 코딩하는 또 다른 유전자와 함께, 관심의 대상이 되는 서열(조절 영역 포함)을 바이러스 벡터 내로 삽입함으로써, 예를 들면 상기 벡터는 이제 표적 특이적이다.
ⅳ. 변형 바이러스를 이용한 전달
전달하고자 하는 핵산을, 특이적 결합 리간드를 발현하도록 조작된 감염성 바이러스 내에서 하우징할 수 있다. 따라서, 바이러스 입자는 표적 세포의 동족 수용체에 특이적으로 결합하고 내용물을 상기 세포로 전달할 것이다. 레트로바이러스 벡터를 특이적으로 표적화하도록 디자인된 신규한 접근법은 락토스 잔기를 바이러스 외피에 화학적으로 첨가함으로써 이루어진 레트로바이러스의 화학적 변형에 기초하여 개발되었다. 상기 화학 변형은 시알로당단백질 수용체를 통한 간 세포의 특이적 감염을 허용할 수 있다.
레트로바이러스 외피 단백질에 대한 및 특이적 세포 수용체에 대한 비오틴화된 항체가 사용되는, 재조합 레트로바이러스를 표적화하는 또 다른 접근법이 디자인되었다. 스트렙타비딘을 사용함으로써 비오틴 성분을 통해 상기 항체를 커플링하였다(문헌 [Roux et al, Proc . Nat'lAcad . Sci . USA, 86:9079-9083, 1989]). 주조직 접합성 복합체 I형 및 II형 항원에 대한 항체를 사용함으로써, 시험관내에서 동종지향성 바이러스에 의해 상기 표면 항원을 뚫는 각종 인간 세포의 감염을 입증하였다(문헌 [Roux et al., 1989]).
C. 벡터 전달 및 세포 형질전환
본 발명에 사용하기 위한 세포, 조직 또는 유기체의 형질전환에 적합한 핵산 전달 방법은 사실상, 본원에 기술되어 있거나, 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 것과 같이, 핵산(예컨대, DNA)을 세포, 조직 또는 유기체로 도입할 수 있는 임의의 방법을 포함하는 것으로 여겨진다. 그러한 방법으로는 예컨대, 임의로 퓨진6(Fugene6)(Roche) 또는 리포펙트아민(Invitrogen)에 의한 생체외 형질감염에 의해(문헌 ([Wilson et al., Science , 244: 1344-1346, 1989], [Nabel and Baltimore, Nature 326:711-713, 1987])); 미세주사(문헌 ([Harland and Weintraub, J Cell Biol , 101:1094-1099, 1985]; 미국 특허 번호 제5,789,215호(본원에서 참고로 포함된다)))를 비롯한, 주사에 의해(특허 번호 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호, 및 제5,580,859호(이들 각각이 본원에서 참고로 포함된다))); 전기천공에 의해(문헌 (특허 번호 제5,384,253호(본원에서 참고로 포함된다); [Tur-Kaspa et al., Mol . Cell Biol., 6:716-718, 1986]; [Potter et al., Proc . Nat'lAcad . Sci . USA, 81:7161-7165, 1984])); 인산칼슘 침전에 의해(문헌 ([Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973]; [Chen and Okayama, Mol . Cell Biol, 7(8):2745-2752, 1987]; [Rippe et al., Mol . Cell Biol, 10:689-695, 1990])); DEAE 덱스트란을 사용한 후, 폴리에틸렌 글리콜을 사용함으로써(문헌 [Gopal, Mol . Cell Biol, 5:1188-1190, 1985]); 직접적인 음 로딩에 의해(문헌 [Fechheimer et al., Proc . Nat'lAcad . Sci . USA, 84:8463-8467, 1987]); 리포좀 매개 형질감염에 의해(문헌 ([Nicolau and Sene, Biochim . Biophys . Acta , 721:185-190, 1982]; [Fraley et al., Proc . Nat'lAcad . Sci. USA , 76:3348-3352, 1979]; [Nicolau et al., Methods Enzymol, 149:157-176, 1987]; [Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980]; [Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989]; [Kato et al., J Biol . Chem., 266:3361-3364, 1991])) 및 수용체 매개 형질감염에 의해(문헌 ([Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988]; [Wu and Wu, J. Biol Chem ., 262:4429-4432, 1987](이들 각각이 본원에서 참고로 포함된다))); 및 상기 방법의 임의 조합인 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
Ⅴ. 세포 배양
배아 줄기 세포, 및 만능성으로 유도되거나, 유도시키고자 하는 세포를 비롯한, 만능성 세포를 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 배양할 수 있다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 일부 실시양태에서, 만능성 세포를 ALK5 억제제, 및 MEK 또는 Erk 억제제 중 하나, 임의로 GSK3β 억제제 및/또는 LIF와 함께 배양한다. 배양 배지는 당업계에 공지되어 있는 바와 같은, 배양 배지의 임의의 다른 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 세포 생존을 위한 기초 배지 성분(예컨대, 비타민 및 미네랄, 임의로 등장성 조건하)을 포함한다. 기초 배지의 예로는 DMEM 또는 그의 변형물, 예컨대, DMEM 넉 아웃이 있다. 배양물을 추가로 넉 아웃 혈청 대체물(KSP: Knock-out serum replacement)로 보충할 수 있다. 본 발명의 배양물은 하나 이상의 탄소 공급원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배양물은 L-아날릴-L-글루타민을 포함한다. 배양물은 혈청을 포함할 수 있거나, 또는 무혈청인 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포를 피더 세포와 접촉시켜 상기 세포를 배양한다. 피더 세포의 예로는 섬유아세포 세포, 예컨대, 마우스 배아 섬유아세포(MEF: mouse embryonic fibroblast) 세포, 또는 x선에 의해 불활성화된 CF1 피더 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 피더 세포 상에서 세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 세포를 피더 세포의 부재하에서 배양한다. 예를 들어, 세포를 예컨대, 분자 테더를 통해 고체 배양 표면(예컨대, 배양 플레이트)에 직접 부착시킬 수 있다. 피더 세포 상에서 배양되고, 그외에는 동일하게 처리된 세포의 유도율과 비교하면, 세포를 고체 배양 표면에 직접 부착시켰을 때 만능성으로의 유도 효율이 더 높았다(즉, 더 많은 비율의 세포가 만능성을 달성)는 것을 본 발명자들은 발견하게 되었다. 분자 테더의 예로는 마트리겔, 세포외 기질(ECM: extracellular matrix), ECM 유사체, 라미닌, 피브로넥틴, 또는 콜라겐을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 당업자는 이것이 비제한적인 목록이고, 세포를 고체 표면에 부착시키는 데 다른 분자들이 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 맨처음 테더를 고체 표면에 부착시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
Ⅵ. 만능성 세포의 사용
본 발명은 예방학적 또는 치료학적 용도를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 줄기 세포 기술에 관한 추가 연구 및 개발을 허용한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포(본 발명의 억제제 중에서 배양된 만능성 세포, 또는 상기 세포로부터 유래되고, 원하는 세포 운명에 따라 분화되도록 유도된 세포)를 기관, 조직, 또는 세포 유형의 재생을 필요로 하는 개체를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 그를 필요로 하는 개체 내로 도입한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 원래 개체의 생검으로부터 수득되고; 본원에 기술된 바와 같이, 만능성으로 유도되고, 임의로 (예컨대, 특정의 원하는 선조 세포로) 분화되도록 유도된 후, 개체에게 다시 이식된다. 일부 실시양태에서, 세포가 개체 내로 다시 도입되기 이전에 유전적으로 변형한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 만능성 세포는 이어서 예를 들어, 조혈(줄기/선조) 세포, 신경(줄기/선조) 세포(및 임의로, 더 분화된 세포, 예컨대, 서브타입 특이적 뉴런, 올리고수지상 세포 등), 췌장 세포(예컨대, 내분비 선조 세포 또는 췌장 호르몬 발현 세포), 간 세포, 심혈관(줄기/선조) 세포(예컨대, 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포), 망막 세포 등을 형성하도록 유도된다.
만능성 줄기 세포의 원하는 세포 유형으로의 분화를 유도하는 각종 방법이 공지되어 있다. 줄기 세포의 다양한 세포 운명으로의 분화를 유도하는 방법을 기술하는 최근 특허 공개 공보의 비제한적인 목록은 하기와 같다: 미국 특허 공보 번호 제2007/0281355호; 제2007/0269412호; 제2007/0264709호; 제2007/0259423호; 제2007/0254359호; 제2007/0196919호; 제2007/0172946호; 제2007/0141703호; 제2007/0134215호.
특정 손상 조직으로 또는 만능성 세포가 이익이 될 수 있는 다른 조직으로 본 발명의 만능성 세포를 도입, 및 임의로는 표적화함으로써 각종 질환을 호전시킬 수 있다. 조직 손상으로부터 유발되는 질환의 예로는 신경퇴행성 질환, 뇌경색, 폐쇄성 혈관 질환, 심근경색, 심부전, 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐기종, 기관지염, 간질성 폐 질환, 천식, B형 간염(간 손상), C형 간염(간 손상), 알콜 간염(간 손상), 간경변(간 손상), 간기능 부전(간 손상), 췌장염, 당뇨병, 크론병, 염증성 대장염, IgA 사구체 신염, 사구체 신염, 신부전, 욕창, 화상, 봉합 상처, 열상, 절상, 교상, 피부염, 반흔성 켈로이드, 켈로이드, 당뇨병성 궤양, 동맥성 궤양 및 정맥성 궤양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 억제제와 함께 인큐베이션된 만능성 세포로부터 트랜스제닉 동물(예컨대, 비인간 동물)이 생성된다. 그러한 세포는 트랜스제닉 세포, 넉 아웃 세포주(예컨대, 부위 특이 재조합을 통해 선별가능한 마커를 도입하는 하나 이상의 유전자가 넉 아웃된 것)일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 억제제와 함께 인큐베이션된 만능성 세포를 화합성을 가진 동물로부터의 배반포 내로 도입한 후, 이어서, 동물의 수용 자궁 내로 도입하고, (예컨대, 선별가능한 마커, 또는 다른 표현형상의 특징들, 예컨대, 외피 색상을 통해) 만능성 세포로부터 유도된 세포에 대하여 생성된 자손을 선별할 수 있다. 키메라 자손을 확인할 수 있고, 특징을 만능성 세포로부터 자손으로 전달(예컨대, 트랜스진)하는 세포주가 확립될 수 있다. 자매종인 동물끼리 교배시킴으로써 동형접합성 동물 세포주를 확립시킬 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따라 임의 유형의 트랜스제닉 동물을 생성하는 것을 제공한다. 동물의 예로는 비인간 포유동물, 및 비인간 영장류를 포함한다. 동물의 예로는 예컨대, 마우스(SCID 마우스 포함), 래트, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 원숭이, 및 침팬지를 포함한다.
세포를 본 발명의 억제제와 함께 배양하고, 이에 세포의 만능성을 유지시킴으로써 세포 표현형, 약물 반응에 관해 편리하게 스크리닝할 수 있고, 또한 만능성 세포의 표현형을 조정할 수 있거나, 원하는 세포 반응을 유도할 수 있는 능력에 관해 화합물 라이브러리 또는 다른 제제(예컨대, 단백질, 핵산, 또는 항체)에 대하여 스크리닝할 수 있다. 라이브러리 스크린은 본질적으로 임의의 원하는 표현형에 영향을 미칠 수 있는 라이브러리 구성원의 능력에 관해 스크리닝하도록 디자인될 수 있다. 표현형의 예로는 예를 들어, 세포 분화, 아포프토시스 또는 다른 세포 사멸, 세포 생존, 사멸, 또는 관심의 대상이 되는 추가의 화합물 또는 약물 존재하의 다른 표현형을 포함할 수 있다.
상기 라이브러리 내의 제제는 임의의 소형 화합물, 또는 생물학적 엔티티, 예컨대, 단백질, 당, 핵산 또는 지질일 수 있다. 전형적으로, 테스트 제제는 소형 화학 분자 및 펩티드일 것이다. 본질적으로, 수용액 또는 유기 용액(특히, DMSO 계) 중에 용해될 수 있는 화합물이 대부분 종종 사용되지만, 본 발명의 분석에서는 임의의 화합물이 잠재 제제로서 사용될 수 있다. 분석 단계를 자동화하고, 임의의 편리한 공급원으로부터 얻은 화합물을 분석에 제공함으로써 대형 화학물질 라이브러리를 스크리닝하도록 상기 분석을 디자인하고, 이는 전형적으로 병렬로 (예를 들어, 로봇 분석에서 미량역가 플레이트에서 미량역가 포맷으로) 수행된다. 시그마(Sigma)(미주리주 세인트 루이스 소재), 알드리치(Aldrich)(미주리주 세인트 루이스 소재), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미주리주 세인트 루이스 소재), 플루카 케미카-바이오케미카 아날리티카(Fluka Chemika-Biochemica Analytika)(스위스 부흐 소재) 등을 비롯한, 화학 화합물의 공급업체가 다수 존재한다는 것을 이해할 것이다.
조합 화학물질 라이브러리는 다수의 화학물질 "빌딩 블록," 예컨대 시약을 조합함으로써 화학적 합성 또는 생물학적 합성 중 어느 하나에 의해 생성되는 다양한 화학 화합물 집합물이다. 예를 들어, 소정 화합물 길이(즉, 폴리펩티드 화합물 내 아미노산의 개수)에 대해 모든 가능한 방식으로 한 세트의 화학물질 빌딩 블록(아미노산)을 조합함으로써 선형 조합 화학물질 라이브러리, 예컨대, 폴리펩티드 라이브러리를 형성한다. 화학물질 빌딩 블록의 조합 혼합을 통해 수백만 개의 화학 화합물을 합성할 수 있다.
조합 화학물질 라이브러리의 제조 및 스크리닝은 당업자에게 주지되어 있다. 이러한 조합 화학물질 라이브러리로는 펩티드 라이브러리(예컨대, 문헌 (미국 특허 5,010,175, 문헌 [Furka, Int . J. Pept . Prot . Res . 37:487-493 (1991)] 및 [Houghton et al., Nature 354:84-88 (1991)]) 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 다양한 화학물질 라이브러리를 생성하기 위해 다른 화학물질을 사용할 수 있다. 이러한 화학물질로는 펩토이드(예컨대, PCT 공보 번호 WO 91/19735), 코딩된 펩티드(예컨대, PCT 공보 WO 93/20242), 무작위 바이오-올리고머(예컨대, PCT 공보 번호 WO 92/00091), 벤조디아제핀(예컨대, 미국 특허 번호 제5,288,514호), 다이버소머(diversomer), 예컨대, 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드(문헌 [Hobbs et al., Proc . Nat . Acad . Sci . USA 90:6909-6913 (1993)]), 비닐계 폴리펩티드(문헌 [Hagihara et al., J. Amer . Chem . Soc . 114:6568 (1992)]), 글로코스가 스캐폴딩된 비펩티드성 펩티도미메틱(문헌 [Hirschmann et al., J. Amer . Chem . Soc. 114:9217-9218 (1992)]), 소형 화합물 라이브러리의 유사 유기 신테제(문헌 [Chen et al., J. Amer . Chem . Soc. 116:2661 (1994)]), 올리고카르바메이트(문헌 [Cho et al., Science 261:1303 (1993)), 및/또는 펩티딜 포스포네이트(문헌 [Campbell et al., J. Org . Chem. 59:658 (1994)), 핵산 라이브러리(문헌 [Ausubel, Berger and Sambrook, 상기 동일 문헌] 참조), 펩티드 핵산 라이브러리(예컨대, 미국 특허 5,539,083 참조), 항체 라이브러리(예컨대, 문헌 ([Vaughn et al, Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996)] 및 PCT/US96/10287) 참조), 당질 라이브러리(예컨대, 문헌 ([Liang et al, Science, 274:1520-1522 (1996)] 및 미국 특허 5,593,853 참조), 소형 유기 분자 라이브러리(예컨대, 벤조디아제핀(문헌 [Baum C&EN, Jan 18, page 33 (1993)]); 이소프레노이드(미국 특허 5,569,588); 티아졸리디논 및 메타티아자논(미국 특허 5,549,974); 피롤리딘(미국 특허 5,525,735 및 5,519,134); 모르폴리노 화합물(미국 특허 5,506,337); 벤조디아제핀(5,288,514) 등 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
조합 라이브러리를 제조하기 위한 장치는 상업적으로 이용가능하다(예컨대, 357 MPS, 390 MPS(켄터키주 루이빌 소재의 Advanced Chem Tech), Symphony(매사추세츠주 워번 소재의 Rainin), 433A(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems), 9050 Plus(매사추세츠주 베드포드 소재의 Millipore)). 추가로, 다수의 조합 라이브러리 그 자체는 상업적으로 이용가능하다(예컨대, 뉴저지주 프린스턴 소재의 ComGenex, 미주리주 세인트 루이스 소재의 Tripos, Inc., 펜실베니아주 엑스턴 소재의 3D Pharmaceuticals, 메릴랜드주 콜롬비아 소재의 Martek Biosciences).
실시예
요약: 이에, 본 발명자들은 LIF 및 ALK5 억제제, GSK3 억제제 및 MEK 억제제로 이루어진 칵테일에 의해 동종으로 유지될 수 있는, 신규한 래트 iPSC(riPSC: rat iPSC)를 성공적으로 확립하였음을 보고하였다. riPSC는 마우스 ESC 특징들을 공유하며, 가장 중요하게는 키메라 현상에 광범위하게 기여할 수 있다. 본 발명자들은 또한, 놀랍게도 MEK 억제제 및 ALK5 억제제의 존재하에 배양물 중에서 유지될 수 있는 것인, "마우스 ESC 유사" 특징을 가진 신규한 인간 iPSC(hiPSC: human iPSC)를 생성하였다. 본 발명자들은 본 발명자들의 실험이 그의 진정 배아 줄기 세포가 여전히 이용가능하지 않은 래트 또는 다른 종으로부터의 리프로그래밍에 의해 만능성 줄기 세포를 생성할 수 있는 구조적 틀을 제공할 것이라고 제안한다.
실시예 1:
본 실시예는 래트 만능성 세포의 생성 및 유지를 입증한다.
Oct4 / Klf4 / Sox2 바이러스 형질도입 및 화학물질 칵테일에 의한 WB-F344 세포로부터 유래된 신규한 riPSC 의 생성. 레트로바이러스에 의해 Oct4, Sox2 및 Klf4를 2배체 래트 간 선조 세포주인 WB-F344(문헌 [Grisham et al., Proc Soc Exp Biol Med 204, 270-279 (1993)])에 형질도입시킨 후, 종래의 mESC 배지 중 MEF 피더 세포 상에서 분리하였다. 형질도입 후 10일이 경과하였을 때, 조밀한 알칼리성 포스파타제(ALP) 양성 ESC 유사 콜로니가 관찰되었다(효율 약 0.4%)(도 1A). 그러나, ESC 유사 콜로니를 채취하고, 동일한 배지 중에서 계대배양하였을 때에는, 신속하게 분화되었고, ESC 형태를 상실하였는데(도 1B), 이는 종래의 mESC 배지 조건이 riPSC의 만능성을 유지시키는 데 충분하지 않다는 것을 시사한다. 소형 분자가 중요한 분화 유도 경로를 저해할 수 있다는 개념을 가정하였을 때, 본 발명자 등은 보다 강력한 방식으로 mESC 자가 재생을 지지하는 소형 분자를 앞서 확인하게 되었고, 이를 사용하였다(문헌 ([Schugar et al., Gene Ther 15, 126-135 (2008)]; [Xu et al., Nat Biotechnol 20, 1261-1264 (2002)])). mESC 및 EpiSC/hESC의 자가 재생을 유지시키기 위한 신호 전달에서의 차이와 상기 화학적 전략법에 기초하여, 본 발명자들은 MEK 억제제 PD0325901, ALK5(TGFβ 신호 전달의 주된 I형 수용체) 억제제 A-83-01, GSK3β 억제제 CHIR99021, 및 FGFR 억제제 PD173074를 선택하고, 상이한 소형 분자의 조합이 riPSC의 만능성을 유지시키는 데 미치는 효과에 대하여 테스트하였다. 0.5 μM PD0325901 및 3 μM CHIR99021의 조합물을 사용하여, riPSC를 배양물 중에서 단기간 동안은 유지시킬 수 있지만, 광범위하게 자발적인 분화를 나타내었다(도 1C). 일련의 계대접종 후, 상기 조건하에서 성장을 한 세포는 보다 느리게 증식하였고, 분화된 세포의 증식으로 인해 배양물은 황폐화되었다. CHIR99021 및 FGFR 억제제 PD173074와 조합된 PD0325901이 LIF에 비의존하는 방식으로 mESC 만능성을 유지시킬 수 있다는 것이 최근 연구를 통해서 입증되었다(문헌 [Ying et al, Cell 115, 281-292 (2003)]). 그러나, PD0325901 및 CHIR99021의 조합과 유사하게, 배지 중 PD173074(0.1 μM)를 포함할 경우, 추가의 이점을 나타나지 않았다. 액티빈 A/Nodal 신호 전달이 미분화 상태의 hESC 및 EpiSC를 유지시키는 데는 중요하지만, mESC 자가 재생에는 없어도 되기 때문에, 이에 본 발명자들은 PD0325901, CHIR99021 및 TGF-β 억제제 A-83-01의 조합이 분화를 억제시킬 수 있고, riPSC의 자가 재생을 촉진시킬 수 있는지 여부를 테스트할 수 있다. 흥미롭게도, 0.5 μM PD0325901, 3 μM CHIR99021 및 0.5 μM A-83-01의 조합물을 사용할 경우, riPSC는 더욱 동종성인 집단으로서 성장을 하며, 자발적인 분화는 실질적으로 억제되었다(도 1D). 그러한 조건하에서 클론 확장 효율은 또한 PD0325901 및 CHIR99021 조합과 비교하였을 때 현저히 증가하였다(도 5). 추가로, 비록 LIF 그 자체가 riPSC 자가 재생을 유지시키는 데에는 충분하지는 않지만, 단지 극소량의 ALP 양성 콜로니만이 관찰되었고, LIF의 부재하에서는 장기간 유지될 수는 없었다(도 5). 또한, 장기간의 riPSC 자가 재생을 위해서는 억제제로 이루어진 독특한 화학물질 칵테일이 필요하였다. LIF, PD0325901, A-83-01, 및 CHIR99021의 존재하에서 riPSC를 30회 초과로 계대접종하여 배양하였을 때 뚜렷한 분화도 증식 감소도 없었지만, 화학적 억제제를 배지로부터 제거한 후에는 1회 계대접종 이내에 ESC 형태를 상실하였고 분화되었다. 배양물 중 전형적인 반구형 콜로니를 형성하는 것에 있어서 이러한 조건하에서의 riPSC는 종래의 mESC와 유사하였다(도 1E). 면역세포화학법을 통해 riPSC는 전형적인 mESC 마커, 예컨대, Oct4(도 1F), Sox2(도 1G), SSEA1(도 1H, 녹색), 나노그(도 1H 적색)를 발현시켰지만, hESC 마커, 예컨대, SSEA3, SSEA4 및 TRA-1-81에 대해서는 음성인 것으로 밝혀졌다. 래트 유전자 프라이머를 사용하여 4개의 클로날 riPSC 세포주에 대해 RT-PCR 분석을 수행함으로써 내인성 래트 Oct4, Sox2, 나노그, Klf4, REX1, TDGF2, FGF4 및 Eras의 발현을 확인하였다(도 1I). 트랜스진에 대한 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR 분석을 수행함으로써 형질도입된 마우스 Oct4, Sox2 및 Klf4 유전자가 대체로 침묵화된 것으로 밝혀졌다(도 1I). 래트 Oct4 프로모터의 메틸화 상태를 분석한 결과, riPSC와 WB-F344 세포 사이에는 차별적인 메틸화가 있는 것으로 나타났다. riPSC 클론은 거의 완전한 탈메틸화 패턴을 나타내었고, 이는 모체 WB-F344 세포의 것과는 달랐다(도 1J). 특히, riPSC는 mESC와 공통된 분자적 특성을 공유하였고, 특히, 착상 후 단계의 배반엽상층 및 EpiSC에는 존재하지 않는 ESC 및 조기 배반엽상층 마커인 REX1 및 ALP를 발현시켰다.
riPSC 는 시험관내 및 생체내 만능성 줄기 세포이다. riPSC의 발생능을 조사하기 위해 시험관내 분화에 대한 분석을 수행하였다. riPSC가 표준 배아유사체 분화 방법하에서 내배엽(알부민 및 Pdx1)(도 2A, 2B), 신경외배엽(βIII 튜불린, Tuj1)(도 2C) 및 중배엽(브라큐리)(도 2D) 유도체로 분화될 수 있다는 것이 면역염색법을 통해 나타났다. 이어서, 본 발명자들은 riPSC의 생체내 발생능에 대하여 조사하였다. riPSC는 중증 복합 면역결핍증(SCID: Severe Combined Immunodeficient)을 앓는 마우스 내로 이식된 후, 신경상피 유사 구조(외배엽), 기도 상피(내배엽), 연골 유사 구조(중배엽) 및 평활근(중배엽)(도 2E~2H)을 비롯한 3개의 배엽층 모두로 구성된 기형종을 형성하였다. 브라운 노르웨이 래트(검은색 털) 배반포(n=18)로 주사된 후, 3마리의 래트가 태어났으며, 이들 모두 외피 색상에 있어 광범위한 키메라 현상을 보였다는 것이 가장 주목할만 하였다(도 2I). 그러나, 어떤 생식선 전달도 검출되지는 않았다. 이를 묶어 정리해 본 바, 상기 결과를 통해 만능 mESC 유사 래트 줄기 세포주로서, 래트 EpiSC와는 다른 본 발명자들의 riPSC가 정의되었다.
실시예 2:
본 실시예는 마우스 배아 줄기 세포와 유사한 상태로 인간 만능성 세포를 유도하고 유지시키기 위한 배양 배지를 입증한다.
mESC와는 대조적으로, 종래의 hESC 및 EpiSC의 자가 재생을 유지시키기 위해서는 bFGF 및 TGFβ/액티빈/Nodal 신호 전달이 필수적이다. 종래의 hESC 배양 조건하에서 TGFβ/액티빈/Nodal 또는 FGFR 신호를 억제하면 hESC 및 EpiSC의 분화는 급격하게 빠른 속도로 일어난다. 최근, bFGF 배양 조건하에서 Oct4, Sox2, c- Myc, 및 Klf4 또는 Oct4, Sox2, 나노그, 및 Lin28의 발현에 의해 섬유아세포로부터 인간 유도 만능성 줄기 세포(hiPSC: human induced pluripotent stem cell)가 생성되었다(문헌 ([Dimos et al, Science 321, 1218-1221 (2008)]; [Lowry et al., Proc Natl Acad Sci USA 105, 2883-2888 (2008)]; [Nakagawa et al., Nat Biotechnol 26, 101-106 (2008)]; [Takahashi et al, Cell 131, 861-872 (2007)]; [Yu et al., Science 318, 1917-1920 (2007)])). 자가 재생 및 세포 형태를 위해 신호 전달을 필요로 한다는 점에서 상기 hiPSC는 종래의 hESC 및 EpiSC와 매우 유사하다. 래트에 관한 연구에 기초하여, 본 발명자들은 인간 만능성 줄기 세포를 위한 mESC 유사 만능성 상태가 포획되고 유지될 수 있는지 여부를 조사하였다. 놀랍게도, 종래의 조건(문헌 [Yu et al., Science 318, 1917-1920 (2007)])하의 것과 유사한 시간 조절 및 효율(도 3A, 평균 1x105개의 형질도입된 세포로부터 15~20개의 iPS 세포 콜로니)로, hLIF를 함유하는 mESC 배지 중에서의 Oct4, Sox2, 나노그, 및 Lin28의 바이러스 발현에 의해 hiPSC가 IMR90 인간 섬유아세포로부터 효율적으로 생성될 수 있고, 이어서, 이는 선별되고, ALK5, GSK3 및 MEK 억제제로 이루어진 화학물질 칵테일 첨가에 의해 확장될 수 있다는 것을 본 발명자들은 발견하였다. 상기 hiPSC는 hLIF 및 PD0325901, A-83-01 및 CHIR99021로 이루어진 화학물질 칵테일하에서 장기간 동안 동종으로 자가 재생(>20 계대접종)하였다(도 3B). 종래의 hESC와는 대조적으로, 이러한 hiPSC는 mESC와 유사한 ALP 양성 반구형 콜로니를 형성하였고(도 3C), MEK 억제제 및 ALK5 억제제에 대해서는 내성을 띤 반면, 동일한 조건하에서 종래의 hESC 세포주 H1은 신속하게 분화되었다. 이러한 hiPSC는 전형적인 만능성 마커, 예컨대, Oct4, Sox2, 나노그, TRA-1-81, SSEA3 및 SSEA4를 동종으로 발현시켰다(도 3D-3I). 상기 조건하에서 4개의 클로날 hiPSC 세포주에 대해 RT-PCR 분석을 수행함으로써 내인성 인간 Oct4, Sox2, 나노 그, REX1, TDGF2 및 FGF4의 발현을 확인하였다(도 3J). 트랜스진에 대한 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR 분석을 수행함으로써 형질도입된 Oct4, Sox2 및 나노그 유전자가 대체로 침묵화된 것으로 밝혀졌다(도 3J). 또한, 이러한 hiPSC는 Oct4 프로모터 상에서 H1 인간 ESC와 유사한 DNA 메틸화 패턴을 나타내었고, 이는 IMR90 섬유아세포의 것과는 달랐다(도 3K). riPSC와 유사하게, hiPSC의 반구형 콜로니 형태 및 장기간의 시험관내 자가 재생을 유지시키기 위해서는 억제제 칵테일이 필요하였다. 억제제 칵테일을 제거하자 1회 계대접종 이내에 콜로니 형태를 상실하였다. 배지로부터 hLIF를 제거하였을 때에는 세포에 대해 즉각적인/극적인 효과는 나타나지 않았다. 그러나, hiPSC를 장기간 동안 배양하는 데에는 hLIF가 유용한 것처럼 보였다. 화학적 억제제는 함유하였지만, hLIF는 함유하지 않는 배지 중에서 배양하였을 때, hiPSC 배양물은 점차적으로 황폐화되었고, 10회 계대를 넘게 동종으로 계대접종될 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 상기 신규한 hiPSC의 자가 재생에서 정확한 신호 전달 기전은 결정되어야 하는 상태로 남아있다.
중요하게는, 상기 신규한 hiPSC가 시험관내에서 내배엽(알부민)(도 4A), 신경외배엽(βIII-튜불린, Tuj1)(도 4B) 및 중배엽(브라큐리)(도 4C) 유도체로 분화될 수 있다는 것을 면역염색법을 통해 확인하였다. 추가로, 상기 hiPSC는 SCID 마우스 내로 이식된 후, 신경상피 유사 구조(외배엽)(도 4D), 상피관 구조(내배엽)(도 4D), 및 연골 유사 구조(중배엽)(도 4E)를 비롯한 3개의 배엽층 모두로 구성된 기형종을 형성하였다. 이를 묶어 정리해 본 바, 상기 결과는 mESC 유사 인간 만능성 줄기 세포는 포획되고 장기간 유지될 수 있다는 것을 시사하였다.
논의
1981년 이래 배아 줄기 세포가 마우스로부터 확립되어 왔지만(문헌 [Martin, G. R., Proc Natl Acad Sci USA 78, 7634-7638 (1981)]), 그의 대응물을, 다른 동물, 예컨대, 래트로부터 얻고자 했던 시도는 완전한 성공을 거두지 못했다(문헌 ([Demers et al., Cloning Stem Cells 9, 512-522 (2007)]; [Ruhnke et al., Stem Cells 21, 428-436 (2003), 2003]; [Schulze et al., Methods Mol Biol 329, 45-58 (2006)]; [Ueda et al., "Establishment of rat embryonic stem cells and making of chimera rats," PLoS ONE 3, e2800 (2008)])). 유전자 리프로그래밍 및 화학적 접근법을 조합함으로써 본 발명자들은 콜로니 형태 및 배양 요건/신호 전달 반응에 있어서 종래의 mESC와 중요한 특징들을 공유하는 신규한 mESC 유사 래트 및 인간 만능성 줄기 세포를 생성할 수 있었다. 소형 분자로 이루어진 독특한 칵테일하에서 본 발명자들의 안정한 riPSC는 생체내에서 광범위하게 키메라 현상에 기여할 수 있었다. 래트가 생리학적 성질 및 행동 연구에 보다 더 적합하며, 다유전자성 인간 질환에 대한 탁월한 모델이 된다. 그러나, 생체내에서 만능인 래트 줄기 세포가 이용가능하지 않기 때문에, 상기와 같이 가치있는 모델을 사용하는 것도 방해를 받게 되었다. 본 발명자들의, 래트 만능성 세포 확립 및 적절한 화학물질 칵테일을 사용하는 전략법이 생물의학 연구용의 유전자가 표적화된 래트를 생성할 수 있는 길을 열게 될 것이다. 본 발명자들의 hiPSC는 보다 강건하게 성장을 하며, 종래의 mESC와는 유사하지만, 종래의 hESC와는 상이한, 신규의 만능 상태를 나타내는 것처럼 보인다.
이를 묶어 정리해 본 바, 상기와 같은 연구 결과는 화학적 접근법이 갖는 독특한 이점을 강조하며, 래트 및 인간 세포의 mESC 유사 만능 상태를 유지시키는 데 있어서 TGF-β 경로를 억제시키는 것의 중요성을 정확하게 지적한다. 본 발명자들의 연구는 총괄적으로, 그의 배아 줄기 세포가 여전히 이용가능하지 않은 래트 또는 다른 종으로부터 조기 ICM 단계의 ESC를 유도하거나 리프로그래밍함으로써 만능성 줄기 세포를 생성할 수 있는 구조적 틀을 제공한다.
실험 절차
세포 배양 및 바이러스 형질도입: 친절하게도 노스캐롤라이나 대학교(University of North Carolina)의 (William B. Coleman) 교수로부터 기증받은, 계대접종 7의 2배체 래트 WB-F344 세포(문헌 [Grisham et al., Proc Soc Exp Biol Med 204, 270-279 (1993)])를 문헌 [Takahashi, K., and Yamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006)]에 기재되어 있는 바와 같이, pMX 기반 레트로바이러스에 의해서 마우스 Oct4, Klf4 및 Sox2(Addgene)에 대해 형질도입시켰다. 24시간 경과 후, 1x105개의 형질도입된 WB-F344 세포를 100 mm 디쉬 중 X선에 의해 불활성화된 CF1 MEF 상에 시딩하고, mESC 성장 배지: 넉 아웃™ DMEM, 20% 넉 아웃 혈청 대체물, 1% 글루타맥스, 1% 비필수 아미노산, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.1 mM β-머캅토에탄올 및 103 U/ml mLIF(Millipore)와 함께 인큐베이션시켰다. 10일 경과 후, mESC 성장 배지 중 MEF 피더 세포 상에서 확장시키기 위해 riPSC 콜로니를 채취하고, MEK 억제제 PD0325901(Stemgent, 0.5 μM), ALK5 억제제 A-83-01(Tocris Bioscience, 0.5 μM), 및 GSK3β 억제제 CHIR99021(Stemgent, 3 μM)로 처리하였다.
인간 섬유아세포 IMR90(ATCC 번호 CCL-186)을 배양하고, (문헌 [Yu et al., Science 318, 1917-1920 (2007)])에 기재되어 있는 바와 같이, pSin-EF2-Puro 기반 렌티바이러스에 의해서 인간 Oct4, Sox2, 나노그 및 Lin28(Addgene)에 대해 형질도입시켰다. 24시간 경과 후, 1x105개의 형질도입된 IMR-90 세포를 100 mm 디쉬 중 X선에 의해 불활성화된 CF1 MEF 피더 세포 상에 시딩하였다. 24시간 경과 후, 배지를, 103 U/ml hLIF(Millipore)가 보충된 mESC 배지로 교체하였다. 3주 경과 후, hiPSC 콜로니가 관찰되었고, MEK 억제제 PD0325901(0.5 μM), ALK5 억제제 A-83-01(0.25 μM), 및 GSK3β 억제제 CHIR99021(3 μM)을 함유하는 동일 배지 중 피더 세포 상에서 확장시키기 위해 주사 후 4주째에 상기 콜로니를 채취하였다.
배반포 주사: 교배 후 4.5일째 브라운 노르웨이(BN: Brown-Norway) 암컷의 자궁으로부터 배반포를 회수하였다. 미네랄 오일하에 HEPES 한 방울을 가한 곳에 배반포를 놓았다. 미세주사 피펫을 사용하여 8-15개의 riPSC를 배반포강 내로 주사하였다. 주사 후, 배반포를 상상 임신한 암컷 수혜자에게로 전달하였다. 동물에 관한 모든 절차는 국립 보건원(National Institute of Health)의 가이드라인에 따라 수행되었다.
보충 데이터
보충 데이터는 보충적인 실험 절차, 표 하나와 도면 하나를 포함한다.
보충적인 실험 절차:
iPSC의 시험관내 분화: 표준 배아유사체 분화 방법에 의해 riPSC 또는 hiPSC의 시험관내 분화를 수행하였다. 0.05% 트립신-EDTA에 의해 riPSC 또는 hiPSC를 해리시키고, 초저 부착 100 mm 디쉬 중, 10% FBS로 보충된 DMEM 배지에서 배양하여 배아유사체(EB)를 형성하였다. 이틀에 한번씩 배지를 교체하였다. 1주 경과 후, EB를 수확하고, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지 중 마트리겔(Matrigel)로 코팅된 6 웰 플레이트로 옮겼다. 3 내지 7일 경과 후, 면역세포화학적 분석을 위해 세포를 고정시켰다. 언급한 것을 제외한, 모든 세포 배양 생성 제품은 인비트로겐(Invitrogen)/기브코 BRL(Gibco BRL)로부터 입수하였다.
세포화학 및 면역형광 분석법: 알칼리성 포스파타제 검출 키트(Millipore)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 알칼리성 포스파타제 염색법을 수행하였다. 면역형광 분석법을 위해, 세포를 10분 동안 4% 파라포름알데히드 중에 고정시키고, 0.1% 트리톤(Triton) X-100(Sigma-Aldrich)을 함유하는 PBS를 사용하여 3회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 고정시킨 세포를 실온(RT: room temperature)에서 30 min 동안 차단 완충액인, PBS(Invitrogen/Gibco BRL) 중 0.1% 트리톤 X-100 및 10% 정상 당나귀 혈청(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc) 중에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 차단 완충액 중 4℃에서 밤새도록 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 그 다음날, 세포를 PBS로 세척하고, RT에서 1시간 동안 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 중에서 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 마우스 항Oct4 항체(1:250)(Santa Cruz Biotechnology), 토끼 항Sox2 항체(1:2000)(Chemicon), 마우스 항SSEA1 항체(1:250)(Santa Cruz Biotechnology), 토끼 항나노그 항체(1:500)(Abeam), 래트 항SSEA3 항체(1:1000)(Chemicon), 마우스 항SSEA4 항체(1:1000)(Chemicon), 마우스 항TRA-1-81 항체(1:1000)(Chemicon), 토끼 항Pdx1 (1:1500)((C. Wright) 박사(테네시주 소재의 Vanderbilt University)로부터 기증받음), 마우스 항βIII-튜불린(Tuj1) 항체 (1:1000)(Covance Research Products), 토끼 항알부민 항체(1:1000)(DAKO)를 1차 항체로 사용하였다. 2차 항체는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 486/555 당나귀 항마우스, 항래트, 항염소 또는 항토끼 IgG (1:500)(Invitrogen)였다. DAPI(Sigma-Aldrich) 염색법에 의해 핵을 시각화하였다. 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) TE2000-U 현미경을 사용하여 영상을 포착하였다.
RT-PCR 분석: QIA슈레더(QIAshredder)(Qiagene)와 결합된 RN이지 플러스 미니 키트(RNeasy Plus Mini Kit)를 사용하여 riPSC 및 hiPSC로부터 RNA를 추출하였다. iScriptTMcDNA 합성 키트(BioRad)를 사용함으로써 1 ㎍ RNA를 이용하여 역전사를 수행하였다. 하기 표 1에 제시되어 있는 프라이머를 사용함으로써 특정 유전자를 증폭시켰다. PCR 조건은 95℃에서 5분 동안, 94℃에서 30초 동안, 어닐링 온도에서 30초 동안, 및 72℃에서 30초 동안 25-35회 사이클, 이어서, 72℃에서 10분. 중아황산염 서열분석법을 사용한 Oct4 프로모터 메틸화 연구를 위해, 비유기성 DNA 단리용 키트(Non Organic DNA Isolation Kit)(Millipore)를 사용하여 WB-F344 세포, riPSC, IMR90, 및 hiPSC로부터 DNA를 단리시켰다. 이어서, DNA를 EZ DNA 메틸화-골드 키트(EZ DNA Methylation-Gold Kit)(캘리포니아주 오렌지 소재의 Zymo Research Corp.)로 처리하였다. 이어서, 처리된 DNA를 관심의 대상이 되는 서열을 증폭시키기 위한 주형으로서 사용하였다. Oct4 프로모터 단편 증폭에 사용된 프라이머를 하기 표 1에 제시하였다. 서열분석용 TOPO TA 클로닝 키트(TOPO TA Cloning Kit)(Invitrogen)를 사용하여 생성된 단편을 클로닝하고, 서열분석하였다.
기형종 형성: 0.05% 트립신-EDTA를 사용함으로써 일련으로 계대접종된 riPSC 또는 hiPSC를 수확하였다. SCID 마우스(n=3)의 신장 주머니 아래에 3 내지 5백만개의 세포를 주사하였다. 4-5주 경과 후, 모든 마우스에서 기형종이 발생하였으며, 이를 제거한 후, 조직학적으로 분석하였다.
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실시예 3 래트 배아 줄기 세포 유도
배반포로부터 래트 ES 세포를 유도하기 위해, 투명대가 제거된 래트 배반포(E4.5)를 20% 넉 아웃 혈청 대체물(KSR: Knock-out serum replacement), 1% 비필수 아미노산, 1000 U/ml 마우스 LIF, 1% 글루타맥스, 3 μM CHIR99021, 0.5 μM PD0325901, 0.25 μM A-83-01(또는 2 μM SB431542)로 보충된 넉 아웃 DMEM 배지와 함께 x선에 의해 불활성화된 CF1 MEF 피더 세포 상에 시딩하였다. 3-5일 경과 후, ICM으로부터 유래된 세포 덩어리를 어큐타제(Accutase)에 의해 해리시키고, 새 피더 상으로 옮겨 놓았다. 전형적인 ES 세포 형태를 가진 콜로니를 채취하고, 어큐타제를 사용하여 해리시킨 후, 새 피더 상에 시딩하였다. 확립된 래트 ES 세포를 상기 배지를 사용하여 배양하고, 약 매 3일마다 계대접종하였다(1:6). 래트 ES 세포 및 riPSC, 둘 모두의 장기간의 자가 재생을 위해서는 LIF 및 억제제 칵테일(CHIR99021, PD0325901, A-83-01)이 존재하여야 한다. 래트 ES 세포 및 riPSC는 마우스 ES 세포의 만능 마커, 예컨대, Oct4, Sox2, 나노그 및 SSEA1 등을 발현시키지만, 종래의 방식으로 배양된 인간 ES 세포에 의해 발현된 마커, 예컨대, SSEA3, SSEA4, TRA-1-61 및 TRA-1-81은 발현시키지 못한다. 래트 ES 세포 및 riPSC, 둘 모두는 마우스 EpiSC에서 발현되지 않는 ICM 마커 REX1 및 ALP를 발현시킨다.
실시예 4 인간 및 원숭이 배아 줄기 세포 유도
인간 및 원숭이 ES 세포를 마우스 ES 세포 유사(조기 ICM) 만능 상태로 전환시키기 위해, 인간 ES 세포(Hues9) 및 원숭이 ES 세포(R366.4)를 20% 넉 아웃 혈청 대체물(KSR), 1% 비필수 아미노산, 1% 글루타맥스, 10 ng/ml bFGF로 보충된 DMEM/F-12 배지와 함께 배양하였다. 세포가 50% 컨플루언스에 도달하였을 때, 배지를 어드밴스(Advance) DMEM/F-12, 1XN2, 1XB27, 1% 글루타맥스, 50 ㎍/ml BSA 배지(2 μM 리신 특이 데메틸라제 1 억제제(파네이트)로 보충됨)로 교체하였다. 3일 경과 후, 10 ㎍/ml 인간 LiF, 3 μM CHIR99021, 0.5 μM PD0325901, 및 2 μM SB431542는 함유하지만, 파네이트는 함유하지 않는 동일 배지와 함께 세포를 배양하였다. 광범위한 분화에도 불구하고, 약 1주간의 처리로 조밀한 마우스 ES 세포 유사 콜로니를 시각화되었다. 전환된 인간/원숭이 ES 세포를 상기 배지와 함께 배양하고, 약 매 4-5일마다 계대접종하였다(1:6). 세포는 만능 마커, 예컨대, Oct4, Sox2, 나노그, SSEA3, SSEA4, TRA-1-61, TRA-1-81 뿐만 아니라, ICM 마커 REX1 및 ALP도 발현하였다.
실시예 5 소형 분자에 의해 배반엽상층 줄기 세포의 배아 줄기 세포로의 전환
종래의 뮤린 배아 줄기 세포(ESC)는 착상 전 배반포의 내세포괴(ICM)의 만능성 세포로부터 유래되고, 이를 나타낸다. 이는 무한대로 자가 재생할 수 있으며, 시험관내에서 모든 세포 유형을 발생시킬 수 있는 능력을 갖고 있으며, 가장 중요하게는, 다시 배반포로 되돌려지게 되면, 생식선을 비롯한, 생체내 동물 전체에 기여할 수 있다. 보다 최근에는 배반엽상층 줄기 세포(EpiSC)로 명명되는 착상 후 단계 배반엽상층으로부터 상이한 유형의 만능성 세포가 유래되었다(문헌 ([Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007]; [Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007])). mESC와는 대조적으로 EpiSC는 장기간의 자가 재생이 가능하고, 기형종 분석에서는 시험관내 뿐만 아니라, 생체내에서도 만능인 것으로 나타난 반면, 이는 ICM 내로는 도입될 수 있고, 키메라 현상에는 기여할 수도 없는데, 이는 EpiSC가 ICM 유래의 ESC보다 만능성이 진행성/후기인 발생 단계로부터의 것이고, 이를 나타낸다는 것을 확인시켜 주며, 생체내 환경하에서 조차 ICM 단계의 만능 단계로는 다시 "리프로그래밍"될 수 없다는 것을 시사한다. 배반포의 사용으로 유도되기는 하지만, 종래의 인간 ESC는 자가 재생 및 분화에서 일부 유전자 발현, 콜로니 형태(즉, 편평한 콜로니) 및 신호 전달 반응을 비롯한, 다수의 특징들과 관련하여 EpiSC와 유사성이 높게 일치하는 것처럼 보인다. EpiSC/hESC는 또한 다수의 다른 방식으로 기능상 및 기계론적으로 mESC(이는 보다 조밀하고, 반구형인 콜로니 형태를 갖고 있다)와 상이하다. 예를 들어, mESC는 백혈병 억제 인자(LIF) 및 골 형성 단백질(BMP)(문헌 [Ying et al., Cell 115, 281-292, 2003])하에서, 또는 MEK 및/또는 FGFR(문헌 Ying et al., Nature 453, 519-523, 2008])의 억제하에서 자가 재생하지만, EpiSC/hESC는 자가 재생을 위해 MAPK, FGF, 및 TGFβ/액티빈/Nodal 경로 활성에 의존하는 것처럼 보이며, MEK, FGFR 및/또는 ALK4/5/7 억제제로 처리되었을 때에는 빠른 속도로 분화되었다(문헌 [Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007]; [Li et al., Differentiation 75, 299-307, 2007]; [Peerani et al., EMBO J 26, 4744-4755, 2007]; [Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007])). 추가로, 규명된 분화 조건하에서의 BMP 처리에 대한 반응으로 mESC는 중배엽 계통으로 분화된 반면, EpiSC/hESC는 영양막 또는 원시 내배엽 세포를 생성하였다(문헌 [Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007]; [D'Amour et al., Nat Biotechnol 23, 1534-1541, 2005]; [Xu et al., Nat Biotechnol 20, 1261-1264, 2002])). 이러한 관찰 결과는 EpiSC 및 hESC가 본질적으로 유사하다는 개념을 강력하게 지지하며, mESC 및 EpiSC/hESC가 착상 전 배반포를 나타내는 mESC 유사 상태 및 착상 후 배반엽상층을 나타내는 EpiSC 유사 상태라는 2가지 다른 만능성 상태를 나타내기 때문에, 배반엽상층 상태(종래의 hESC 포함)가 ICM 상태로 다시 전환될 수 있을지 여부에 관한 흥미로운 가설을 제기한다. mESCs 또는 mEpiSC로부터의 키메라 현상에 기여할 수 있는 그의 능력에 있어 뚜렷한 차이가 나타나기 때문에(이것이 EpiSC의 mESC로의 기능적 전환에 관해 결정적으로 확인시켜 주는 것이다), 뮤린 시스템은 상기와 같이 흥미로운 과정을 연구할 수 있는 이상적인 플랫폼을 나타내며, 아마도 종래의 hESC로부터 새로운 유형의 ICM/mESC 유사 인간 만능성 세포를 생성할 수 있도록 하는 기반을 제공한다.
EpiSC는 Oct4, Sox2 및 나노그를 비롯한, 마스터 만능성 유전자를 발현시킨다. Oct4, Sox2 및 Klf4의 과다발현으로 뮤린 체세포의 리프로그래밍이 유도되었고, 이는 생식선 적격 만능성 세포가 되는 것으로 나타났다(문헌 [Nakagawa et al., Nat Biotechnol 26, 101-106, 2008]). 추가로, 보다 소수의 만능성 유전자을 발현하는(예컨대, 나노그 발현의 결실) 생식선 줄기 세포는 배양물 중에서 mESC 유사 세포로 전환될 수 있는 것으로 나타났다(문헌 ([Chambers et al., Nature 450, 1230-1234, 2007]; [Kanatsu-Shinohara et al., Cell 119, 1001-1012, 2004])). 추가로, 최근에는 (FAB-SC로 명명되는) 비만능성 세포 유형이 배세포로부터 유도되었고, 간단하게 LIF 및 BMP 조건하에서 만능 mESC 유사 세포를 생성하는 것으로 나타났다(문헌 [Chou et al., Cell 135, 449-461, 2008]). 또한, 최근 연구를 통해서는 mESC 콜로니내의 세포 서브집단이 연속하여 다른 상태 사이를(예컨대, ESC 유사 표현형과 배반엽상층 유사 표현형 사이를) 변동하도록 만드는 몇몇의 중요한 전사 인자(예컨대, 나노그, Rex1, 및 스텔라)의 역동적인 발현을 보이는 것을 시사하였다(문헌 ([Chambers et al., Nature 450, 1230-1234, 2007]; [Hayashi et al., Cell Stem Cell 3, 391-401, 2008]; [Singh et al., Stem Cell 25, 2534-2542, 2007]; [Toyooka et al., Development 135, 909-918, 2008])). 이러한 연구는 ICM-mESC보다 덜 "안정한" 만능성 상태를 보이는 EpiSC가 시험관내에서 배양 변동하에 "자발적으로" 다시 mESC 상태로 전이될 수 있는 능력을 가질 수도 있다는 가능성을 제기한다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, EpiSC를 트립신으로 처리하여 단일 세포를 수득하고, EpiSC 콜로니 내의 "전환된" mESC 유사 세포는 mESC의 자가 재생은 촉진시키지만, EpiSC의 분화는 유도하는 조건하에서 포획/선택될 것이며 확장될 것이라는 개념에 기초하여 mESC 자가 재생 조건하에서 플레이팅하였다. EpiSC를 피더 세포와 함께 LIF가 보충된 종래의 mESC 성장 조건하에서 배양하였을 때에는 수회의 계대접종에 걸쳐 1차 계대접종에서 분화된 EpiSC(예컨대, 콜로니 밖으로 전개되고/확장된 세포)가 확인될 수 없고, 어떤 콜로니도 확인될 수 없다는 것을 본 발명자들은 발견하게 되었다(도 6A). EpiSC로부터 mESC로의 "자발적인" 전환이 매우 비효율적인 것이라고 가정한다면, (예컨대, 보다 뚜렷한 표현형의 차이를 나타내고, 분화된 EpiSC의 과도성장을 최소화시키면서) EpiSC로부터의 상기와 같은 "희귀의" 전환된 mESC 유사 세포를 선택/포획하고 확장시키기 위해서는 보다 강력하고 보다 엄격한 차별적인 자가 재생 촉진 및 분화 유도 조건이 필요할 수 있다. FGF 및 MAPK 신호전달 경로와 관련하여 mESC와 EpiSC 사이의 차별적인 신호 전달 반응(자가 재생 대 분화) 뿐만 아니라, MEK-ERK 신호 전달의 억제가 세포의 보다 원시적인 상태로의 리프로그래밍을 촉진시킨다는 관찰 결과(문헌 [Chen et al., Proc Natl Acad Sci U S A 104, 10482-10487, 2007]; [Shi et al., Cell Stem Cell 2, 525-528, 2008]; [Silva et al., PLoS Biol 6, e253, 2008]))에 기초하여, 이어서 본 발명자들은 일반적인 mESC 자가 재생 조건하에서 선택성 FGFR 억제제 PD173074 (0.1 μM) 및 MEK 억제제 PD0325901(0.5 μM) 조합물로 EpiSC를 처리하였다. mESC의 강건한 클로날 성장을 촉진시키고 분화된 세포의 성장을 억제시키는 상기 2PD/LIF 조건하에서 본 발명자들은 EpiSC의 분화가 가속화되고, 전체 세포 배양물의 성장이 감소된 것을 관찰하게 되었다. 2PD/LIF 배지 중에서 계속하여 배양하였을 때에는 세포 대부분이 사멸하였고, 수회의 계대접종에 걸쳐 어떤 mESC 유사 콜로니도 확인되지 않았다. 유사하게, mESC 성장/생존을 개선시키기 위해 2PD/LIF 조건에 CHIR99021(3 μM)을 첨가하였을 때, EpiSC의 mESC 유사 상태로의 전환은 촉진되거나 포획되지 않았다(도 6A). 이러한 결과는 EpiSC가 mESC 자가 재생을 촉진시키는 조건하에서는 자발적으로 ESC 유사 상태로 쉽게 전환되지 않는 "안정한" 만능성 상태를 나타낸다는 것을 시사하였다. 이는 또한 EpiSC의 mESC 유사 상태로의 전환은 오직 MEK 및 GSK3으로 이루어진 화학적 억제제를 사용하는 것과 함께 Klf4의 과다발현에 의해서만 달성될 수 있다는 보다 최근의 연구와도 일치한다(문헌 [Guo et al., Development 136, 1063-1069, 2009]).
TGFβ/액티빈/Nodal 활성은 마우스 배아형성시에 시공간적으로 역동적으로 조절되며, 착상시 배반엽상층에서 조기 선조 세포의 운명을 조절하는 데 필요하다(문헌 [Mesnard et al, Development 133, 2497-2505, 2006]). FGF 및 TGFβ/액티빈/Nodal 경로 활성을 필요로 하는 EpiSC의 유도는 TGFβ/액티빈/Nodal이 EpiSC에 항분화 신호를 제공한다는 것을 시사한다(문헌 ([Brons et al., Nature 448, 191-195, 2007]; [Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007])). 추가로, E 카드헤린이 1 세포 단계로부터의 배아에서 발현되고, 신호 전달에 의한 E 카드헤린의 하향조절이 배반포의 착상을 촉진시킨다고 보고된 바 있다(문헌 [Li et al., J Biol Chem 277, 46447-46455, 2002]). 또한, TGFβ/액티빈/Nodal 활성은 또한 장배형성시에 E 카드헤린을 하향조절함으로써 상피-중간엽 전이(EMT: epithelial-mesenchymal transition)를 촉진시킨다(문헌 ([Derynck and Akhurst, Nat Cell Biol 9, 1000-1004, 2007]; [Gadue et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103, 16806-16811, 2006]; [Sirard et al., Genes Dev 12, 107-119, 1998])). 이러한 연구 결과에 기초하여, 본 발명자들은, TGFβ/액티빈/Nodal 신호 전달의 억제가 중간엽 상피 전이(MET: mesenchymal-epithelial transition) 과정을 촉진시킬 수 있고, 그 결과, EpiSC의 mESC 유사 상태로의 전환도 촉진시킬 수 있을 것이라고 가정하였다. A-83-01은 선택적 ALK4/5/7 억제제인데, 이는 BMP 수용체에 대하여 교차 억제성 효과를 나타내지 않는다(문헌 [Tojo et al., Cancer Sci 96, 791-800, 2005]). 이전 보고 결과와 일치하는 것으로서, 0.5 μM의 A-83-01에 의한 TGFβ/액티빈/Nodal 신호 전달 차단이 bFGF로 보충된 EpiSC/hESC 배양 조건하에서 EpiSC의 신속한 분화를 유도하였다. 매우 대조적으로, LIF로 보충된 mESC 배양 조건하에서는 A-83-01이, EpiSC 전체 집단이 mESC 콜로니 형태와 유사하고 ALP(mESC에서는 고도로 발현되지만, EpiSC에서는 발현되지 않는 만능성 마커)(도 6C)를 발현하는 보다 조밀한 반구형 콜로니를 형성하도록 유도하였다. 광범위하게 사용되는 또 다른 특이 ALK4/5/7 억제제 SB431542는 EpiSC에 대해 유사한 효과를 가진다. A-83-01로 처리된 콜로니를 선별을 위해 2PD/LIF 조건에 노출시켰을 때에는 콜로니 중 50% 초과의 콜로니가 자가 재생할 수 있고, ALP 활성을 유지할 수 있었는데, 이는 세포가 일부 mESC 특성을 획득하였다는 것을 시사한다. ALK5, MEK, FGFR 및 GSK3으로 이루어진 억제제(일명 mAMFGi 조건)로 보충된 mESC 성장 배지 중에서 상기 반구형 ALP 양성 콜로니를 추가로 유지시키고 확장시켰다. 이들 세포는 mAMFGi 조건하에서 장기간 동안 자가 재생할 수 있고, 구별할 수 없는 mESC 콜로니 형태를 가질 수 있고(도 6D), 만능성 마커, 예컨대, Oct4, 나노그, SSEA1을 발현시킬 수 있을 뿐만 아니라, ICM 마커 REX1도 되찾을 수 있다. 그러나, 이들 세포를 렌티바이러스에 의해 구성적으로 활성인 GFP로 표지하고, 세포가 상실배와 응집하였을 때에 본 발명자들은 생성된 배아를 마우스로 이식시킨 후에 어떤 키메라 동물도 수득하지 못했다(도 7A). 이러한 결과는, MEK, FGFR 및 GSK3 억제와 함께 TGFβ 신호 전달의 억제가 강력한 리프로그래밍 활성을 갖고 있으며, EpiSC의 mESC 유사 상태로의 부분적인 전환을 촉진시킬 수 있다는 것을 시사한다.
유전자 조절에 있어 히스톤 변형, 예컨대, 아세틸화 및 메틸화가 중요한 역할을 한다는 것이 확립되어 있다. 스텔라는 생식선으로 mESC의 적격성에서 중요한 유전자이며, EpiSC 및 mESC내 배반엽상층 유사 세포에서는 전사적으로 침묵성이라는 것을 시사한다. 또한, 히스톤 변형이 mESC에서 스텔라 발현을 조절한다(문헌 ([Hayashi et al, Cell Stem Cell 3, 391-401, 2008]; [Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007])). 진성의 생체내 만능성의 원인이 되는 침묵화된 유전자좌의 탈억제는 EpiSC가 mESC 유사 상태로의 후생유전적 제한/문턱값을 극복할 수 있도록 촉진시켜 줄 수 있다고 본 발명자들은 가정하였다. 그 결과, 본 발명자들은, 모노 및 디메틸화된 히스톤 H3K4를 특이적으로 탈메틸화시키는 히스톤 데메틸라제 LSD1을 억제시킴으로써 전반적인 H3K4 메틸화를 증가시키는 것으로 밝혀진 소형 분자 파네이트를 선택하였다(문헌 [Lee et al., Chem Biol 13, 563-567, 2006]). 놀랍게도, 2 μM 파네이트 처리 후 4일이 경과하였을 때, EpiSC 중 70-80% 정도까지 mESC 성장 조건에서 작고 조밀한 콜로니를 형성하였다. 이어서, 파네이트 처리된 세포를 2PD/LIF를 사용하여 선별하였을 때, 세포 중 대략 20%가 반구형 및 ALP 양성 콜로니로서 선별에서 살아남았다. MEK, FGFR 및 GSK3으로 이루어진 억제제(일명 mMFGi 조건)를 사용하여, 또는 mAMFGi 조건을 사용하여 상기 콜로니를 추가로 확장시켰다. 상기 두 조건 모두에 의해 안정한 세포 배양물을 수득하였는데 (8개월 간에 걸쳐 > 80회 계대접종), 이는 mESC와는 형태학적으로 구별이 불가능하였다(도 6E, F). 이어서, 본 발명자들은 상실배 응집 및 생성된 배아의 이식에 의해 생체내에서 GFP 표지된 파네이트/mMFGi 세포 및 파네이트/mAMFGi 세포를 조사하였다. 놀랍게도, 외피 색상 및 PCR 유전자형 분석에 의해 다중 성체 조직 중 GFP 통합의 존재 여부에 관해 측정한 바, 본 발명자들은 파네이트/mAMFGi 세포로부터 (9마리의 신생 새끼 중) 7마리의 성체 키메라를 수득하였다(도 7A, B, C). 결과적으로, 파네이트/mAMFGi 세포-응집된 상실배의 이식으로부터의 E13.5 배아의 다중 조직(즉, 3개의 배엽층, 생식샘 포함) 중에서 광범위하게 넓게 펼쳐진 GFP 양성 세포가 관찰되었다(도 7A, D, 10A). 파네이트/mAMFGi 세포로부터의 생식선에의 기여를 조사하기 위해, 생식샘으로부터 유래된 GFP/SSEA1 이중 양성 세포를 FACS에 의해 단리시키고, 생식선 마커 블림프1 및 스텔라를 발현한다는 것을 실시간 PCR에 의해 확인하였다(도 7E). 상기 데이터는, EpiSC로부터 전환된 파네이트/mAMFGi 세포가 진성의 생체내 만능성을 되찾았다는 것을 시사한다. 대조적으로, GFP 양성 세포는 오직 파네이트/mMFGi 세포-응집된 상실배의 이식으로부터 회수된 E13.5 배아의 난황낭에서만 발견되었다(도 7A).
이에, 추가로 파네이트/mAMFGi 세포의 특징을 규명하였다. 장기간 확장된 파네이트/mAMFGi 세포에서 Oct4, 나노그, SSEA1, 및 스텔라를 비롯한, 만능성과 관련된 마커의 동종 발현을 면역세포화학법을 통해 확인하였다(도 8A, 11A, 12). 추가로, 파네이트/mAMFGi 세포에서 특이적인 ICM의 유전자 발현과, Rex1, Pecam1, 스텔라, Stra8, Dax1, Fbxo15, Esrrb, 및 Fgf4를 비롯한, (mESC에서는 발현되지만, EpiSC는 발현되지 않는) 생식선으로 적격인 마커의 유전자 발현이 재건되었다는 것이 반정량적 RT-PCR 분석을 통해 입증되었다(도 8B). 대조적으로, 배반엽상층 및 조기 배엽층와 관련된 유전자, 예컨대, Fgf5 및 브라큐리(T)의 전사체는 파네이트/mAMFGi 세포에서 감소되었거나, 검출불가능하였다(도 8B, 9C). 추가로, 전환된 파네이트/mAMFGi 세포는 mESC와 보다 더 유사한 반면(피어슨(Pearson) 상관값: 0.87), 원래의 EpiSC는 mESC와 더 상이하다는 것이(피어슨 상관값: 0.74)(도 8C) 마이크로어레이에 의한 전사체 분석을 통해 입증되었는데, 이는 이전 보고 내용과도 일치한다. 전환과 관련된 특이적인 후생유전적 변화를 추가로 분석하기 위해, 본 발명자들은 그의 발현이 ICM 특성과 밀접한 관련이 있는 것인 스텔라 및 Fgf4(문헌 ([Hayashi et al., Cell Stem Cell 3, 391-401, 2008]; [Imamura et al., BMC Dev Biol 6, 34, 2006]))의 프로모터 DNA 메틸화를 중아황산염 게놈 서열분석을 사용하여 조사하였다. 스텔라 및 Fgf4의 프로모터 영역은 대개 파네이트/mAMFGi 세포 및 mESC에서 메틸화되지 않은 상태로 있지만, EpiSC에서는 과메틸화되어 있는 것으로 밝혀졌다(도 8D). mESC 유사 상태로 제한되어 있는 스텔라의 후생유전적 상태를 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 EpiSC, 전환된 파네이트/mAMFGi 세포, 및 mESC 중 그의 프로모터 영역에 관한 ChIP-Q PCR 분석을 수행하였다. 파네이트/mAMFGi 세포에서 스텔라의 H3K4 및 H3K27 메틸화 패턴은 mESC에서 관찰되는 것과 유사하였지만, EpiSC에서의 것과는 상이하였다는 것을 본 발명자들은 발견하였으며, 이를 통해 전환된 파네이트/mAMFGi 세포에서 스텔라의 후생유전적 상태는 mESC 유사 상태로 변경되었다는 것을 확인하게 되었다(도 8E).
파네이트/mAMFGi 세포를 또한 그의 시험관내 기능적 특성에 관하여도 조사하였다. 이는 mESC와 성장율이 유사한 것으로 나타났다(도 9A). 파네이트/mAMFGi 세포를 현탁액 중에서 배아유사체를 거쳐 분화시켰을 때, 면역세포화학법에 의해 젯된 바와 같이, 파네이트/mAMFGi 세포는 3개의 1차 배엽층 중에서 신경 세포(βIII-튜불린 및 MAP2ab 양성), 박동성 심근세포(심장 트로포닌 및 MHC 양성), 및 내배엽 세포(Sox17 또는 알부민 양성)를 비롯한, 세포 유도체를 효과적으로 생성할 수 있다(도 9B). mESC 및 EpiSC/hESC는 자가 재생 및 분화에서 신호 전달 입력(예컨대, 성장 인자)에 대한 반응이 상이하기 때문에, mESC 분화를 위해 개발되고, 효과적으로 작용할 수 있는 조건이 EpiSC/hESC의 상응하는 분화를 유도하는 데 있어서는 종종 비효율적일 수 있다. EpiSC/hESC를 mESC 유사 상태로 전환시키는 것이 갖는 이점들 중에 하나는 분화 조건이 mESC 작용으로부터 EpiSC/hESC 작용으로 보다 쉽게 해석될 수 있다는 점이다. BMP4 처리에 대한 차별적인 반응은 mESC와 EpiSC를 구별하기 위한 기능적 분석법을 나타낸다. 이전 연구와 일관되게(문헌 ([Beddington and Robertson, Development 105, 133-131, 1989]; [Czyz and Wobus, Differentiation 68, 167-174, 2001]; [Qi et al, Proc Natl Acad Sci U S A 101, 6027-6032, 2004]; [Winnier et al., Genes Dev 9, 2105-2116, 1995])), mESC와 같이 BMP4로 처리하였을 때, 파네이트/mAMFGi 세포는 중배엽 특이적인 마커 유전자인 브라큐리(T)를 발현하도록 유도되었지만, 동일 조건하에서는 EpiSC와 같이 영양외배엽(영양막 마커(Cdx2)는 유도하지 못함) 또는 원시 내배엽 세포(Gata6)를 일으키지는 못했다는 것을 본 발명자들은 발견하였고, 이는 파네이트/mAMFGi 세포의 mESC로의 유사한 시험관내 분화능/반응을 시사한다(도 9C). 이를 추가로 입증하기 위해, 본 발명자들은 단일층의 화학적으로 규명된 지정 단계별 심장 분화 과정에서 EpiSC, 전환된 파네이트/mAMFGi 세포, 및 mESC를 시도하고 비교하였다. BMP 활성이 중배엽 분화의 조기 단계에서 필수적인 역할을 하는 상기 다단계 과정에서, 파네이트/mAMFGi 세포가 mESC 만큼 효율적으로 박동 심근 세포로 분화되지만, 동일한 조건하에서의 EpiSC의 분화는, 적절한 심장 마커를 발현하거나, 또는 특징적인 박동 표현형을 가진 세포를 거의 생산하지 못하였다는 것을 본 발명자들은 발견하였고(도 9D), 이를 통해 파네이트/mAMFGi 세포가 mESC와 기능적으로 유사하다는 것을 다시 확인하게 되었다. 또한, 단일 세포 생존 분석법을 통해서 또한, 파네이트/mAMFGi 세포가 클로네 의해 피더가 없는 N2/B27-화학적으로 규명된 조건하에서 mESC 만큼 효율적으로 Oct4-양성 콜로니로서 확장하였지만, EpiSC는 동일한 조건하에서 단일 세포로부터 불충분하게 생존하였다는 것이 입증되었다(도 11B). 이러한 데이터는 추가로 후생유전적 변형, 및 mESC 또는 EpiSC가 필요로 하는 차별적인 신호전달 경로를 표적하는 약리학상 조작에 의해 EpiSC가 mESC 유사 상태로 기능적으로 전환될 수 있다는 것을 입증하였다.
본 발명자들의 연구와 일관되게, EpiSC 세포는 화학적 화합물과 함께 리프로그래밍 유전자(즉, Klf4)의 과다발현에 의해 mESC 유사 상태로 전환된다고 최근 보고되었다(문헌 [Guo et al., Development 136, 1063-1069, 2009]). 이러한 연구에서, 본 발명자들은 어떤 유전자 조작도 없이 안정한 EpiSC를 mESC 유사의, 발생학상 보다 조기의 만능성 상태로 전환시킬 수 있는 화학적으로 규명된 처리법을 고안하였다. 배반엽상층 유사 세포는 종래의 mESC의 콜로니에 존재하며 전후로 전이하며(문헌 [Hayashi et al., Cell Stem Cell 3, 391-401, 2008]); mESC 및 EpiSC가 Oct4, Sox2 및 나노그를 비롯한, 기본적인 만능성 전사 인자 세트를 공유하고; mESC가 배양물 중에서 더욱 안정적이라는 것을 입증하는 연구에도 불구하고, 본 연구에서 본 발명자들은 EpiSC가 종래의 mESC 배양 조건에서는 빠르게 분화되었지만, "자발적으로" 전환된 mESC는 군집 또는 클로날 수준으로는 일련의 계대접종에 걸쳐 용이하게 확인될 수 없고 단리될 수 없다는 것을 발견하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 소형 분자 억제제를 사용한 TGFβ 경로의 차단 또는 H3K4 데메틸라제 LSD1 억제가 EpiSC를 일부 ICM 특이 유전자 발현의 활성화를 가진 mESC 유사 표현형으로 변화시키는 현저한 형태학적 변화를 유도하였다는 것을 발견하였다. 그러나, EpiSC를, 키메라에 기여할 수 있는 능력을 가진 mESC 유사 상태로 전체적으로 전환시키는 것은 오직 LSD1, ALK5, MEK, FGFR, 및 GSK3으로 이루어진 억제제의 조합을 통해서만 쉽게 이루어질 수 있었다. 이러한 관찰 결과는 신호 전달의 시너지 및 직접적인 후생유전적 조절에 의해 발생학적으로 후기 단계인 EpiSC로부터 ICM 단계의 mESC로의 리프로그래밍에 관한 강력하고 직접적인 유도를 강조한다. 이는 또한 리프로그래밍을 촉진시키고, 진성 만능성을 유지시키는 데 있어 TGFβ 경로 억제가 중요한 역할을 한다는 것을 강조하며, 이는 추가로 키메라 현상 적격 래트 만능성 세포를 생성하는 데 있어서의 본 발명자들의 최근 연구를 지지한다(문헌 [Li et al., Cell Stem Cell 4, 16-19, 2009]). 총괄적으로, 본 발명자들의 연구는, 2개의 만능성 상태를 구별짓는 신호전달 경로와 후생유전적 표적을 자발적으로 정확하게 약리학적으로 제어함으로써 어떤 유전자 조작도 없이 만능성이 제한된 EpiSC를 mESC 유사 상태로 쉽게 전환시킬 수 있다는 개념 증명을 입증하였고, 기전에 관한 추가 연구에 편리한 실험 시스템을 제공하였다. 상기와 같은 방법 및 개념은 또한 새로운 유형의 mESC 유사 인간 만능성 세포를 생성할 수 있는 방안을 제시할 수 있다.
실험 절차
세포 배양: 뮤린 EpiSC 세포주는 폴 티사(Paul Tesar) 박사(Case Western Reserve University)로부터 기증받았다. 이전에 기술된 바와 같이 10 ng/ml bFGF로 보충된 인간 ESC 배지 중에서 방사선 조사 CF1 MEF 상에서 EpiSC(세포주 EpiSC-5, 수컷)를 유지시켰다(문헌 [Tesar et al., Nature 448, 196-199, 2007]). EpiSC를 1 mg/ml 콜라게나제 IV형(Invitrogen)과 함께 매 3-4일마다 계대접종하였다. 20% KSR(Invitrogen), 0.1 mM 2-ME(Sigma-Aldrich), 2 mM L 글루타민(Invitrogen), 0.1 mM NEAA(Invitrogen), 및 103 유니트/ml 재조합 뮤린 백혈병 억제 인자(LIF)(ESGRO, Millipore)로 보충된 넉 아웃 DMEM(Invitrogen)으로 구성된 것인 종래의 mESC 성장 배지를 사용하여 방사선 조사 CF1 MEF 상에서 R1 mESC를 배양하였다. 0.05% 트립신/EDTA를 사용하여 mESC 및 전환된 세포를 단일 세포 현탁액으로서 매 3일마다 계대접종하고, 통상의 배양을 위해 1 ㎠당 1.0X104개의 세포로 시딩하였다. 피더가 없는 배양을 위해, 1XN2(Invitrogen), 1XB27(Invitrogen), 0.1 mM 2-ME, 2 mM L 글루타민, 0.1 mM NEAA, 50 ㎍/ml BSA 분획 V(GIBCO), 103 유니트/ml LIF 및 10 ng/ml BMP4(R&D)로 보충된 넉 아웃 DMEM으로 구성된 것인 화학적으로 규명된 배지 중 젤라틴으로 코팅된 조직 배양 디쉬 상에서 세포를 성장시켰다. 성장 곡선 실험을 위해, 젤라틴으로 코팅된 12 웰 플레이트 중 피더가 없는 조건하에서 세포를 배양하였다. 이중으로 된 세포 샘플을 웰당 1.0X105개의 세포인 밀도로 플레이팅하였다. (24 hr의 간격을 둔) 각 시점 동안, 이중으로 된 웰로부터 얻은 세포를 트립신으로 처리하고, 혈구계를 사용하여 계수하였다. 계수값의 평균값을 구하고, 플롯팅하였다. ALK 억제제 A-83-01, SB431542, MEK 억제제 PD0325901, GSK3 억제제 CHIR99021, 및 FGF 수용체 억제제 PD 173074는 스템젠트 인크.(Stemgent Inc.)로부터 구입하였다. 파네이트는 시그마(Sigma)(P8511)로부터 구입하였다.
반정량적 RT - PCR 및 실시간 PCR: RN이지 플러스 미니 키트(RNeasy plus mini kit)(Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 추출하고, 제조사의 지시에 따라 올리고 dT 프라이머를 사용하여 i스크립트 cDNA 합성 키트(iScript cDNA Synthesis Kit)(Bio-Rad)로 역전사시켰다. PCR 생성물을 (1.5%) 아가로스 겔 상에서 분해하고, 에티디움 브로마이드에 의해 시각화하였다. 바이오래드 겔(Bio-Rad Gel) 문서 시스템을 사용하여 영상을 촬영하였다. IQ SYBR 그린(SYBR Green)(Bio-Rad)을 사용하는 바이오래드 실시간 PCR 검출 시스템 상에서 이중으로 된 정량적 PCR들 각각에서 희석된 cDNA를 사용하였다. 사용된 프라이머는 하기 보충 자료 표 2에 열거되어 있다.
중아황산염 서열분석 분석법: 비유기 DNA 단리용 키트(Non Organic DNA Isolation Kit)(Millipore)를 사용하여 DNA를 R1 mESC, EpiSC, 및 파네이트/mAMFGi 세포로부터 단리시켰다. 이어서, DNA를 EZ DNA 메틸화-골드 키트(캘리포니아주 오렌지 소재의 Zymo Research Corp.)로 처리하였다. 이어서, 처리된 DNA를 사용하여 관심의 대상이 되는 서열을 증폭시켰다. 프로모터 단편 증폭에 사용된 프라이머는 이전에 공개된 바 있고(문헌 ([Hayashi et al., Cell Stem Cell 3, 391-401, 2008]; [Imamura et al, BMC Dev Biol 6, 34, 2006])), 하기 보충 자료 표 2에 열거되어 있다. 서열분석용 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 생성된 단편을 클로닝하고, 서열분석하였다.
유식세포 측정 및 세포 분류: 부착성 세포를 PBS 중에서 2회에 걸쳐 세척한 후, 세포 해리 완충액(Cell Dissociation Buffer)(Invitrogen) 중 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 해리시키고, PBS + 3% 정상 염소 혈청(차단 완충액) 중에 다시 현탁시켰다. 세포를 항체 항SSEA1(1:50, Santa Cruz)과 함께 4℃에서 40분 동안 인큐베이션시킨 후, 상응하는 2차 항체와 함께 인큐베이션시킨 후에 세척 단계를 수행하였다. FACS아리아(FACSAria) 세포 분류기 및 FACS디바(FACSDiva) 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 세포를 분석하고 분류하였다. 여기용 488 nm 레이저를 사용하여 GFP 채널에서의 형광 강도에 따라 GFP 양성인 것을 측정하였다. 적색 채널에서의 형광에 따라 SSEA1 양성인 것을 측정하였다.
시험관내 분화: 파네이트/mAMFGi 세포를 트립신으로 처리하여 단일 세포로 만들고, 현탁액 중에서 배양하여 저부착 플레이트 중, 10% FBS로 보충된 DMEM 배지에서 배아유사체/EB를 형성하였다. 배지를 이틀에 한번씩 새로 교체해 주고, EB를 현탁액 중에서 6일 동안 성장시켰다. 이어서, 0.1% 젤라틴으로 코팅된 플레이트 상에 EB를 다시 플레이팅하였다. 각종 시점(3일 내지 16일까지)에 지정된 항체를 사용하여 대표적인 계통 특이 마커를 면역염색법으로 처리함으로써 자발적인 분화를 조사하였다. 지정 심장 분화를 위해, 세포를 마트리겔로 코팅된 플레이트 상에 2 x 104/㎠로 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24시간이 경과하였을 때, 세포를 화학적으로 규명된 배지(CDM: chemically defined medium) [RPMI 1640, 0.5xN2, 1xB27 (비타민 A 미포함), 0.5x글루타맥스, 0.55 mM 베타 머캅토에탄올, 및 1x비필수 아미노산으로 구성됨] 내로 교체해 주고, 5일 동안 3 μM BIO(Calbiochem) 및 20 ng/ml BMP-4(R&D)로 처리하였다. 이어서, 100 ng/ml Dkk-1을 함유하는 CDM으로 배지를 교체하고, 세포를 추가로 5일 동안 배양하였다. 간략하면, 11일째 세포를 트립신으로 처리하여/탈착시키고(0.05% 트립신), 추가의 성장 인자를 포함하지 않는 CDM 중 젤라틴으로 코팅된 6 웰 플레이트 상에 다시 플레이팅하고, 심장 콜로니 대부분에서 박동성인 표현형이 나타날 때 추가로 4-6일 동안 배양하였다.
특징 규명 분석: 제조사가 지시한 바와 같이 알칼리성 포스파타제 검출 키트(Chemicon)를 사용하여 ALP 염색법을 수행하였다. 표준 프로토콜을 사용하여 면역세포화학법을 수행하였다. 간략하면, 세포를 4% 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich) 중에 고정시키고, PBS를 사용하여 3회에 걸쳐 세척한 후, 실온에서 1 hr 동안 0.3% 트리톤 X-100(Sigma-Aldrich) 및 5% 정상 당나귀 혈청(Jackson Immuno Research)을 함유하는 PBS 중에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 4℃에서 밤새도록 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다: 알부민(Abeam, AB 19188, 1:200); 브라큐리(Santa Cruz, C-19, 1:200); 심장 트로포닌 t 항체(CT3)(Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:700); MAP2ab(Abeam, ab5392, 1:1000); MF20(Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:200); 나노그(Abeam, ab21603, 1:500); Oct4(Santa Cruz, sc-5279, 1:100); Sox17(R&D systems, AF1924, 1:300); SSEA1(Santa Cruz, sc-21702, 1:100); 스텔라(Millipore, MAB4388, 1:200); Tuj1(Covance, MMS-435P, 1:1000). PBS를 사용하여 3회에 걸쳐 세척한 후, 세포를 RT에서 2 hr 동안 적절한 알렉사 플루오르에 접합된 2차 항체(Invitrogen)와 함께 인큐베이션시켰다. DAPI(Sigma) 염색법에 의해 핵을 검출하였다. 자이스(Zeiss) HXP 120에 의해 영상을 포착하였다.
키메라 형성: 렌티바이러스를 사용하여 전환된 세포를 GFP에 의해 안정적으로 표지하였다. 세포를 8 세포 단계 마우스 배아와 함께 응집시킨 후, 2.5 dpc 상상 임신한 CD1 마우스의 자궁 내로 이식하였다.
마이크로어레이 분석: 뮤린 ES 세포, EpiSC 세포 및 파네이트/mAMFGi 세포의 전반적인 유전자 발현을 조사하고자 마이크로어레이 하이브리드화를 위해 일루미나 센트릭스 비드칩 어레이 마우스(Illumina Sentrix BeadChip Array MouseRef-8 v2)(캘리포니아주 소재의 Illumina)를 사용하였다. 일루미나 토탈프렙 RNA 증폭 키트(Illumina TotalPrep RNA amplification kit)(캘리포니아주 포스터 시티 1791 소재의 Ambion AMIL)를 사용하여 500 ng의 총 RNA로부터 비오틴-16-UTP-표지된 cRNA를 합성하였다. 공급받은 시약과 GE 헬쓰케어(GE Healthcare) 스트렙타비딘-Cy3 염색액을 사용하여 일루미나 비드스테이션 500X 시스템 매뉴얼(Illumina BeadStation 500X System Manual)(캘리포니아주 샌디에고 소재의 Illumina)에 따라 750 ng의 표지된 증폭 cRNA를 함유하는 하이브리드화 믹스를 제조하였다. 일루미나 어레이 마우스Ref-8 v2에의 하이브리드화는 비드칩 Hyb 휠(BeadChip Hyb Wheel) 상에서 18 h 동안 55℃에서 이루어졌다. 일루미나 비드어레이 판독기(Illumina BeadArray Reader)를 사용하여 어레이를 스캐닝하였다. 모든 샘플을 생물학상 2개씩 부본으로 제조하였다. 마이크로어레이 데이터의 프로세싱 및 분석은 일루미나 비드스튜디오(Illumina BeadStudio) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. R1 mESC 세포의 마이크로어레이 데이터는 본 발명자들의 이전 연구 GEO 데이터세트(GSM402334 및 GSM402335)로부터 입수하였다. 배경에 대해 모든 미처리 데이터를 감산하고, 순위 공변량 옵션을 사용하여 함께 정규화시켰다. 본 발명자들은 파네이트/mAMFGi 및 EpiSC의 마이크로어레이 데이터를 GEO 데이터세트로 기탁하고, 수탁 번호(R1 마우스 ES 세포의 경우, GSM402334 및 GSM402335; 파네이트/mAMFGi 및 EpiSC의 경우, GSE17664)를 받았다.
크로마틴 면역침전을 위한 실시간 PCR( ChIP - qPCR : Real - Time PCR for chromatin immunoprecipitation ): 상업적으로 이용가능한 마그나(Magna) ChIP™ G 키트(카탈로그 번호 17-611, Millipore)를 사용하여 ChIP를 수행하였다. 간략하면, 피더가 없이 배양된 1x106개의 세포를 1% 포름알데히드를 사용하여 고정시키고, 용해시키고, 초음파처리하여 뉴클레오좀에 접합된 200-500 bp의 DNA 단편을 수득하였다. 미리 자기 비드와 접합된 2차 항체와 반응을 시킨 항트리메틸-히스톤 H3 리신 4(Millipore, 카탈로그 번호 17-614, 3 ul/반응) 또는 항트리메틸-히스톤 H3 리신 27(Millipore, 카탈로그 번호 17-622, 4 ㎍/반응)을 사용하여 초음파처리된 용해물을 면역침전시켰다. 각 항체를 24hr 동안 인큐베이션시킨 후, 면역침전물을 회수하고, 포함되어 있는 DNA 단편을 프로테이나제 K(Proteinase K)와 함께 시킴으로써 정제하였다. DNA 단편에 대해 실시간 PCR을 수행하였다.
항체와 함께 인큐베이션시키기 이전의 전세포 용해물을 입력값으로서 사용하였다. 전체 용해물과 면역침전물로부터 얻은 1 ㎕의 DNA 단편에 대해 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 정상 토끼 IgG와의 면역침전물은 음성 대조군 샘플로서의 역할을 하였고, 이는 어떤 검출가능한 배경도 나타내지 않았다. 프라이머 서열을 표 2에 열거하였다.
Figure 112011055324757-pct00024
실시예 6: 복제가능하고, 만능성을 유지하는 만능성 동물 세포의 특징 규명
새롭게 생성된 hiPSC의 특징을 규명하기 위해, 실시간 PCR을 사용하여 hiPSC의 유전자 발현을 분석하였다. 인간 ES 세포주인 Hues9(hES facility, Harvard University, http://mcb.harvard.edu/melton/hues/)를 대조군으로서 사용하였다. Hues9 세포와 비교하였을 때 본 발명의 hiPSC는 예컨대, Gbx2(5배), Dppa3(2배) 및 Klf4(2.5배)와 같이 특정 유전자를 더 높은 수준으로 발현시켰다는 것이 실시간 PCR 분석을 통해 밝혀졌다. 이러한 마커는 또한 마우스 EpiSC를 제외한, 마우스 ES 세포에서 고도로 발현된 것이 관찰되었다. 실시간 PCR 분석법에 사용된 프라이머는 하기와 같았다:
Dppa3: 5'-CAACCTACATCCCAGGGTCT-3'(서열번호 86); 5'-TCAACGTCTCGGAGGAGATT-3'(서열번호 87);
Gbx2: 5'-AAAGGCTTCCTGGCCAAAG-3'(서열번호 88)
5'-TTGACTCGTCTTTCCCTTGC-3'(서열변호 89)
Klf4: 5'-AGCCTAAATGATGGTGCTTGGT-3'(서열번호 90)
5'-TTGAAAACTTTGGCTTCCTTGTT-3'(서열번호 91)
삭제
본 발명자들은 웨스턴 블롯 분석법을 사용하여 hiPSC 중 E 카드헤린의 발현에 대해서도 분석하였다. hiPSC 중 E 카드헤린의 발현은 Hues9 인간 ES 세포 중의 발현에 2배를 차지하였다.
상기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된 것이지, 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다. 당업계의 숙련인에게 본 발명의 다른 변형은 쉽게 자명해질 것이며, 첨부되는 특허청구범위에 포함될 것이다. 본원에서 인용되는 모든 공보, 데이터베이스, 진뱅크(Genbank) 서열, 특허, 및 특허 출원은 본원에서 참고 문헌으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Li, Wenlin Zhou, Hongyan Ding, Sheng The Scripps Research Institute <120> Generation and Maintenance of Stem Cells <130> 014740-002910PC <140> WO PCT/US09/68274 <141> 2009-12-16 <150> US 61/138,407 <151> 2008-12-17 <160> 91 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic GSK3 inhibitor L803, unmyristoylated GSK3beta Inhibitor XIII <221> MOD_RES <222> (10)...(10) <223> phosphoserine <221> MOD_RES <222> (11)...(11) <223> prolinamide <400> 1 Lys Glu Ala Pro Pro Ala Pro Pro Gln Ser Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for rat Oct4 <400> 2 tactgcccgc cccagcg 17 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for rat Oct4 <400> 3 gctgcttggc aatgctagt 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for rat Sox2 <400> 4 aaggccgtgc 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Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for human endogenous Sox2 <400> 31 agttgggatc gaacaaaagc tatt 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for human Rex-1 <400> 32 cagatcctaa acagctcgca gaat 24 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for human Rex-1 <400> 33 gcgtacgcaa attaaagtcc aga 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for human FGF-4 <400> 34 ctacaacgcc tacgagtcct aca 23 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for human FGF-4 <400> 35 gttgcaccag aaaagtcaga gttg 24 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for human TDGF2 <400> 36 ctgctgcctg aatgggggaa cctgc 25 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for human TDGF2 <400> 37 gccacgaggt gctcatccat cacaagg 27 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for human transgenic Oct4 <400> 38 cagtgcccga aacccacac 19 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for human transgenic Oct4 <400> 39 agaggaactg cttccttcac gaca 24 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for human transgenic Sox2 <400> 40 tacctcttcc tcccactcca 20 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for human transgenic Sox2 <400> 41 agaggaactg cttccttcac gaca 24 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for human transgenic Nanog <400> 42 cagaaggcct cagcacctac 20 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for human transgenic Nanog <400> 43 agaggaactg cttccttcac gaca 24 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for human GADPH <400> 44 gtggacctga cctgccgtct 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for human GADPH <400> 45 ggaggagtgg gtgtcgctgt 20 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic bisulfite-sequencing forward primer for rat Oct4 <400> 46 atgggatttt ggaggatttt tag 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic bisulfite-sequencing reverse primer for rat Oct4 <400> 47 ctcaaaccca aataccccta ctt 23 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic bisulfite-sequencing forward primer for human Oct4 <400> 48 ggatgttatt aagatgaaga tagttgg 27 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic bisulfite-sequencing reverse primer for human Oct4 <400> 49 cctaaactcc ccttcaaaat ctatt 25 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Blimp1 <400> 50 tcagcctctt ccctaggttg tatc 24 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Blimp1 <400> 51 aatcttaagg atccatcggt tcaac 25 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Brachyury <400> 52 atgccaaaga aagaaacgac 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Brachyury <400> 53 agaggctgta gaacatgatt 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Cdx2 <400> 54 aggctgagcc atgaggagta 20 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Cdx2 <400> 55 cgaggtccat aattccactc a 21 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Dax1 <400> 56 gtggcagggc agcatcctct acaa 24 <210> 57 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Dax1 <400> 57 caaaagaagc ggtaca 16 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Essrb <400> 58 cgccatcaaa tgcgagtaca tgc 23 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Esrrb <400> 59 gaatcaccat ccaggcactc tg 22 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Fbxo15/ECAT3 <400> 60 tagattcttg gacttccgtt ca 22 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Fbxo15/ECAT3 <400> 61 accaaggtca ccgcatccaa 20 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Fgf4 <400> 62 cgtggtgagc atcttcggag tgg 23 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Fgf4 <400> 63 ccttcttggt ccgcccgttc tta 23 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Fgf5 <400> 64 ctgtactgca gagtgggcat cgg 23 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Fgf5 <400> 65 gacttctgcg aggctgcgac agg 23 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for GADPH <400> 66 gtgttcctac ccccaatgtg t 21 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for GADPH <400> 67 attgtcatac caggaaatga gctt 24 <210> 68 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Gata6 <400> 68 accttatggc gtagaaatgc tgagggtg 28 <210> 69 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Gata6 <400> 69 ctgaatactt gaggtcactg ttctcggg 28 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Pecam1 <400> 70 gtcatggcca tggtcgagta 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Pecam1 <400> 71 agcaggacag gtccaacaac 20 <210> 72 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Rex-1 <400> 72 tgaaagtgag attagccccg ag 22 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Rex-1 <400> 73 gtcccatccc cttcaatagc ac 22 <210> 74 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Stella <400> 74 gaaactcctc agaagaaa 18 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Stella <400> 75 ctcttgttct ccacaggtac 20 <210> 76 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR forward primer for Stra8 <400> 76 gcaaccaacc cagtgatgat gg 22 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RT-PCR reverse primer for Stra8 <400> 77 catctggtcc aacagcctca g 21 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic bisulfite-sequencing PCR forward primer for Fgf4 <400> 78 tttaggtttt aagagtgttg gggagaagat 30 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic bisulfite-sequencing PCR reverse primer for Fgf4 <400> 79 tacaaaacaa aaacatcaaa cccattctaa 30 <210> 80 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic bisulfite-sequencing PCR forward primer for Stella <400> 80 attttgtgat tagggttggt ttagaa 26 <210> 81 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic bisulfite-sequencing PCR reverse primer for Stella <400> 81 ccaaaacatc ctcttcatct ttcttct 27 <210> 82 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic bisulfite-sequencing PCR forward primer for Stella nest <400> 82 tttttggaat tggttgggat tg 22 <210> 83 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic bisulfite-sequencing PCR reverse primer for Stella nest <400> 83 cttctaaaaa atttcaaaat ccttcatt 28 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic chromatin immunoprecipitation (ChIP-qPCR) forward primer for Stella <400> 84 gatccagctg gtctgagcta 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic chromatin immunoprecipitation (ChIP-qPCR) reverse primer for Stella <400> 85 gtgcagggat cataggagtg 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic real-time PCR primer Dppa3 <400> 86 caacctacat cccagggtct 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic real-time PCR primer Dppa3 <400> 87 tcaacgtctc ggaggagatt 20 <210> 88 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic real-time PCR primer Gbx2 <400> 88 aaaggcttcc tggccaaag 19 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic real-time PCR primer Gbx2 <400> 89 ttgactcgtc tttcccttgc 20 <210> 90 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic real-time PCR primer Klf4 <400> 90 agcctaaatg atggtgcttg gt 22 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic real-time PCR primer Klf4 <400> 91 ttgaaaactt tggcttcctt gtt 23

Claims (57)

1회 이상의 세포 분열을 통해 만능성 세포를 배양하는 방법으로서,
세포 만능성을 유지하면서 1회 이상의 세포 분열이 가능하도록,
a. ALK5 억제제,
b. GSK3 억제제 및
c. MEK 억제제
의 충분량 존재하에서 만능성 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 배양 방법.
삭제
제1항에 있어서, GSK3 억제제는 CHIR99021인 배양 방법.
제1항에 있어서, 배양 단계는 일정량의 백혈병 억제 인자(LIF)의 존재하에서 세포를 배양하는 것을 더 포함하는 것인 배양 방법.
제1항에 있어서, MEK 억제제는 PD0325901인 배양 방법.
제1항에 있어서, 배양 단계는 LIF의 추가 존재하에서 수행되는 것인 배양 방법.
제1항에 있어서, ALK5 억제제는 A-83-01인 배양 방법.
제1항에 있어서, ALK5 억제제는 SB431542인 배양 방법.
제1항에 있어서, 만능성 세포는 세포 만능성을 유지하면서 5회 이상의 세포 분열을 통해 배양되는 것인 배양 방법.
제1항에 있어서, 이종성 핵산을 만능성 세포로 도입하는 단계, 및 생성된 세포를, 만능성을 유지하면서 1회 이상의 부가적인 세포 분열이 가능하도록 배양하는 단계를 더 포함하는 배양 방법.
제10항에 있어서, 이종성 핵산을 동물 세포로 도입 후, 만능성을 유도하고, 이어서 배양 단계에 제공하는 것인 배양 방법.
제1항에 있어서, 세포는 래트 또는 인간 세포인 배양 방법.
제1항에 있어서, 만능성 세포는 배아 줄기 세포인 배양 방법.
제1항에 있어서, 만능성 세포는 유도된 만능성 줄기 세포인 배양 방법.
제1항에 있어서, 세포는 비인간 동물 세포이고, 방법은 만능성 세포를, 상기 세포와 동일한 동물종 유래의 배반포로 도입하는 단계, 및 배반포를 동일종 동물의 자궁 내로 도입하는 단계를 더 포함하는 것인 배양 방법.
제15항에 있어서, 만능성 세포 유래의 핵산 존재를 기초로 상기 동물의 키메라 자손을 선별하는 배양 방법.
세포 만능성을 유지하면서 1회 이상의 세포 분열이 가능하도록,
a. ALK5 억제제,
b. GSK3 억제제 및
c. MEK 억제제
의 충분량을 포함하는 만능성 포유동물 세포의 배양물.
제17항에 있어서, 백혈병 억제 인자(LIF)를 더 포함하는 배양물.
삭제
제17항에 있어서, GSK3 억제제는 CHIR99021인 배양물.
제17항에 있어서, MEK 억제제는 PD0325901인 배양물.
제17항에 있어서, ALK5 억제제는 A-83-01인 배양물.
제17항에 있어서, ALK5 억제제는 SB431542인 배양물.
제17항에 있어서, 세포는 인간 또는 래트 세포인 배양물.
제17항에 있어서, 세포는 배아 줄기 세포인 배양물.
만능성 세포를 배지에서 배양시 세포 만능성을 유지하면서 1회 이상의 세포 분열이 가능하도록, ALK5 억제제, MEK 억제제 및 GSK3 억제제의 충분량을 포함하는 세포 배양 배지.
제26항에 있어서, 백혈병 억제 인자(LIF)를 더 포함하는 세포 배양 배지.
제26항에 있어서, GSK3 억제제는 CHIR99021인 세포 배양 배지.
제26항에 있어서, MEK 억제제는 PD0325901인 세포 배양 배지.
삭제
제26항에 있어서, ALK5 억제제는 A-83-01인 세포 배양 배지.
제26항에 있어서, ALK5 억제제는 SB431542인 세포 배양 배지.
제26항에 있어서, 배지는 사전 포장된, 밀봉 용기에 존재하는 것인 세포 배양 배지.
부분적으로 만능성인 포유동물 세포의 만능성을 증가시키는 방법으로서,
a. 부분적으로 만능성인 세포를, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 히스톤 H3K4 탈메틸화의 억제제 또는 H3K4 메틸화의 활성제에서 선택된 후생유전적 개질제와 접촉시키는 단계;
b. 단계 (a) 수행 후, 세포를 MEK 억제제 및 GSK3 억제제와 함께, 후생유전적 개질제의 부재하에서 배양함으로써 부분적으로 만능성인 포유동물 세포와 비교시 ALP-1 및 REX-1을 포함하는 하나 이상의 내세포괴(ICM) 특이적 마커를 발현하는 세포를 생성하는 단계; 및
c. 단계 (b) 수행 후, 세포를 (i) ALK5 억제제, (ii) MEK 억제제 및 (iii) GSK3 억제제와 함께 배양하는 단계
를 포함하고, 여기서 부분적으로 만능성인 세포는 하나 이상의 ALP-1 또는 REX-1를 발현하지 않는 것인 증가 방법.
삭제
제34항에 있어서, 단계 (b) 또는 (c) 수행 후 세포를 백혈병 억제 인자(LIF)의 존재하에서 배양하는 것을 더 포함하는 것인 증가 방법.
제34항에 있어서, 부분적으로 만능성인 세포는 배반엽상층 줄기 세포인 증가 방법.
제34항에 있어서, 후생유전적 개질제는 발프로산 또는 파네이트인 증가 방법.
삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2009117439A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
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CA2751332C (en) 2009-02-03 2024-04-02 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising said stem cells
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CN102575251B (zh) * 2009-05-18 2018-12-04 库尔纳公司 通过抑制针对重编程因子的天然反义转录物来治疗重编程因子相关的疾病
CN102741394B (zh) 2009-10-16 2016-05-04 斯克里普斯研究所 多能细胞的诱导
AU2010315166B2 (en) 2009-11-04 2015-01-22 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Episomal reprogramming with chemicals
CN105176930B (zh) 2010-03-31 2021-05-04 斯克里普斯研究所 重编程细胞
WO2011159726A2 (en) 2010-06-14 2011-12-22 The Scripps Research Institute Reprogramming of cells to a new fate
JP2013535966A (ja) * 2010-07-27 2013-09-19 テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド 引き抜かれた毛包由来のケラチン生成細胞から誘導多能性幹細胞を生成させる方法
WO2012014205A1 (en) 2010-07-27 2012-02-02 Technion Research & Development Foundation Ltd. Isolated mesenchymal progenitor cells and extracellular matrix produced thereby
EP2616540A4 (en) * 2010-09-14 2014-02-19 Univ Kyoto METHOD OF EFFICIENTLY ESTABLISHING INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS
WO2012044979A2 (en) 2010-10-01 2012-04-05 The Goverment Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Manipulation of stem cell function by p53 isoforms
CN103380212B (zh) * 2010-12-22 2017-04-05 菲特治疗公司 用于单细胞分选与增强ipsc重新编程的细胞培养平台
BR112014013152B1 (pt) 2011-12-01 2021-08-31 New York Stem Cell Foundation, Inc Sistema automatizado para geração de células-tronco pluripotentes induzidas (ipscs)
US10428309B2 (en) 2011-12-01 2019-10-01 New York Stem Cell Foundation, Inc. Systems and methods for producing stem cells and differentiated cells
AU2013290146B2 (en) * 2012-07-11 2018-01-18 Imstem Biotechnology, Inc. Mesenchymal-like stem cells derived from human embryonic stem cells, methods and uses thereof
WO2014130706A1 (en) * 2013-02-20 2014-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
US20150037883A1 (en) * 2013-03-03 2015-02-05 Royan Institute Method for derivation and long-term establishment of ground state pluripotent embryonic stem cells
HUE056903T2 (hu) 2013-04-16 2022-04-28 Regeneron Pharma Patkány genom célzott módosítása
US10920192B2 (en) 2013-04-23 2021-02-16 Yeda Research And Development Co. Ltd. Isolated naive pluripotent stem cells and methods of generating same
AU2014280843B2 (en) 2013-06-14 2017-04-20 The University Of Queensland Renal progenitor cells
KR101655383B1 (ko) 2013-07-27 2016-09-08 고려대학교 산학협력단 소분자 화합물을 포함하는 만능성 줄기세포의 염색체 안정성 유지용 조성물
US9512406B2 (en) 2013-12-20 2016-12-06 The J. David Gladstone Institute, a testamentary trust established under the Will of J. David Gladstone Generating hepatocytes
KR102460549B1 (ko) 2014-03-04 2022-10-28 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 개선된 재프로그래밍 방법 및 세포 배양 플랫폼
CA2945027C (en) * 2014-04-07 2023-10-31 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Modulating cell proliferation and pluripotency
EP3194572B1 (en) * 2014-07-30 2023-10-25 Yeda Research and Development Co. Ltd. Media for culturing pluripotent stem cells
EP3183336B1 (en) 2014-08-22 2020-11-25 Cambridge Enterprise Limited Resetting pluripotent stem cells
CN105441384B (zh) * 2014-09-26 2021-01-05 北京大学 一种制备动物和人类原始多潜能干细胞的方法，试剂盒及用途
WO2016123117A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Fate Therapeutics, Inc. Cells with increased immuno-regulatory properties and methods for their use and manufacture
US10669528B2 (en) 2015-06-25 2020-06-02 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
JP2018520688A (ja) 2015-07-21 2018-08-02 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション Ｐｄ−ｌ１発現造血幹細胞およびその使用
EP3362570A4 (en) 2015-10-16 2019-03-20 Fate Therapeutics, Inc. PLATFORM FOR INDUCTION AND MAINTENANCE OF PLURIPOTENCE IN THE FUNDAMENTAL STATE
CA3002162A1 (en) * 2015-10-21 2017-04-27 Indiana University Research And Technology Corporation Methods of generating human inner ear sensory epithelia and sensory neurons
WO2017154795A1 (ja) 2016-03-08 2017-09-14 公立大学法人名古屋市立大学 人工多能性幹細胞の腸管上皮細胞への分化誘導
US20190119642A1 (en) 2016-03-15 2019-04-25 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
EP3455346A1 (en) 2016-05-12 2019-03-20 Erasmus University Medical Center Rotterdam A method for culturing myogenic cells, cultures obtained therefrom, screening methods, and cell culture medium
DK3519558T3 (da) 2016-09-28 2023-11-13 Organovo Inc Anvendelse af modificeret nyrevæv i assays
US20190302100A1 (en) * 2016-10-28 2019-10-03 National Cancer Center Method for preparing liver progenitor cells
JP2018091790A (ja) * 2016-12-06 2018-06-14 東ソー株式会社 細胞の染色方法
EP3622054A1 (en) * 2017-05-08 2020-03-18 Regents of the University of Minnesota Acceleration of stem cell differentiation
NL2019517B1 (en) 2017-09-08 2019-03-19 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam New therapy for Pompe disease
US11879137B2 (en) 2017-09-22 2024-01-23 The Children's Medical Center Corporation Treatment of type 1 diabetes and autoimmune diseases or disorders
JP7330466B2 (ja) 2017-11-30 2023-08-22 国立大学法人京都大学 細胞の培養方法
CN111684063A (zh) * 2018-01-31 2020-09-18 富士胶片株式会社 细胞的制造方法
CA3090473C (en) 2018-02-09 2024-04-02 Public University Corporation Nagoya City University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into intestinal epithelial cells
US11901045B2 (en) 2019-01-15 2024-02-13 International Business Machines Corporation Machine learning framework for finding materials with desired properties
KR102224273B1 (ko) * 2019-10-10 2021-03-08 고려대학교 산학협력단 줄기세포 유래 성숙 심근세포 및 이를 이용한 심혈관 질환 모델
EP3922431A1 (en) 2020-06-08 2021-12-15 Erasmus University Medical Center Rotterdam Method of manufacturing microdevices for lab-on-chip applications
CN112063656A (zh) * 2020-08-28 2020-12-11 中国科学院广州生物医药与健康研究院 Map2k3或Map2k6在提高诱导成体细胞生成多能性干细胞效率中的用途

Family Cites Families (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5010175A (en) 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5340740A (en) 1992-05-15 1994-08-23 North Carolina State University Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process
US5702932A (en) 1992-07-20 1997-12-30 University Of Florida Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
WO1995003402A1 (en) 1993-07-22 1995-02-02 Merck & Co., Inc. EXPRESSION OF HUMAN INTERLEUKIN-1β IN A TRANSGENIC ANIMAL
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5656610A (en) 1994-06-21 1997-08-12 University Of Southern California Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
GB9807935D0 (en) 1998-04-14 1998-06-10 Univ Edinburgh Lineage specific cells and progenitor cells
US5945100A (en) 1996-07-31 1999-08-31 Fbp Corporation Tumor delivery vehicles
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
US6090622A (en) 1997-03-31 2000-07-18 The Johns Hopkins School Of Medicine Human embryonic pluripotent germ cells
US6087496A (en) 1998-05-22 2000-07-11 G. D. Searle & Co. Substituted pyrazoles suitable as p38 kinase inhibitors
US6344476B1 (en) 1997-05-23 2002-02-05 Bayer Corporation Inhibition of p38 kinase activity by aryl ureas
CA2290520C (en) 1997-05-23 2009-01-27 Bayer Corporation Inhibition of p38 kinase activity by aryl ureas
US6093742A (en) 1997-06-27 2000-07-25 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of p38
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
WO1999020624A1 (en) 1997-10-20 1999-04-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Bicyclic kinase inhibitors
WO1999027076A1 (en) 1997-11-25 1999-06-03 Arc Genomic Research Pluripotent embryonic stem cells and methods of obtaining them
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
ATE346600T1 (de) 1997-12-22 2006-12-15 Bayer Pharmaceuticals Corp Inhibierung der p38 kinase-aktivität durch die verwendung von aryl- und heteroarylsubstituierten harnstoffen
JP3887769B2 (ja) 1997-12-22 2007-02-28 バイエル コーポレイション 対称および非対称ジフェニル尿素を用いるｐ３８キナーゼの阻害
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
JP2002521025A (ja) * 1998-07-24 2002-07-16 ザ カーネギー インスチチューション オブ ワシントン 増殖因子のＴＧＦ−βファミリーのメンバーを使用する、生殖系列幹細胞の維持および増殖のための方法。
CA2341370A1 (en) 1998-08-20 2000-03-02 Smithkline Beecham Corporation Novel substituted triazole compounds
US6184226B1 (en) 1998-08-28 2001-02-06 Scios Inc. Quinazoline derivatives as inhibitors of P-38 α
EP1114039A1 (en) 1998-09-18 2001-07-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated INHIBITORS OF p38
AR023659A1 (es) 1998-09-18 2002-09-04 Vertex Pharma Un compuesto inhibidor de p38, una composicion farmaceutica que lo comprende y el uso de dicha composicion en el tratamiento y prevencion de estados patologicos
JP2002529070A (ja) 1998-11-09 2002-09-10 モナシュ・ユニヴァーシティ 胚性幹細胞
US6509361B1 (en) 1999-05-12 2003-01-21 Pharmacia Corporation 1,5-Diaryl substituted pyrazoles as p38 kinase inhibitors
US6541477B2 (en) 1999-08-27 2003-04-01 Scios, Inc. Inhibitors of p38-a kinase
US20020142457A1 (en) 1999-12-28 2002-10-03 Akihiro Umezawa Cell having the potentiality of differentiation into cardiomyocytes
US6560871B1 (en) 2000-03-21 2003-05-13 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Semiconductor substrate having increased facture strength and method of forming the same
US6458589B1 (en) * 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
JP2008119003A (ja) * 2001-10-30 2008-05-29 Renomedix Institute Inc 中胚葉幹細胞もしくはｅｓ細胞、または不死化した中胚葉幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法
CN1671835A (zh) * 2001-12-28 2005-09-21 塞拉提斯股份公司 一种建立多能人胚泡衍生的干细胞的方法
GB0210539D0 (en) * 2002-05-08 2002-06-19 Univ Edinburgh Control of es cell self renewal and lineage specification, and medium therefor
JP2006517234A (ja) 2003-02-10 2006-07-20 アムジエン・インコーポレーテツド バニロイド受容体リガンドおよび治療におけるこれらのリガンドの使用
AU2003901099A0 (en) 2003-03-11 2003-03-27 Es Cell International Pte Ltd. Methods of inducing differentiation of stem cells
US20070010008A1 (en) * 2005-06-29 2007-01-11 Tissuetech, Inc. Ex vivo expansion of primary animal cells
KR101164104B1 (ko) 2003-10-03 2012-07-12 게이이치 후쿠다 줄기세포로부터 심근세포의 분화를 유도하는 방법
CA2542276A1 (en) 2003-10-16 2005-04-28 The University Court Of The University Of Edinburgh Control of es cell self-renewal and lineage specification, and medium therefor
US20070141703A1 (en) 2003-11-19 2007-06-21 Stanley Edouard G Methods for producing blood products from pluripotent cells in cell culture
US20070269412A1 (en) 2003-12-02 2007-11-22 Celavie Biosciences, Llc Pluripotent cells
JP2007528226A (ja) * 2004-03-10 2007-10-11 リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ カリフォルニア 胚幹細胞の増殖用組成物および方法
EP1735430A4 (en) * 2004-04-13 2007-10-31 Sungkwang Educational Foundati IN VITRO METHOD FOR ISOLATION, PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF GERMPLE STEM CELLS
WO2005121320A1 (ja) * 2004-06-10 2005-12-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 幹細胞自己複製促進剤
WO2006020919A2 (en) 2004-08-13 2006-02-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells
WO2006026473A2 (en) 2004-08-25 2006-03-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS
ATE554184T1 (de) 2004-12-16 2012-05-15 Harvard College Durch das nukleäre aminoxidase-homolog lsd1 vermittelte histondemethylierung
WO2006088867A2 (en) * 2005-02-15 2006-08-24 Medistem Laboratories, Incorporated Method for expansion of stem cells
GB0505970D0 (en) * 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
US20060234911A1 (en) * 2005-03-24 2006-10-19 Hoffmann F M Method of reversing epithelial mesenchymal transition
WO2006128152A2 (en) 2005-05-26 2006-11-30 Thomas Jefferson University Method to treat and prevent posterior capsule opacification
AU2006257859B2 (en) 2005-06-10 2009-12-10 Irm Llc Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells
WO2007010858A1 (ja) * 2005-07-15 2007-01-25 Kyoto University 骨格筋組織由来の単一細胞よりクローン化した多能性幹細胞
MX2008001709A (es) 2005-08-01 2008-11-26 Nupotential Inc Produccion de celulas reprogramadas con potencial restablecido.
BRPI0614805A2 (pt) 2005-08-10 2011-04-12 Univ Johns Hopkins poliaminas úteis como produtos terapêuticos antiparasìticos e anticáncer e como inibidores de demetilase lisina-especìficos
US20080242594A1 (en) 2005-09-08 2008-10-02 Mckay Ronald D G Methods for Promoting Stem Cell Proliferation and Survival
KR100679642B1 (ko) * 2005-11-16 2007-02-06 주식회사 알앤엘바이오 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하는세포치료제
EA014166B1 (ru) 2005-12-13 2010-10-29 Киото Юниверсити Ядерный фактор перепрограммирования
US20090227032A1 (en) 2005-12-13 2009-09-10 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
DE102006001640A1 (de) 2006-01-11 2007-07-12 Degussa Gmbh Keramische Wandverkleidungsverbände mit IR-Strahlung reflektierenden Eigenschaften
US20090186076A1 (en) 2006-02-01 2009-07-23 Kazunori Kataoka Combined Use of TGF-Beta Signaling Inhibitor and Antitumor Agent
US7541186B2 (en) 2006-02-22 2009-06-02 University Of Washington Method of generating human retinal progenitors from embryonic stem cells
TW200815597A (en) 2006-03-30 2008-04-01 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors, and uses thereof
GB0615327D0 (en) * 2006-03-30 2006-09-13 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
CA2650561C (en) 2006-05-02 2014-02-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
BRPI0713119A2 (pt) 2006-06-30 2012-04-17 Schering Corp piperidinas substituìdas que aumentam a atividade de p53 e os usos destas
GB0613756D0 (en) * 2006-07-12 2006-08-23 Univ Sheffield Cell culture medium
WO2008006583A1 (en) 2006-07-14 2008-01-17 Novartis Ag Pyrimidine derivatives as alk-5 inhibitors
US20080125342A1 (en) 2006-11-07 2008-05-29 Advanced Technology Materials, Inc. Formulations for cleaning memory device structures
GB0622395D0 (en) 2006-11-09 2006-12-20 Univ Cambridge Tech Methods relating to pluripotent cells
WO2008075741A1 (ja) * 2006-12-20 2008-06-26 Keio University 糖尿病治療剤及び予防剤
US7892830B2 (en) 2007-01-17 2011-02-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Clonal culture of human pluripotent stem cells
WO2008087917A1 (ja) * 2007-01-18 2008-07-24 Riken 視細胞への分化誘導方法
US20100172883A1 (en) 2007-01-19 2010-07-08 Bruneau Benoit Gaetan Methods of generating cardiomyocytes
CN101641436A (zh) 2007-01-30 2010-02-03 佐治亚大学研究基金会 用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞（mmc）的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群
WO2008105630A1 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Procell Therapeutics Inc. Combined use of cell permeable nanog and oct4 for increasing self-renewal and suppressing differentiation of stem cells
JP2010523685A (ja) 2007-04-13 2010-07-15 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー リジン特異的デメチラーゼ阻害剤
US8648069B2 (en) 2007-06-08 2014-02-11 Abbvie Inc. 5-substituted indazoles as kinase inhibitors
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
KR20160005142A (ko) 2007-06-29 2016-01-13 셀룰러 다이내믹스 인터내셔널, 인코포레이티드 배아줄기세포 배양을 위한 자동화 방법 및 장치
US20120282229A1 (en) 2007-08-01 2012-11-08 Christian Kannemeier Non-viral delivery of transcription factors that reprogram human somatic cells into a stem cell-like state
JP6151879B2 (ja) 2007-08-31 2017-06-21 ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ 体細胞を再プログラミングすることにおけるｗｎｔ経路の刺激
CA2660123C (en) 2007-10-31 2017-05-09 Kyoto University Nuclear reprogramming method
JP4604076B2 (ja) 2007-11-07 2010-12-22 国立大学法人静岡大学 燃料電池用電解質膜
WO2009073523A2 (en) 2007-11-29 2009-06-11 Children's Hospital Of Orange County De-differentiation of human cells
EP2227241A1 (en) 2007-11-30 2010-09-15 Cytomatrix PTY LTD Methods of inducing pluripotency involving sox2 protein
AU2008329563A1 (en) 2007-11-30 2009-06-04 Cytomatrix Pty Ltd Methods of inducing pluripotency involving Oct4 protein
WO2009117439A2 (en) * 2008-03-17 2009-09-24 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
US10047346B2 (en) * 2008-08-08 2018-08-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Method of treating heart tissue using induced pluripotent stem cells
US8298825B1 (en) 2008-08-25 2012-10-30 The General Hospital Corporation TGF-beta receptor inhibitors to enhance direct reprogramming
SG172160A1 (en) 2008-12-17 2011-07-28 Scripps Research Inst Generation and maintenance of stem cells
US20120122212A1 (en) 2009-03-06 2012-05-17 Marica Grskovic Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells
EP2438159B1 (en) 2009-05-29 2018-10-03 Kyoto University Method for selecting clone of induced pluripotent stem cells
SG10201608797WA (en) 2009-08-07 2016-12-29 Univ Kyoto Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
CN102741394B (zh) 2009-10-16 2016-05-04 斯克里普斯研究所 多能细胞的诱导
US8486701B2 (en) 2010-03-05 2013-07-16 University Of Houston ETS2 and MESP1 generate cardiac progenitors from fibroblasts
CN105176930B (zh) 2010-03-31 2021-05-04 斯克里普斯研究所 重编程细胞
JO3421B1 (ar) 2011-06-20 2019-10-20 H Lundbeck As طريقة لإعطاء 1-((1ار.3س)-6-كلورو-3-فينيل-اندان-1-ايل)-1.2.2-ترايميثيل- بيبيرازين واملاجها لمعالجة انفصام الشخصية

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Vallier, L. et al. Journal of Cell Science, 2005.10.1., Vol.118, no.19, pp.4495-4509

Also Published As

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