CN101313065A

CN101313065A - 具有恢复的潜能的重编程序细胞的生产

Info

Publication number: CN101313065A
Application number: CNA2006800366098A
Authority: CN
Inventors: K·J·埃勒特森
Original assignee: NuPotential Inc
Current assignee: NuPotential Inc
Priority date: 2005-08-01
Filing date: 2006-08-01
Publication date: 2008-11-26
Also published as: CA2617611A1; BRPI0614470A2; MX2008001709A; IL189113A; KR20080043805A; US20070032447A1; WO2007016566A2; US20100159459A1; IL189113A0; WO2007016566A9; EP1917356A2; JP2009502201A; US7601699B2; JP4395193B2; KR101004634B1; US8987220B2; AU2006275479A1; WO2007016566A3; AU2006275479B2

Abstract

描述了用此类化合物个别或组合处理培养中细胞和/或核移植单位和/或干细胞的方法。该方法导致总体甲基化不足的基因组以及细胞分化和/或发育潜能或可能性恢复。此外，描述了用于体外生产重编程序的细胞的方法，所述重编程序的细胞已具有通过使基因组脱甲基恢复的分化潜能(全能、多潜能、或多能)。

Description

具有恢复的潜能的重编程序细胞的生产

Kenneth J.Eilertsen

与相关申请的交叉参考

在此要求于2005年8月1日提交的临时申请系列号60/704,465的优先权，所述临时申请引入本文作为参考。

发明领域

总体而言，本发明涉及细胞生物学、干细胞、细胞分化、体细胞核移植和基于细胞的治疗领域。更具体而言，本发明涉及用于给细胞重编程序和基于细胞的治疗的方法和产物。还提供了分离和培养方法，以及关于分离的细胞的治疗用途。

现有技术描述

近期的饮食研究已描述了甲基供体状态、一碳代谢和DNA甲基化之间的相互作用[1-12]。DNA甲基化与发育状态和分化潜能相关[13-19]。此外，关于体细胞核移植(SCNT)诱导的重编程序和与正常受精相关的重编程序的明确需求是DNA脱甲基作用[20]。在这个背景中综述下述背景材料。

在多细胞生物发育期间，不同细胞和组织获得不同基因表达程序。这些不同基因表达模式看起来基本上由外遗传修饰调节，所述外遗传修饰例如DNA甲基化、组蛋白修饰和各种染色质结合蛋白[21，22]。因此多细胞生物内的每种细胞类型具有独特的外遗传标记，一旦细胞分化或退出细胞周期，所述标记就被认为变成“固定的”。

然而，某些细胞在正常发育期间或某些疾病情况下经历主要外遗传“重编程序”。重编程序涉及核中外遗传标记的去除，随后为不同标记组的确立[23-25]。例如，在受精时，配子外遗传标记被消除且替换为全能性和胚胎发育所需的胚胎标记。重编程序也在原生殖细胞中发生，其中亲本印记被消除以恢复全能性。癌细胞和转分化的细胞也被认为经历重编程序。最后，显著的重编程序是为了生殖克隆化和干细胞疗法目的SCNT后所需的[26-33]。

最近已获得对正常发育和SCNT中外遗传重编程序的新了解。尽管对重编程序机制和所包括的因素的了解仍是初步的，但基础认识现在达到一定阶段，在所述阶段可以发展更详细的概念且可以设计新实验方法，以检查将提供新商业机会的机制方面。体内诱导的(受精和胚胎发生)和体外诱导的SCNT重编程序的简要概述如下。

外遗传重编程序和发育

体内重编程序-受精：

DNA甲基化：在小鼠中，在受精时，亲本基因组在不同细胞周期阶段具有不同的外遗传标记和染色质组织。由成熟精子递送的父本基因组是单拷贝并且由鱼精蛋白致密地包裹。母本基因组停滞在中期II并且它的双拷贝基因组由组蛋白包裹。在受精时，鱼精蛋白替换为组蛋白，且母本基因组完成减数分裂。如通过间接免疫荧光[34]和亚硫酸氢盐测序[35]检测的，组蛋白获得后，父本基因组经历全基因组的DNA甲基化丧失。脱甲基作用在父本前核中的DNA复制开始前完成。然而，应当指出并非所有基因组区域都在这个阶段脱甲基。认为卵母细胞细胞质包含特异性靶向或排除精子染色质中的某些序列种类的脱甲基因子。

组蛋白修饰：母本染色质被这样组织，从而使得DNA甲基化和染色质修饰在受精时丰富。这些包括与活性和阻抑状态相关的核酸组蛋白修饰和染色质蛋白质。例如，组蛋白修饰一般与活性状态相关，例如乙酰化赖氨酸和H3K4me在雌性前核中发现[34，36，37]。也存在很大程度上与阻抑染色质状态相关的异染色质修饰，例如H3K9me2/3、H3K27me1和H4K20me3。

与雄性前核相关的组蛋白是高度乙酰化的[34，36]；然而，紧在组蛋白掺入后，H3K4me1、H3K9me1和H3K27me1是可检测的[37-39]。这在DNA甲基化仍存在于雄性前核中时发生。对于父本基因组发生的渐进性组蛋白修饰可能导致等价于母本基因组那种的染色质状态。

植入前发育

被动脱甲基作用：在小鼠中从单细胞到胚泡期，在总体DNA甲基化方面存在进一步的变化。DNA甲基化随着每次卵裂分裂渐进地减少，并且这种丧失依赖于DNA复制[40，41]。Dnmt1o-由卵母细胞遗传的DNMT1蛋白质在前3次卵裂分裂期间被排除[42，43]，从而解释了通过被动机制的甲基化丧失的原因。

组蛋白修饰：组蛋白修饰在被动DNA脱甲基作用期间重编程序的程度目前不清楚。

外遗传不对称和谱系定型

甲基化：哺乳动物胚胎发生中的第一个谱系分配事件在桑椹胚期发生，且导致胚泡中的内细胞团(ICM)和滋养外胚层(trophoectoderm)(TE)谱系形成。关于细胞命运决定的机制未知。有趣的是，二细胞裂球仍是全能的，但到四细胞期(在小鼠中)时，基于全能性减少呈现谱系偏倚[44]。已检测到胚外和胚胎谱系之间DNA甲基化中的总体差异，且差异可早在胚泡期检测，在所述胚泡期时主动和被动脱甲基作用的组合已导致TE中较低的甲基化状态。相比之下，由于从头甲基化，ICM具有增加的总体甲基化水平，所述从头甲基化可能由从头DNA甲基转移酶DNMT3b引起，所述DNMT3b在胚泡ICM而不是TE中是可检测的[34]。

组蛋白修饰：在小鼠中，组蛋白H3K9me3标记ICM中的异染色质焦点，并且H3K27me1、me2和me3在ICM比TE中更丰富[38]。失活X染色体和某些印记的区域在TE中由H327me和H3K9me标记。一般而言，如同DNA甲基化一样，当与TE比较时，也在ICM中发现较高水平的特异性阻抑组蛋白甲基化标记。因此外遗传不对称是发育所需的。

体细胞核移植：实验上改变外遗传标记的一种方法是经由SCNT或克隆。SCNT要求分化的体细胞核被重编程序至卵母细胞环境中的全能性状态，其中核DNA材料已被去除(通常称为“去核”)。已在来自多个物种的克隆的胚胎和成体中检查到的所有外遗传标记都显示异常，并且大多数SCNT胚胎在它们具有的精确外遗传特征方面也不同于彼此，从而指出SCNT诱导的外遗传重编程序是偶然和随机过程[30-33，45]。

此外，SCNT胚胎发育是高度可变的，其中绝大多数在所有发育阶段时死亡，且存活者具有多种异常。在发育至更晚妊娠期或至足月的那些中，许多具有胎盘异常，且相当大的比例由于对子宫外生活适应不良而在围产期死亡。因为克隆的动物的后代看起来正常，所以大多数克隆的发育问题很可能由外遗传缺陷引起。SCNT胚胎的发育和外遗传异常倾向于越严重，它们就越早被检查到，而越少的异常胚胎存活至更晚阶段[46]。

克隆的后代和SCNT胚胎中描述的外遗传缺陷包括X失活[47，48]、印记[49-51]、DNA甲基化(总体和具体基因座)[36，47，52，53]、组蛋白乙酰化[43]、甲基化[43]中的错误，和基因表达中的改变[54]，所述基因表达中的改变包括不能再活化Oct4，所述Oct4是关键多潜能性(pluripotency)和发育上重要的基因[55-57]。

由SCNT诱导的重编程序因此看起来具有至少2个重要需求：核内蛋白去除和体细胞DNA脱甲基作用，后者显然是最重要的。例如，当将来自小鼠胸腺细胞的甲基化的体细胞核注射到爪蟾属(Xenopus)卵母细胞内时，Somonsson和Gurdon观察到相当大的Oct4表达延迟[20]。当在核移植前使核去蛋白时，延迟下降。然而，当注射未甲基化的DNA例如细菌质粒时，没有可检测的延迟。这指示当所有阻抑蛋白质已从核中去除时，仍然发生相当大延迟，并且在转录可以接着发生前，那种DNA必须进行脱甲基。此外，使用Dnmt1的减效等位基因，Blelloch等人证实体细胞供体细胞的脱甲基作用改善了克隆效率和体外胚胎干细胞生产，从而指出通过减少DNA甲基化使得能够恢复分化的细胞的分化和发育潜能[136]。

关于从DNA中去除甲基化的机制仍不了解：从DNA(或关于那种物质的组蛋白)中去除甲基化在机制上仍不了解。受精卵中父本基因组的DNA甲基化丧失可能是酶催化的主动脱甲基作用。卵母细胞也可以主动使转移的体细胞核脱甲基，从而暗示活性是存在的。已暗示几种候选生物化学途径将直接去除胞苷环C5位置中的甲基(直接脱甲基作用)或去除胞苷碱基(间接脱甲基作用)。迄今为止，去除甲基的直接方法仍未得到描述或仍未得到证实。

脱甲基作用的间接途径涉及DNA修复：例如，DNA糖基化酶例如胸苷DNA糖基化酶和甲基结合结构域蛋白质4正常修复T:G错配，所述T:G错配被认为由5meC的自发脱氨作用引起。最近已显示活化诱导的胞苷脱氨酶和Apobecl胞苷脱氨酶可以使5meC脱氨以产生T，且这些酶在卵母细胞和生殖细胞中表达。与碱基切除修复偶联的这种胞苷脱氨酶活性理论上可以导致脱甲基作用而无DNA复制，但仍将需要早期受精卵中的广泛碱基切除修复。

环境因素：越来越多的大量证据暗示可修饰的环境因素例如饮食可以影响DNA甲基化。例如，出生前喂养甲基补充饮食可以增加DNA甲基化水平和后代中基因的表型表达。小鼠中的皮毛颜色由野灰色(agouti)基因表达决定。这由毛囊中野灰色基因长末端重复序列的DNA甲基化状态决定。如果这个区域是超甲基化的，那么小鼠颜色是野灰色，而如果小鼠是甲基化不足的，那么小鼠是黄色的。当给妊娠雌性小鼠被喂养甲基补充饮食时，所述甲基补充饮食富含锌、甲硫氨酸、甜菜碱、胆碱、叶酸(folate)和维生素B₁₂，在野灰色长末端重复序列的甲基化状态中存在改变，并且没有一只幼崽具有黄色皮毛[58]。因此，在子宫内暴露于营养物可以导致后代中基因组的外遗传修饰。

叶酸在DNA甲基化中的作用：水溶性B维生素叶酸在DNA甲基化状态中起重要和调节作用。叶酸的唯一生物化学功能是介导一碳部分转移[59-61]，且因此在一碳代谢中具有中心作用。动物研究已进一步显示叶酸缺乏在大鼠肝脏中引起基因组和基因特异性甲基化不足，并且程度似乎取决于叶酸耗尽的严重性和持续时间[62，63]。DNA甲基化不足已也在靠低饮食叶酸生活的人淋巴细胞中得到鉴定，并且可以通过叶酸饱足得到逆转[64]。然而，关于DNA甲基化的叶酸缺乏作用也是非常复杂的。例如，具有或不具有DNMT1减少的叶酸缺乏不影响在正常或赘生性组织中的总体基因组DNA甲基化水平，或2种候选基因E-钙粘着蛋白和p53的甲基化水平。

一碳代谢

SAM∶SAH比和营养物作用在DNA甲基化调节中的重要性：营养物可用性可以在DNA甲基化调节中起重要作用。此外，牵涉于一碳代谢中的因素也可能在甲基化状态中起重要作用，因为它们影响甲基的供应，且因此影响甲基化过程的生物化学途径。由饮食供应的胆碱和甲硫氨酸形式的甲基，或来自叶酸依赖性一碳库的甲基必须活化为S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，以充当转甲基反应中的底物。因为S-腺苷高半胱氨酸(SAH)是转甲基反应的产物和SAM依赖性甲基转移酶的有效抑制剂，所以SAM∶SAH比是转甲基作用潜能的重要指标[65，66]。当比率高时，甲基化潜能高。当比率低时，甲基化潜能低。众所周知的是单独的叶酸耗尽是减少SAM库的充分干扰力量。这导致SAH的细胞水平增加，因为SAH-高半胱氨酸互变平衡实际上支持SAH合成。因此当高半胱氨酸代谢被抑制时，如在叶酸缺乏中，细胞SAH水平将增加。增加的SAH抑制甲基转移酶活性和后续DNA甲基化反应。

甘氨酸-N-甲基转移酶(GNMT)使转甲基反应最优化：胞质酶GNMT通过调节SAM∶SAH比发挥作用，以使转甲基反应最优化。当甲基丰富和SAM水平升高时，GNMT通过从甘氨酸形成肌氨酸来去除过量甲基。SAM还通过抑制5，10-亚甲四氢叶酸还原酶(MTHFR)减少来源于一碳库的甲基供应[67，68]，所述MTHFR是负责5-甲基四氢叶酸(5-甲基-THF)合成的酶。5-甲基-THF是供应出其甲基给高半胱氨酸以形成甲硫氨酸的叶酸辅酶。因为5-甲基-THF还与GNMT结合且抑制其活性[69，70]，所以由于经由SAM抑制MTHFR的5-甲基-THF水平降低导致GNMT活性增加。活化GNMT的因子导致甲基转移酶包括DNA甲基转移酶下调。

迄今为止，尚没有测试培养细胞中的GNMT活化导致DNA甲基化减少的假设的报道。然而，少数报道已描述了啮齿类动物中的GNMT饮食处理[71-73]。例如，补加了维生素A和维生素A衍生物例如全反式视黄酸(ATRA)的饮食，导致大鼠肝细胞中的GNMT活性增加和DNA甲基化不足，而饮食叶酸、胆碱、甜菜碱和维生素B_6&12减少也导致特定组织中的DNA甲基化减少。因此，甲硫氨酸循环组分的处理和调整甲基供体的营养物可用性代表使DNA脱甲基和恢复潜能的可能体外方法。迄今为止，仍未报道通过修饰牵涉于一碳代谢中的组分、改变营养物可用性、和/或改变GNMT来重编程序或改变重编程序效率的在先尝试。

用于诱导细胞重编程序的目前方法：用于诱导哺乳动物中的细胞重编程序的目前方法主要依赖于SCNT，包括核重编程序和程度较低地暴露于细胞提取物、细胞类型融合和核内蛋白去除。然而，这些方法没有一种克服了减少有效重编程序所需的DNA甲基化水平的主要限速步骤。

核重编程序无效：核重编程序依赖于染色质状态和特异性DNA脱甲基作用，这一般是无效或缓慢的。例如，SCNT克隆要求基因表达的有效重编程序，以沉默供体细胞基因表达且激活基因表达的胚胎模式。近期观察指出重编程序可以由SCNT后不久发生的早期事件起始，但随后在发育通过卵裂和可能地原肠胚形成进展时继续。因为重编程序是缓慢和渐进的，所以与受精的胚胎比较，NT单位具有显著改变的特征。

用于核移植的上述方法是工业一般已知的，且已应用于或正在应用于指导干细胞分化的应用。然而，几乎所有应用都取决于核移植技术。Geron(Menlo Park CA)已使用胚胎干细胞以生产神经细胞和心肌细胞，且已在处理干细胞以生产其他种类的组织中取得进展。Infigen，Inc.(DeForest，WI)也接受了主要涉及家畜克隆应用的几个核移植专利。

在改善核移植效率的其他尝试中，MIT，Whitehead Institute的Dr.Rudolph Jaenisch使用cDNA微阵列，以确立用于在核移植中特异性给核重编程序的分子标准。Dr.Jaenisch的主要焦点在于人疾病例如癌症，和给癌症重编程序，以及设计策略以改善外遗传重编程序。他的主要努力已集中于对确立DNA甲基化和给甲基化的基因组重编程序的机制的理解。Dr.Jaenisch尝试通过下述方法开发缺乏甲基化的核移植产生的单位：敲除供体细胞系中的DNMT1且使用该系以生产NT单位[136]。

Temple University的Dr.Keith Latham正在检查无效重编程序如何影响克隆的胚胎。Dr.Latham的研究主要集中于生理学数据-检查克隆后的表型变化[137，139]。

Harvard University的Dr.Kevin Eggan正在评估使用核移植作为模型如何能够恢复(重编程序)成体细胞的发育命运，且通过下述成为2005年的头条新闻，使人皮肤细胞与胚胎干细胞融合以产生外观和表现如同干细胞的杂种，可能为生成对于患者特制的遗传学匹配的干细胞建立基础[138]。

在研究中的用于生产干细胞或干细胞样细胞(stem-like cell)的其他方法中有Reproductive Genetics Institute的Uri Verlinsky的实践(InVitro Fertilization Clinic，Chicago，IL)。根据体细胞分子将指导干细胞分化成与体细胞相同类型的细胞的理论，Verlinsky采用了使用细胞融合方法用于使体细胞与干细胞融合的方法。据报道Verlinsky已使用他的新StemBrid(干/杂种(stem/hybrid))技术生产了10种胚胎干细胞系。没有使用胚胎。

发明概述

本发明的目的涉及通过减少细胞的总体DNA甲基化用于恢复细胞分化潜能的方法。

本发明的进一步目的涉及处理培养中的细胞和/或核移植(NT)单位和/或干细胞，以产生总体甲基化不足的基因组和恢复的细胞关于分化的潜能(例如，多潜能(pluripotential)、多能(multipotential)、和/或全能)，所述关于分化的潜能定义为细胞分化成新细胞类型的能力。

本发明涉及用于给真核细胞重编程序的方法，所述方法包括作为步骤(a)减少真核细胞中的S-腺苷甲硫氨酸与S-腺苷高半胱氨酸比(SAM与SAH比)。SAM与SAH比可以减少至0.1或更少，优选0.5或更少，且最优选1.00或更少。步骤(a)可以包括使细胞与选自SEQ.ID.NOS：1-41的siRNA接触。此外，步骤(a)可以包括增加真核细胞内的甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者。步骤(a)还可以包括使细胞与有效增加细胞内的甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者的量的视黄酸接触。此外，该方法包括作为步骤(b)减少真核细胞内DNA中的5-甲基胞嘧啶水平。同时执行步骤(a)和(b)在本发明的范围内。步骤(b)还包括特异性抑制真核细胞内的DNA甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者。步骤(b)还可以包括使细胞与DNA甲基转移酶抑制剂接触。此外，步骤(b)可以包括使细胞与抑制有效量的小干扰核糖核酸(siRNA)接触，所述siRNA的尺寸和构型设定为抑制DNA甲基转移酶的表达。

本发明还涉及用于给真核细胞重编程序的方法，所述方法包括作为步骤(a)特异性抑制真核细胞内的DNA甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者；和同时作为步骤(b)增加真核细胞内的甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者。步骤(a)可以包括使细胞与抑制有效量的siRNA接触，所述siRNA的尺寸和构型设定为抑制DNA甲基转移酶的表达。步骤(a)还可以包括使细胞与抑制有效量的siRNA接触，所述siRNA的尺寸和构型设定为抑制以使细胞中DNA的5-甲基化胞嘧啶减少至少约5％。步骤(b)可以包括使细胞与有效增加细胞内的甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者的量的视黄酸接触。步骤(b)还可以包括使细胞与全反式视黄酸接触。此外，步骤(b)可以包括使细胞与结合视黄酸受体的化合物接触。除了步骤(a)和(b)，该方法可以包括作为步骤(c)特异性抑制细胞内的酶的表达、活性、或表达和活性两者，所述酶选自5，10-亚甲四氢叶酸还原酶和胱硫醚(cystathione)β-合酶。使细胞与选自SEQ.ID.NOS：1-41的siRNA接触在本发明的范围内。

本发明进一步涉及改变真核细胞中的分化潜能的方法，所述方法包括使真核细胞在体外与一定量的siRNA接触，其中所述siRNA的尺寸和构型设定为特异性抑制DNA甲基转移酶的表达，前提是所述siRNA不抑制甘氨酸-N-甲基转移酶的表达，且其中所述量有效诱导全基因组的DNA脱甲基作用，其中细胞的分化潜能增加。真核细胞选自干细胞、祖细胞(progenitor cell)、体细胞、和实施体细胞核移植的细胞(NT细胞)。这种方法包括使细胞与siRNA接触，所述siRNA的尺寸和构型设定为特异性抑制DNA甲基转移酶的表达，所述DNA甲基转移酶选自DNA甲基转移酶1(Dnmt 1)、DNA甲基转移酶3a(Dnmt 3a)、和DNA甲基转移酶3b(Dnmt 3b)。该方法进一步包括使细胞与有效增加甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者的量的化合物例如视黄酸或全反式视黄酸接触。细胞还可以与组合物接触，所述组合物包括siRNA和全反式视黄酸的组合。

本发明进一步涉及增加分化的细胞中的分化潜能的方法，所述方法包括使分化的细胞在体外与组合物接触，所述组合物包括下述组合作为步骤(i)击倒有效量的小干扰核糖核酸(siRNA)，其中所述siRNA的尺寸和构型设定为特异性抑制DNA甲基转移酶的表达；(ii)击倒有效量的siRNA，其中所述siRNA的尺寸和构型设定为抑制酶的表达，所述酶选自5，10-亚甲四氢叶酸还原酶和胱硫醚β-合酶；和(iii)有效增加甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者的化合物，其中细胞与组合物接触有效诱导细胞内全基因组的DNA脱甲基作用的时间，由此细胞的分化潜能增加。该方法包括使细胞与包括siRNA的组合物接触，所述siRNA的尺寸和构型设定为特异性抑制DNA甲基转移酶的表达，所述DNA甲基转移酶选自DNA甲基转移酶1(Dnmt 1)、DNA甲基转移酶3a(Dnmt 3a)、和DNA甲基转移酶3b(Dnmt 3b)。有效增加甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者的化合物是视黄酸或全反式视黄酸。细胞与选自SEQ.ID.NOS：1-41的siRNA接触。

本发明进一步涉及用于测定细胞的发育潜能的方法，所述方法包括测定细胞中的SAM与SAH比，其中SAM与SAH比小于约1.0指示细胞的发育潜能增加。该方法包括测量细胞DNA中存在的胞嘧啶残基甲基化，其中甲基化小于约10％指示细胞的发育潜能增加。

本发明进一步包括用于控制细胞中的分化潜能的方法，所述方法包括作为步骤(a)使细胞中的SAM与SAH比维持小于约1.0；和(b)使细胞DNA中的胞嘧啶残基甲基化维持小于约40％。权利要求34的方法包括作为步骤(a)使细胞中的SAM与SAH比维持小于约0.5；和作为步骤(b)使细胞DNA中的胞嘧啶残基甲基化维持小于约20％。

本发明进一步涉及用于增加培养基内放置的分化的细胞中的分化潜能的细胞培养基，所述培养基包括足以维持细胞生存力的基础培养基，与减少细胞培养基中存在的甲基供体活性的因子组合。该因子选自高半胱氨酸和全反式视黄酸。可替代地，该因子是抑制有效量的siRNA，所述siRNA的尺寸和构型设定为抑制DNA甲基转移酶的表达。

本发明还涉及用于鉴定影响细胞分化的化合物的方法，所述方法包括作为步骤(a)，使细胞DNA中甲基化的胞嘧啶百分比减少至少约5％，其中细胞在减少前具有第一种表型；和作为步骤(b)，使细胞中的SAM与SAH比减少至小于约1.0；和，作为步骤(c)使细胞与怀疑影响细胞分化的化合物接触；和，作为步骤(d)比较细胞的第一种表型与步骤(c)后的细胞表型，其中步骤(c)后出现不同于第一种表型的表型指示化合物对细胞分化有影响。步骤(a)可以包括使细胞DNA中甲基化的胞嘧啶百分比减少至少约5％。步骤(a)还可以包括使细胞DNA中甲基化的胞嘧啶百分比减少至少约10％。该细胞可以包括监控转录变化的报道系统，所述报道系统测量酶活性的存在，所述酶活性选自萤光素酶活性、β-内酰胺酶活性、和β-半乳糖苷酶活性。

本发明涉及恢复细胞的分化潜能的方法，所述方法包括：

(a)通过减少体外的甲基供体来减少体细胞核、细胞、和/或细胞的特定部分中的DNA甲基化；

(b)增加GNMT基因表达和/或酶活性，其导致SAM∶SAH比减少和DNA甲基化水平减少；

(c)通过减少特定酶例如MTHFR和/或胱硫醚β-合酶(Cbs)的表达和/或活性来减少SAM∶SAH比；

(d)减少DNA甲基转移酶包括Dnmts 1、3a和/或3b的活性；

(e)增加体外的高半胱氨酸和/或SAH水平、胰高血糖素、或相关因子，以降低SAM∶SAH比(减少的SAM∶SAH将降低甲基化)；

(f)耗尽谷胱甘肽水平以降低SAM∶SAH比；

(g)开发掺入一种或多种上述因子的确定成分培养基以减少甲基化(缺乏甲基供体的培养基，具有添加的高半胱氨酸的培养基，等)；

(h)开发基于使用β-内酰胺酶报道基因和/或其他可行报道基因(萤光素酶、β葡糖苷酶等)的新测定，以鉴定诱导GNMT基因转录的因子，或鉴定刺激GNMT活性的其他因子或活性；和

(i)开发基于使用β-内酰胺酶报道基因和/或其他可行报道基因(萤光素酶、β葡糖苷酶等)的新测定，以鉴定减少DNA甲基转移酶基因转录的因子，或鉴定减少DNA甲基转移酶活性的其他因子或活性。

本发明包括但不限于：

(a)通过使基因组脱甲基使得能够体外生产具有恢复的分化潜能(全能、多潜能、多能)的重编程序细胞的新研究工具，包括特化培养基和细胞培养物；

(b)通过这些培养基和培养物生产的可以用于研究或治疗应用的新干细胞样细胞；

(c)使用β内酰胺酶报道基因、萤光素酶、β半乳糖苷酶、和/或其他相关报道基因，用于监控GNMT表达的新测定系统，以评估GNMT表达或其他活性对恢复细胞分化潜能的影响；

(d)使用β内酰胺酶报道基因、萤光素酶、β半乳糖苷酶、和/或其他相关报道基因，用于监控DNA甲基转移酶表达的新测定系统，以评估DNA甲基转移酶表达或其他活性对恢复细胞分化潜能的影响；

(e)改善体细胞核移植的效率；和

(f)改善来自SCNT重建的胚(或单位)的胚胎干细胞的衍生。

实施方案包括：

(a)用ATRA处理现有的商业或其他培养基，这增加GNMT转录和活性，降低SAM∶SAH比，且减少细胞的甲基化潜能并恢复分化和/或发育潜能；

(b)使用干扰RNA技术修饰现有的商业或其他培养基，以使得能够击倒DNA甲基转移酶1、3a和/或3b，从而导致DNA甲基化水平减少；

(c)使用干扰RNA技术、反义或其他击倒技术修饰现有的商业或其他培养基，以使得能够击倒MTHFR和/或Cbs，从而导致SAM∶SAH比和DNA甲基化减少；

(d)修饰现有的商业或其他培养基，以增加GNMT转录、蛋白质表达和活性，从而导致SAM∶SAH比和DNA甲基化减少；

(e)通过改变甲基供体和/或高半胱氨酸和/或SAH水平修饰现有的商业或其他培养基，以减少SAM∶SAH比。

不希望坚持对本发明基本原理的一种解释，认为由饮食、培养基、或叶酸依赖性一碳库提供的甲基是正常功能所必需的。甲基缺乏导致转甲基反应下调。由饮食(或培养基)供应的胆碱和甲硫氨酸形式的甲基，或由叶酸依赖性一碳库供应的甲基必须活化为SAM，以充当众多转甲基反应中的底物。因为SAH是转甲基反应的产物和大多数SAM依赖性甲基转移酶的有效抑制剂，所以SAM/SAH比是转甲基作用潜能的重要指标。因此，SAM的细胞内供应对于转甲基作用是关键的，但这种比率的调节也是重要的。

胞质酶GNMT通过调节SAM/SAH比发挥作用，以使转甲基反应最优化。当甲基丰富且SAM水平升高时，GNMT通过从甘氨酸形成基本上失活的代谢物肌氨酸来去除过量甲基。SAM还通过抑制MTHFR减少来源于一碳库的甲基供应，所述MTHFR是负责5-甲基-THF合成的酶，所述5-甲基-THF是贡献出其甲基给高半胱氨酸以形成甲硫氨酸的叶酸辅酶。因为5-甲基-THF还与GNMT结合且抑制其活性，所以由于经由SAM抑制MTHFR的5-甲基-THF水平减少导致GNMT活性增加。相反，在甲基和SAM减少的条件下，MTHFR的抑制被去除，从而导致5-甲基-THF浓度增加和后续的GNMT抑制。当甲基可用性受损时，这确保甲基对于重要的转甲基反应被保存。因此，不适当地活化GNMT的因子可能导致众多甲基转移酶下调，所述甲基转移酶在合适的甲基化状态维持中是重要的。

本发明由加速开发新型、更得力、有效的细胞重编程序方法的需要驱动。此类方法影响治疗上有价值的细胞包括干细胞的发现和开发，用于加速基于干细胞和其他细胞的疗法研究的新研究工具，有价值或濒危动物的繁殖，和高价值基因工程动物的生产。

本发明涉及解决使用目前方法用于使细胞去分化，且使它们再分化成新细胞的问题。具体而言，主要基于SCNT的目前方法是高度无效的，且产生不可靠的结果。新发明避免了核移植的使用，及其相关局限性。SCNT单位显示DNA甲基化调节中的缺陷，包括总体脱甲基作用中的缺乏，这促成无效的细胞重编程序。本发明克服了这个具体问题。

本发明还将通过改善重建后所需的去分化(总体脱甲基作用)过程，使得实现和改善SCNT用于生产濒危动物，增值性家畜和ES细胞衍生的效率。

本发明还将使得能够开发基于细胞的新疗法，所述新疗法克服免疫排斥以及与胚胎干细胞使用相关的材料来源有限的关键问题。通过使得能够使用患者自身的体细胞用于去分化且再分化成新细胞类型，本发明将从广泛多样的起始细胞类型提供免疫相容的细胞来源。

此外，干细胞研究领域目前受到不充足的细胞培养物和培养基的高度限制，所述细胞培养物和培养基用于使细胞维持在去分化状态，或用于指导细胞沿具体谱系分化。与新发明相关的途径、蛋白质和相关分子将使得能够开发克服这些局限性的新培养物和培养基。类似地，本发明将提供分化和再分化的新标记，和生产新分化的细胞系的能力，这通过提供和增强用于筛选再生医学药物候选物的新方法，将加速药物发现。

由于原材料来源有限和在GMP/GML指导下昂贵的分离和扩大方法，基于细胞的疗法领域目前高度受限。例如，在涉及胰岛细胞移植以在糖尿病患者中生产胰岛素的新细胞疗法应用的情况下，目前方法需要至少2个尸体供体提供仅仅用于1个患者的充足细胞。本发明涉及通过显著改善待使用的原材料和所需产物的量来克服这些缺点。此外，此类细胞携带在受体中诱导不利的免疫排斥的内在危险。本发明涉及通过提供使用患者自己的细胞作为原材料来源的机会克服这个问题。

本发明涉及可以通过调节DNA甲基化加速重编程序进展的方法。旨在改变DNA甲基转移酶的表达和/或活性的方法通过改变SAM∶SAH比，可以具有增加重编程序效率的显著作用。一种方法是通过使用化合物特异性改变关键酶的表达来改变甲基代谢调节，所述化合物例如视黄酸(RA)和类视黄醇。ATRA和其他类视黄醇化合物的施用诱导和活化GNMT，从而使SAM依赖性转甲基反应受损，包括DNA甲基化，从而导致基因组DNA甲基化不足。其他人已使用甲基化抑制剂例如5-氮杂胞苷和5-氮杂-2′-脱氧胞苷，以减少DNA甲基化水平且提供抗肿瘤作用[82]。

另一种方法是在培养物体细胞中超表达脱甲基酶。迄今为止，活性脱甲基酶仍未被确认。

本发明超过先前方法的关键优点包括：

本发明不涉及核移植的使用，因此避免了核重编程序和实际细胞发育中的高无效水平。

本发明不依赖于使用胚胎干细胞作为用于细胞分化的原材料。因此，它克服了原材料可用性中的关键限制屏障。

本发明可以用于改善胚胎和成体干细胞培养系统，以使自发性分化降到最低。

本发明不依赖于胚胎干细胞或其他外来材料用于开发新再生细胞疗法，且因此使患者的免疫排斥可能性降到最低。

本发明采用经由简单营养途径的天然代谢过程，因此减少了可能有助于失败的复杂因子数目，例如由化合物例如5′-氮杂胞苷和azacitadine(也称为Aza C，且在商标VIDAZA下由Pharmion of Boulder，CO制造)诱导的细胞毒性作用，或需要遗传改变例如使用转基因系统超表达活性脱甲基酶。

本发明可以用于改善SCNT。

本发明可以用于更有效地改善来自SCNT产生的胚胎(单位)的ES细胞衍生。

由于与附图结合进行的本发明优选实施方案的下列详细描述，本发明的目的和优点将更充分地呈现。

附图简述

图1的图描述了在单独的生长培养基(CON)、用DMSO处理的生长培养基(DMSO)、和用全反式视黄酸处理的生长培养基(ATRA)中生长至汇合后，牛中连续核移植供体体细胞的胞嘧啶甲基化的相对水平。参见实施例1。

图2的图举例说明了在单独的生长培养基(CON)、用DMSO处理的生长培养基(DMSO)、和用全反式视黄酸处理的生长培养基(ATRA)中生长至汇合后，牛中连续核移植供体体细胞的GNMT基因表达水平(如通过实时PCR测量的)。参见实施例1。

图3A和3B的照片举例说明了如实施例2中所述处理的牛细胞。图3A显示了用ATRA处理后的细胞。图3B显示了在ATRA处理后，用油红-O(用于脂质的常见染料)阳性染色后的细胞。参见实施例2。

图4A和4B的照片显示了如实施例4中所述，用ATRA随后为成骨诱导培养基处理的鼠3T3 L1细胞。图4A描述了用碱性磷酸酶染色测试为成骨细胞样细胞阳性的细胞。图4B描述了用茜素染色显示磷酸钙矿化的细胞。

图5的凝胶照片举例说明了在用ATRA随后为成骨诱导培养基处理的鼠3T3 L1细胞中，关于骨钙蛋白和cbfa1-成骨细胞特异性标记的基因表达(通过RT-PCR)。参见实施例4。

图6A和6B的凝胶照片举例说明了如实施例5中所述，通过siRNA击倒Dnmt1基因。图6A描述了使用Dnmt1 siRNA特异性击倒Dnmt1。图6B描述了使用核纤层蛋白siRNA特异性击倒核纤层蛋白。

图6C的凝胶照片显示如图6A中所示的Dnmt1击倒持续经过至少二细胞期。参见实施例5。

图7A和7B的图举例说明了如实施例5.1中所述，DNA甲基转移酶3b siRNA转染对鼠NIH3T3体细胞甲基化的作用。图7A描述的实时PCR结果显示与对照相比较，Dnmt3b mRNA水平减少79％。图7B描述的HPLC结果显示细胞中的甲基化的胞嘧啶相对减少52％。

缩写和定义

除非本文另有描述，下述定义和缩写将在本公开内容中自始至终应用：

ATRA意指全反式视黄酸。

Cbs意指胱硫醚β-合酶。

细胞重编程序意指终末分化的细胞通过其可以恢复至某一状态的过程，在所述状态中它具有分化成新细胞类型的潜力。

培养基或生长培养基意指能够支持细胞生长的合适培养基。

脱甲基培养基或脱甲基生长培养基意指能够以诱导DNA脱甲基作用的方式支持细胞生长的合适培养基。

分化意指在胚胎发育期间细胞通过其变成结构上和功能上特化的过程。

DMSO意指二甲基亚砜。

DNA意指脱氧核糖核酸。

DNA甲基化意指真核DNA中的甲基(-CH3基团)附着至胞嘧啶(DNA中发现的4种含氮碱基之一)。这通常作为保护自身DNA不受酶和化学药品作用的方式进行，所述酶和化学药品为了破坏外来DNA而产生，和作为调节DNA中的基因转录的作用的方式进行。

DNMT意指DNA甲基转移酶。

外因遗传学指就功能中的可遗传变化而无核苷酸序列中的变化而言的DNA状态。外遗传变化可以由DNA修饰例如由甲基化和脱甲基作用引起，而无DNA核苷酸序列中的任何变化。

FRET意指荧光共振能量转移。

GAPDH意指甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

GNMT意指甘氨酸-N-甲基转移酶。

H3K4me意指Lys4上的组蛋白H3甲基化。

H3K9me2/3意指组蛋白H3上的特定赖氨酸残基例如赖氨酸9的二/三甲基化。

组蛋白意指在染色体中发现的负责使DNA足够压紧的一类蛋白质分子，从而使得它适应于核内。原核生物没有组蛋白。然而，热原体属(Thermoplasma)(无细胞壁的古菌(Archaea)域成员)的DNA由非常类似真核生物组蛋白的高度碱性的DNA结合蛋白包围。

IBMX意指异丁基甲基黄嘌呤。

ICM意指内细胞团。

“击倒”意指以基因特异性方式抑制基因表达。具有一个或多个基因“击倒”的细胞称为击倒生物或简单地“击倒”。

MDS意指骨髓异常增生综合征。

MTHFR意指5，10-亚甲四氢叶酸还原酶。

卵母细胞意指发育中的雌性生殖细胞，它通过减数分裂分成4个单倍体细胞，从而形成可以由精细胞受精的1个卵。

多潜能性意指能够分化成3个胚层的细胞类型或初生组织类型。

RA意指视黄酸。

重编程序意指消除核中的外遗传标记，随后确立不同的外遗传标记组。在多细胞生物发育期间，不同细胞和组织获得不同基因表达程序。这些不同基因表达模式看起来基本上由外遗传修饰调节，所述外遗传修饰例如DNA甲基化、组蛋白修饰和其他染色质结合蛋白[22，23]。因此多细胞生物内的每种细胞类型都具有独特的外遗传标记，一旦细胞分化或退出细胞周期，所述标记就常规地被认为变成“固定的”和不可变的。然而，一些细胞在正常发育期间或一些疾病情况下经历主要外遗传“重编程序”。

RNA意指核糖核酸。

RT-PCR意指逆转录聚合酶链反应。

SAH意指S-腺苷高半胱氨酸。

SAM意指S-腺苷甲硫氨酸。

SCNT意指体细胞核移植。

siRNA意指小干扰RNA，也称为短干扰RNA或沉默RNA。

体细胞意指已分化成身体的组织、器官等的任何生物的细胞(与生殖细胞相对比-各种细胞中的任何一种，特别是卵或精细胞，由其可以发育新生物)。

TE意指滋养外胚层。

全能的意指能够发育成完全胚胎或器官。

TZD意指噻唑烷二酮。

发明详述

本发明涉及以恢复分化潜能且可以用作治疗细胞的自体来源的方式诱导患者的成体干细胞或完全分化的体细胞的脱甲基作用；或使用脱甲基的细胞以改善SCNT效率，或更有效地产生将用于治疗目的的患者特异性ES细胞。

本发明具体涉及特化细胞系和特化细胞培养物。用于实现两者的方法对于本发明是关键的。在其基本意义上，该方法涉及产生重编程序的细胞系的脱甲基步骤。使得能够脱甲基的因子被包括在细胞培养基中，所述细胞培养基用于生产可以分化成新细胞类型的细胞。

本发明涉及其中可以添加ATRA和/或siRNA，或充分调整组分的细胞培养基，以通过用特定分化因子诱导和/或使用脱甲基的细胞用于SCNT，所述特定分化因子例如但不限于细胞因子、生长因子、转录因子，来使DNA甲基化水平减少至这样的程度，从而恢复分化和/或发育潜能。

本发明涉及重编程序的细胞的体外生产，所述重编程序的细胞具有通过使基因组脱甲基恢复的分化潜能(全能、多潜能、多能)。该实施方案包括：

(a)用ATRA、siRNA、和/或类似或相关分子处理；

(b)使用干扰RNA技术、反义、或用于抑制的其他机制击倒DNA甲基转移酶1、3a和/或3b；

(c)使用干扰RNA技术击倒MTHFR和/或Cbs；

(d)增加GNMT的转录、蛋白质表达和活性；

(e)增加体外的高半胱氨酸水平；

(f)增加SAH水平；

(g)减少SAM水平；

(h)减少甲基供体水平，所述甲基供体例如但不限于，叶酸、甲硫氨酸、胆碱、甜菜碱、维生素B6和B12；

(i)使用该细胞以改善SCNT；和

(j)使用该细胞以更有效地从SCNT重建的单位(胚胎)衍生ES细胞。

细胞：为了本发明的目的，除非具体地相反限定，术语一种或多种“细胞”包括任何体细胞、胚胎干(ES)细胞、成体干细胞、核移植(NT)单位、和干细胞样细胞。用于移植的有希望的器官和组织来源在于干细胞技术的发展。理论上，干细胞可以经历自我更新的细胞分裂，以无限期产生表型和基因型相同的子细胞，且最后可以分化成至少一种最终细胞类型。通过从患者自己的细胞产生组织或器官，可以产生移植组织以提供与异种移植相关的优点，而无感染或组织排斥的相关危险。

干细胞还提供了用于改善基因疗法结果的希望。患者自己的干细胞可以在体外进行基因改造，随后再引入体内以生产所需基因产物。这些基因改造的干细胞将具有被诱导分化的潜能，以形成多数细胞类型用于在身体的具体部位处植入，或用于全身应用。可替代地，异源干细胞可以进行基因改造以表达受体的主要组织相容性复合物(MHC)抗原，或无MHC，以允许将那些细胞从供体移植到受体，而无相关的排斥危险。

干细胞被定义为具有分化成几个细胞谱系的广泛和无限增殖潜能，且在移植后可以使组织重新居群(repopulate)的细胞。典型干细胞是胚胎干(ES)细胞，因为它具有无限的自我更新和多潜能分化潜能。这些细胞来源于胚泡的内细胞团，或可以来源于来自植入后胚胎的原生殖细胞(胚胎生殖干细胞或EG细胞)。ES和EG细胞已从小鼠获得，且最近还从非人灵长类动物和人获得。当引入小鼠胚泡或其他动物胚泡内时，ES细胞可以有助于所有小鼠(动物)组织。当在出生后动物中移植时，ES和EG细胞产生畸胎瘤，这再次证实其多潜能性。ES和EG细胞可以通过用抗体SSEA1和SSEA4的阳性染色来鉴定。

在分子水平上，ES和EG细胞表达对这些未分化的细胞高度特异的许多转录因子。这些包括Oct-4和Rex-1。还发现的是LIF-R以及转录因子Sox-2和Rox-1，尽管后2者也在非ES细胞中表达。Oct-4是在原肠形成前期胚胎、早期卵裂期胚胎、胚泡的内细胞团细胞、和胚胎癌(EC)细胞中表达的转录因子。当细胞在体外被诱导分化时，Oct-4是下调的，并且在成体动物中，Oct-4只在生殖细胞中发现。几项研究已显示Oct-4是维持ES细胞的未分化的表型所需的，且在确定胚胎发生和分化的早期步骤中起主要作用。Oct-4与Rox-1组合引起锌指蛋白Rex-1的转录激活，且也是使ES维持在未分化状态所需的。同样地，Sox-2连同Oct-4一起是保留ES/EC细胞的未分化状态和维持鼠(但不是人)ES细胞所需的。人或鼠原生殖细胞需要LIF的存在。ES细胞的另一个标记是端粒酶的存在，所述端粒酶给这些细胞提供了在体外无限自我更新的潜能。

干细胞已在几种器官组织中得到鉴定。最佳表征的是造血干细胞。这是已基于细胞表面标记和功能特征纯化的中胚层衍生细胞。从骨髓、血液、脐带血、胎儿肝和卵黄囊中分离的造血干细胞，是为了受体生命再起始造血且产生多个造血谱系的祖细胞[93-100]。当移植到受致死性照射的动物或人中时，造血干细胞可以使红细胞类、嗜中性粒细胞-巨噬细胞、巨核细胞和淋巴造血细胞库居群(populate)。在体外，造血干细胞可以被诱导以经历至少一些自我更新的细胞分裂，且可以被诱导以分化成与体内可见相同的谱系。因此，这种细胞满足干细胞的标准。然而，只分化以形成造血谱系细胞的干细胞不能提供用于修复其他损伤组织的细胞来源，例如由高剂量化学治疗剂损伤的心脏或肺组织。

已进行广泛研究的第二种干细胞是神经干细胞[101-103]。神经干细胞最初在胎儿脑的室下带和嗅球中被鉴定。在最近以前，认为成体脑不再包含具有干细胞潜能的细胞。然而，在啮齿类动物中以及最近同样在非人灵长类动物和人中的几项研究已显示干细胞继续存在于成体脑中。这些干细胞可以在体内增殖且在体内不断再生至少一些神经元细胞。当先体外后体内培养时，神经干细胞可以被诱导以增殖，以及分化成不同类型的神经元和神经胶质细胞。当移植到脑内时，神经干细胞可以移入且产生神经细胞和神经胶质细胞。因此，这种细胞也满足干细胞的定义。

已被命名为干细胞的第三种组织特异性细胞是最初由Fridenshtein描述的间充质干细胞(MSC)[104]。最初来源于胚胎中胚层且从成体骨髓中分离的间充质干细胞，可以分化以形成肌肉、骨、软骨、脂肪、髓基质、和腱。在胚胎发生期间，中胚层发育成肢芽中胚层，产生骨、软骨、脂肪、骨骼肌和可能地内皮的组织。中胚层还分化成体壁中胚层，这可以产生心肌、平滑肌、或由内皮和造血祖细胞组成的血岛。因此原始中胚层或间充质干细胞可以提供许多细胞和组织类型的来源。许多间充质干细胞已被分离[105-117]。在已得到描述的许多间充质干细胞中，全都显示有限的分化，以只形成一般被视为间充质来源的那些分化的细胞。迄今为止报道的大多数多能的间充质干细胞是由Pittenger等人分离的细胞[118]，它表达SH2.sup.+SH4.sup.+CD29.sup.+CD44.sup.+CD71.sup.+CD90.sup.+CD106.sup.+CD120a.sup.+CD124.sup.+CD14.sup.-CD34.sup.-CD45.sup.-表型。这种细胞能够分化以形成许多间充质来源的细胞类型，但在分化潜能方面显然限制于间充质谱系的细胞，因为分离它的团队指出，造血细胞从未在扩大培养中被鉴定。

其他干细胞已被鉴定，包括胃肠干细胞、表皮干细胞、和肝干细胞，也称为卵圆细胞[119-121]。这些中的大多数较少充分表征。

与ES细胞相比较，组织特异性干细胞具有较少的自我更新能力，且尽管它们分化成多个谱系，但它们不是多潜能的。没有研究已致力于组织特异性细胞是否表达上述ES细胞标记。此外，组织特异性干细胞中的端粒酶活性程度仍未被充分研究，部分是因为难以获得这些细胞的大量高度富集的群体。

在最近以前，认为器官特异性干细胞只能分化成相同组织的细胞。许多近期出版物已暗示成体器官特异性干细胞也许能够分化成不同组织的细胞。许多研究已显示在骨髓移植时移植的细胞可以分化成骨骼肌[122-123]。这可以考虑在髓中存在的间充质细胞的可能分化潜能范畴内。Jackson公开了肌卫星细胞可以分化成造血细胞，再一次在体壁中胚层内的表型转换[124]。其他研究已显示来自1个胚层(例如体壁中胚层)的干细胞可以分化成被认为在胚胎发生期间来源于不同胚层的组织。例如，在经历髓移植的人或动物中检测到的内皮细胞或其前体至少部分来源于髓供体[125-126]。因此，脏壁中胚层而不是体壁中胚层例如MSC衍生的后代随着输注的髓一起转移。甚至更令人惊讶的是报道显示在啮齿类动物和人中，肝上皮细胞和胆管上皮细胞来源于供体髓[127-129]。同样地，3个团体已显示神经干细胞可以分化成造血细胞。最后，Clarke等人报道将神经干细胞注射入胚泡内可以有助于嵌合小鼠的所有组织[130]。

由异源胚胎干细胞产生的组织和器官移植要求，细胞被进一步进行基因修饰以抑制某些细胞表面标记表达，或继续使用化学疗法免疫抑制剂以保护不受移植排斥。因此，尽管胚胎干细胞研究提供了关于移植器官供应有限问题的有希望的可替代解决方法，但与需要免疫抑制以维持异源细胞或组织移植相关的问题和危险仍然存在。估计将需要确立20种免疫学不同的胚胎干细胞系，以提供免疫相容性细胞用于针对大多数群体的疗法[132]。

使用来自发育的个体而不是胚胎的细胞作为自体同源或同种异体干细胞的来源，将克服与移植的胚胎干细胞使用相关的组织不相容性问题，以及解决与胚胎干细胞研究相关的伦理困境。迄今与用于组织移植的自体干细胞使用相关的最大缺点在于其有限的分化潜能。许多干细胞已从发育完全的生物特别是人中分离，而这些细胞尽管被报道是多能的，但已显示分化成多种细胞类型的潜能有限。

尽管具有多分化潜能的干细胞先前已由其他人分离，但具有分化成广泛多样的不同谱系细胞类型的潜能的脱甲基细胞仍未得到描述，所述细胞类型包括成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌、内皮、基质、平滑肌、心肌、神经(nueral)细胞和造血细胞。如果细胞和组织移植以及基因疗法将提供预期治疗进展，那么需要具有恢复或扩大的分化和/或发育潜能的脱甲基细胞，作为用于患者特异性治疗细胞的来源，或作为用于SCNT的更有效供体细胞，或作为用于筛选分化因子或化合物的目标，所述分化因子或化合物可以用于帮助诱导沿特定谱系分化。

细胞培养基：本发明利用细胞培养基、生长因子、和方法用于诱导细胞的DNA脱甲基作用，以及使脱甲基的细胞培养物生长和维持。培养基为细胞的生长和维持作准备，且可以用于筛选另外的因子和有用的因子组合。使用本文提供的细胞培养基、生长因子、和方法使细胞以基本上未分化的状态生长的能力提供了重要利益，包括生产具有多重遗传修饰(如在基因疗法应用中)的具有重要治疗应用的细胞系的能力。

细胞培养基可以包括有效支持脱甲基的细胞生长的生长培养基；有效支持脱甲基的细胞生长的营养血清；非必需和必需氨基酸，以及丙酮酸盐。任选地，细胞培养基还可以包括还原剂。

在本发明实践中有用的合适培养基的另一个非限制性例子包括以Dulbecco氏极限必需培养基(DMEM)为基础制备的多种生长培养基。DMEM可以补加多种补料，包括胎小牛血清、谷氨酰胺和/或丙酮酸钠。优选地DMEM包括15％胎小牛血清、2mM谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠。

合适培养基的另一个例子是无葡萄糖和磷酸盐的改良人输卵管液(tubal fluid)培养基(HTF)，所述HTF补加了15％胎小牛血清、0.2mM谷氨酰胺、0.5mM牛磺酸、和各0.01mM的下述氨基酸：天冬酰胺、甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸。

生长因子：生长培养基可以包括任何血清或基于血清的溶液，所述溶液补充有效维持脱甲基的细胞生长和生存力的营养物。此类血清的例子包括但不限于，胎牛血清(FBS)和胎小牛血清(FCS)。例如，FBS可以以约1％-约25％的浓度提供。具体地，FBS可以以约2.5％-约20％的浓度提供。在一个实施方案中，脱甲基的细胞在10％的FBS中生长。

也可以提供生长因子，以帮助脱甲基的细胞培养物衍生和维持在基本上未分化的状态。此类生长因子的特性和有效浓度可以使用如本文所述的方法，或使用细胞培养领域技术人员已知技术来确定。例如，一种或多种下述因子可以以规定的终浓度使用：毛喉素(forskolin)([3R-(3α，4αβ，5B，6B，6aα.，10α.，10aβ，10α)]-5-(乙酰基氧基)-3-乙烯基十二氢-6，10，10b-三羟基-3，4a，7，7，10a-五甲基-1H-萘[2，1-b]吡喃-1-酮)10μM，霍乱毒素10μM，异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)0.1mM，二丁酰基环腺苷酸(dbcAMP)1mM。在另一个实施方案中，生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，更具体而言，是约1-10ng/ml的人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

另一种因子是从人胚胎癌(EC)细胞培养物收获的生长培养基。在一个具体例子中，人NTERA-2 EC细胞(ATCC登记号CRL 1973)在补加了10％胎小牛血清的DMEM中生长至汇合，或小鼠ES细胞在补加了15％胎小牛血清、2mM谷氨酰胺、1000U/ml LIF的DMEM中生长至汇合。生长培养基在几天内每天进行收获，通过0.22微米过滤器且于-80℃冷冻。将这种人EC或小鼠ES“条件”培养基以实验上测定的量加入脱甲基的生长培养基中，所述量如通过对脱甲基的细胞生长和生存力的作用判断的。

在另一个实施方案中，生长培养基包括关于受体的配体，所述配体通过结合与gp130缔合的受体，或通过直接与gp130结合并激活gp130来激活信号转导gp130。例如，可以使用约1000U/ml-2000U/ml的人重组白血病抑制因子(LIF)或10U/ml的制瘤素-M。

组织培养抗生素：一般地，胚胎生殖(EG)培养基也包含常用的组织培养抗生素，例如青霉素和链霉素。随后可以向这些基础溶液中的任何一种中每日添加有效量的因子，以制备本发明的人EG生长培养基。术语“有效量”意指使用对细胞培养领域技术人员常见的判断且通过本文提供的教导，这样的所述因子的量，以便允许对人EG细胞的人EG生长和生存力的有利作用。

一般地，脱甲基培养基还包含常用的组织培养抗生素，例如青霉素和链霉素。随后可以向这些基础溶液中的任何一种中每日添加有效量的这些因子，以制备本发明的脱甲基生长培养基。如本文使用的，术语“有效量”是使用对细胞培养领域技术人员常见的判断且通过本文提供的教导，这样的所述因子的量，以便允许对细胞的脱甲基和生存力的有利作用。

范围：表1提供了关于在本发明的细胞培养基中有用的成分的范围。

表1

培养基最优选的优选的可接受的

工作pH范围 7.0-7.4 7.0-7.4 7.0-7.4

组分 mg/L mg/L mg/L

CaCl(无水) 200.00 50-350 1-500

Fe(NO₃)3-9H₂O 0.1 0 0.01-0.2 0.001-1.0

KCl 400.00 100-600 1-1000

MgSO₄(无水) 97.67 10-250 1-500

NaCl 6400.00 5000-8000 1000-10000

NaHCO₃ 3700.00 2000-6000 500-10000

NaH₂PO₄-H₂O 125.00 50-250 1-500

D-葡萄糖 1000.00 1000-5000 1-10000

酚红 15.00 15.00 15.00

丙酮酸钠 110.00 10-200--- 1-1000

L-精氨酸-HCl 84.00 50-150 10-500

L-谷氨酰胺 584.00 300-600 100-900

甘氨酸 30.00 10-60 1-100

L-组氨酸(Histadine) 42.00 10-100 1-1000

-HCl-H₂O

L-异亮氨酸 105.00 10-250 1-500

L-亮氨酸 105.00 10-250 1-500

L-赖氨酸-HCl 146.00 10-250 1-500

L-甲硫氨酸 30.00 10-100 1-500

L-苯丙氨酸 66.00 10-100 1-500

L-丝氨酸 42.00 10-100 1-500

L-苏氨酸 95.00 50-250 1-500

L-色氨酸 16.00 5-50 1-100

L-酪氨酸-2Na-2H₂O 104.00 10-500 1-900

L-缬氨酸 94.00 50-150 10-500

D-泛酸钙 4.00 1-10 0.1-50

氯化氯(Chlorine 4.00 1-10 0.1-50

Chloride)

叶酸 4.00 1-10 0.1-50

i-肌醇 7.20 1-10 0.1-50

烟酰胺 4.00 1-10 0.1-50

吡哆醛-HCl 4.00 1-10 0.1-50

核黄素 0.40 1-10 0.1-50

盐酸硫胺素 4.00 1-10 0.1-50

可以在本发明中使用的细胞培养基的例子是如下表2中所述的α-MEM(Chemicon International，Temecula CA)：

表2

关于培养的一般技术

分子遗传学和基因工程中的一般方法在Sambrook等人[84]，Miller和Calos eds.[85]，以及F.M.Ausubel等人eds.[86]的当前版本中描述。细胞生物学、蛋白质化学和抗体技术可以在J.E.Colligan等人eds.[87]，J.S.Bonifacino等人[88]，和J.E.Colligan等人eds.[89]中找到。关于在本公开内容中提及的基因操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业厂家获得，所述商业厂家例如BioRad(Hercules，CA)、Stratagene(La Jolla，CA)、Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA)、ClonTech(Mountain View，CA)、和Sigma-Aldrich Co(St.Louis，MO)。

细胞培养方法一般在Freshney ed，[90]，M.A.Harrison和I.F.Rae[91]，以及K.Turksen ed.[92]中描述。细胞培养供应品和试剂可从商业厂家获得，所述商业厂家例如Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)、Nalgene-Nunc International(Rochester，NY)、Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)、Hyclone(Logan，UT)、Chemicon International(Temecula，CA)和ICN Biomedicals(Costa Mesa，CA)。

脱甲基的细胞可以在加上饲养细胞的板上生长。可替代地，饲养细胞可以首先生长至汇合，随后进行有丝分裂灭活(例如，通过照射)以阻止进一步生长。可替代地，脱甲基的细胞可以没有饲养层细胞而生长。此类方法具有使细胞培养处理简化的优点，因为只需监控1组细胞，脱甲基的细胞的生长。

培养确立的脱甲基的细胞：一旦确立，脱甲基的细胞就可以使用多种技术在上述条件培养基中进行培养。在一个例子中，容器使饲养细胞维持在非条件培养基中。使用标准方法制备裂解的饲养细胞的基质。随后将待培养的脱甲基的细胞添加到基质连同条件培养基顶上。可替代地，脱甲基的细胞可以使用本领域已知的方法在活饲养细胞上生长。随后监控脱甲基的细胞的生长，以测定培养的细胞已变得分化的程度。关于碱性磷酸酶的标记可以用于确定哪些细胞已分化。当足够数目的细胞已分化时，或当培养物已生长至汇合时，至少部分未分化的细胞可以进行传代。细胞传代的测定和用于实现此类传代的技术可以使用本领域众所周知的标准技术来进行。

培养体细胞的去分化：细胞在定制的生长培养基中生长，所述生长培养基缺乏一种或多种甲基供体或辅酶(叶酸、甜菜碱、胆碱、维生素B6、维生素B12和甲硫氨酸)，或包含增加量的高半胱氨酸或SAH。配方基于Chemicon International Specialty Media(Phillipsburg，NJ)或美国典型培养物保藏中心(ATCC)推荐的培养基。

配方缺乏或补加如下显示于表3中：

表3

培养基最优选的优选的可接受的

[M]

叶酸 0 0-2.26×10^-5 0-4.53×10^-4

甜菜碱 0 0-8.53×10^-5 0-1.71×10^-3

胆碱 0 0-3.38×10^-5 0-6.76×10^-4

维生素B₆ 0 0-8.10×10^-9 0-1.62×10^-7

维生素B₁₂ 0 0-1.23×10^-9 2.46×10^-8

甲硫氨酸 0 0-3.35×10^-4 6.67×10^-3

高半胱氨酸 0.0005 0.0001-0.001 0.00001-0.002

SAH 0.0005 0.0001-0.001 0.00001-0.002

例如，培养基可以补加10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素和0.1％两性霉素。将透析的胎牛血清(Invitrogen)添加到叶酸缺乏培养基中，以消除血清中的叶酸。细胞维持于37℃、95％湿度和5％CO₂中。培养基每3-4天进行更换，且细胞在～90％汇合时进行传代，重复最高达6周。终点包括胞嘧啶甲基化水平减少，SAM∶SAH比减少，以及GNMT表达、活性和蛋白质丰度增加。

为了抑制Dnmt活性和胞嘧啶甲基化，细胞在下述培养基中生长：

(a)用Dnmt1、2、3a和/或3b siRNA(Dharmacon，Inc.)外理的培养基；

(b)用RG108(Analytical Systems Laboratory，LSU School ofVeterinary Medicine)处理的培养基；

(c)用5-AzadCyd(Sigma)处理的培养基。

根据制造商的规程的siRNA转染简述在下文提供。

为了刺激GNMT合成和活性，细胞在用ATRA(Sigma)处理的培养基中生长。为了保护ATRA不暴露于光，操作在柔和照明下进行且处理瓶用箔包裹。

为了抑制组蛋白脱乙酰作用且诱导脱甲基作用，细胞在用TSA和/或VPA(Sigma)处理的培养基中生长。处理浓度如下在表4中列出，但不限于表4中举例说明的情形：

表4

培养基最优选的优选的可接受的

[μM]

Dnmt siRNA^a 0.05 0.01-0.1 0.001-0.2

RG108^b 20 10-100 1-200

AzadCyd^c 0.25 0.1-0.5 0.01-1.0

ATRA^d 0.05 0.01-0.1 0.01-200

TSA^e 0.30 0.1-3.0 0.01-300

VPA^f 20×10³ 1-40×10³ 0.1-200×10³

^a对于75％基因击倒的制造商建议[100nM]；使用[40nM]Dnmt1和/或3b siRNA的20-40％CpG岛脱甲基作用[133]；在NuPotential的初步研究中使用[200nM]Dnmt3b siRNA的79％基因击倒和～50％总体基因组脱甲基作用。

^b使用[100μM]RG108的20％脱甲基作用[134]。

^c使用[0.5μM]AzadCyd的40％脱甲基作用[134]。

^d在我们的初步研究中使用[100nM]ATRA的～25％脱甲基作用。

^e使用[0.2μM]TSA的5％脱甲基作用[135]。

^f使用[20mM]VPA的4.8％脱甲基作用[135]。

细胞维持于37℃、95％湿度和5％CO₂中。培养基每3-4天更换为新鲜处理，且细胞在～90％汇合时进行传代，重复最高达6周；关于例外参见下文的Dnmt siRNA转染方法。细胞生存力/细胞毒性和生长速率通过相对细胞计数来确定。终点包括胞嘧啶甲基化水平减少，SAM∶SAH比减少，GNMT表达、活性和蛋白质丰度增加，以及Dnmt表达减少。

Dnmt siRNA转染：在约70-80％汇合时，细胞在生长培养基中进行转染，所述生长培养基包含DharmaFECT(Dharmacon，Inc.)转染试剂，Dnmt1、2、3a和/或3b siRNA(Dharmacon，Inc.)，亲环蛋白(cyclophillin)b siRNA(阳性对照siRNA)，或果蝇非靶向siRNA(阴性对照siRNA)；Dnmt2尚未被测定为功能性的且可以充当另外的对照。转染根据制造商的规程来进行。细胞在转染培养基中温育48小时。根据制造商的建议，如果在24小时后观察到细胞毒性，那么将转染培养基替换为生长培养基，且温育继续另外24小时；在48小时温育后显示80％生存力的孔用于分化。

可替代的实施方案

本发明还涉及基于使用报道基因的新测定的开发，所述报道基因例如βgalactamase、萤光素酶、β葡糖苷酶等，所述报道基因提供了监控GNMT表达和/或活性对脱甲基作用和细胞分化潜能恢复的影响的能力。

本发明进一步涉及使用去分化的供体细胞的SCNT新方法的开发。

本发明还涉及从SCNT重建的单位(胚胎)衍生胚胎干细胞的新方法的开发。

实施例

下述实施例被包括只用于帮助更完全地理解本发明。实施例不以任何方式限制本文所述的本发明范围。

实施例1-RA对牛体细胞甲基化的作用：

牛连续核移植供体体细胞(从未生产成功的活动物，且特征在于低胚泡发育速率(＜10％，P＜0.001)和低妊娠起始速率(＜1％，P＜0.05)的细胞系)在T-75瓶中进行培养，直至在生长培养基(CON)，或用DMSO或ATRA(DMSO媒介物)处理的生长培养基中汇合；使用10nM、50nM和100nM ATRA浓度。ATRA处理后，收集细胞且从细胞中分离DNA。随后将DNA完全消化成单核苷酸用于反相HPLC。反相HPLC如Cezar等人[76]所述的进行，以测量甲基化的胞嘧啶残基的相对水平。

如图1中举例说明的，HPLC揭示与CON相比较，在100nM ATRA处理的培养基中培养的那些细胞中，相对甲基化的胞嘧啶减少25％。与CON相比较，用DMSO或10-50nM ATRA处理的那些显示甲基化的胞嘧啶减少8-10％。这些结果指出ATRA在体外可以减少甲基化状态，甚至在对重编程序有抵抗力的细胞中，例如通过连续核移植获得的那些。

如图2中举例说明的，实时RT-PCR分析显示编码甘氨酸-N-甲基转移酶(GNMT)的基因上调，所述GNMT是调节SAM∶SAH比和细胞甲基化潜能的关键酶。(结果描述为GNMT与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPD)比。GAPD表达水平用于使GNMT表达对已知标记标准化。)注意到如图2中所示的GNMT上调与图1中所示的DNA甲基化减少同时发生，此外，RT-PCR证实Oct4以及Sox2和nanog的上调和强烈表达(数据未显示)，所述Oct4是最有诊断价值的哺乳动物干细胞/多潜能性标记。RT-PCR实验使用商购可得的试剂盒且根据制造商的说明书(TAQMAN牌RT-PCR测定，Applied Biosystems，Foster City，CA)来进行。其他人已证实Oct4脱甲基作用是小鼠体细胞核有效重编程序的必要条件[20]。

这些数据指出暴露于ATRA增加GNMT表达和可能地GNMT酶活性，从而导致总体脱甲基作用(包括Oct4启动子脱甲基作用和后续表达)。DNA甲基化减少与去分化一致，而Oct4表达增加与分化潜能恢复一致。据我们所知，这是通过改变一碳代谢在哺乳动物体细胞中诱导干细胞标记的第一次证实。结果是有意义的，因为它们显示哺乳动物细胞可以被诱导，以表达通常只在未分化的干细胞中发现的标记，因此指出细胞可以进行重编程序以分化成不同细胞类型。

实施例2-RA和脂肪形成诱导混合物(Cocktail)对牛体细胞的作用：

为了确定分化潜能是否被恢复，牛体细胞在T-75瓶中进行培养，直至在CON、DMSO或ATRA培养基(与实施例1中相同的RA)中汇合。ATRA处理后，收集细胞用于RNA分离，或转移到6孔板且在脂肪形成诱导混合物中进行培养，所述脂肪形成诱导混合物包括DMEM、FBS、胰岛素、IBMX和地塞米松。48小时后去除IBMX且添加TZD。细胞维持在诱导培养基中11-12天，随后进行油红-O染色(Aldrich，Milwaukee，WI)以确定脂滴的存在，或收集用于RNA分离。将RNA逆转录成cDNA用于关于干细胞标记(Oct 4、Sox2、Nanog、AP)和脂肪形成标记(PPARγ、LPL、FAS)的RT-PCR，或直接在关于GNMT的单步定量实时RT-PCR中使用。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作标准化/持家基因。

如图3A中举例说明的，在暴露于ATRA期间，观察到显著的形态学变化，包括非常类似于胚状体(embryoid body)的结构发育。如图3B中通过箭标举例说明的，在诱导后还观察到阳性油红-O染色，从而指出脂质的存在。经由PCR的基因表达分析揭示PPARγ的诱导，所述PPARγ是脂肪细胞分化的已知标记(数据未显示)。这些结果是有意义的，因为它们暗示体细胞可以被诱导以再分化成其他细胞类型。

实施例3-RA和脂肪形成诱导混合物对原代肝细胞的作用：

原代大鼠肝细胞在用50-200nM ATRA处理的培养基中生长。处理后，细胞在与上文对于牛体细胞所述相同的比较条件下进行培养，只是除了将脂肪形成诱导混合物(如实施例2中所述)加入T-75瓶中。在ATRA处理期间观察到形态学变化，且在最初暴露于诱导培养基后48小时内，这些变化变得显著。到暴露于脂肪形成诱导培养基第4天时，这些形态学变化伴随球状体(spheroid body)发育的开始和如由汇合证明的明显细胞增殖，这是对照细胞中未达到的状态。这些观察暗示在培养中ATRA处理和暴露于脂肪形成诱导培养基后，终末分化的这些原代肝细胞再进入细胞周期，且在处理后显著增殖。

实施例4-RA和成骨诱导混合物对鼠体细胞的作用：

3T3 L1细胞在用50-200nM ATRA处理的培养基中生长。ATRA处理后，将细胞转移到6孔板且暴露于成骨诱导培养基21天，所述成骨诱导培养基包括DMEM、FBS、抗坏血酸2-磷酸盐、地塞米松、β磷酸甘油、和维生素D。如图4A和图4B中举例说明的，成骨诱导后，使用碱性磷酸酶和茜素染色分别观察到对于成骨细胞样细胞(图4A)和磷酸钙矿化的阳性染色。如图5中举例说明的，RT-PCR揭示骨钙蛋白和cbfa1的诱导，所述骨钙蛋白和cbfa1是成骨细胞特异性分化的已知标记。

实施例5-使用干扰RNA技术通过击倒DNA甲基转移酶1、3A和/或3B，生产具有恢复的分化潜能的细胞的细胞系生产和细胞培养物生产：

使用干扰RNA技术击倒DNA甲基转移酶1、3a和/或3b导致DNA甲基化水平减少。通过修饰培养基以掺入siRNA技术，可以实现选择性基因表达抑制。下文描述了用于达到这种影响的方法-包括基础培养基、特定处理和对那种培养基的修饰、以及证实击倒潜力的方法。

改变一碳代谢和/或抑制DNMT活性诱导总体DNA脱甲基作用，所述DNA脱甲基作用可以恢复分化潜能。能够再分化成多个谱系的去分化的细胞系可以通过总体外遗传重编程序来生产。初步研究设计为在用于SCNT的牛供体细胞系和鼠成纤维细胞细胞系中，分析使用siRNA技术的DNMT基因击倒对总体DNA脱甲基作用的影响，其证实了如何完成这点。

实施例5.1-DNA甲基转移酶1 siRNA转染对牛体细胞供体细胞甲基化和发育潜能的作用：

从屠宰场卵巢中抽吸的牛卵母细胞在成熟培养基(培养基199；Biowhittaker)中、于38.5℃在增湿的5％CO₂培养箱中成熟过夜，所述成熟培养基补加了黄体生成素(10IU/ml；Sigma)、雌二醇(1mg/ml；Sigma)、和FBS(10％；Hyclone，Logan，UT)。牛核移植如Forsberg等人所述[131]进行。由Robert等人[140])使用的针对Dnmt1的人siRNA从Dharmacon RNA Technologies(Lafayette，CO)订购。序列如下：AAGCAUGAGCACCGUUCUCC.dT.dT。(SEQ.ID.NO：1)这根据制造商的说明书形成双链体且进行脱盐。siRNA转染根据LIPOFECTIN制造商规程来发生。简言之，将溶于1X通用(Universal)缓冲液的2μM siRNA与LIPOFECTIN(Invitrogen)转染试剂和无血清生长培养基(Opti-MEM；Invitrogen)混合。(Invitrogen)和Robert等人[140]。在转染前，从～40-60％汇合的细胞中取出培养基，且添加3ml转染试剂溶液，最终转染浓度200nM siRNA和0.6％LIPOFECTIN转染试剂。

细胞于37℃温育24小时，且用包含血清的AmnioMAX牌培养基(Invitrogen)进行洗涤。在分析前将细胞转染2次。同时产生对照和测试样品，且包括：

1.用单独的培养基处理的细胞。

2.用单独的转染试剂(LIPOFECTIN)处理的细胞。

3.用对照siRNA(核纤层蛋白A/C；Dharmacon)处理的细胞。

4.用测试siRNA(Dnmt1；Dharmacon)处理的细胞。

下述图和图例概括了这些研究。图6A和6B举例说明了经由siRNA击倒Dnmt1。在siRNA处理用于SCNT的牛供体细胞后，Dnmt1被有效击倒(图6A，泳道D)，而肌动蛋白表达不受影响(图6A，泳道G-I)。相反，暴露于核纤层蛋白siRNA击倒核纤层蛋白表达(图6B，泳道C)，而不是Dnmt1(图6A，泳道C)。HPLC分析证实在用Dnmt1 siRNA处理的细胞中总体甲基化水平减少约40％，且细胞随后用于SCNT。图6C举例说明当与对照(泳道A和B)相比较时，Dnmt1击倒持续经过至少二细胞期(泳道C-F)，且当与对照相比较时，胚泡发育速率明显更高(50％对21％，p＜0.05)。

实施例5.2-DNA甲基转移酶3b siRNA转染对鼠体细胞甲基化的作用：

NIH3T3细胞用200nM鼠Dnmt3b siRNA(Dharmacon RNATechnologies，Lafayette，CO)进行转染。合并的siRNA序列如下：GCAAUGAUCUCUCUAACGU(SEQ.ID.NO：2)；GGAAUGCGCUGGGUACAGU(SEQ.ID.NO：3)；UAAUCUGGCUACCUUCAAU(SEQ.ID.NO：4)；GCAAAGGUUUAUAUGAGGG(SEQ.ID.NO：5)。转染规程基本上如制造商所述在我们实验室中进行最优化。简言之，将溶于1X siRNA缓冲液的2μM siRNA与DharmaFECT转染试剂和无血清生长培养基(DMEM；Hyclone，Logan，UT)混合。在转染前，从～70-80％汇合的细胞中取出培养基，且添加转染试剂溶液以覆盖表面。最终转染浓度为6孔板每孔2ml总体积中200nM siRNA和0.6％DharmaFECT转染试剂。

细胞于37℃在5％CO₂中温育24-48小时。所有实验包括一式三份的下述对照和测试样品：

1.未处理的细胞(单独的培养基)

2.模拟转染(无siRNA；只有DharmaFECT)

3.阳性对照siRNA(亲环蛋白b)

4.阴性对照siRNA(果蝇非靶向)

5.测试siRNA(Dnmt 3b)

Dnmt3b mRNA表达通过实时RT-PCR(使用TAQMAN牌RT-PCR试剂盒且根据制造商的说明书)来测定。结果显示于图7A中；n＝2。甲基化水平经由HPLC测定。结果显示于图7B中；n＝3。

如图7A中举例说明的，实时RT-PCR揭示与对照细胞相比较，用Dnmt3b siRNA转染的细胞中相对于亲环蛋白b的Dnmt3b mRNA水平减少79％。如图7B中举例说明的，HPLC揭示与对照细胞相比较，在用Dnmt3b siRNA转染的细胞中甲基化的胞嘧啶减少52％。这些数据指出Dnmt3b基因击倒可以在体外减少甲基化状态。

实施例6-在人和鼠体细胞中用于DNA甲基转移酶siRNA转染的新培养基：

另外的人和鼠Dnmt siRNA已购自Dharmacon(Lafayette，CO)。合并的siRNA序列如下：

1.人Dnmt1：GGAAGAAGAGUUACUAUAA(SEQ.ID.NO：6)；

GAGCGGAGGUGUCCCAAUA(SEQ.ID.NO：7)；

GGACGACCCUGACCUCAAA(SEQ.ID.NO：8)

GAACGGUGCUCAUGCUUAC(SEQ.ID.NO：9).

2.人Dnmt3a：GCACAAGGGUACCUACGGG(SEQ.ID.NO：10)；

CAAGAGAGCGGCUGGUGUA(SEQ.ID.NO：11)；

GCACUGAAAUGGAAAGGGU(SEQ.ID.NO：12)；

GAACUGCUUUCUGGAGUGU(SEQ.ID.NO：13).

3.人Dnmt3b：GAAAGUACGUCGCUUCUGA(SEQ.ID.NO：14)；

ACAAAUGGCUUCAGAUGUU(SEQ.ID.NO：15)；

GCUCUUACCUUACCAUCGA(SEQ.ID.NO：16)；

UUUACCACCUGCUGAAUUA(SEQ.ID.NO：17).

4.鼠Dnmt1：1-GGAAAGAGAUGGCUUAACA(SEQ.ID.NO：18)；

GCUGGGAGAUGGCGUCAUA(SEQ.ID.NO：19)；

GAUAAGAAACGCAGAGUUG(SEQ.ID.NO：20)；

GGUAGAGAGUUACGACGAA(SEQ.ID.NO：21).

5.鼠Dnmt3a：CGCGAUUUCUUGAGUCUAA(SEQ.ID.NO：22)；

CGAAUUGUGUCUUGGUGGA(SEQ.ID.NO：23)；

AAACAUCGAGGACAUUUGU(SEQ.ID.NO：24)；

CAAGGGACUUUAUGAGGGU(SEQ.ID.NO：25).

所有规程将基本上如制造商所述在我们实验室中进行最优化。简言之，将溶于1X siRNA缓冲液的2μM siRNA与DharmaFECT转染试剂和无血清生长培养基(DMEM；Hyclone，Logan，UT)混合。在转染前，从～70-80％汇合的细胞中取出培养基，且添加转染试剂溶液以覆盖表面。最终转染浓度为6孔板每孔2ml总体积中200nM siRNA和0.6％DharmaFECT转染试剂。

细胞于37℃在5％CO₂中温育24-48小时。所有实验将包括一式三份的下述样品：未处理的细胞，模拟转染(无siRNA；只有DharmaFECT)，阳性对照siRNA(亲环蛋白b)，阴性对照siRNA(果蝇非靶向)，和测试siRNA。

实时RT-PCR将用于证实基因击倒。HPLC将用于测量相对胞嘧啶甲基化水平。

实施例7-使用干扰RNA技术击倒MTHFR和/或Cbs的新培养基：

使用干扰RNA技术击倒MTHFR和/或Cbs导致SAM∶SAH比和DNA甲基化减少。合适的siRNAs在商业上购买(Dharmacon RNAtechnologies，Lafayette，CO)，且根据制造商的说明书形成双链体且进行脱盐。合并的人和鼠siRNA序列如下：

人MTHFR：AGUGAGAGCUCCAAAGAUA(SEQ.ID.NO：26)；

GAAGUGAGUUUGGUGACUA(SEQ.ID.NO：27)；

GACCAAAGAGUUACAUCUA(SEQ.ID.NO：28)；

GCAAGUGUCUUUGAAGUCU(SEQ.ID.NO：29).

人Cbs：AGACGGAGCAGACAACCUA(SEQ.ID.NO：30)；

CACCACCGCUGAUGAGAUC(SEQ.ID.NO：31)；

GGACGGUGGUGGACAAGUG(SEQ.ID.NO：32)；

GGAAGAAGUUCGGCCUGAA(SEQ.ID.NO：33).

鼠MTHFR：CGCCAUGGCUACAGAGUAA(SEQ.ID.NO：34)；

GCGGAAACCAGCCUGAUGA(SEQ.ID.NO：35)；

CAGAAGGCCUACCUCGAAU(SEQ.ID.NO：36)；

CAUACGAGCUGCGGGUCAA(SEQ.ID.NO：37).

鼠Cbs：GCAAACAGCCUAUGAGGUG(SEQ.ID.NO：38)；

GCAAAGUCCUCUACAAGCA(SEQ.ID.NO：39)；

GAUCGAAGAUGCUGAGCGA(SEQ.ID.NO：40)；

CAACCCUUUGGCACACUA(SEQ.ID.NO：41).

阳性和阴性siRNAs购自Dharmacon且直接在转染中使用。

所有规程基本上如制造商所述进行最优化。简言之，将溶于1XsiRNA缓冲液的2μM siRNA与DharmaFECT转染试剂和无血清生长培养基(DMEM；Hyclone，Logan，UT)混合。在转染前，从～70-80％汇合的细胞中取出培养基，且添加转染试剂溶液以覆盖表面。最终转染浓度为6孔板每孔2ml总体积中200nM siRNA和0.6％DharmaFECT转染试剂。

实时RT-PCR用于证实基因击倒。HPLC用于测量相对胞嘧啶甲基化水平。

实施例8-增加GNMT转录、蛋白质表达和活性的新培养基：

增加GNMT的转录、蛋白质表达和活性导致SAM∶SAH比和DNA甲基化减少。这包括鉴定具有与ATRA相似作用的化合物、提取物、分子，所述作用例如增加GNMT活性、和/或减少SAM∶SAH比。

在体外耗尽甲基供体导致SAM∶SAH比和DNA甲基化减少。该培养基是定制设计的，且缺乏一种或多种甲基供体或辅酶(叶酸、甜菜碱、胆碱、维生素B6、维生素B12和甲硫氨酸和/或其他)；或具有增加量的高半胱氨酸；或缺乏甲基供体/辅酶和/或增加高半胱氨酸水平的组合。配方基于HyClone′s 1640培养基(HyClone，Logan，UT)，具有如表5中所示的修饰：

表5

实验培养基对照培养基

组分： g/L g/L

培养基1：甜菜碱 0 0.03

培养基2：胆碱 0 0.03

培养基3：维生素B₆ 0 0.000005

培养基4：维生素B₁₂ 0 0.000005

培养基5：甲硫氨酸 0 0.15

培养基6：叶酸 0 0.03

实施例9-在体外增加高半胱氨酸水平的培养基：

体外增加高半胱氨酸水平导致SAM∶SAH比和DNA甲基化减少。该培养基是定制设计的，以包含增加量的高半胱氨酸；或缺乏甲基供体/辅酶和/或增加高半胱氨酸水平的组合。配方基于HyClone′s 1640培养基，具有如表6中所示的修饰：

表6

实验培养基对照培养基

组分： g/L g/L

培养基6：高半胱氨酸 0.0625 0

培养基7：叶酸 0 0.03

高半胱氨酸 0.0625 0

培养基8：甜菜碱 0 0.03

高半胱氨酸 0.0625 0

培养基9：胆碱 0 0.03

高半胱氨酸 0.0625 0

培养基10：维生素B₆ 0 0.03

高半胱氨酸 0.0625 0

培养基11：维生素B₁₂ 0 0.03

高半胱氨酸 0.0625 0

在确定成分培养基中培养细胞导致SAM∶SAH比和DNA甲基化减少，所述确定成分培养基具有减少或耗尽水平的特定甲基供体、或多个甲基供体，或包含增加水平的高半胱氨酸，或增加水平的高半胱氨酸与减少或耗尽水平的特定甲基供体组合。

实施例10-使用GNMT启动子的高通量测定：

增加GNMT表达和/或活化GNMT的因子可能下调DNA甲基转移酶，且减少总体甲基化水平。开发基于β-内酰胺酶的测定(和/或本文描述的其他测定)，以通过诱导GNMT转录鉴定GNMT表达诱导物(和抑制剂)。

β-内酰胺酶测定(Invitrogen)用于开发基于细胞的测定，所述测定可以用于鉴定通过一碳代谢途径诱导DNA脱甲基作用的药物、分子和提取物，以及用于鉴定诱导体外恢复的多潜能和多能细胞系的再分化的药物、分子和提取物。最初目的是开发可以用于筛选诱导GNMT表达的药物、分子和提取物的基于细胞的测定。

这种测定的基础将是GENEBLAZER技术(Invitrogen)，基于膜通透荧光共振能量转移(FRET)基底物(CCF2-AM)的基因报道系统，所述基因报道系统提供可行的细胞染色，与荧光激活细胞分选术的相容性，辐射计读出，和用于高通量筛选的最优化平台。在CCF2底物分子中由于缺乏FRET，CCF2在405nm处的激发分别导致蓝/绿发射。可透过细胞的CCF2-AM由通过头孢菌素核心连接的2种荧光团-7-羟基香豆素和荧光素组成。

香豆素在405nm处的激发导致FRET至荧光素部分，这在530nm处发出绿色荧光。β-内酰胺酶在CCF2-AM底物分子的头孢菌素核心内将β-内酰胺部分切割成2个分开荧光团，从而导致FRET破坏。

细胞在405nm处的激发导致在460nm处检测到的、经由香豆素的蓝色荧光发射。细胞中存在β-内酰胺酶引起从绿色到蓝色荧光细胞的变化。因此，在FACS分析期间，可以收集具有不同发射特征的细胞。

包含人GNMT的5′上游区的1.8kb DNA片段从基因组DNA进行PCR扩增。使用的引物是：

Pr4564：5’-GGGGTACCAGCATCTT-3’(SEQ.ID.NO：42)和

Pr6391：5’-GCGAGATCTCCTGCGCCGCGCCTGGCT-3’(SEQ.ID.NO：43).

PCR条件如下：1.5mM MgCl₂，200nm引物，由在60℃1分钟的退火步骤、在72℃延伸2分钟、和35个循环组成的35个循环。

扩增后，分别加入SDS和EDTA至0.1％和5mM。DNA用2.5M乙酸铵和70％乙醇进行沉淀。片段用KpnI和BglII进行消化，且在凝胶电泳后通过洗脱从琼脂糖中分离片段。将片段连接到携带β-内酰胺酶M编码序列(blaM)基因的载体p7-blaM内。使用Lipofectamine 2000牌试剂(Invitrogen)作为转染试剂将构建体转染到CHO-K1细胞内。不含插入片段的载体作为阴性对照进行转染。通过针对Zeocin的抗性选择稳定细胞。细胞在无酚红的MEM-α培养基中生长，所述MEM-α培养基具有10％活性炭处理的血清、青霉素/链霉素和10mM HEPES缓冲液。

具有低β-内酰胺酶表达的克隆通过FACS分析进行选择。细胞进行胰蛋白酶消化，且用FACS缓冲液[磷酸缓冲盐水(PBS)，5％活性炭处理的FBS]洗涤2次，且使用合适的GENEBLAZER技术，可透过细胞的基于FRET的底物(CCFs-AM)在黑暗中伴随轻微振荡以1×10⁶细胞/ml的浓度装载1小时。

细胞通过离心进行收获且以相同细胞浓度重悬浮于FACS缓冲液中。细胞使用Becton-Dickenson FACStarplus细胞分选仪(Franklin Lakes，NJ)进行分选。使用氩UV激光器以激发装载底物的细胞。将具有应答绿色荧光的克隆收集到96孔板内，且生长至6×106的最终细胞群体，所述96孔板包含具有200g/ml Zeocin的生长培养基。通过用ATRA处理测试稳定细胞系的可诱导性。

先前实验已证实GNMT转录对于ATRA的剂量响应。这种响应用作关于成功测定的标准。具体而言，当通过用100nM ATRA处理检测到3倍诱导且通过实时PCR证实时，测定被视为成功的。鉴定具有ATRA可诱导的β-内酰胺酶表达的克隆且用于进一步的发育。

利用具有类似应用、使用其他报道基因例如萤光素酶(luceriferase)、β-半乳糖苷酶等的测定也在本发明的范围内。

应当理解本发明不限于本文举例说明和描述的部分的具体构建和安排，而包含如在参考书目后的权利要求范围内的此类其修饰形式。

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序列表

<110>Eilertsen，Kenneth

<120>具有恢复的潜能的重编程序细胞的生产

<130>26969.007

<140>xx/yyy,zzz

<141>2006-08-01

<150>60/704,465

<151>2005-08-01

<160>43

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>针对DNMT1的人siRNA

<220>

<221>modified_base

<222>(6)..(6)

<223>位置6的“n”是尿苷(u)

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>n是a、c、g或t

<220>

<221>modified_base

<222>(15)..(16)

<223>位置15和16的“n”是尿苷(u)

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(16)

<223>n是a、c、g或t

<220>

<221>modified_base

<222>(18)..(18)

<223>位置18的“n”是尿苷(u)

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>n是a、c、g或t

<220>

<221>modified_base

<222>(21)..(21)

<223>位置21的“n”是脱氧胸苷(dT)

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(22)

<223>n是a、c、g或t

<220>

<221>modified_base

<222>(22)..(22)

<223>位置21的“n”是脱氧胸苷(dT)

<400>1

aagcangagc accgnncncc nn 22

<210>2

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3b的鼠siRNA

<400>2

gcaaugaucu cucuaacgu 19

<210>3

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3b的鼠siRNA

<400>3

ggaaugcgcu ggguacagu 19

<210>4

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3b的鼠siRNA

<400>4

uaaucuggcu accuucaau 19

<210>5

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3b的鼠siRNA

<400>5

gcaaagguuu auaugaggg 19

<210>6

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt1的人siRNA

<400>6

ggaagaagag uuacuauaa 19

<210>7

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt1的人siRNA

<400>7

gagcggaggu gucccaaua 19

<210>8

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt1的人siRNA

<400>8

ggacgacccu gaccucaaa 19

<210>9

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt1的人siRNA

<400>9

gaacggugcu caugcuuac 19

<210>10

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3a的人siRNA

<400>10

gcacaagggu accuacggg 19

<210>11

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3a的人siRNA

<400>11

caagagagcg gcuggugua 19

<210>12

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3a的人siRNA

<400>12

gcacugaaau ggaaagggu 19

<210>13

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3a的人siRNA

<400>13

gaacugcuuu cuggagugu 19

<210>14

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3b的人siRNA

<400>14

gaaaguacgu cgcuucuga 19

<210>15

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3b的人siRNA

<400>15

acaaauggcu ucagauguu 19

<210>16

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3b的人siRNA

<400>16

gcucuuaccu uaccaucga 19

<210>17

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3b的人siRNA

<400>17

uuuaccaccu gcugaauua 19

<210>18

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt1的鼠siRNA

<400>18

ggaaagagau ggcuuaaca 19

<210>19

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt1的鼠siRNA

<400>19

gcugggagau ggcgucaua 19

<210>20

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt1的鼠siRNA

<400>20

gauaagaaac gcagaguug 19

<210>21

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt1的鼠siRNA

<400>21

gguagagagu uacgacgaa 19

<210>22

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3a的鼠siRNA

<400>22

cgcgauuucu ugagucuaa 19

<210>23

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3a的鼠siRNA

<400>23

cgaauugugu cuuggugga 19

<210>24

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3a的鼠siRNA

<400>24

aaacaucgag gacauuugu 19

<210>25

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Dnmt3a的鼠siRNA

<400>25

caagggacuu uaugagggu 19

<210>26

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对MTHFR的人siRNA

<400>26

agugagagcu ccaaagaua 19

<210>27

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对MTHFR的人siRNA

<400>27

gaagugaguu ugguga cua 19

<210>28

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对MTHFR的人siRNA

<400>28

gaccaaagag uuacaucua 19

<210>29

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对MTHFR的人siRNA

<400>29

gcaagugucu uugaagucu 19

<210>30

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Cbs的人siRNA

<400>30

agacggagca gacaaccua 19

<210>31

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Cbs的人siRNA

<400>31

caccaccgcu gaugagauc 19

<210>32

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Cbs的人siRNA

<400>32

ggacgguggu ggacaagug 19

<210>33

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Cbs的人siRNA

<400>33

ggaagaaguu cggccugaa 19

<210>34

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对MTHFR的鼠siRNA

<400>34

cgccauggcu acagaguaa 19

<210>35

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对MTHFR的鼠siRNA

<400>35

gcggaaacca gccugauga 19

<210>36

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对MTHFR的鼠siRNA

<400>36

cagaaggccu accucgaau 19

<210>37

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对MTHFR的鼠siRNA

<400>37

cauacgagcu gcgggucaa 19

<210>38

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Cbs的鼠siRNA

<400>38

gcaaacagcc uaugaggug 19

<210>39

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Cbs的鼠siRNA

<400>39

gcaaaguccu cuacaagca 19

<210>40

<211>19

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Cbs的鼠siRNA

<400>40

gaucgaagau gcugagcga 19

<210>41

<211>18

<212>RNA

<213>人工的

<220>

<223>针对Cbs的鼠siRNA

<400>41

caacccuuug gcacacua 18

<210>42

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人GNMT 5’上游区域的PCR引物

<400>42

ggggtaccag catctt 16

<210>43

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人GNMT 5’上游区域的PCR引物

<400>43

gcgagatctc ctgcgccgcg cctggct 27

Claims

1.一种用于给真核细胞重编程序的方法，所述方法包括：

(a)减少所述真核细胞中的S-腺苷甲硫氨酸与S-腺苷高半胱氨酸比(SAM与SAH比)。

2.权利要求1的方法，其进一步包括：(b)减少所述真核细胞内DNA中的5-甲基胞嘧啶水平。

3.权利要求2的方法，其中步骤(a)和(b)同时进行。

4.权利要求2的方法，其中步骤(b)包括特异性抑制所述真核细胞内的DNA甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性。

5.权利要求4的方法，其中步骤(b)包括使所述细胞与DNA甲基转移酶抑制剂接触。

6.权利要求4的方法，其中步骤(b)包括使所述细胞与抑制有效量的小干扰核糖核酸(siRNA)接触，所述小干扰核糖核酸的尺寸和构型设定为抑制DNA甲基转移酶的表达。

7.权利要求1的方法，其中步骤(a)包括使所述细胞与选自SEQ.ID.NOS：1-41的siRNA接触。

8.权利要求1的方法，其中步骤(a)包括增加所述真核细胞内的甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者。

9.权利要求8的方法，其中步骤(a)包括使所述细胞与有效增加所述细胞内的甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者的量的视黄酸接触。

10.权利要求1的方法，其中所述SAM与SAH比减少至0.1或更少。

11.权利要求1的方法，其中所述SAM与SAH比减少至0.5或更少。

12.权利要求1的方法，其中所述SAM与SAH比减少至1.00或更少。

13.一种用于给真核细胞重编程序的方法，所述方法包括：

(a)特异性抑制真核细胞内的DNA甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性；和同时

(b)增加所述真核细胞内的甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者。

14.权利要求13的方法，其中步骤(a)包括使所述细胞与抑制有效量的siRNA接触，所述siRNA的尺寸和构型设定为抑制DNA甲基转移酶的表达。

15.权利要求13的方法，其中步骤(a)包括使所述细胞与抑制有效量的siRNA接触，所述siRNA的尺寸和构型设定为抑制以使所述细胞中DNA的5-甲基化胞嘧啶减少至少约5％。

16.权利要求13的方法，其中步骤(b)包括使所述细胞与有效增加所述细胞内的甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者的量的视黄酸接触。

17.权利要求16的方法，其中步骤(b)包括使所述细胞与全反式视黄酸接触。

18.权利要求16的方法，其中步骤(b)包括使所述细胞与结合视黄酸受体的化合物接触。

19.权利要求13的方法，其进一步包括与步骤(a)和(b)同时的：

(c)特异性抑制所述细胞内的酶的表达、活性、或表达和活性，所述酶选自5，10-亚甲四氢叶酸还原酶和胱硫醚β-合酶。

20.权利要求13的方法，其包括使所述细胞与选自SEQ.ID.NOS：1-41的siRNA接触。

21.一种改变真核细胞中的分化潜能的方法，所述方法包括使所述真核细胞在体外与一定量的siRNA接触，其中所述siRNA的尺寸和构型设定为特异性抑制DNA甲基转移酶的表达，前提是所述siRNA不抑制甘氨酸-N-甲基转移酶的表达，且其中所述量有效诱导全基因组的DNA脱甲基作用，其中细胞的分化潜能增加。

22.权利要求21的方法，其中所述真核细胞选自干细胞、祖细胞、体细胞、和实施体细胞核移植的细胞(NT细胞)。

23.权利要求21的方法，其包括使所述细胞与siRNA接触，所述siRNA的尺寸和构型设定为特异性抑制DNA甲基转移酶的表达，所述DNA甲基转移酶选自DNA甲基转移酶1(Dnmt 1)、DNA甲基转移酶3a(Dnmt 3a)、和DNA甲基转移酶3b(Dnmt 3b)。

24.权利要求21的方法，其进一步包括使所述细胞与有效增加甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者的量的化合物接触。

25.权利要求24的方法，其包括使所述细胞与视黄酸接触。

26.权利要求24的方法，其包括使所述细胞与全反式视黄酸接触。

27.权利要求24的方法，其包括使所述细胞与组合物接触，所述组合物包括所述siRNA和全反式视黄酸的组合。

28.一种增加分化的细胞中的分化潜能的方法，所述方法包括使分化的细胞在体外与组合物接触，所述组合物包括下述组合：

(i)击倒有效量的小干扰核糖核酸(siRNA)，其中所述siRNA的尺寸和构型设定为特异性抑制DNA甲基转移酶的表达；(ii)击倒有效量的siRNA，其中所述siRNA的尺寸和构型设定为抑制酶的表达，所述酶选自5，10-亚甲四氢叶酸还原酶和胱硫醚β-合酶；和(iii)有效增加甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者的化合物，

其中所述细胞与所述组合物接触有效诱导所述细胞内全基因组的DNA脱甲基作用的时间，由此细胞的分化潜能增加。

29.权利要求28的方法，其包括使所述细胞与包括siRNA的组合物接触，所述siRNA的尺寸和构型设定为特异性抑制DNA甲基转移酶的表达，所述DNA甲基转移酶选自DNA甲基转移酶1(Dnmt 1)、DNA甲基转移酶3a(Dnmt 3a)、和DNA甲基转移酶3b(Dnmt 3b)。

30.权利要求28的方法，其中有效增加甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者的所述化合物是视黄酸。

31.权利要求28的方法，其中有效增加甘氨酸-N-甲基转移酶的表达、活性、或表达和活性两者的所述化合物是全反式视黄酸。

32.权利要求28的方法，其包括使所述细胞与选自SEQ.ID.NOS：1-41的siRNA接触。

33.一种用于测定细胞的发育潜能的方法，所述方法包括测定所述细胞中的SAM与SAH比，其中SAM与SAH比小于约1.0指示所述细胞的发育潜能增加。

34.权利要求33的方法，其进一步包括测量所述细胞的DNA中存在的胞嘧啶残基的甲基化，其中甲基化小于约10％指示所述细胞的发育潜能增加。

35.一种用于控制细胞中的分化潜能的方法，所述方法包括；

(a)使所述细胞中的SAM与SAH比维持小于约1.0；和

(b)使所述细胞DNA中胞嘧啶残基的甲基化维持小于约40％。

36.权利要求34的方法，其包括：

(a)使所述细胞中的所述SAM与SAH比维持小于约0.5；和

(b)使所述细胞DNA中胞嘧啶残基的甲基化维持小于约20％。

37.一种用于增加所述培养基内放置的分化的细胞中的分化潜能的细胞培养基，所述培养基包括足以维持所述细胞生存力的基础培养基，与减少所述细胞培养基中存在的甲基供体活性的因子组合。

38.权利要求37的细胞培养基，其中所述因子选自高半胱氨酸和全反式视黄酸。

39.权利要求37的细胞培养基，其中所述因子是抑制有效量的siRNA，所述siRNA的尺寸和构型设定为抑制DNA甲基转移酶的表达。

40.一种用于鉴定影响细胞分化的化合物的方法，所述方法包括：

(a)使细胞DNA中甲基化的胞嘧啶百分比减少至少约5％，其中所述细胞在所述减少前具有第一种表型；

(b)使所述细胞中的SAM与SAH比减少至小于约1.0；和随后

(c)使所述细胞与怀疑影响细胞分化的化合物接触；和

(d)比较所述细胞的所述第一种表型与步骤(c)后的细胞表型，其中步骤(c)后出现不同于所述第一种表型的表型指示所述化合物对细胞分化有影响。

41.权利要求40的方法，其中步骤(a)包括使所述细胞的所述DNA中甲基化的胞嘧啶百分比减少至少约5％。

42.权利要求40的方法，其中步骤(a)包括使所述细胞的所述DNA中甲基化的胞嘧啶百分比减少至少约10％。

43.权利要求40的方法，其中所述细胞包括监控转录变化的报道系统。

44.权利要求43的方法，其中所述报道系统测量酶活性的存在，所述酶活性选自萤光素酶活性、β-内酰胺酶活性、和β-半乳糖苷酶活性。